專利名稱：基于硫代修飾的連接酶非依賴性基因克隆方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新的基因克隆方法，尤其涉及一種基于硫代修飾的連接酶非依賴性基因克隆方法，可以用于重組蛋白表達載體構建，屬于基因工程技術領域。
背景技術：
基因克隆技術的出現(xiàn)極大地促進了現(xiàn)代基因工程、蛋白質工程的發(fā)展。傳統(tǒng)基因克隆技術涉及目標基因DNA片段與質粒載體的限制性核酸內切酶消化、連接酶連接環(huán)化目標基因與質粒兩步必不可少的操作。由于限制性核酸內切酶消化反應與DNA連接酶反應，特別是限制性核酸內切酶消化反應，效率的高低直接決定著目標基因克隆能否成功。雖然利用堿性磷酸單酯酶除去線性化載體的5’磷酸基團，會大大提高陽性克隆百分比，但該操作異常繁瑣，手法難于掌握，經(jīng)常起不到應有作用。為了克服常規(guī)基因克隆方法的缺陷，開發(fā)了連接酶非依賴性克隆方法。其中基于T4DNA聚合酶的連接酶非依賴性克隆方法是其中的一種方法(Nucleic Acids Research，Vol.18，No.20p6069-6074)，該方法通過在擴增目標基因的引物5’端添加一段特殊的堿基序列(一般為12-15個堿基)，該段特殊堿基序列的3’端最后一個堿基是此段序列中唯一的一個該種堿基(例如dG)，在dCTP的存在下目標基因與線性質粒載體與T4DNA聚合酶一起溫育，產生長的5’單鏈突出端，帶有5’單鏈突出端的目標基因與線性質粒載體互補配對后，轉化大腸桿菌修復目標基因與線性質粒載體間的缺口，完成目標基因的克隆。該方法操作缺點主要有1)需要在目標基因與線性質粒載體的5’端引入一段特定的堿基序列，導致克隆的目標基因的兩端附加了一段人為的堿基序列；2)引入的一段特定堿基序列有時較難設計，造成目標基因克隆困難。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有基因克隆技術的不足，提供一種新的連接酶非依賴性基因克隆方法，這種基因克隆技術不需要限制性核酸內切酶消化與連接酶反應，使得基因克隆操作簡便、克隆效率與通量大大提高，可用于大規(guī)?；蚩寺　?br> 為實現(xiàn)這樣的目的，在本發(fā)明中，用于擴增目標基因與質粒載體的引物片段(寡核苷酸片斷)具有如下特征引物5’端第11-21位間的某一磷酸二酯鍵為硫代修飾；擴增目標基因的正向引物5’端的第1位至硫代修飾上游第2位間的連續(xù)堿基序列與擴增載體的反向引物5’端的第1位至硫代修飾上游第2位間的連續(xù)堿基序列互補配對，擴增目標基因的反向引物5’端的第1位至硫代修飾上游第2位間的連續(xù)堿基序列與擴增載體的正向引物5’端的第1位至硫代修飾上游第2位間的連續(xù)堿基序列互補配對；正向引物與反向引物擴增目標基因與質粒載體，然后用限制性內切核酸酶Dpn I消化環(huán)形質粒模板，最后純化PCR產物，如此制備的DNA片段5’端第11-21位間含有一處硫代修飾。5’外切核酸酶從雙鏈DNA的5’端降解DNA鏈，用其消化PCR擴增的目標基因與線性化質粒載體DNA分子，會產生3’單鏈突出端，硫代修飾的存在使得5’外切核酸酶在消化DNA過程中會終止在硫代修飾處，從而產生長10-20個核苷酸的3’單鏈突出端。由于目標基因與質粒載體的3’突出端堿基序列互補配對，二者形成穩(wěn)定的完全配對雙鏈，不需要進行DNA連接反應，可以直接轉化大腸桿菌。轉化后，大腸桿菌DNA修復系統(tǒng)可以修復目標基因與質粒載體間的DNA缺口，形成完整的含有目標基因的重組DNA分子。
本發(fā)明的具體步驟如下1、設計合成用于擴增目標基因與質粒載體的引物序列。引物的序列特征是(1)5’端第11-21位間的某一磷酸基團為硫代修飾；(2)擴增目標基因的正向引物的5’端第1位至硫代修飾上游第2位間的連續(xù)堿基序列與擴增質粒載體的反向引物的5’端第1位至硫代修飾上游第2位間的連續(xù)堿基序列互補配對，擴增目標基因的反向引物的5’端第1位至硫代修飾上游第2位間的連續(xù)堿基序列與擴增質粒載體的正向引物的5’端第1位至硫代修飾上游第2位間的連續(xù)堿基序列互補配對；(3)3’端下游堿基序列與待擴增DNA片段兩端堿基序列配對。
2、聚合酶鏈式反應(PCR)擴增目標基因與線性化質粒載體DNA片段。將用于擴增DNA片段(目標基因與質粒載體)的正向引物與反向引物、目標核酸模板分子(含目標基因的基因組DNA或質粒載體DNA)、高忠實度耐高溫DNA聚合酶(例如pfu DNA聚合酶)、4種脫氧核苷三磷酸(dNTPs)加入PCR反應緩沖液，進行反應。PCR條件同一般的液相聚合酶鏈式反應。
3、純化擴增的目標基因與線性化質粒載體DNA片段。對擴增的線性化質粒載體PCR產物，先用限制性核酸內切酶Dpn I(其特異性識別切割雙鏈DNA中A甲基化的GmATC序列)消化質粒模板，由于質粒模板具有多處GmATC序列，DpnI處理使得質粒模板變成很多段短的DNA雙鏈，這些短的DNA雙鏈轉化大腸桿菌不能夠產生克隆，從而消除了野生型質粒模板產生的假陽性克隆，回收經(jīng)Dpn I處理的線性化質粒載體以及目標基因的擴增產物。
4、利用5’外切核酸酶(例如λ外切核酸酶與T7基因6蛋白)消化PCR擴增的目標基因與線性化質粒載體DNA片斷。5’外切核酸酶特異性從5’端水解雙連DNA中帶有5’磷酸基團的DNA鏈。用5’外切核酸酶消化制備的目標基因與線性化質粒載體DNA片斷2-5分鐘。5’外切核酸酶消化和硫代修飾(阻礙核酸酶消化)的存在使得DNA片段的兩端產生長為10-20個核苷酸的3’突出端。
5、5’外切核酸酶處理的目標基因與線性化質粒載體DNA片斷間的雜交配對。將5’外切核酸酶消化的兩種DNA片斷混合后，室溫放置15分鐘，使二者的3’突出端雜交配對，形成含目標基因的帶缺口重組質粒。
6、含目標基因的帶缺口重組質粒轉化大腸桿菌。雜交混合物(該混合物中含有含目標基因的帶缺口重組質粒)轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，在固體培養(yǎng)基上37度培養(yǎng)過夜。在大腸桿菌的繁殖過程中，帶缺口重組質粒中目標基因與質粒載體間的缺口會被修復，形成含目標基因的完整重組質粒。
7、含目標基因的完整重組質粒的鑒定。挑取單菌落，利用擴增目標基因的引物與Taq DNA聚合酶進行菌落PCR，鑒定含目標基因的完整重組質粒的陽性克隆。培養(yǎng)陽性克隆，并抽提含目標基因的完整重組質粒DNA。
本發(fā)明與現(xiàn)有的基因克隆技術相比有顯著的進步。主要優(yōu)點如下(1)含有目標基因的陽性克隆率高。由于采用PCR擴增質粒載體，消除了限制性核酸內切酶消化質粒造成的假陽性克隆(不含目標基因的質粒載體)，從而極大地提高了陽性克隆比例。(2)操作通量大，適宜于多個目標基因同時克隆?；诹虼揎椀倪B接酶非依賴性基因克降方法在整個操作過程中不需要特異性的限制性核酸內切酶，操作統(tǒng)一僅需要外切核酸酶消化生成長粘性末端，因此可以簡單的擴大克隆通量，進行大規(guī)?；蚩寺　?3)插入目標基因兩端用于與載體互補的堿基序列隨意。硫代修飾的存在保證了各種5’外切核酸酶消化反應能夠有效地終止在硫代修飾處，使得3’突出端可以隨意設計，大大方便了操作。(4)目標基因PCR擴增忠實性高。由于硫代修飾不影響各種DNA聚合酶催化的PCR反應，因此可以采用忠實性最高的pfu DNA聚合酶擴增目標基因，降低在PCR中引入突變的頻率。此優(yōu)點在構建目標基因(特別是長基因)的表達克隆中優(yōu)勢尤為明顯，可以保證構建的表達載體能夠表達出正確的重組蛋白。
本發(fā)明可用于基因克隆，基因片段拼接、目標基因定點突變等領域。目標基因與質粒載體無需限制性核酸內切酶消化，因此可以大大降低假陽性克隆(空質粒)百分比，提高目標基因克隆成功率。


圖1為本發(fā)明基于硫代修飾引物與5’外切核酸酶消化的連接酶非依賴性基因克隆方法的原理圖。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發(fā)明的技術方案作進一步詳細描述。以下實施例不構成對本發(fā)明的限定。
本發(fā)明方法如圖1所示，首先利用5’端第11-21位間某一磷酸二酯鍵是硫代修飾的引物片段分別擴增目標基因與質粒載體，獲得5’端第11-21位間某一磷酸二酯鍵是硫代修飾的目標基因與線性化質粒載體的DNA片段；然后利用5’外切核酸酶消化制備的DNA分子，硫代修飾的存在使得5’外切核酸酶在消化DNA過程中會終止在硫代修飾處，從而產生長10-20個核苷酸的3’單鏈突出端；由于目標基因與線性化質粒載體的3’單鏈突出端互補配對，二者混合雜交會形成含目標基因的帶缺口重組質粒；該質粒轉化大腸桿菌后，目標基因與質粒載體間的缺口會被大腸桿菌修復好，形成含目標基因的完整重組質粒，從而完成目標基因的克隆。
本發(fā)明一個實施例中的目標基因是衣原體內切核酸酶IV基因，要將其克隆到pUC18載體，使用的5’外切核酸酶為T7基因6蛋白，硫代修飾存在于引物5’端第15位的磷酸二酯鍵，具體實施步驟如下第一步，設計合成用于擴增衣原體內切核酸酶IV基因與pUC18質粒的引物序列。4條引物分別為pUC-18-U-F、pUC-18-U-R、CpendoIV-F、CpendoIV-R。其中pUC-18-U-F與pUC-18-U-R用于擴增pUC18質粒載體，CpendoIV-F、CpendoIV-R用于擴增衣原體內切核酸酶IV基因。4條引物堿基序列如下pUC-18-U-F5’ATCACCACCATTGAg-aagcttggcactggccgtcgpUC-18-U-R5’ACCAGGCCGCTGCTg-gaattcgtaatcatggtcatagCpendoIV-F5’AGCAGCGGCCTGGTc-atatgaaagtacttcctcctccctcCpendoIV-R5’TCAATGGTGGTGATg-ctaactatctctgttttttgaaaac其中，符號-表示硫代修飾，小寫字母堿基序列與擴增DNA片斷互補配對，大寫字母堿基為目標基因與線性化質粒載體互補配對區(qū)。引物可以自己利用DNA合成儀合成或由各DNA合成公司合成。
第二步，聚合酶鏈式反應(PCR)擴增衣原體內切核酸酶IV基因與線性化pUC18質粒載體DNA片段。PCR反應組成(50微升反應體積)正向引物與反向引物，0.5μM；DNA模板(100納克衣原體基因組DNA，或10納克pUC18質粒載體DNA)；pfu DNA聚合酶，2.5個單位；dNTPs，200μM；1×PCR反應緩沖液。PCR反應條件95℃×5分鐘；(95℃×30秒，65℃×30秒，72℃×4分鐘)×20個循環(huán)；72℃×10分鐘。
第三步，純化衣原體內切核酸酶IV基因與線性化pUC18質粒載體PCR擴增產物。衣原體內切核酸酶IV基因擴增產物直接用PCR產物純化試劑盒純化。由于線性化pUC18質粒載體PCR擴增產物中含有環(huán)狀的pUC18質粒模板，可以利用限制性核酸內切酶Dpn I處理PCR產物，將pUC18質粒模板消化成短的DNA片斷，再利用PCR產物純化試劑盒純化Dpn I處理的線性化pUC18質粒載體PCR擴增片段。Dpn I特異性識別切割雙鏈DNA中A甲基化的GmATC序列，由于質粒模板具有多處GmATC序列，Dpn I處理把質粒模板變成很多段短的DNA雙鏈，這些短的DNA雙鏈轉化大腸桿菌時不能夠產生克隆，從而消除了野生型質粒模板產生的假陽性克隆。Dpn I處理與PCR產物純化試劑盒操作按產品操作說明進行。
擴增的衣原體內切核酸酶IV基因堿基序列如下，其中省略號代表衣原體內切核酸酶IV基因中間的堿基序列，符號-表示硫代修飾5’AGCAGCGGCCTGGTc-atatgaaagtacttcctcctccctc..............
TCGTCGCCGGACCAg tatactttcatgaaggaggagggag..............
..............gttttcaaaaaacagagatagttag cATCACCACCATTGA..............caaaagttttttgtctctatcaatc-gTAGTGGTGGTAACT5’擴增的線性化pUC18質粒載體堿基序列如下，其中省略號代表線性化pUC18質粒載體中間的堿基序列，符號-表示硫代修飾5’ATCACCACCATTGAg-aagcttggcactggccgtcg...................
TAGTGGTGGTAACTc ttcgaaccgtgaccggcagc...................
.............ctatgaccatgattacgaattc cAGCAGCGGCCTGGT.............gatactggtactaatgcttaag-gTCGTCGCCGGACCA 5’第四步，利用T7基因6蛋白消化衣原體內切核酸酶IV基因與線性化pUC18質粒載體的PCR擴增的DNA片斷。
將純化的衣原體內切核酸酶IV基因與線性化pUC18質粒載體的PCR擴增片斷進行T7基因6蛋白消化處理，由于硫代修飾會將T7基因6蛋白消化反應終止在硫代修飾位置(5’端第十五位磷酸二酯鍵)，因此可以產生長為14個核苷酸的3’突出端。T7基因6蛋白消化反應組成(50微升反應體積)1個單位的T7基因6蛋白，1個皮克摩爾的衣原體內切核酸酶IV基因或線性化pUC18質粒載體DNA片斷，1×T7基因6蛋白反應緩沖液。反應條件37度溫育5分鐘，70度處理15分鐘失活T7基因6蛋白。
T7基因6蛋白消化后的衣原體內切核酸酶IV基因堿基序列如下，其中省略號代表衣原體內切核酸酶IV基因中間的堿基序列，符號-表示硫代修飾5’c-atatgaaagtacttcctcctccctc.............
TCGTCGCCGGACCAg tatactttcatgaaggaggagggag.............
.............gttttcaaaaaacagagatagttag cATCACCACCATTGA.............caaaagttttttgtctctatcaatc-g 5’T7基因6蛋白消化后的線性化pUC18質粒載體堿基序列如下，其中省略號代表線性化pUC18質粒載體中間的堿基序列，符號-表示硫代修飾5’g-aagcttggcactggccgtcg...................
TAGTGGTGGTAACTc ttcgaaccgtgaccggcagc...................
...................ctatgaccatgattacgaattc cAGCAGCGGCCTGGT...................gatactggtactaatgcttaag-g 5’第五步，T7基因6蛋白處理過的衣原體內切核酸酶IV基因片段與線性化pUC18質粒載體DNA片斷互補配對。將T7基因6蛋白消化后的衣原體內切核酸酶IV基因片段與線性化pUC18質粒載體片斷等摩爾(各0.1個皮克摩爾)混合于1×T7基因6蛋白反應緩沖液，室溫或冰上放置15分鐘，使二者3’突出端互補配對，形成插入了衣原體內切核酸酶IV基因的帶缺口pUC18重組質粒。
插入了衣原體內切核酸酶IV基因的帶缺口pUC18重組質粒堿基序列如下，其中省略號代表帶缺口pUC18重組質粒中間的堿基序列，符號_代表衣原體內切核酸酶IV基因與pUC18質粒間的缺口，符號-表示硫代修飾..........ctatgaccatgattacgaattc c AGCAGCGGCCTGGT_c-atatgaaagtacttcctcctccctc..........gatactggtactaatgcttaag-g_TCGTCGCCGGACCA g tatactttcatgaaggaggagggag...........................................................................
...........................................................................
gttttcaaaaaacagagatagttag cATCACCACCATTGA_g-aagcttggcactggccgtcg..........
caaaagttttttgtctctatcaatc-g_TAGTGGTGGTAACTc ttcgaaccgtgaccggcagc..........
第六步，含衣原體內切核酸酶IV基因的帶缺口pUC18重組質粒轉化大腸桿菌。將第五步制備的插入了衣原體內切核酸酶IV基因的帶缺口pUC18重組質粒轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞(氯化鈣法制備的感受態(tài)細胞即可)，轉化后菌體涂布于含100微克/毫升氨芐青霉素的LB平板，于37度培養(yǎng)過夜。大腸桿菌的DNA修復系統(tǒng)會修復好衣原體內切核酸酶IV基因與pUC18質粒間的缺口，形成沒有缺口的插入了衣原體內切核酸酶IV基因的完整pUC18重組質粒。轉化按標準操作進行。
第七步，含衣原體內切核酸酶IV基因的pUC18重組質粒的鑒定。從第六步的平板上挑取單菌落，進行菌落PCR，鑒定含有衣原體內切核酸酶IV基因的單菌落，若能擴增出衣原體內切核酸酶IV基因的特異性DNA條帶，該菌落即為插入了衣原體內切核酸酶IV基因的pUC18重組質粒的陽性克隆，培養(yǎng)陽性克隆并從中抽提重組質粒。菌落PCR組成(10微升反應體積)衣原體內切核酸酶IV基因特異性引物，0.5μM；Taq DNA聚合酶，0.5單位；dNTPs，200μM；1×Taq聚合酶反應緩沖液；單菌落菌體。反應條件95℃×10分鐘；(95℃×30秒，65℃×30秒，72℃×1分鐘)×30個循環(huán)；72℃×5分鐘。質粒抽提按標準操作進行。
權利要求
1.一種基于硫代修飾的連接酶非依賴性基因克隆方法，其特征在于包括以下步驟1)設計合成用于擴增目標基因與質粒載體的引物序列；引物序列的特征是(1)5’端第11-21位間的某一磷酸基團為硫代修飾；(2)擴增目標基因的正向引物的5’端第1位至硫代修飾上游第2位間的連續(xù)堿基序列與擴增質粒載體的反向引物的5’端第1位至硫代修飾上游第2位間的連續(xù)堿基序列互補配對，擴增目標基因的反向引物的5’端第1位至硫代修飾上游第2位間的連續(xù)堿基序列與擴增質粒載體的正向引物的5’端第1位至硫代修飾上游第2位間的連續(xù)堿基序列互補配對；(3)3’端下游堿基序列與待擴增DNA片段兩端堿基序列配對；2)將用于擴增目標基因與質粒載體的正向引物與反向引物、目標基因與質粒載體的DNA模板分子、DNA聚合酶、4種脫氧核苷三磷酸的混合物dNTPs加入聚合酶鏈式反應緩沖液，進行反應；3)對擴增的線性化質粒載體PCR產物，先用DNA限制性核酸內切酶DpnI消化去除質粒模板；分別回收目標基因與經(jīng)Dpn I處理的線性化質粒載體的PCR擴增產物；4)5’外切核酸酶處理PCR擴增的目標基因與線性化質粒載體DNA片斷，5’外切核酸酶特異性從5’端降解雙連DNA的一條DNA鏈，DNA中的硫代修飾阻斷5’外切核酸酶消化，因此經(jīng)5’外切核酸酶消化使得DNA片段的兩端產生長為10-20個核苷酸的3’突出端；5)將5’外切核酸酶消化的兩種DNA片斷混合，使二者的3’突出端雜交配對，形成含目標基因的帶缺口重組質粒；6)將含目標基因的帶缺口重組質粒轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，37度培養(yǎng)，修復重組質粒中的缺口，形成含目標基因的完整重組質粒；7)利用擴增目標基因的引物與Taq DNA聚合酶進行菌落PCR，鑒定含目標基因的完整重組質粒的陽性克隆，從陽性克隆中抽提含目標基因的完整重組質粒DNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于硫代修飾的連接酶非依賴性基因克隆方法，其中擴增目標基因與質粒載體的引物的5’端第11－21位間的某一磷酸二酯鍵為硫代修飾；目標基因的正向引物和載體的反向引物，目標基因的反向引物和載體的正向引物，每對引物5’端至硫代修飾上游第2位的連續(xù)堿基序列互補配對。PCR擴增目標基因與質粒載體后，純化PCR產物。5’外切核酸酶從5’端降解DNA鏈，硫代修飾與5’外切核酸酶消化DNA雙鏈的共同作用會生成長10－20個核苷酸的3’單鏈突出端。由于目標基因與質粒載體的3’突出端堿基序列互補，形成穩(wěn)定的完全配對雙鏈，不需要進行DNA連接反應，直接轉化大腸桿菌。本發(fā)明目標基因克隆不依賴于限制性核酸內切酶與DNA連接酶，操作通量大，可用于大規(guī)?；蚩寺?。
文檔編號C12N15/10GK101067133SQ20071003938
公開日2007年11月7日 申請日期2007年4月12日 優(yōu)先權日2007年4月12日
發(fā)明者劉喜朋, 劉建華 申請人:上海交通大學