專利名稱：生產(chǎn)rna病毒和基于rna病毒的載體顆粒的組合物及方法
技術領域：
本發(fā)明總地涉及病毒學、醫(yī)藥學和基因治療領域。具體地說，本發(fā)明涉及使用非感染性輔助痘病毒生產(chǎn)重組丙型肝炎病毒(HCV)、鼻病毒、流感病毒及衍生于慢病毒屬的載體顆粒的方法。本發(fā)明的組合物和方法被用于生產(chǎn)實質(zhì)上沒有有復制能力的輔助病毒的復制缺陷型基因治療載體制備物。
丙型肝炎病毒(HCV)、逆轉(zhuǎn)錄病毒、鼻病毒、流感病毒和慢病毒等病毒均為含有由RNA組成的基因組的病毒，并且都是疫苗和基因治療載體的潛在來源。減毒的病毒不會致病，但因為缺乏培養(yǎng)受損傷之突變體的系統(tǒng)，因而使減毒病毒的篩選和生產(chǎn)遇到很大困難。如其他的基因治療載體一樣，從RNA病毒衍生的載體包含有外源基因的表達盒。這些載體可被包裝到病毒顆粒中，并通過感染被送入靶細胞。因為在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的包裝效率很差，從而使RNA病毒作為基因治療載體的應用受到限制。
本發(fā)明提供使用無活力、有復制缺陷的輔助痘病毒重組體，在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中或于體外生產(chǎn)RNA病毒基因組序列和重組RNA病毒以及RNA病毒衍生的載體的方法。這些方法可以在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)和體外產(chǎn)生RNA病毒基因組和病毒顆粒，而不依賴于他們的天然復制途徑，從而避開任何細胞屏障的限制。本發(fā)明還提供按這些方法生產(chǎn)的新的病毒序列。
本發(fā)明提供生產(chǎn)包殼RNA病毒的方法，其包括以下步驟a)提供多肽編碼序列，其中所說的多肽能夠形成衣殼，并在真核細胞中包裝RNA病毒基因組序列；b)提供包含RNA病毒基因組序列的構建體，其中所說的基因組序列被正確地連接到噬菌體啟動子和噬菌體轉(zhuǎn)錄終止子序列之間，并且所說的噬菌體啟動子和噬菌體轉(zhuǎn)錄終止序列是可操作地匹配的；c)提供噬菌體RNA聚合酶的編碼序列，該編碼序列與步驟b)的噬菌體啟動子可操作地匹配，并可操作地連接到痘病毒啟動子上；d)在允許序列表達并組裝含有RNA病毒基因組序列的衣殼的條件下，在真核細胞胞質(zhì)中共同表達步驟a)的多肽編碼序列、步驟b)的RNA病毒基因組序列和步驟c)的噬菌體RNA聚合酶編碼序列，從而制得包殼的RNA病毒。
根據(jù)本方法的一個可選擇的方面，如果步驟b)的構建體(即含有可操作地連接到噬菌體啟動子和噬菌體轉(zhuǎn)錄終止序列上的RNA病毒基因組序列的構建體)沒有功能性內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)，則將編碼衣殼形成多肽的基因克隆到質(zhì)粒或病毒載體中。步驟a)的編碼序列被可操作地連接到在動物細胞胞質(zhì)中有活性的啟動子上。
一個方面，將噬菌體聚合酶的編碼序列克隆到復制缺陷型痘病毒中；可將該編碼序列可操作地連接到步驟b)的與之相匹配的噬菌體啟動子上。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個方面，含有RNA基因組序列的構建體可包括質(zhì)?；虿《据d體。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個方面，噬菌體可選自T3、T7和SP6噬菌體。T3噬菌體RNA聚合酶與T3噬菌體啟動子相配合；T7噬菌體RNA聚合酶與T7噬菌體啟動子相配合；SP6噬菌體RNA聚合酶與SP6噬菌體啟動子相配合。構建體可包含T3噬菌體轉(zhuǎn)錄終止序列和T3噬菌體啟動子，或T7噬菌體轉(zhuǎn)錄終止序列和T7噬菌體啟動子，或SP6噬菌體轉(zhuǎn)錄終止序列和SP6噬菌體啟動子。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個方面，在真核細胞胞質(zhì)中有活性的啟動子可以是衍生于痘病毒家族病毒成員的啟動子。痘病毒家族的病毒可以是正痘病毒屬的病毒。正痘病毒屬的病毒可以是痘病毒。痘苗病毒啟動子可以是晚期、中期或早期痘苗病毒啟動子。痘病毒可以是正痘病毒屬的病毒，如痘苗病毒。或者，痘病毒可以是選自下列一組病毒屬的病毒副痘病毒，禽痘病毒，山羊痘病毒，亞塔痘病毒，野兔痘病毒，豬痘病毒和軟疣痘病毒。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個可選擇的方面，真核細胞胞質(zhì)包括真核細胞，或者，真核細胞胞質(zhì)包括體外制備物。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個方面，所說的RNA病毒是肝炎病毒，如甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或者在其核心內(nèi)含有RNA前體的未成熟乙型肝炎病毒?；蛘?，RNA病毒可以是慢病毒、鼻病毒、流感病毒、人類免疫缺陷病毒(HIV)如HIV-1(在一個實施方案中，所說的人類免疫缺陷病毒缺少Rev反應元件或被膜序列)、沙礫病毒、LCMV、副流感病毒、呼腸孤病毒、輪狀病毒、星狀病毒、絲狀病毒、冠狀病毒(詳見下文討論，因為本發(fā)明包含所有RNA病毒)。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個可選擇的方面，有復制缺陷的、包殼的RNA病毒是感染性的或非感染性的。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個可選擇的方面，該方法生產(chǎn)的制備物實質(zhì)上不含有復制能力的痘病毒，例如，該方法生產(chǎn)的制備物99％是沒有復制能力的痘病毒，或99.5％是沒有復制能力的痘病毒，或100％是沒有復制能力的痘病毒(參見下文所述的“實質(zhì)上沒有”的定義)。
一個方面，復制缺陷型痘病毒缺乏病毒復制所需的多肽。病毒復制所需的多肽可以是病毒衣殼多肽。復制缺陷型痘病毒之所以是有缺陷的，是因為其存在轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)缺陷。
另一個方面，步驟a)的一個，幾個或全部多肽編碼序列被摻入步驟b)的RNA病毒基因組序列中，并且該構建體進一步包含一個內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)。IRES可以從任何來源獲得(詳見下文討論)。
本發(fā)明提供一個生產(chǎn)包殼RNA病毒的系統(tǒng)，其包括以下成分a)多肽編碼序列，其中所說的多肽能夠包裝RNA基因組序列，并且各編碼序列均被克隆到構建體中，從而使之可操作地連接到啟動子上；b)包含被可操作地的連接到噬菌體啟動子和噬菌體轉(zhuǎn)錄終止序列上的RNA病毒基因組的構建體，其中所說的RNA病毒基因組序列可被步驟a)的多肽包裝到衣殼中；c)與步驟b)的噬菌體啟動子可操作地配合的噬菌體RNA聚合酶的編碼序列，其中所說的編碼序列被克隆到復制缺陷型痘病毒中，從而被可操作地連接到一個痘病毒啟動子上；并且，其中在允許該編碼序列表達并組裝包含有RNA基因組序列的衣殼的條件下，在真核細胞胞質(zhì)中共同表達步驟a)的多肽，步驟b)的RNA基因組序列及步驟c)的噬菌體聚合酶編碼序列，從而產(chǎn)生包殼的RNA病毒。
根據(jù)該系統(tǒng)的一個方面，步驟a)的一個，幾個或全部多肽編碼序列被摻入步驟b)的RNA病毒基因組序列中，并且所獲得的構建體進一步包含一個內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)。
本發(fā)明提供包含有RNA基因組序列并在其3’末端帶有2’，3’-環(huán)磷酸的重組病毒基因組序列。本發(fā)明提供包含RNA基因組序列并在其3’末端帶有2’，3’-環(huán)磷酸的重組病毒顆粒。如下文所述，RNA基因組序列可衍生于任何RNA病毒。
本發(fā)明提供一種包含有RNA基因組序列和噬菌體RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止子序列及其3’末端polyA序列的重組病毒基因組序列。本發(fā)明提供一種包含RNA基因組序列和噬菌體RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止子序列及其3’末端polyA序列的重組病毒顆粒。如下文中詳細討論的，RNA基因組序列可衍生于任何RNA病毒。
本發(fā)明提供缺少Rev反應元件(RRE)或被膜序列，并包括噬菌體RNA聚合酶終止子序列的重組慢病毒基因組序列。本發(fā)明提供包含RNA基因組序列的重組慢病毒顆粒，所說的序列缺少Rev反應元件或被膜序列，并包含噬菌體RNA聚合酶終止子序列。
本文中引用的所有的出版物、專利和專利申請均全文列為本文參考文獻。
本發(fā)明的一個或多個實施方案將在附圖和詳細描述中給出。借助這些附圖和詳細描述，將會更為清楚地理解本發(fā)明的其他特征、目的及優(yōu)點。
圖2是圖解描述如實施例1中詳細說明的包含有HCV多聚蛋白編碼區(qū)的pVHCV質(zhì)粒。
圖3是圖解描述如實施例1中詳細說明的pVAC質(zhì)粒。
圖4是圖解描述如實施例1中詳細說明的pT7HCV-RIB質(zhì)粒；該質(zhì)粒包含位于噬菌體T7啟動子(PT7)與噬菌體T7終止子(TT7)之間的HCV基因組RNA的DNA拷貝和發(fā)夾結(jié)構-核酶(Rz)序列。
圖5是圖解描述如實施例2中詳細說明的pRHIN質(zhì)粒；在該質(zhì)粒中，鼻病毒的多聚蛋白開放讀碼框(ORF)位于痘苗病毒晚期啟動子與痘苗病毒終止子之間。圖中細線代表PUC19質(zhì)粒的主鏈序列。
圖6是圖解描述如實施例2中詳細說明的pT7RHIN質(zhì)粒；該質(zhì)粒中，T7啟動子和T7終止子之間依次插入了鼻病毒基因組RNA的DNA拷貝，該拷貝包括5’UTR、多聚蛋白編碼區(qū)、帶有poly(A)的3’UTR，和發(fā)夾結(jié)構-核酶(Rz)的cDNA。圖中細線代表pUC19質(zhì)粒的主鏈序列。
圖7是圖解描述如實施例3中詳細說明的質(zhì)粒pINF1-8；該質(zhì)粒中，流感病毒ANS和PB2的ORF與兩個分立的痘苗病毒晚期啟動子相連接。圖中箭頭代表轉(zhuǎn)錄的方向，細線代表pUC19質(zhì)粒的主鏈序列。
圖8是圖解描述如實施例3中詳細說明的pT7INF1質(zhì)粒；該質(zhì)粒中，A型流感病毒之RNA片段1的cDNA與發(fā)夾結(jié)構-核酶編碼序列相連接。整個編碼區(qū)域位于T7啟動子和T7終止子之間。
圖9是圖解描述如實施例4中詳細說明的pGAG-POL質(zhì)粒；該質(zhì)粒中，HIV-1 HXB2gag/pol多聚蛋白編碼區(qū)位于痘苗病毒早/晚期啟動子(pvacE/L)和痘苗病毒終止子(Tvac)之間。圖中細線代表PUC19質(zhì)粒的主鏈序列。


圖10是圖解描述如實施例4中詳細說明的pVSVG；在此質(zhì)粒中，水皰性口腔炎病毒G(VSV-G)蛋白編碼區(qū)位于噬菌體T7啟動子(PT7)和噬菌體T7終止子(PT7)之間。圖中細線代表PT7的主鏈序列。
圖11是圖解描述如實施例4中詳細說明的pT7EGFP質(zhì)粒；在此質(zhì)粒中基因排列次序如下噬菌體T7啟動子(PT7)，三聯(lián)鳥苷酸、HIV-1 HXB2 5’LTR、HIV-1 HXB2包裝信號、巨細胞病毒(CMV)啟動子、增強型綠色熒光蛋白編碼區(qū)、HIV-1 HXB2多聚嘌呤段(PPT)、HIV-1 HXB2 3’U3、三聯(lián)鳥苷酸、HIV-1 HXB2 3’R、噬菌體T7終止子(TT7)。圖中細線代表pBR322質(zhì)粒的主鏈序列。
在各附圖中，同樣的符號代表同樣的元件。
本發(fā)明的一個目的是提供一種使用無復制能力的復制缺陷型重組痘病毒生產(chǎn)包殼的RNA基因組序列，RNA病毒載體和RNA病毒顆粒的高滴度制備物的方法。所說的RNA病毒和基因組序列可以是任何RNA病毒，例如包括肝炎病毒(如甲型肝炎病毒(HAV)，HCV)、鼻病毒、流感病毒和慢病毒。使用本發(fā)明方法生產(chǎn)的RNA病毒載體和包殼產(chǎn)物基本上或完全沒有感染性痘病毒。本發(fā)明提供的方法還可用于生產(chǎn)任何其他RNA病毒。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，生產(chǎn)HCV、鼻病毒，和流感病毒等RNA病毒的方法包括以下步驟a)用包含位于噬菌體啟動子和噬菌體轉(zhuǎn)錄終止子之間的病毒基因組RNA編碼區(qū)的質(zhì)粒和包含病毒蛋白轉(zhuǎn)錄單元的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞；b)用包含噬菌體RNA聚合酶基因但無增殖能力的痘病毒重組體感染所說的細胞；c)收獲RNA病毒顆粒。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，生產(chǎn)慢病毒載體顆粒的方法包含如下步驟；a)用包含位于噬菌體啟動子和噬菌體轉(zhuǎn)錄終止子之間的慢病毒衍生之載體編碼區(qū)的質(zhì)粒和包含病毒蛋白轉(zhuǎn)錄單元的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞；b)用含有噬菌體RNA聚合酶基因但無增殖能力的痘病毒重組體感染所說的細胞；c)收獲RNA病毒顆粒。
本發(fā)明還提供沒有感染性痘病毒的RNA病毒(如HCV、鼻病毒、流感病毒)的制備物，所說的RNA病毒包括帶有噬菌體RNA聚合酶的終止子序列或其3’末端有2’，3’-環(huán)磷酸的病毒體RNA。
本發(fā)明還提供沒有感染性痘病毒的慢病毒載體顆粒的制備物，所說的載體顆粒包括帶有噬菌體RNA聚合酶終止子序列，但沒有Rev反應元件或任何其他被膜序列的載體。HCV、鼻病毒、流感病毒和慢病毒載體的生產(chǎn)用于生產(chǎn)本發(fā)明的RNA病毒(如HCV、鼻病毒，流感病毒，和慢病毒衍生的載體)的復制缺陷型輔助痘病毒可以是重組體痘苗病毒。復制缺陷型痘病毒具有一個插入在其基因組的胸腺嘧啶核苷酸激酶區(qū)的噬菌體RNA聚合酶基因。該RNA聚合酶的表達是由痘病毒如痘苗病毒啟動子驅(qū)動的。例如，F(xiàn)uerst等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1986 838122-26)描述了生產(chǎn)包含噬菌體RNA聚合酶基因的痘苗病毒重組體的方法。
在一個方面，除含有噬菌體RNA聚合酶基因外，復制缺陷型輔助痘病毒(如輔助痘苗病毒重組體)還具有復制缺陷，如必要基因的缺陷，例如缺少必要基因，或具有可誘導的必要基因，或具有處于非痘病毒來源之RNA聚合酶啟動子控制下的必要基因。例如，可使用D13L缺陷型痘苗病毒重組體VT7ΔD13L生產(chǎn)RNA病毒，如HCV、鼻病毒、流感病毒和慢病毒衍生的載體。D13L基因是必要基因，其表達產(chǎn)物是病毒顆粒組裝所必須的，其表達的限制或阻抑對于病毒轉(zhuǎn)錄和DNA復制沒有影響(如參見Zhang(1992)Virol.187643-653)，但能夠阻礙痘苗病毒顆粒的形成。因此使用D13L陰性痘苗病毒重組體生產(chǎn)如HCV、鼻病毒、流感病毒和慢病毒載體等RNA病毒顆粒，可得到幾乎沒有輔助牛痘病毒污染的制備物。
在下文描述的舉例方法中，D13L陰性痘苗病毒重組體的構建和增殖是按照Falkner等人的美國專利5,770,212(1998)中描述的改良方法完成的。在D13L陰性痘苗病毒重組體中，D13L的ORF通過同源重組被細菌鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(gpt)基因和LacZ基因所取代。gpt和LacZ基因的表達受痘苗病毒早/晚期啟動子的控制。缺陷型痘苗病毒是在HeLa細胞中篩選和增殖的。所說的HeLa細胞被編碼處于痘苗病毒晚期啟動子控制下的D13L基因的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染。
除了具有必要基因缺陷的缺陷型痘苗病毒重組體之外，本發(fā)明的方法中還可使用條件致病性的、誘導子依賴性的或RNA聚合酶(如噬菌體RNA聚合酶)依賴性的痘苗病毒重組體生產(chǎn)RNA病毒。這類重組體中的一種包括有IPTG可誘導的D13L基因(參見Zhang(1992)Virol.187643-53)。如果沒有IPTG，痘苗病毒重組體的復制便會被到抑制?；蛘?，D13L基因的痘苗病毒啟動子也可被噬菌體啟動子取代。如果D13L基因的啟動子是噬菌體啟動子，而又沒有噬菌體RNA聚合酶，則D13L基因產(chǎn)物便不能產(chǎn)生。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，為了由克隆的cDNA產(chǎn)生HCV，須使用兩個質(zhì)粒一個質(zhì)粒包含被克隆在噬菌體啟動子(如T7，SP6或T3啟動子)和噬菌體轉(zhuǎn)錄終止子之間的全長HCV基因組RNA的cDNA拷貝。這樣一個轉(zhuǎn)錄單元的轉(zhuǎn)錄是借助識別啟動子和終止子的噬菌體RNA聚合酶完成的，這種轉(zhuǎn)錄將產(chǎn)生特定大小的RNA分子。另一個質(zhì)粒則包含直接連接到上游痘苗病毒晚期啟動子上的病毒多聚蛋白的編碼序列。使用這些質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染對痘苗病毒敏感的適當?shù)乃拗骷毎?。然后再用含有處于痘苗病毒啟動?如痘苗病毒晚期或早/晚期啟動子)控制下的噬菌體RNA聚合酶基因的輔助痘苗病毒重組體感染之。
一個方面，輔助痘苗病毒重組體還包括復制或包殼所必需的基因的缺陷，或者有一個可誘導的必要基因。例如，30℃保溫72-96小時后，收集細胞培養(yǎng)物并通過0.2μm濾膜過濾以除去殘存的牛痘病毒顆粒。濾液中即含有HCV病毒體。使用本發(fā)明所提供的方法生產(chǎn)的HCV病毒顆粒與天然病毒顆粒相似，但它們的病毒體RNA分子是和天然的RNA分子不同的。它們在3’末端包含一個噬菌體RNA聚合酶的終止子序列，而且大約有一半的RNA分子在此終止子序列后帶有poly(A)尾部。在其5’末端，病毒體RNA可以有3個額外的核苷酸，而且5-10％的RNA帶有帽結(jié)構。該HCV制備物能夠感染MT-2和Huh-7細胞，從而產(chǎn)生負鏈RNA。
為了得到其中病毒體RNA不含有噬菌體轉(zhuǎn)錄終止序列(如T7終止子序列)的RNA基因組序列(如HCV病毒體)，可使用含有發(fā)夾結(jié)構-核酶盒(參見Altschuler(1992)，Gene 12285-90)的質(zhì)粒進行體內(nèi)RNA病毒顆粒(如HVC)的合成。在此質(zhì)粒中，編碼病毒體RNA的cDNA的3’末端與發(fā)夾結(jié)構-核酶cDNA相連接(見圖4)。然后將病毒RNA-核酶編碼序列置于噬菌體啟動子和噬菌體終止子之間。轉(zhuǎn)錄之后，由發(fā)夾結(jié)構-核酶引發(fā)的順式切割反應將自動切割所得到的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，以產(chǎn)生3’末端不帶有噬菌體終止子序列的病毒體RNA。所得到的病毒體RNA因其3’末端帶有2’，3’-環(huán)磷酸，故在結(jié)構上有別于原來的RNA。當使用該構建體表達HCV病毒體RNA時，所產(chǎn)生的病毒顆粒的滴度將得以提高。
例如，在生產(chǎn)慢病毒RNA的方法中，需要使用兩個質(zhì)粒。其中一個含有由病毒體RNA的cDNA組成的DNA片段，該片段后面帶有70個核苷酸的Poly(A)尾部，再后面是發(fā)夾結(jié)構-核酶的cDNA。該DNA片段側(cè)翼接有噬菌體啟動子和噬菌體終止子。另一個質(zhì)粒含有位于痘苗病毒晚期啟動子下游的RNA病毒(如鼻病毒)多聚蛋白編碼區(qū)。用這兩個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染對痘苗病毒和鼻病毒均敏感的細胞。然后再用含有處于痘苗病毒晚期或早/晚期啟動子控制下的噬菌體RNA聚合酶基因的輔助痘苗病毒重組體感染被轉(zhuǎn)染的細胞。30℃下保溫72-96小時后，收集細胞培養(yǎng)物上清并通過0.2μm濾膜過濾，濾液中即含有感染性RNA病毒。所產(chǎn)生的病毒顆粒含有其3’末端帶2’，3’-環(huán)磷酸的RNA分子。
例如，在生產(chǎn)流感病毒的方法中，須使用兩種類型的質(zhì)粒。一種類型的質(zhì)粒包含病毒體RNA的cDNA拷貝，其后是發(fā)夾結(jié)構-核酶的cDNA(如參見Chowrira(1994)J.Biol.Chem.26925856-64)。整段cDNA被置于噬菌體啟動子和噬菌體終止子之間。A型和B型流感病毒有8個單鏈片段和負鏈RNA，而C型流感病毒則有7個。為了表達整套片段，須構建8個質(zhì)粒，從而使每個質(zhì)粒編碼一個RNA片段。另一種類型的質(zhì)粒包含位于痘苗病毒晚期啟動子下游的病毒蛋白(PB1、PB2、PA、HA、NP、NA、M和NS)編碼區(qū)序列。每種質(zhì)粒編碼兩種病毒蛋白。用十二個質(zhì)粒(8個用于RNA基因組片段，4個用于病毒蛋白)共傳染對痘病毒和流感病毒均敏感的細胞，之后再用含有噬菌體RNA聚合酶基因的輔助痘苗病毒重組體感染之。30℃下保溫72-96小時后，收集培養(yǎng)物上清并用濾膜過濾。濾液中即含有流感病毒顆粒。所產(chǎn)生的病毒顆粒包含在其3’末端帶有2’，3’-環(huán)磷酸的RNA分子。
例如，在生產(chǎn)慢病毒衍生的載體顆粒的方法中，需要使用三個質(zhì)粒。其中一個質(zhì)粒包含編碼位于噬菌體啟動子和相應的轉(zhuǎn)錄終止子信號之間的載體RNA的cDNA。該cDNA片段包含有5’長未端重復系列(5’LTR)、包裝信號、連接在適當啟動子(如CMV、SV40啟動子及其他組織特異性啟動子)上的所需蛋白的ORF、多聚嘌呤段，以及3’LTR。另外一個質(zhì)粒包含了編碼包裝所需之Gag-Pol蛋白的cDNA。第三個質(zhì)粒包含編碼導向和進入細胞所需之病毒被膜蛋白的cDNA。該cDNA被連接到痘病毒啟動子(如痘苗病毒晚期啟動子)上。用這些質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染對痘苗病毒敏感的細胞，然后再用含有處于痘苗病毒啟動子(如晚期或早/晚期啟動子)控制下的噬菌體RNA聚合酶基因的復制缺陷型輔助痘苗病毒重組體感染之。30℃保溫72-96小時后，從培養(yǎng)物上清收集載體顆粒并通過0.2μm濾膜過濾。被包裝在顆粒中的載體含有噬菌體終止子序列，而且大約有一半的載體在噬菌體終止子序列后帶有poly(A)尾部。在一個方面，載體并不包含其他方法中所需要的細胞轉(zhuǎn)運元件(如Rev反應元件)。該方法可用于大規(guī)模生產(chǎn)載體顆粒制備物。制備物的滴度可高達108cfu/ml。
如果轉(zhuǎn)錄是以兩個或三個鳥苷酸(G)開始的，則借助噬菌體RNA聚合酶完成的RNA合成將更為有效。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，設計所得到的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物使之在其5’末端含有雙或三聯(lián)鳥苷酸標志。就某些慢病毒載體而言，為了使反轉(zhuǎn)錄能夠順利進行，可對RNA載體進行必要的修飾。例如，從借助T7 RNA聚合酶合成的載體RNA反轉(zhuǎn)錄得到的強終止DNA將在其3’末端含有兩個或三個鳥苷酸。為了使強終止DNA與3’末端LTR進行堿基配對，可將一定數(shù)量的(1，2，或3個)鳥苷酸插入到3’LTR的U3和R之間(如參見Coffin，F(xiàn)ields Virology，3d.，philadelphia，New YorkLippincott-Raven Publisher，1996，pp.1767-1847)。
輔助痘苗病毒感染后的培養(yǎng)溫度對于生產(chǎn)高產(chǎn)率病毒和載體顆粒是非常重要的。雖然痘苗病毒復制的最適溫度約為37℃，但生產(chǎn)RNA病毒和載體顆粒的最適溫度卻是29±2℃。例如，在30℃生產(chǎn)的HCV病毒顆粒的產(chǎn)率比在37℃下生產(chǎn)的HCV病毒顆粒的產(chǎn)率要高500-1000倍。在30℃下生產(chǎn)的HIV衍生的載體顆粒的滴度為108cfu/ml培養(yǎng)物，比在37℃下生產(chǎn)的載體顆粒的產(chǎn)率大約高1000倍。定義除特別定義者外，本文中所使用的所有科技術語均具有本發(fā)明所屬領域?qū)I(yè)人員所熟知的通用的含義。除特別指出者外，本文使用的下列術語具有如下所述的含義。
術語“RNA病毒”指的是其基因組為RNA的病毒。RNA病毒的具體例子包括HAV、未成熟的HBV、HCV、LCMV、鼻病毒、流感病毒、沙礫病毒、副流感病毒、呼腸孤病毒、輪狀病毒、星狀病毒、絲狀病毒、冠狀病毒。術語“RNA病毒”還包括逆轉(zhuǎn)錄病毒家族的病毒，如慢病毒屬或泡沫病毒屬，全病毒科、煙草脆裂病毒屬的病毒、丁型病毒、昆蟲病毒如Nyamanini virus。RNA病毒還包括植物病毒，如那些見于真菌傳桿狀病毒屬的病毒，傘形植物病毒屬的病毒，歐防風黃點病毒科的病毒，玉米退綠斑駁病毒屬的病毒，Iaedovirus屬和Viroids屬的病毒。
術語“痘病毒”指的是痘病毒科的所有病毒，包括脊椎動物病毒亞科的所有病毒，例如正痘病毒屬的病毒(例如痘苗病毒)、付痘病毒屬的病毒、禽痘病毒屬的病毒、山羊痘病毒屬的病毒、野兔痘病毒屬的病毒、軟疣痘病毒屬的病毒、豬痘病毒屬的病毒、亞塔痘病毒屬的病毒、昆蟲痘病毒亞科的病毒，以用其他在分類學上尚未確定的病毒，如加州港海豹痘病毒、cotia病毒、軟疣樣痘病毒、黑尾鹿痘病毒等。
術語“痘病毒啟動子”包括任何一種痘病毒啟動子，其中有許多都是本領域已知的。痘病毒如痘苗病毒，是在真核細胞的胞質(zhì)內(nèi)復制的。痘病毒啟動子的類別包括牛痘病毒早期、中期、和晚期啟動子(如參見Broyles(1997)J.Biol.Chem.27335662-35667；Zhu(1998)J.Virol.723893-3899；Holzer(1999)Virology 253107-114；Carroll(1997)Curr.Opin.Biotechnol 8573-577；Sutter(1995)FEBS Lett.3719-12)。術語“啟動子”是指一批指導核酸轉(zhuǎn)錄的核酸控制序列。僅就在本文中的應用來說，啟動子包括在轉(zhuǎn)錄起始位點附近的必不可少的核酸序列，如II型聚合酶啟動子中的TATA元件。啟動子還可以選擇性地包括距離轉(zhuǎn)錄起始位點約幾千個堿基對的遠端增強子或阻抑元件?！敖M成型”啟動子是指在大多數(shù)分環(huán)境和發(fā)育條件下有活性的啟動子?！翱烧T導型”啟動子是指處于環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)下的啟動子。術語“可操作地連接”是指核酸表達控制序列(如啟動子，或是轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點序列)與第二個核酸序列之間的功能性連接，其中表達控制序列指導相當于第二個序列的核酸的轉(zhuǎn)錄。
術語“缺陷型痘病毒”是指其親代痘病毒的必要基因(復制或包殼所需的任何基因)有缺陷、突變或經(jīng)受重組操作的痘病毒。例如，可工程化改造的必要基因是處于可誘導性啟動子或只被來源于痘病毒以外種屬的RNA聚合酶使用的啟動子的控制下的。術語“無活力的痘病毒”指的是有致死性的或條件致死性突變或缺陷的痘病毒。術語“誘導子依賴性，條件致死性病毒”是指在其基因組中含有的可誘導的必要基因的病毒突變體?！翱烧T導的必要基因”是指至關重要的，并只在特異性啟動子存在下才得以表達的基因?！皬椭迫毕莸摹笔侵覆缓袑υ谏?如體內(nèi))條件下復制和形成含基因組的衣殼所必需之遺傳信息的病毒基因組。
術語“突變的RNA病毒”指的是其基因組RNA所包含的核苷酸序列與相應的野生型RNA病毒不同的RNA病毒。術語“重組RNA病毒”指的是基因組中包含有外源序列的RNA病毒，這些外源序列可以是從其他種屬獲得的，或者是體外合成的，或者是已經(jīng)過人工操作的，例如已重排的。
術語“RNA病毒衍生的載體”是指包含有外源基因表達盒，并且能被包裝成病毒顆粒的RNA。術語“載體RNA”是指包含有外源基因表達盒，并且能被包裝成病毒顆粒的RNA。“病毒顆?！笔侵钙渲腥炕虿糠植《净蚪M核酸被包裝的病毒體?！拜d體顆粒”是指其中編碼表達盒的核酸被包裝的病毒顆粒。
本文中使用的術語“表達盒”是指能夠影響在與相應序列相配合的宿主細胞中表達的核苷酸序列。表達盒至少包括與多肽編碼序列可操作地連接的啟動子；并且還可以與其他序列，如轉(zhuǎn)錄終止信號可操作地連接。還可能使用在表達中起輔助作用的或必不可少的附加因子，如增強子?！翱刹僮鞯氐倪B接”是指連接到DNA序列上游的啟動子上，從而使該啟動子可以介導DNA序列的轉(zhuǎn)錄。因此，表達盒也包括質(zhì)粒、表達載體、重組體病毒、重組“裸DNA”載體等存在形式?！拜d體”包含可以感染、轉(zhuǎn)染、瞬時性或永久性轉(zhuǎn)導細胞的核酸。如人們所知道的，載體可以是裸核酸或與蛋白或脂質(zhì)相復合的核酸。載體可以選擇性的包含病毒或細菌核酸，和/或蛋白質(zhì)，和/或膜成分(如細胞膜、病毒脂質(zhì)被膜等)。載體包括DNA片段可以與之連接并在其上面復制的RNA復制子。因此載體包括但并不僅限于RNA、自身復制的環(huán)狀或線性DNA或RNA(如質(zhì)粒、病毒、和其類似物，參見美國專利5,217,879)，并包括表達或不表達的質(zhì)粒。當重組微生物或細胞培養(yǎng)物被描述成攜帶表達載體時，即意味著該載體包括有染色體外線狀或環(huán)狀DNA以及被摻入到宿主染色體中的DNA。當載體被保留在宿主細胞內(nèi)時，該載體或者可在細胞有絲分裂期間作為自主結(jié)構被穩(wěn)定地復制，或者被整合到宿主細胞基因組內(nèi)。
術語“噬菌體啟動子”和“噬菌體轉(zhuǎn)錄終止序列”分別是指任何一種噬菌體啟動子和噬菌體轉(zhuǎn)錄終止序列，其中有很多是本領域已知的。例如包括來源于T3、T7和SP6噬菌體的啟動子和終止序列?？寺『筒僮魇删w啟動子和噬菌體終止序列的方法是本領技術人員熟知的(如參見Yoo(2000)Biomol.Eng.16191-197；Bermudez-Cruz(1999)Biochimie 81757-764；Greenblatt(1998)Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.63327-336；Cisneros(1996)Gene 181127-133；以及美國專利6,143,518、6,110.680、6,096,523、5,891,636、5,792,625)。術語“噬菌體聚合酶”是指任何一種噬菌體聚合酶，包括那些與T3、T3和SP6噬菌體啟動子相匹配的聚合酶。克隆和操作聚合酶的方法是本領域技術人員熟知的(如參見Temiakov(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA9714109-14114；Pavlov(2000)Nucleic Acids Res.284658-4664；Jeng(1997)Can.J.Microbiol.431147-3830；美國專利5,604；118、5,556,769)。
術語“藥物組合物”是指適于作為藥物用于治療對象的組合物。本發(fā)明的藥物組合物是包含藥學上有效量的組合物的制劑，其中包括本發(fā)明的載體與藥學上可接受的載體的組合(即載體系統(tǒng))。本發(fā)明提供一種制備物，該制備物包含基本上或完全沒有輔助痘病毒的藥物組合物。術語“基本上沒有輔助痘病毒”或“基本上沒有復制能力的病毒”是指制備物(如因為感染本發(fā)明的載體系統(tǒng)所得到的產(chǎn)物)中有少于大約0.01％、0.02％、0.03％、0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％或1％的衣殼可以在具有復制能力的細胞中復制而不需要其他來源的補充，如細胞、其他病毒、質(zhì)粒等。在可選擇的實施方案中，藥物組合物有100％的純度，而且輔助病毒的純度可以達到大約99.99％、99.98％、99.97％、99.96％、99.95％、99.93％、99.90％、99.5％、99.0％、98％、97％、95％、93％、90％。
術語“具有復制能力的細胞”或“具有復制能力的宿主細胞”或“生產(chǎn)細胞”包括能夠支持痘病毒基因組復制和衣殼包裝的任何細胞。
術語“內(nèi)部核糖體進入位點”或“IRES”是指所有不依賴于mRNA 5’帽結(jié)構而啟動核糖體“內(nèi)部”進入的5’非翻譯區(qū)。IRES是高度明確的RNA二級結(jié)構，如保守的莖-環(huán)結(jié)構。作為一種未見于真核細胞的機制，其為介導帽結(jié)構非依賴性病毒蛋白翻譯起始的內(nèi)部核糖體進入位點。IRES雖然未見于真核細胞，但可見于包括HCV在內(nèi)的各種RNA病毒(如參見Jang(1990)Enzyme 44292-309；Honda(1990)J.Virol.731165-1174；Psaridi(1999)FEBS Lett.45349-53，以及美國專利6,193,980、6,096,505、5,928,888、5,738,985)。
術語“核酶”描述可以自身切割的DNA序列，許多核酶及分離、克隆、操作核酶序列的方法，都是本領域技術人員已知的(如參見美國專利6,210,931、6,043,077、6,143,503、6,130,092、6,087,484、6,069,007、5,912,149、5,779,260、5,631,115)。
術語“核酸”或“核酸序列”是指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。該術語包括核酸，如寡核苷酸，其中包括天然核苷酸的已知類似物。該術語還包括帶有人工合成的主鏈的核酸樣結(jié)構(如參見Oligonucleotides and Analogues，APractical Approach，ed.F.Eckstein，Oxford Univ.Press(1991)；Antisense Strategies，Annalsof the N.Y.Academy of Sciences，Vol.600，Eds.Baserga et al.(NYAS 1992)；Milligan(1993)J.Med.Chem.361923-1937；Antisense Research and Applications(1993，CRCPress)，WO97/03211；WO96/39154；Mata(1997)Toxicol.Appl.Pharmacol.144189-197；Stauss-Soukup(1997)Biochemistry 368692-8698；Samstag(1996)Antisense Nucleic AcidDrug Dev.6153-156)。
在本文中，重組體是指體外合成的或人工操作的多核苷酸(如“重組多核苷酸”)，該術語還指在細胞或其他生物學系統(tǒng)中使用重組多核苷酸生產(chǎn)基因產(chǎn)物的方法，或由重組多核苷酸編碼的多肽(“重組蛋白”)?！爸亟M手段”還包括將含有各種編碼區(qū)或結(jié)構域或不同來源啟動子序列的核酸連接到表達盒或表達載體中，在本發(fā)明的載體中進行可誘導性或結(jié)構性表達。通用技術本發(fā)明的核酸序列和用于實現(xiàn)本發(fā)明的其他核酸，包括RNA、cDNA、基因組DNA、載體、相關的病毒或其雜合體，均可從各種來源中分離得到并經(jīng)受遺傳工程操作、擴增，和/或被重組表達。
另外，也可以使用已知的化學合成技術體外合成這些核酸。所說的技術可參見Carruters(1982)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47411-418；Adams(1983)J.Am.Chem.Soc.105661；Belousov(1997)Nucleic Acids Res.253440-3444；Frenkel(1995)FreeRadic.Biol.Med.19373-380；Blommers(1994)Biochemistry 337886-7896；Narang(1979)Meth.Enzymol.6890；Brown(1979)Meth.Enzymol.108109；Beaucage(1981)Tetra.Lett.221859；以及美國專利4,458,066。然后可合成互補鏈并將這些互補鏈在適當條件下一起退火，或者是使用DNA聚合酶，將此互補鏈與適當?shù)囊镄蛄邢嗉雍?，以得到雙鏈DNA片段。
核酸操作技術，例如造成序列突變、亞克隆、探針標記、測序、雜交等在科學文獻和專利文獻均已有充分描述(如參見Sambrook，ed.Molecular CloningA LaboratoryManul(2nd.ed.)，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory(1998)；Current Protocols InMolrcular Biology，Ausubel，ed.John wiley & Sons，Inc.New York(1997)；LaboratoryTechniques In Biochemistry And Molecular BiologyHybridization Wtth Nucleic AcidProbes，Part I.Theory and Nucleic Acid Preparation，Tijssen，ed.Elsevier，N.Y(1993))。
核酸、載體、衣殼、多肽等的分析和定量可以使用許多通用的方法完成，如NMR等分析生物化學方法、分光光度法、放射顯影法、電泳、毛細管電泳、高效液相色譜(HPLC)、薄層層析(TLC)、超擴散層析、免疫沉淀、免疫擴散、免疫電泳、放射免疫、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、免疫熒光試驗等各種免疫學方法、Southern分析、Northern分析、點印跡分析、凝膠電泳(SDS-PAGE)、RT-PCR、定量PCR、其他核酸或靶或信號擴增技術、放射標記、閃爍計數(shù)及親和層析等。RNA病毒丙型肝炎病毒本發(fā)明提供新的重組丙型肝炎病毒(HCV)基因組序列、包含這些HCV序列的病毒顆粒以及生產(chǎn)HCV顆粒的方法。HCV是單股正鏈RNA病毒，其基因組由5’端非編碼區(qū)(5’UTR)、多聚蛋白編碼區(qū)和3’UTR組成的。在5’端非編碼區(qū)(5UTR)內(nèi)存在一個內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)(Houghton，F(xiàn)ielads Virology pp.10351058)。已發(fā)現(xiàn)一個肝炎病毒的IRES存在于341個核苷酸的5’端非編碼區(qū)內(nèi)，其為HCV基因中的最保守的部分(參見Kolupaeva(2000)J.Virol.746242-6250；Hellen(1999)J.Virol.Hepatology 670-87)。目前已報道了幾株HCV的全長基因組RNA序列(如參見Choo，et al.Sience 244359；Aizaki et al.Hepatology 20621-627；Tahaka(1995)Biochem.Biophs.Res.Comm.215744)。
HCV是一種尚未在細胞培養(yǎng)物培養(yǎng)成功的RNA病毒。據(jù)報道，從病人血清中獲得的HCV能夠感染人原代肝細胞(Carlon(1993)Archives of Virology 831-39；Iacovacci(1993)Research in Virology 144273-279；Faurnier(1998)J.Gen.Virol.792367-2374)、外周血單核細胞(Bouffard(1992)J.Infectious Disease 1661276-1280)人T細胞系(HPBMa10-2)、B細胞系(Daudi)(Bertolini(1993)Research in Virology144281-285；Shimizu(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 895477-5481)和肝細胞系(Tagwa(1995)J.Gastroenterol.Hepatol.10523-527；Seipp(1997)J.Gen.Virol.782467-2476；Yoo(1995)J.Virol.6932-38)。然而，HCV在這些細胞中的復制通常是瞬時的和低效的。在細胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)HCV的另一種方法是使用體外“失控”轉(zhuǎn)錄方法(參見Yoo(1995)J.Virology6932-38)合成的HCV基因組RNA轉(zhuǎn)染到人肝細胞系Huh7中。盡管有報道說被轉(zhuǎn)染的細胞中可產(chǎn)生感染性病毒顆粒，但這種方法的病毒復制效率很差。
重組RNA病毒基因組序列和載體(包括HCV基因組和病毒顆粒)的生產(chǎn)與操作方法是本領域已知的(如參見美國專利6,156,495、6,153,421、6,110,465、5,981,274、5,849,523和5,789,559)。鼻病毒本發(fā)明提供新的重組鼻病毒基因組序列，包含這些序列的病毒顆粒以及生產(chǎn)鼻病毒顆粒的方法。
鼻病毒是單股正鏈RNA病毒。其基因組由單鏈RNA分子組成，并包括5’端非編碼區(qū)(5’UTR)、多聚蛋白編碼區(qū)和在帶有poly(A)未端的3’UTR以及一個小分子蛋白VPg(VPg緊靠基因組的5’末端)。已公布了全長基因組RNA的序列(參見Callahan(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82732-736)。鼻病毒可在人細胞和某些靈長類動物細胞中生長。培養(yǎng)鼻病毒最常用的人細胞系是二倍體成纖維細胞WI-38細胞系(Hayflick(1996)Exp.Cell.Res.25585-621)、胎兒扁桃體細胞系(Fox(1975)Arm.J.Epidemiol.101122-143)、MRC-5細胞系(Jacobs(1970)Nature227168-1)和HeLa細胞系(Conant(1968)J.Immunol.100107-113)。盡管尚未見有關由克隆的基因組RNA產(chǎn)生鼻病毒的報導，但已經(jīng)證明用體外轉(zhuǎn)錄的病毒RNA轉(zhuǎn)染人細胞可產(chǎn)生感染性脊髓灰質(zhì)炎病毒(Semler(1984)Nucleic Acids Res.125123-5141)。與鼻病毒一樣，脊髓灰質(zhì)炎病毒也屬于微小RNA病毒科。
產(chǎn)生和操作重組RNA病毒基因組序列及載體(包括鼻病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組和病毒顆粒)的方法是本領域技術人員熟悉的(如參見Mc Knight(1998)RNA41569-1584，以及美國專利6,156,538、5,614,413、5,691,134、5,753,521和5,674,729)。流感病毒本發(fā)明提供新的重組流感病毒基因組序列、包含這些序列的病毒顆粒以及生產(chǎn)流感病毒顆粒的方法。
流感病毒是負鏈RNA病毒。其基因組由幾部分單鏈RNA分子組成，A型和B型流感病毒包含8個單鏈RNA片段，C型流感病毒包含7個單鏈RNA片段(如參見Lambet al.(1996)Fields Virology，出處同上)。A、B和C流感病毒的完整個序列均已有報道。流感病毒能在受孕卵和腎細胞中生長。例如Neumann((1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 699345-9350；(2000)Virology 267310-317)報道了由克隆的基因組RNA分子的cDNA拷貝生產(chǎn)病毒的方法。已報道的系統(tǒng)是利用人RNA聚合酶在人胚腎細胞293T中合成病毒RNA和mRNA，以產(chǎn)生流感病毒顆粒。
重組RNA病毒基因組序列和載體(包括流感病毒基因組和病毒顆粒)的生產(chǎn)和操作方法是本領域技術人員已知的(如參見Kemdirim(1986)Virology 152126-135，以及美國專利5,877,852和5,879,925)。慢病毒屬衍生的載體本發(fā)明提供新的重組慢病毒基因組序列、包含這些序列的病毒顆粒以及生產(chǎn)慢病毒顆粒的方法。
慢病毒衍生的載體和相關的包裝系統(tǒng)最初是由Naldini建立的(Science 272263-267)，近來Dull等人又對其進行了改進，以進一步降低產(chǎn)生有復制能力的HIV的可能性(Dull(1998)J.Virol.728463-71)。在該系統(tǒng)中，使用分別編碼HIV Gag-Pol、Rev、皰疹性口腔炎病毒G(VSV-G)被膜蛋白和載體RNA的4個質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人腎上皮細胞系293T。在載體顆粒生成細胞中合成HIV-1前體多聚蛋白Gag/Pol和Gag后，它們將依次包裝載體RNA并從質(zhì)膜出芽以形成病毒顆粒。當VSV-G蛋白與Gag-Pol被共表達時，便得到在其表面上展示有VSV-G蛋白的病毒顆粒，從而更有利于顆粒進入宿主細胞。
產(chǎn)生和操作重組RNA病毒基因組序列及載體(包括慢病毒基因組和病毒顆粒)的方法是本領域技術人員已知的(如參見Kirchhoff(1990)Viroloqy 177305-311；以及美國專利6,165,782、5,994,516、5,994,136、5,747,324、5,624,795和5,614,404)。痘病毒本發(fā)明提供使用復制缺陷型痘病毒生產(chǎn)包殼RNA病毒和RNA基因組序列的方法。根據(jù)該方法的一個方面，將編碼噬菌體聚合酶的序列克隆到復制缺陷型痘病毒中，從而使該編碼序列能夠與痘病毒啟動子可操作地連接。
痘病毒是DNA病毒。它利用自身的酶進行DNA復制和轉(zhuǎn)錄。病毒的復制全部在宿主細胞的胞質(zhì)中完成。痘苗病毒DNA聚合酶也能復制存在于胞質(zhì)中的質(zhì)粒，以產(chǎn)生不均一的和大的線性DNA。如果胞質(zhì)中的DNA包含有痘苗病毒啟動子，它便能夠借助痘苗病毒RNA聚合酶進行轉(zhuǎn)錄。由于具有以上這些特點，痘病毒已被廣泛用于表達外源蛋白(如參見Panicali and Paoletti，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 794927-31；Hackett et al.，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 797415-19；Scheiflinger et al.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 899977-81；Merchlinsky and Moss，1992，Virol.190522-26)。其中一個痘苗病毒表達系統(tǒng)是利用噬菌體RNA聚合酶，如T7、T3或SP6(參見Fuerstet al.，1987，Mol.Cell.Biol.72538-2-2544；Roariguez et al.，1990，J.Virol.644851-4857；Usdin et al.，1993，BioTech.14222-224)。在該表達系統(tǒng)中，使用編碼噬菌體RNA聚合酶的重組痘苗病毒進行體內(nèi)轉(zhuǎn)錄。將被轉(zhuǎn)錄的DNA克隆到質(zhì)粒中噬菌體啟動子的下游。用重組痘苗病毒感染細胞，然后再用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染之。痘病毒感染后即可合成噬菌體RNA聚合酶，然后開始轉(zhuǎn)錄噬菌體啟動子下游的DNA。
通過抑制一個或多個痘病毒生長所需的必要基因的表達，可使痘病毒失去復制能力。一種方法是在必要基因的ORF之前插入一個可誘導的啟動子(如參見Fuerst et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 862549-2553)。例如，條件致死性、誘導劑依賴性痘苗病毒即包含有可誘導的D13L基因(如參見Zhang(1992)Virol.187643-653)。如果缺乏誘導劑，必要基因的表達便受到抑制。另一種方法是從病毒基因組中去掉生長所需的必要基因。Falkner等人曾利用能穩(wěn)定地表達相應的必要蛋白的互補細胞系來增殖缺少必要基因的缺陷型痘病毒重組體(Falkner等人(1998)美國專利5,770,212和5,766,882)。
產(chǎn)生和操作重組RNA病毒基因組序列及載體(包括痘病毒)的方法是本領域技術人員已知的(如參見美國專利6,214,353、6,168,943、6,130,066、6,051,410、5,990,091、5,849,304、5,770,212、5,770,210、5,766,882、5,762,938、5,747,324、5,718,902、5,605,692)。藥物的配制和投用本發(fā)明還提供用于體外或體內(nèi)向細胞中轉(zhuǎn)移核酸的配制的藥用載體。可使用本發(fā)明的載體、載體系統(tǒng)和方法生產(chǎn)復制缺陷型基因轉(zhuǎn)染和基因治療載體，特別是用于體內(nèi)或體外向細胞中轉(zhuǎn)移核酸。使用本發(fā)明的載體系統(tǒng)和方法，這些序列可被包裝而制成基因治療載體制劑，而且這些制劑無輔助病毒的污染，可以在基因置換治療(在體細胞或生殖組織中)或腫瘤治療中作為藥物使用(如參見Karpati(1999)Muscle Nerve161141-1153；Grystal(1999)Cancer Chemother.Pharmacol.43 SupplS90-9)。
本發(fā)明的載體、載體系統(tǒng)、藥物組合物和方法也可用于其他非人類系統(tǒng)。例如，本發(fā)明的載體可用于實驗動物(如小鼠、大鼠)及重要經(jīng)濟動物(如豬、牛)的基因的遞送(如參見Mayr(1999)Virology 263496-506；Mittal(1996)Viroloqy 222299-309；Prevec(1999)J.Infect.Dis.16127-30)。
可以借助適當?shù)呐浞酵队眠@些藥物。為實現(xiàn)本發(fā)明，由攝生學決定的常規(guī)投用方法在專利和非專利科學文獻中已有充分的描述，一些典型的例子將在后面敘述。關于配方、劑量、用法等的詳細描述也可參見有關專利和非專利科學文獻，如參見最新版的Remingtons Pharmaceutial Scienccs，Maack Publishing Co.，Easton PA。藥物組合物本發(fā)明提供由實質(zhì)上沒有輔助病毒的RNA病毒和載體顆粒制劑與藥學上可作接受的載體組成的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物可進一步包含其他活性劑，如其他重組病毒、質(zhì)粒、裸DNA或藥物(如抗腫瘤劑)。
藥學上可接受的載體包括生理上可接受的化合物，例如用于穩(wěn)定組合物，或增加或降低藥物成分的吸收的化合物。生理上可接受的化合物包括碳水化合物如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖，抗氧化劑如抗壞血酸或谷胱甘肽，螯合劑、低分子量蛋白質(zhì)、降低共投用之藥劑的清除率或水解率的成分，或賦形劑或其它穩(wěn)定劑或緩沖液。也可使用去污劑穩(wěn)定藥物組合物，或用于增加或減少藥物組合物的吸收率。
其它生理上可接受的成分包括潤濕劑、乳化劑、分散劑或用于阻止微生物生長與繁殖的防腐劑。許多防腐劑都是已知的，如抗壞血酸。本領域技術人員可以依據(jù)給藥途徑和所投用之藥劑的特定生理-化學特征來選擇這些藥學上可接受的載體，包括生理上可接受的化合物。
所投用的組合物通常包括其中含有RNA病毒和載體顆粒及藥學上可接受的載體的緩沖液?？墒褂酶鞣N載體，如緩沖鹽水等。這些溶液是無菌的，而且通常沒有不需要的物質(zhì)?？梢允褂靡阎某Ｒ?guī)滅菌技術對這些組合物進行除菌處理。這些組合物還可以含有藥學上可接受的輔助物質(zhì)，如pH調(diào)節(jié)和緩沖劑、毒性調(diào)節(jié)劑等，例如乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等。這些制劑中的病毒衣殼的濃度范圍可以很寬，并主要依據(jù)液體體積、粘度、病人體重及給藥途徑等因素來選擇并確定所需的特定濃度。給藥劑量的確定可以依據(jù)疾病的性質(zhì)、病人狀況、給藥途徑等因素，按各種不同的劑量單位形式投用本發(fā)明的藥物組合物。具體地說，每毫升含水溶液中病毒的濃度一般含有103-1018個，較好含有105-1015個，最好含有106-1013個病毒顆粒。更具體的劑量范圍可參見最新版的Remington’s Pharmaceutical Sciences；Sterman(1998)Hum.Gene Ther.91083-1092以及Smith(1997)Hum.Gene.Ther.8943-954。
RNA病毒的確切用量和濃度、給藥次數(shù)或治療有效劑量通常由臨床醫(yī)生確定。給藥方案將取決于各種因素，例如待使用基因治療載體治療之疾病的進展階段和嚴重程度、病人的一般狀況、生理條件及年齡等。臨床醫(yī)生可以根據(jù)每個病人的具體病情來確定用藥劑量。
遺傳工程生產(chǎn)的RNA載體已被用于基因治療(如參見Bosch(2000)Hum.Gene Ther.111139-1150；Mukhtar(2000)Hum.Gene Ther.11347-359；Deglon(2000)Hum.Gene Ther.11179-190；Sallberg(1998)Hum.Gene.Ther.91719-1729)。在實施本發(fā)明的過程中，可以參考具體實例，結(jié)合上述各種因素來確定所采用的給藥途徑、配方組成、給藥次數(shù)及劑量水平。
可根據(jù)給藥劑量和頻率以及病人的耐受性，以單劑或多劑方式通過鞘內(nèi)途徑投用本發(fā)明的含有RNA病毒和載體顆粒的藥物組合物。特定部位給藥(如腹腔內(nèi)或鞘內(nèi))的典型劑量為大約0.5至50ml，每毫升藥物組合物含有大約1013個病毒顆粒。優(yōu)選的給藥劑量為大約5至20ml，每毫升藥物組合物含有大約109個病毒顆粒。較低的給藥劑量為大約1至5ml，每毫升含有大約106個病毒顆粒?？苫谏衔挠懻摰母鞣N不同的因素和主客觀標準，以及必要時參照常規(guī)劑量和病人的耐受能力投用本發(fā)明的藥物組合物。
對于病毒的確切濃度、配方組成和劑量以及給藥頻率，還應在第一次用藥后體內(nèi)(如原位)的轉(zhuǎn)基因表達水平和載體滯留水平的不同，分別作出必要的相應調(diào)整。遞送途徑可借助本領域已知的方法，以全身(如靜脈內(nèi))或局部(如腫瘤周邊或本囊腔內(nèi))給藥方式遞送本發(fā)明的含有RNA病毒構建體的藥物組合物?？商岬降闹亟M病毒或病毒載體的遞送途徑包括動脈內(nèi)、腫瘤內(nèi)、靜脈內(nèi)、腸胃道外、腹腔內(nèi)、胸腔內(nèi)、口腔內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、氣管內(nèi)(如通過氣霧劑)、透粘膜(如口、膀胱、陰道、子宮、直腸、鼻)、腫瘤內(nèi)(如經(jīng)皮膚或局部注射)等途徑。使用動脈內(nèi)注射容易產(chǎn)生“區(qū)域效應”，將使藥物集中到某一特定的器官(如腦、肝、脾、肺)。例如，如果希望在肝臟中產(chǎn)生抗腫瘤局部效應，可采用肝動脈注射或頸動脈注射方法。如希望向腦內(nèi)遞送病毒制劑(如治療腦腫瘤)，則可以通過頸動脈注射或頸動脈系動脈(如枕動脈、耳動脈、顳動脈、腦動脈或上頜動脈等)注射方法遞送。
本發(fā)明的載體可以單獨或與其他適當?shù)某煞忠黄鹬瞥蓺忪F劑用于呼吸道吸入給藥。可將這些氣霧劑放入加壓的推進劑如二氯二氟甲烷、丙烷或氮氣內(nèi)給藥，也可將其制成通過霧化器或噴霧器給藥的制劑。最好用上述的含水藥用緩沖液配制適于這種給藥方式的制劑，并使用支氣管鏡向肺內(nèi)遞送。肺部疾病的基因治療方法包括以基因替代療法(如使用囊性纖維化跨膜調(diào)節(jié)蛋白基因)治療肺囊性纖維化，或治療肺腫瘤或其他呼吸道疾病。
另外，可將本發(fā)明的載體與各種基質(zhì)如乳化劑或水溶性基質(zhì)相混合以制成栓劑。適于陰道內(nèi)給藥的制劑包括陰道栓、棉塞、霜劑、凝膠劑、軟膏、泡沫劑或噴霧劑。
可將本發(fā)明的藥物組合物以單劑或多劑形式密封在安瓿或小藥瓶等容器內(nèi)，于凍干條件下貯存?zhèn)溆?。使用前只須加入適當?shù)臒o菌液體賦形劑如注射用水重新配制即可。需要時，也可以由無菌粉末劑、顆粒劑或片劑臨時配制成注射液或懸浮劑。
也可以以脂質(zhì)制劑形式投用本發(fā)明的構建體，特別是可以與脂質(zhì)體復合制成脂質(zhì)/核酸復合物(如參見國際專利WO93/24640(Debs and Zhu)和WO91/06309(Brigham)，美國專利5,279,933，以及Mannino(1988)和Felgner(1987)的前述文獻)。也可將本發(fā)明的RNA病毒重組構建體包裹在脂質(zhì)體中進行局部或全身給藥，或通過氣霧劑遞送。藥盒本發(fā)明提供包含載體、載體系統(tǒng)或本發(fā)明的藥物組合物的藥盒。藥盒還可包含復制感受態(tài)細胞。藥盒中可包括教導使用者如何分離復制缺陷型RNA病毒和載體顆粒的有關方法學的詳細說明書。含有藥物制劑的藥盒中還可包括有關適應癥、給藥劑量、給藥途徑及給藥方法的說明。
不必再作更詳盡的說明，相信以上的描述足以使本領域技術人員理解本發(fā)明的基本精神和原則，并充分利用本發(fā)明。下列實施例旨在進一步舉例描述本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明。實施例1HCV-核酶-T7終止子-poly(A)RNA病毒顆粒的制備本實施例旨在舉例說明制備或生產(chǎn)感染性HCV病毒顆粒，特別是HCV-核酶-T7終止子-Poly(A)RNA病毒顆粒的方法。
生產(chǎn)感染性HCV病毒顆粒的第一個步驟是構建下述兩個質(zhì)粒(a)含有全長度HCV基因組RNA之DNA拷貝的pT7HCV(圖1)，和(b)含有處于合成的痘苗病毒晚期啟動子下游HCV多聚蛋白編碼區(qū)的pVHCV(圖2)。包括5’UTR、多聚蛋白的ORF和3’UTR的HCV基因組的DNA拷貝兩側(cè)翼分別連接有上游噬菌體T7啟動子(PT7)和下游噬菌體T7終止子(TT7)。圖1中的細線代表PUC19主鏈。在質(zhì)粒pVHCV中，HCV多聚蛋白編碼區(qū)被連接到痘苗病毒啟動子(pvacL)上。圖2的中細線代表pUC19主鏈。
根據(jù)Aizaki(1998)Hepatology 27621-627報道的HCV基因組序列，利用逆轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的聚合酶鏈反應(RT-PCR)，從HCV感染的病人血清中擴增得到HCV基因組的cDNA拷貝，之后克隆到質(zhì)粒pUC19中。為了構建質(zhì)粒pT7HCV，利用T7啟動子接尾引物和T7終止子接尾引物擴增HCV基因組RNA的cDNA，引物序列如下所示5’-TAATACGACTCACTATAGGGCCAGCCCCCTGATGGGGGCGACACTCC-3’(SEQ ID NO1)5’-CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGACATGATCTGCAGAGAGGCCAGTATCAG-3’(SEQ ID NO2)然后將PCR產(chǎn)物克隆到pUC19(Life Technology)中，得到質(zhì)粒pT7HCV。利用RT-PCR技術擴增HCV多聚蛋白編碼區(qū)的cDNA拷貝，并將其克隆到質(zhì)粒pVAC(圖3)中的痘苗病毒晚期啟動子下游，得到質(zhì)粒pVHCV。在該構建體中，為了更有利于帽結(jié)構依賴性翻譯的進行，最好刪去5’端非翻譯區(qū)。在pVAC質(zhì)粒中，痘苗病毒晚期啟動子(PvacL)側(cè)翼連接有多克隆位點區(qū)。圖3中的細線代表pUC19質(zhì)粒主鏈。
然后，在T25培養(yǎng)瓶中將10μg pT7HCV和10μg pVHCV與2ml加有2.5％胎牛血清的MEM培養(yǎng)基混合，借助DOTAP脂質(zhì)體(Boehringer Mannheim)，用這些質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HeLa細胞(106個)。轉(zhuǎn)染后4小時，棄去培養(yǎng)液，用加在含2.5％胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中vT7ΔD13L(107pfu)感染細胞。感染后2小時，棄去接種物并在含2.5％胎牛血清的MEM培養(yǎng)液中，于30℃和5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)細胞。培養(yǎng)48小時后，收集含有HCV顆粒的細胞培養(yǎng)物上清。
為了確定HCV的感染滴度，用含有1％胎牛血清的OPTI-MEMTM培養(yǎng)液對收集的細胞培養(yǎng)物上清進行系列10倍稀釋，然后將1ml稀釋的上清液加入到12孔培養(yǎng)板的各孔內(nèi)。各孔內(nèi)均接種有預培養(yǎng)的Huh7細胞(5×105個/孔)。培養(yǎng)24小時后棄去接種物，并換成1ml含10％胎牛血清的新鮮DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)1-2天后，收集細胞并抽提總RNA。利用RT-PCR技術擴增HCV 5’端非編碼區(qū)的300bp片段，以確定HCV RNA的負鏈。用于反轉(zhuǎn)錄的引物序列如下所示5’-ATGATGCACGGTCTACGAGAGACCTCCCGGGGC-3’(SEQ ID NO3)用于PCR擴增的引物序列如下所示5’-CCAGCCCCCTGATGGGGGCGACA-3’(SQE ID NO4)5’-ACTCGCAAGCACCTATCAGGCA-3’(SQE ID NO5)也可按下述方法產(chǎn)生含有HCV基因組RNA，但沒有T7終止子序列和poly(A)的HCV病毒顆粒首先，以HCV基因組RNA的cDNA作為模板，用T7終止子接尾引物(SEQ ID.NO2)和含有Mfe 1與Pac1酶切位點的T7終止子接尾引物進行PCR擴增。
含有Mfe 1和Pac1酶切位點的T7終止子接尾引物的序列如下所示5，-CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTACAATTGCCCCTTAATTAAGACACACATGATCTGCAGAGAGGCCAGTATCAG-3’(SQE ID NO6)下劃線部分為Mfe 1、Pac1的酶切位點。將此PCR產(chǎn)物插入到pUC19。然后用Mfe1和Pac1酶消化所得到的質(zhì)粒，并與發(fā)夾結(jié)構-核酶cDNA連接，如此得到質(zhì)粒pT7HCV-RIB(圖4)。在質(zhì)粒pT7HCV-RIB中，HCV基因組RNA的cDNA拷貝和相鄰的發(fā)夾結(jié)構-核酶序列兩側(cè)翼分別連接有噬菌體T7啟動子(PT7)和噬菌體T7終止子(TT7)。圖4中的細線代表pBR322質(zhì)粒的主鏈。
由下列兩條寡核苷酸雜交形成含發(fā)夾結(jié)構-核酶編碼序列的cDNA5’-TCCTCCAATTAAAGAACACAACCAGAGAAACACACGTTGTGGTATATTACCTGGTAC-3’(SQE ID NO7)5’-AATTGTACCAGGTAATATACCACAACGTGTGTTTCTCTGGTTGTGTTCTTTAATTGGAGGAAT-3’(SQE ID NO8)用質(zhì)粒pT7HCV-RIB和pVHCV共轉(zhuǎn)染細胞。然后用輔助重組痘病毒vT7ΔD13L感染已被轉(zhuǎn)染的細胞。輔助痘病毒重組體vT7ΔD13L中的D13L基因已按Falkner等人(美國專利5,770,212)所述的方法刪除。合成HCV-核酶-T7終止子-poly(A)RNA后，酶切產(chǎn)生只有兩個額外核苷酸GT，并在3′末端有2，3-環(huán)磷酸的HCV RNA。如此得到的病毒顆粒比含T7終止子和poly(A)尾部的HCV RNA具有稍高的感染性。實施例2感染性鼻病毒顆粒的生產(chǎn)本實施例舉例說明本發(fā)明的生產(chǎn)感染性鼻病毒顆粒的方法。
以質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和輔助痘苗病毒感染方法生產(chǎn)鼻病毒。使用本發(fā)明的方法，可在幾天內(nèi)得到高感染滴度的病毒原液。根據(jù)已報道的人鼻病毒14的基因組序列(Stanway et al.，1984，Nucleic Acids Res.127859-7875)，利用RT-PCR方法獲得包括70個核苷酸poly(A)長尾部的鼻病毒基因組的cDNA拷貝。然后將此cDNA克隆到質(zhì)粒pBR322中。從已克隆的鼻病毒cDNA構建兩個用于病毒生產(chǎn)的質(zhì)粒。
使用基于pUS19的質(zhì)粒pRHIN(圖5)表達鼻病毒的病毒蛋白。該質(zhì)粒中，在痘苗病毒晚期啟動子下游區(qū)插入了編碼多聚蛋白的ORF序列。
另一個pT7RHRIN(圖6)質(zhì)粒被用作合成鼻病毒基因組RNA的模板。為了構建pT7RHRIN，使用T7啟動子接尾引物和含有Mlu 1及Pac1酶切位點的T7終止子接尾引物擴增編碼鼻病毒基因組RNA的cDNA。T7啟動子接尾引物包含有Mlu 1與Pac1酶切位點的T7終止子接尾引物具有如下序列5’-TAATACGACTCACTATAGGTTAAAACTGGGTGTGGGTTGTTCCCAC-3’(SQE ID NO9)5’-CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATAACGCGTCCCCTTAATTAAGACACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’(SQE IDNO10)下劃線部分為Mlu 1和Pac1酶切位點。將此PCR產(chǎn)物克隆到pUC19中。用Mlu 1和Pac1酶消化所得到的質(zhì)粒，然后與發(fā)夾結(jié)構-核酶cDNA連接。下列兩條寡核苷酸引物被用于雜交以形成發(fā)夾結(jié)構-核酶cDNA5’-TCCTCCAATTAAAGAACTTTACCAGAGAAACACACGTTGTGGTATATTACCTGGTA-3’(SQE ID NO11)5’-CGCGTACCAGGTAATATACCACAACGTGTGTTTCTCTGGTAAAGTTCTTTAATTGGAGGAAT-3’(SQE ID NO12)所得到的pT7RHIN含有連接到發(fā)夾結(jié)構核酶cDNA(包括poly A尾部)上的病毒基因組RNA的cDNA拷貝。此鼻病毒-核酶編碼序列兩側(cè)翼分別連接有T7啟動和T7終止子。
為了生產(chǎn)鼻病毒顆粒，借助DOTAP脂質(zhì)體用10μg pRHIN和10μg pT7RHIN共轉(zhuǎn)染HeLa細胞(106個)，然后再用重組痘病毒vT7ΔD13L感染之。感染2小時后棄去接種物并換成含有2.5％胎牛血清的新鮮MEM培養(yǎng)基。30℃培養(yǎng)48小時后，收集含有鼻病毒顆粒的培養(yǎng)物上清。為了確定所得到的鼻病毒的感染滴度，用含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基對收集的細胞培養(yǎng)物上清進行系列10倍稀釋。然后取1ml稀釋的病毒加入到每孔含有預先培養(yǎng)的大約106個HeLa細胞的12孔培養(yǎng)板的各孔中。37℃培養(yǎng)2-3天后，計數(shù)噬菌斑的數(shù)目。
與天然鼻病毒RNA相比，重組產(chǎn)生的鼻病毒RNA包含有兩個額外的核苷酸并在3′末端有2′，3′-環(huán)磷酸。實施例3感染性A型流感病毒顆粒的生產(chǎn)本實施例舉例說明本發(fā)明的生產(chǎn)感染性A型流感病毒顆粒的方法。
以質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和其后的輔助痘苗病毒感染方法生產(chǎn)A型流感病毒。使用本發(fā)明方法，可在幾天內(nèi)得到高感染滴度的病毒原液。根據(jù)已報道的人流感病毒A/PR/8/34的RNA片段序列(如參見Fields et al.，1982，Cell 28303-313；Fields et al.，1981，Nature 290213-217；Winter et al.，1982，Nucleic Acids Res.102135-2143；Winter et al.，1981，Nature 29272-75；Winter et al.，1981，Virology 114423-428；Winter et al.，1981，Nuceic Acids Res.81965-1974；Baez et al.，1980，Nucleic Acids Res.85845-5858)設計引物，并利用RT-PCR技術獲得8個RNA片段的cDNA拷貝。然后將各個cDNA分別克隆到質(zhì)粒pUC19中。從克隆的流感病毒cDNA構建兩種類型的用于生產(chǎn)病毒顆粒的質(zhì)粒。一個用于表達病毒蛋白。使用上述片段構建pINF1-8、pINF2-7、pINF3-6和pINF4-5四個質(zhì)粒。每個質(zhì)粒都有兩個處于痘苗病毒晚期啟動子控制下的病毒蛋白表達盒(圖7)。
pINF1-8包含PB2和NS的ORF，pINF2-7包含PB1和M的ORF，pINF3-6包含PA和NA的ORF，pINF4-5包含HA和NP的ORF。另一類型的質(zhì)粒用于表達基因組RNA片段。構建基于pUC19的下列八個質(zhì)粒pT7INF1、pT7INF2、pT7INF3、pT7INF4、pT7INF5、pT7INF6、pT7INF7和pT7INF8。每個質(zhì)粒都攜帶一個用于轉(zhuǎn)錄上述各病毒基因組RNA片段的轉(zhuǎn)錄單元。在各轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)，基因組RNA的cDNA拷貝都位于T7啟動子和T7終止子之間，以這種方向插入便可借助T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄這些cDNA，以產(chǎn)生基因組(負鏈)RNA。發(fā)夾結(jié)構-核酶cDNA被插入在基因組RNA的cDNA拷貝和T7終止子之間(圖8)。
為了構建pT7INF1、pT7INF2、pT7INF3、pT7INF4、pT7INF5、pT7INF6、pT7INF7和pT7INF8這八個質(zhì)粒，以八個T7啟動子接尾引物和八個含有Mlu1與Pac1酶切位點的T7終止子接尾引物擴增每個基因組RNA片段的cDNA。用于擴增片段1的T7啟動子接尾引物和T7終止子標記引物如序列下所示5’-TAATACGACTCACTATAGGAGCGAAAGCAGGTCAATTATATTCAA-3’(SQE ID NO13)5’-CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTAGCTACGCGTCCCCTTAATTAAGACACAGTAGAAACAAGGTCGTTTTTAAAC-3’(SQE IDNO14)劃下線部分顯示Mlu1和Pac1酶切位點。
用于擴增片段2的T7啟動子接尾引物和T7終止子接尾引物具有下示序列5’-TAATACGACTCACTATAGGAGCGAAAAGCAGGCAAACCATTTGAATGGAT-3，(SQE ID NO15)5’-CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTACGCGTCCCCTTAATTAAGACACAGTAGGAACAAGGCATTTTTTCATG-3’(SQE IDNO16)用于擴增片段3的T7啟動子接尾引物和T7終止子接尾引物具有下示序列5’-TAATACGACTCACTATAGGAGCGAAAGCAGGTACTGATCCAAAATGG-3’(SQE ID NO17)5’-CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTACGCGTCCCCTTAATTAAGACACAGTAGAAACAAGGTACTTTTTTG-3’(SQE ID NO18)用于擴增片段4的T7啟動子接尾引物和T7終止子接尾引物具有下示序列5’-TAATACGACTCACTATAGGAGCGAAAAGCAGGGGAAAATAAAAACAA-3’(SQE ID NO19)5’-CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTACGCGTCCCCTTAATTAAGACACAGTAGAAACAAGGGTGTTTTTCC-3’(SQE IDNO20)用于擴增片段5的T7啟動子接尾引物和T7終止子接尾引物的序列如下所示5’-TAATACGACTCACTATAGGAGCAAAAGCAGGGTAGAATATCACTCACTG-3’(SQE ID NO21)5’-CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTACGCGTCCCCTTAATTAAAGACACAGTAGAAACAAGGGTATTTTTCTTTAATTG-3’(SQE ID NO22)用于擴增片段6的T7啟動子接尾引物和T7終止子接尾引物的序列如下所示5’-TAATACGACTCACTATAGGAGCGAAAGCAGGGGTTTAAAATGAATCC-3’(SQE ID NO23)5’-CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTACGCGTCCCCTTAATTAAGACACAGTAGAAACAAGGAGTTTTTTGAAC-3’(SQE IDNO24)用于擴增片段7的T7啟動子接尾引物和T7終止子接尾引物具有下示序列
5’-TAATACGACTCACTATAGGAGCGAAAGCAGGTAGATATTGAAAGATGA-3’(SQE ID NO25)5’-CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTACGCGTCCCCTTAATTAAGACACAGTAGAAACAAGGTAGTTTTTTTTTACTCC-3’(SQEID NO26)用于擴增片段8的T7啟動子接尾引物和T7終止子接尾引物具有下示序列5’-TAATACGACTCACTATAGGAGCAAAAGCAGGGTGACAAAGACATAATG-3’(SQE ID NO27)5’-CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTACGCGTCCCCTTAATTAAGACACAGTAGAAACAAGGGTGTTTTTTATTATT-3’(SQEID NO28)將所得到的PCR產(chǎn)物克隆到pUC19中。然后用Mlu 1和Pac1酶消化所得到的質(zhì)粒，并與發(fā)夾結(jié)構-核酶cDNA相連接。使用下示兩條寡核苷酸引物進行序列雜交，以形成發(fā)夾結(jié)構-核酶cDNA5’-TCCTCCAATTAAAGAACagtACCAGAGAAACACACGTTGTGGTATATTACCT3GGTA-3’(SQE ID NO29)5’-CGCGTACCAGGTAATATACCACAACGTGTGTTTCTCTGGTactGTTCTTTAATTGGAGGAAT-3’(SQE ID NO30)所得到的八個質(zhì)粒pT7INF1、pT7INF2、pT7INF3、pT7INF4、pT7INF5、pT7INF6、pT7INF7和pT7INF8各包含一個編碼基因組RNA片段的cDNA。將cDNA連接到發(fā)夾結(jié)構-核酶編碼序列上，得到兩側(cè)翼分別連接有T7啟動子和T7終止子的編碼RNA片段-核酶的cDNA。
為了生產(chǎn)流感病毒顆粒，借助DOTAP(Boehringer Mannheim)，使用各5μg pINF1至pINF8共轉(zhuǎn)染T25培養(yǎng)瓶中的HeLa細胞(106個)，然后再用重組痘病毒vT7ΔD13L感染這些細胞。感染2小時后，棄去接種物并換成含有2.5％胎牛血清的新鮮MEM培養(yǎng)基。30℃保溫48小時后，收集含有A型流感病毒顆粒的培養(yǎng)物上清。為了確定流感病毒的感染滴度，用含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基對收集到的細胞培養(yǎng)物上清進行系列10倍稀釋。然后取1ml稀釋的病毒加入到每孔含有約106個預培養(yǎng)的MDCK細胞(Madin-Darby狗腎細胞)的12孔平板各孔中。保溫后計數(shù)噬菌斑的數(shù)目。
與野生型流感病毒RNA相比，按本發(fā)明方法重組產(chǎn)生的流感病毒RNA片段包含兩個額外的核苷酸并在3’末端有2’，3’-羥基磷酸。實施例4HIV-1衍生的載體顆粒的生產(chǎn)本實施例舉例說明本發(fā)明的生產(chǎn)HIV-1載體顆粒的方法。
根據(jù)HIV-1 HXB2病毒株(Wong-Staal et.al.(1985)Nature 313277-284)和水泡性口腔炎病毒G糖蛋白(VSV-G)(Rose and Bergmann(1983)Cell 34513-524)的序列數(shù)據(jù)，構建三個用于生產(chǎn)了HIV-1載體顆粒的質(zhì)粒。用于表達HIV-I HXB2 gag-pol的質(zhì)粒pGAG-POL(圖9)含有被克隆在痘苗病毒7.5早/晚期啟動子和痘苗病毒終止子之間的gag-pol的編碼區(qū)。另一個質(zhì)粒pVSV-G(圖10)含有克隆到T7質(zhì)粒的啟動子和終止子之間的VSV-G編碼區(qū)(Rose and Bergmann(1983)Cell 34513-524)。在痘苗病毒感染的細胞中，由于只有10％借助T7 RNA聚合酶在胞質(zhì)中合成的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物帶有帽結(jié)構并因此而被順利翻譯，所以利用T7 RNA聚合酶表達VSV-G被膜糖蛋白可避免在細胞表面積聚過多的被膜糖蛋白。VSV-G的過度表達可引起群體細胞間的融合并在細胞中產(chǎn)生毒性。這些影響將減少載體顆粒的產(chǎn)量。第三個質(zhì)粒pT7EGFP(圖11)被用作合成載體RNA分子的模板。該RNA分子包括HIV-1 5’長末端重復序列(5’CTR)，其后是包裝信號序列和利于增強綠色熒光蛋白的CMV啟動子控制的轉(zhuǎn)錄單元，再后面是多聚嘌呤序列段和3’LTR。在反轉(zhuǎn)錄過程中，由于3’U3和3’R之間已經(jīng)有三聯(lián)G與強終止DNA之3’末端的三聯(lián)C相配對，所以不需要再插入三聯(lián)G。將此載體RNA分子的DNA拷貝克隆到T7啟動子和T7終止子之間，得到質(zhì)粒pT7EGFP。
為了生產(chǎn)HIV-1衍生的載體顆粒，借助DOTAP(Boehringer Mannheim)脂質(zhì)體，用懸浮于4ml含有2.5％胎牛血清的MEM中的10μg pGAG-POL、10μg pVSVG和10μgpT7EGFP共轉(zhuǎn)染HeLa細胞(106個)。感染4小時后，再用純化的輔助痘苗病毒重組體vT7ΔD13L(107pfu)感染細胞。感染2小時后棄去接種物并換成含10％胎牛血清的新鮮DMEM培養(yǎng)基以培養(yǎng)細胞。培養(yǎng)48小時后，收集含病毒載體顆粒的培養(yǎng)物上清。為了確定載體的滴度，對收集的細胞培養(yǎng)物上清進行系列10倍稀釋，然后將1ml稀釋的載體加入到每孔含有約105個預培養(yǎng)的HeLa細胞的12孔平板的各孔中。24小時后，使用熒光顯微鏡計數(shù)發(fā)出綠色熒光的細胞。
雖然上文已描述了本發(fā)明的許多實施方案，但應明確的是，在不背離本發(fā)明的精神和原則前提下，對本發(fā)明所作的各種改動和改變均將落入本發(fā)明的待批權利要求范圍內(nèi)。
序列表5’-AAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTGGAATATAAATA-3’(SEQ ID NO1)5’-CATAGTATCGATTACACCTCTACCG-3’(SEQ ID NO2)5’-GAGAGGTTTTCTACTTGCTCATTAG-3’(SEQ ID NO3)5’-AAAAGTAGAAAAAATATTTTTTTTTTTGAGATTAAATA-3’(SEQ ID NO4)5’-TTAATTGTTGTCGCCCATAATCTTGGTAATACTTACCCC-3’(SEQ ID NO5)5’-ATGAATAATACTATCATTAATTCTTTG-3’(SEQ ID NO6)5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGGATTTAAATA-3’(SEQ ID NO7)5’-TAATACGACTCACTATAGGGCCAGCCCCCTGATGGGGGCGACACTCC-3’(SEQ ID NO8)5’-CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGACATGATCTGCAGAGAGGCCAGTATCAG-3’(SEQ ID NO9)5’-ATGATGCACGGTCTACGAGACCTCCCGGGGC-3’(SEQ ID NO10)5’-CCAGCCCCCTGATGGGGGCGACGA-3’(SEQ ID NO11)5’-ACTCGCAAGCACCCTATCAGGCA-3’(SEQ ID NO12)5’-GCGCCAGTCCTCCGATTGACTGAG-3’(SEQ ID NO13)5’-CGGCCCCCGAAGTCCCTGGGACG-3’(SEQ ID NO14)
權利要求
1.生產(chǎn)包殼RNA病毒的方法，其包括以下步驟(a)提供能夠在真核細胞中形式衣殼并包裝RNA病毒基因組的多肽編碼序列；(b)提供包括可操作地連接到噬菌體啟動子和噬菌體轉(zhuǎn)錄終止子序列上的病毒RNA病毒基因組序列的構建體，其中噬菌體啟動子和噬菌體轉(zhuǎn)錄終止序列是可操作地匹配的；(c)提供與步驟(b)的噬菌體啟動子可操作地匹配的噬菌體RNA聚合酶編碼序列，其中所說的編碼序列被可操作地連接到痘病毒啟動子上；(d)在允許序列表達并組裝包含RNA病毒基因組序列的衣殼的條件下，在真核細胞中共同表達步驟(a)的多肽、步驟(b)的RNA病毒基因組序列以及步驟(c)的噬菌體RNA聚合酶編碼序列，從而制得包殼的RNA病毒。
2.權利要求1的方法，其中真核細胞是動物細胞。
3.權利要求1的方法，其中所說的動物細胞是哺乳動物細胞。
4.權利要求1的方法，其中哺乳動物細胞是人細胞。
5.權利要求1的方法，其中編碼衣殼形成多肽的基因被克隆到質(zhì)粒或病毒載體中。
6.權利要求1的方法，其中步驟(a)的編碼序列被操作地連接到在動物細胞胞質(zhì)中有活性的啟動子上。
7.權利要求1的方法，其中RNA病毒基因組序列包括內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)。
8.權利要求1的方法，其中所說的內(nèi)部核糖體進入位點是肝炎病毒內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)。
9.權利要求1的方法，其中含有RNA病毒基因組序列的構建體包括質(zhì)粒或病毒載體。
10.權利要求1的方法，其中所說的噬菌體選自于T3噬菌體，T7噬菌體和SP6噬菌體。
11.權利要求1的方法，其中T3噬菌體RNA聚合酶的表達是由T3噬菌體啟動子驅(qū)動的，T7噬菌體RNA聚合酶的表達是由T7噬菌體啟動子驅(qū)動的，并且SP6噬菌體RNA聚合酶的表達是由SP6噬菌體啟動子驅(qū)動的。
12.權利要求1的方法，其中構建體包括T3噬菌體轉(zhuǎn)錄終止序列和T3噬菌體啟動子，T7噬菌體轉(zhuǎn)錄終止序列和T7噬菌體啟動子，以及SP6噬菌體轉(zhuǎn)錄終止序列和SP6噬菌體啟動子。
13.權利要求3的方法，其中所說的在動物細胞胞質(zhì)中有活性的啟動子是衍生于痘病毒科病毒的序動子。
14.權利要求13的方法，其中痘病毒科的病毒是正痘病毒屬的病毒。
15.權利要求14的方法，其中正痘病毒屬的病毒是痘苗病毒。
16.權利要求15的方法，其中痘苗病毒啟動子是痘苗病毒晚期啟動子。
17.權利要求1的方法，其中痘病毒是正痘病毒屬的病毒。
18.權利要求17的方法，其中正痘病毒屬的痘病毒是痘苗病毒。
19.權利要求1的方法，其中痘病毒是選下列一組病毒屬的病毒；付痘病毒屬、禽痘病毒屬、山羊病毒屬、亞塔痘病毒屬、野兔痘病毒屬、豬痘病毒屬和軟尤痘病毒屬的病毒。
20.權利要求1的方法，其中所說真核細胞胞質(zhì)包含真核細胞。
21.權利要求1的方法，其中真核細胞胞質(zhì)包含體外制劑。
22.權利要求1的方法，其中RNA病毒是包含RNA基因組的肝炎病毒。
23.權利要求22的方法，其中RNA病毒是丙型肝炎病毒。
24.權利要求22的方法，其中RNA病毒是不成熟的乙型肝炎病毒。
25.權利要求22的方法，其中RNA病毒是甲型肝炎病毒。
26.權利要求1的方法，其中RNA病毒是慢病毒。
27.權利要求1的方法，其中RNA病毒是鼻病毒。
28.權利要求1的方法，其中RNA病毒是流感病毒。
29.權利要求1的方法，其中RNA病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)。
30.權利要求29的方法，其中人免疫缺陷病毒(HIV)是HIV-1。
31.權利要求30的方法，其中人免疫缺陷病毒缺少Rev反應元件或被膜序列。
32.權利要求1的方法，其中RNA病毒是選自下列一組的病毒腺病毒、LCMV、付流感病毒、呼腸孤病毒、輪狀病毒、星狀病毒、絲狀病毒和冠狀病毒。
33.權利要求1的方法，其中噬菌體RNA聚合酶被克隆到復制缺陷型痘病毒中。
34.權利要求1的方法，其中包殼RNA病毒是感染性的。
35.權利要求1的方法，其中包殼RNA病毒是非感染性的。
36.權利要求1的方法，其中所說的方法產(chǎn)生的制備物99％是沒有復制能力的痘病毒。
37.權利要求36的方法，其中所說的方法產(chǎn)生的制備物100％是沒有復制能力的痘病毒。
38.權利要求1的方法，其中復制缺陷型痘病毒缺少制造病毒復制所必需的多肽的能力。
39.權利要求38的方法，其中病毒復制所必需的多肽是病毒衣殼多肽。
40.權利要求1的方法，其中復制缺陷型痘病毒的缺陷在于轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)缺陷。
41.權利要求1的方法，其中步驟(a)的一個、幾個或所有的多肽編碼序列被摻入到步驟(b)的RNA病毒基因組序列中，并且所說的構建體進一步包括內(nèi)部核糖體進入位點(IRER)。
42.生產(chǎn)包殼RNA病毒的系統(tǒng)，其包括下列成分(a)多肽編碼序列，其中所說的多肽能包裝RNA病毒基因組序列，并且各編碼序列均被克隆到構建體中，從而使之可操作地連接到啟動子上；(b)包含與噬菌體啟動子及噬菌體轉(zhuǎn)錄終止序列可操作地連接的RNA病毒基因組序列的構建體，其中所說的RNA病毒基因組序列能夠被步驟(a)的多肽包裝到衣殼內(nèi)；(c)與步驟(b)的噬菌體啟動子可操作地配合的噬菌體RNA聚合酶的編碼序列，其中所說的編碼序列可操作地連接到痘病毒啟動子上；其中在允許編碼序列表達并組裝包含RNA病毒基因組序列的衣殼的條件下，在真核細胞胞質(zhì)中共同表達步驟(a)的多肽，步驟(b)的RNA病毒基因組序列及步驟(c)的噬菌體RNA聚合酶編碼序列；以產(chǎn)生包殼RNA病毒。
43.權利要求42的系統(tǒng)，其中真核細胞是動物細胞。
44.權利要求43的系統(tǒng)，其中動物細胞是哺乳動物細胞。
45.權利要求44的系統(tǒng)，其中哺乳動物細胞是人細胞。
46.權利要求42的系統(tǒng)，其中編碼衣殼形成多肽的基因被克隆到質(zhì)?；虿《据d體中。
47.權利要求42的系統(tǒng)，其中步驟(a)的一個、幾個或所有的多肽編碼序列被摻入到步驟(b)的RNA病毒基因組序列中并且所說的構建體進一步包括內(nèi)部核糖體進入序列(IRES)。
48.權利要求42的系統(tǒng)，其中所說的噬菌體RNA聚合酶的編碼序列被克隆到復制缺陷痘病毒中。
49.權利要求42的系統(tǒng)，其中包殼RNA病毒是感染性的。
50.權利要求42的系統(tǒng)，其中包殼RNA病毒是非感染性的。
51.權利要求42的系統(tǒng)，其中所說的方法產(chǎn)生的制備物99％是沒有復制能力的痘病毒。
52.權利要求51的系統(tǒng)，其中所說的方法產(chǎn)生的制備物100％是沒有復制能力的痘病毒。
53.權利要求42的系統(tǒng)，其中所說的噬菌體啟動子被克隆到復制缺陷型痘病毒中。
54.包含RNA基因組序列并在其3’末端有2’，3’-環(huán)磷酸的重組病毒基因組序列。
55.包含RNA基因組序列及其3’末端有2’，3’-環(huán)磷酸的重組病毒顆粒。
56.包含RNA基因組序列和噬菌體RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄終止子序列及其3’末端poly(A)序列的重組病毒基因組序列。
57.包含RNA基因組序列和噬菌體RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄終止子序列及其3’末端poly(A)序列的重組病毒顆粒。
58.缺少Rev反應元件(RRE)或被膜序列并包含噬菌體RNA聚合酶的終止子序列的重組慢病毒基因組序列。
59.包含有缺少Rev反應元件(RRE)或被膜序列，并包含有噬菌體RNA聚合酶終止子序列的重組慢病毒顆粒。
全文摘要
本發(fā)明提供使用無復制能力的輔助痘病毒重組體在細胞培養(yǎng)物中以及體外生產(chǎn)RNA病毒序列、重組RNA病毒、RNA病毒突變體和RNA病毒衍生的載體的方法。這些方法允許不依賴于其天然復制途徑并避開任何細胞屏障，在細胞培養(yǎng)物中以及體外產(chǎn)生RNA病毒序列和病毒顆粒。本發(fā)明還提供按本發(fā)明方法制得的新的RNA病毒序列和病毒顆粒。
文檔編號C12N15/83GK1418951SQ0111974
公開日2003年5月21日 申請日期2001年5月23日 優(yōu)先權日2001年5月23日
發(fā)明者馮愈, 唐恒立 申請人:廣州綠健生物技術有限公司