專利名稱：一種瘦蛋白基因的修飾方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明所屬的技術(shù)領(lǐng)域?qū)儆谏锛夹g(shù)領(lǐng)域。
本發(fā)明的技術(shù)背景肥胖是指由于脂肪的過度積累造成體重超出正常范圍，它經(jīng)常與疾病相聯(lián)系，如高血壓、II型糖尿病和不育癥等。肥胖不僅影響人類健康，并且已成為嚴(yán)重影響社會發(fā)展的障礙。在1988-1994年間，美國約有20％的婦女和25％男性是肥胖者，歐洲35-65歲間的成人中有50％以上屬于肥胖者；據(jù)英國有關(guān)部門統(tǒng)計，英國的肥胖者由1980年的男性8％和女性6％增至1997的男性20％和女性17％；發(fā)展中國家在過去的20年中肥胖者的比例也在迅速增加。在美國和歐洲，每年減肥藥物和食品的銷售額均上千億美元。雖然現(xiàn)階段我國的人口肥胖問題并不嚴(yán)重，但隨著物質(zhì)生活水平的提高，肥胖趨勢也日趨嚴(yán)重，例如，我國現(xiàn)在每年的減肥藥物和食品的銷售額都在百億元以上。
在1994年以前的40年中，研究者通過對機(jī)體生長調(diào)節(jié)的大量研究，提出了許多關(guān)于體重調(diào)節(jié)的假說。1953年，Kennedy(Kennedy G.C.，Proc.R.Soc.Lond.B.，140，579-592(1953))提出了抑制攝食信號的產(chǎn)生是由于脂肪的儲存并作用于大腦的結(jié)果；當(dāng)代謝和散發(fā)熱量誘導(dǎo)體重下降后，抑制攝食信號水平被嚴(yán)格控制，而產(chǎn)生了攝食量的增加，直到能量空缺被補(bǔ)齊。1994年，Stellar(Stellar E.，The physiology of motivation.Psychol.Rev.，61，5(1954))通過下丘腦的VMH核和LHA核損毀實(shí)驗(yàn)提出下丘腦通過VMH核作為飽食中樞，LHA作為攝食中樞來對動物的攝食行為進(jìn)行雙重調(diào)控，從而達(dá)到調(diào)節(jié)體重的目的。VMH產(chǎn)生的信號可以通過自主神經(jīng)系統(tǒng)的交感和副交感神經(jīng)向下傳遞到肝臟、胰腺和脂肪等組織調(diào)節(jié)胰島素的分泌和脂肪代謝。另外一些研究表明(Travers S.等，Annu.Rev.Neurosci.，10，595-632(1987))，小鼠飽食中樞在后腦腦干的NTS區(qū)域，因?yàn)轱柛挟a(chǎn)生于攝食過程，個體在攝食中，食物對胃腸的機(jī)械和化學(xué)感受器刺激而產(chǎn)生的信號在此區(qū)域集中并綜合，產(chǎn)生飽感。但后腦與前腦的切斷術(shù)證明，在沒有下丘腦調(diào)節(jié)的情況下，攝食調(diào)節(jié)是可以進(jìn)行的，因此認(rèn)為NTS區(qū)域是飽食中樞。這兩種觀點(diǎn)都各有依據(jù)，另外，NTS與VMH和LHA間存在更復(fù)雜的聯(lián)系，這一點(diǎn)需進(jìn)行進(jìn)一步研究證明。1973年，Gibbs和Smith(Gibbs J.等，J.Comp.Physiol.Psychol.，84，488-495(1973))提出飽食因子，認(rèn)為其產(chǎn)生于個體進(jìn)食中，包括胃腸道分泌的一些肽類物質(zhì)，將信號傳遞給大腦抑制進(jìn)食，導(dǎo)致攝食結(jié)束。這些假說主要集中在飲食調(diào)節(jié)、激素和神經(jīng)內(nèi)分泌水平上，直到1994年，美國Rockefeller大學(xué)J.M.Friedman博士領(lǐng)導(dǎo)的研究小組利用位置克隆技術(shù)克隆了鼠ob基因和人的同源物，確定了ob基因的產(chǎn)物---瘦蛋白(Leptin)是由脂肪組織產(chǎn)生的反映脂肪組成的信號因子，成熟肽分子量為16kD，其不僅可以維持和促進(jìn)能量消耗，還可以降低攝食量(Zhang，Y.等，Nature，373，425-432(1994))。從而揭開研究肥胖形成機(jī)理尤其是分子遺傳基礎(chǔ)的新篇章。
目前已確定，Leptin是脂肪細(xì)胞分泌的，它通過內(nèi)分泌作用分解脂肪，維持和促進(jìn)能量消耗(Zhang，Y.等，Nature，373，425-432(1994))。另外，它在個體繁育、造血和糖代謝方面有一定作用。鑒于Leptin對體重調(diào)節(jié)的重要作用和其在個體繁育、造血和糖代謝方面有一定作用，本發(fā)明人對已發(fā)表的人ob基因和豬ob基因進(jìn)行了修飾表達(dá)，并對相應(yīng)的表達(dá)條件進(jìn)行了選擇研究。
Leptin為非糖蛋白。其中，人Leptin在大腸桿菌中的表達(dá)已進(jìn)行了許多研究，其表達(dá)量最高可達(dá)50％左右(Jeong KJ和Lee SY.，Appl EnvironMicrobiol.，1999，65(7)3027-32)。但是，豬Leptin在大腸桿菌中的表達(dá)尚未見報道。
1999年，KL Jeong進(jìn)行了人Leptin在大腸桿菌中的表達(dá)(Jeong KJ和LeeSY.，Appl Environ Microbiol.，1999，65(7)3027-32)(其表達(dá)序列如SEQ NO1所示)。2000年，本發(fā)明人也進(jìn)行了人Leptin在大腸桿菌中的表達(dá)(其表達(dá)序列如SEQ NO 2所示)。但不同的是，本發(fā)明人將編碼成熟肽第二個氨基酸脯氨酸的CCC密碼子修飾為大腸桿菌使用頻率高的CCG密碼子，在Ptac啟動子下表達(dá)的融合表達(dá)蛋白最高表達(dá)量為50％；非融合表達(dá)在PT7啟動子下，加上編碼起始氨基酸的密碼子ATG，其表達(dá)量高達(dá)55％，說明上述修飾對該蛋白表達(dá)有一定影響。
2000年，本發(fā)明人又進(jìn)行了豬Leptin在大腸桿菌中的表達(dá)將編碼成熟肽第二個氨基酸脯氨酸的CCC密碼子修飾為大腸桿菌使用頻率高的CCG密碼子，在Ptac啟動子下表達(dá)的融合表達(dá)蛋白最高表達(dá)量為49％；非融合表達(dá)在PT7啟動子下，加上編碼起始氨基酸的密碼子ATG，其表達(dá)量高達(dá)49％，說明上述修飾對該蛋白表達(dá)有一定影響。
本發(fā)明人還進(jìn)行了Leptin在大腸桿菌中表達(dá)條件的研究，分別做了表達(dá)載體在不同大腸桿菌菌株、不同IPTG濃度、不同生長階段和不同誘導(dǎo)時間下的誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。
本發(fā)明的目的本發(fā)明的目的是要提供瘦蛋白基因的一種修飾方法，該方法能有效地增加瘦蛋白基因的表達(dá)，并使之成為一種降低個體體重的有效方法和提高飼料利用率與瘦肉率的有效方法。
本發(fā)明的效果本發(fā)明將人和豬的ob基因經(jīng)過PCR方法修飾克隆于Ptac啟動子和PT7啟動子的下游，進(jìn)行融合和非融合表達(dá)，融合表達(dá)分子量為42kD，其中含有26kD的谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶和16kD的重組蛋白Leptin；非融合表達(dá)分子量為16kD(參見附

圖1)。
依據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，人ob基因的表達(dá)最高可達(dá)55％，豬ob基因的表達(dá)最高達(dá)49％。
依據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，注射重組得到的瘦蛋白到小鼠體內(nèi)，以檢測其生物學(xué)活性，發(fā)現(xiàn)可使小鼠體重顯著下降，表明瘦蛋白可作為減輕體重的藥物即減肥藥物使用；并且，瘦蛋白還可在小鼠體內(nèi)通過限制體脂增加以減少攝食，以提高飼料轉(zhuǎn)化率。
本發(fā)明的技術(shù)方案本發(fā)明以瘦蛋白(ob)基因全長cDNA為模板，通過引物設(shè)計改變編碼成熟Leptin第二個氨基酸的密碼子，使其成為大腸桿菌使用頻率高的密碼子；然后，將其分別克隆于Ptac啟動子和PT7啟動子下游，進(jìn)行融合和非融合表達(dá)。表達(dá)條件為菌體生長至OD6000.9左右，補(bǔ)加1/5的培養(yǎng)基，在0.1m Mol/L的IPTG誘導(dǎo)下誘導(dǎo)2.5-3小時。通過對人和豬ob基因表達(dá)產(chǎn)物純化，其中人重組Leptin純度達(dá)96％，豬重組Leptin純度達(dá)95％。
其中，依據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，融合表達(dá)和非融合表達(dá)的引物分別為豬ob(POB)融合表達(dá)引物引物15’GGGATCCGTGCCGATCTGGAGAGTCCAGGATG 3’引物25’GGAATTCTTCAAGGCTTCAGCAGCCAGGG 3’人ob(HOB)融合表達(dá)引物引物15’GGGATCCGTGCCGATCCAAAAAGTCCAAGA 3’引物25’CGAATTCCTTCAAGGCCTCAGCACCCAG 3’豬ob(POB)非融合表達(dá)引物引物15’GCATATGGTGCCGATCTGGAGAGTCCAGG 3’引物25’GGAATTCTTCAAGGCTTCAGCAGCCAGGG 3’人ob(HOB)非融合表達(dá)引物引物15’GCATATGGTGCCGATCCAAAAAGTCCAAGA 3’引物25’CGAATTCCTTCAAGGCCTCAGCACCCAG 3’使用的PCR反應(yīng)體系及其反應(yīng)條件為PCR反應(yīng)體系2.5μl 10×Taq DNA聚合酶緩沖液(500mmol/L KCl，100mmol/L Tris·Cl，15mmol/L MgCl2，0.01％明膠)，2μl dNTPs(2.5mmol/L)，引物終濃度0.5μmol/L，1U Taq DNA聚合酶，模板DNA 50-100ng。終體積為25μl。
PCR反應(yīng)條件94℃、3分鐘；然后94℃、0.5分鐘，60℃、0.5分鐘，72℃、0.7分鐘28個循環(huán)；最后72℃、5分鐘。4℃長時間保存。
用1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。
融合表達(dá)分子量為42kD，其中含有26kD的谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶和16kD的重組蛋白Leptin，兩個肽鏈間有一個凝血酶因子X的酶切位點(diǎn)；非融合表達(dá)分子量為16kD。利用純化的非融合表達(dá)重組蛋白制備抗兔血清，進(jìn)行生物學(xué)活性檢測實(shí)驗(yàn)，Western印漬雜交為陽性；利用純化產(chǎn)物注射小鼠，可使小鼠體重下降，與對照組有顯著性差異(p＜0.05)，表明純化產(chǎn)物具有生物學(xué)活性。本發(fā)明所用的實(shí)驗(yàn)材料1.菌株和克隆載體(1)本發(fā)明所用菌株見表1表1.本發(fā)明所用菌株和其表型及基因型
(2)本發(fā)明所用表達(dá)載體融合表達(dá)載體pGEMX-2T，購自Amershampharmacia公司(AmershamPharmcia Biotech Inc.，800 Centennial Ave，PO Box 1327，Piscataway，NJ 08855，USA)；非融合表達(dá)載體pET-5a，購自Promega公司(Promega Corporation，2800Wood Hollow Road Madison，WI 53711-5399，USA)。
2.實(shí)驗(yàn)用模板和動物實(shí)驗(yàn)用PCR模板為本實(shí)驗(yàn)室(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國北京圓明園西路2號)保存；制備抗血清的新西蘭大耳白購自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院種兔廠(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京圓明園西路2號)，生物學(xué)活性實(shí)驗(yàn)用小白鼠購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物室(北京市海淀區(qū)學(xué)院路38號)。
3.酶與試劑限制性內(nèi)切酶、修飾酶、羊抗兔二抗、完全佐劑和不完全佐劑分別購自華美生物工程公司(中國河南洛陽國家高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)三山路007號)、Biolab(New England Biolabs Ltd.，73 Knowl Piece Wilbury Way Hitchin，HertfordshireSG4 OTY England，UK)公司和Promega公司(Promega Corporation，2800 WoodHollow Road Madison，WI 53711-5399，USA公司地址)；PCR引物由上海生物工程公司(中國上海市漕寶路500號1號樓235室)合成。
4.DNA分析軟件同源性分析軟件GENETYX-MAX8.5；PCR引物設(shè)計軟件OLIGO4.0；數(shù)據(jù)分析軟件SAS(6.12版本)。
本發(fā)明所用的實(shí)驗(yàn)方法1.試劑的配制質(zhì)粒DNA提取溶液I50mM葡萄糖，2.5mM Tris·Cl(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)，高壓滅菌(8磅15分鐘)，貯存于4℃；質(zhì)粒DNA提取溶液II0.2M NaOH，1％SDS，現(xiàn)配現(xiàn)用；質(zhì)粒DNA提取溶液III5M乙酸鉀溶液60ml，冰乙酸11.5ml，滅菌水28.5ml；1M IPTG溶液IPTG 2g溶解于10ml雙蒸水中，過濾除菌，分裝貯存于-20℃；1M DTT溶液DTT 3.09g溶解于20ml 0.01Mol/L乙酸鈉中，過濾除菌，分裝，貯存于-20℃；轉(zhuǎn)移緩沖液2.9g甘氨酸、5.8gTris、0.37g SDS加入200ml甲醇，再加入ddH2O定容至1000ml；麗舂紅S染色2g麗舂紅、30g三氯乙酸、30g磺基水楊酸，定容于100ml；封閉液5g脫脂奶粉、0.02g疊氮化鈉、0.02mlTween-20，定容于100ml；RNaseA溶液10mg/ml溶于10mM Tris·Cl(pH7.5)，15mM NaCl中100℃煮沸10分鐘，室溫冷卻后，貯存于-20℃。
2.感受態(tài)細(xì)胞的制備(CaCl2法)挑取DH5α或JM109大腸桿菌原種，在LB瓊脂板上劃線培養(yǎng)；挑取培養(yǎng)好的新鮮單菌落，接種到100ml LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.4～0.5；將菌轉(zhuǎn)移至一預(yù)冷的滅菌100ml離心管中，冰浴10～15分鐘；4000rpm，4℃離心10分鐘，回收細(xì)菌沉淀；加入20ml冰預(yù)冷的0.1M CaCl2懸浮細(xì)菌沉淀；冰浴10～15分鐘；4000rpm，4℃離心10分鐘，回收細(xì)菌沉淀；加入4ml 0.1M CaCl2溶液重懸細(xì)菌沉淀(這時細(xì)胞可直接用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn))；加甘油至終濃度為15％～20％；混勻，分裝成200μl一小份，凍存于-70℃。
3.質(zhì)粒DNA的小規(guī)模提取---堿裂解法接種單菌落于3ml含70ug/ml Amp的LB液體培養(yǎng)基中，220rpm，37℃振蕩培養(yǎng)過夜(8-10小時)，10,000rpm，4℃離心5分鐘(無4℃條件常溫亦可)，收集菌體；適量STE重懸細(xì)菌沉淀，3ml培養(yǎng)物沉淀在一個1.5ml離心管中，4℃離心5分鐘，收集菌體；傾去STE液體，加入200ul溶液I，振蕩充分懸浮細(xì)胞于溶液I中；加入新配制的溶液II 200ul，將管迅速顛倒混勻10次，室溫靜置5分鐘；加入溶液III 200ul，將管倒置振蕩1分鐘，冰浴5分鐘；1,2000rpm離心8分鐘，小心取上清于離心管中；用與上清等體積的Tris飽和酚、酚/氯仿、氯仿順次抽提一次，保留水相；加入1/10體積的pH5.2的3M NaAc，再加2體積的無水乙醇，-70℃冰箱內(nèi)沉淀15分鐘；離心棄上清，加入70％乙醇洗滌沉淀；離心棄上清，真空抽干，去除痕量乙醇；加入50ul TE同時加1ulRNase放入37℃中2小時；電泳檢查含量。
4.質(zhì)粒DNA的大量制備接種大腸桿菌單菌落于100ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜；4000rpm，4℃離心10分鐘，收集菌體，棄上清；將細(xì)菌沉淀用20ml冰預(yù)冷的STE溶液重懸，按上述方法重新離心，去上清，倒置，吸干殘留液，加入冰預(yù)冷的質(zhì)粒提取溶液I 2ml，將細(xì)菌沉淀重懸；加入200μl新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml溶于10mM Tris·Cl，pH8.0)，混勻；加入4ml新配制的質(zhì)粒提取溶液II，蓋緊離心管蓋，緩慢顛倒數(shù)次，充分混勻內(nèi)容物，于室溫放置5～10分鐘；加2ml用冰預(yù)冷的質(zhì)粒提取溶液III，將離心管顛倒數(shù)次，冰浴15分鐘，可見白色絮狀沉淀產(chǎn)生；12,000rpm，4℃離心20分鐘；將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加0.6倍體積異丙醇，充分混勻，于室溫放置10分鐘；10000rpm，室溫離心15分鐘，回收質(zhì)粒沉淀；去除上清，用70％乙醇洗沉淀一次，稍抽干，溶于1ml TE中；加入5μl RNaseA(5mg/ml)，37℃消化1小時；轉(zhuǎn)移至小離心管，用等體積的苯酚、苯酚∶氯仿、氯仿，各抽提一次；加入1/5體積的10M NH4AC，再加入2倍體積的無水乙醇，混勻，室溫放置30分鐘；12,000rpm，室溫離心10分鐘棄上清，用70％乙醇洗沉淀兩次，真空抽干，溶于適量TE中，儲存于-20℃。
5.重組質(zhì)粒大小的快速鑒定---Cracking法挑取轉(zhuǎn)化后平板培養(yǎng)的白色菌落，在另一塊含有Amp的LB板上劃線培養(yǎng)12～16小時，用牙簽挑取少量菌體，涂于含有20μl滅菌水的離心管內(nèi)；振蕩，充分懸浮菌體后，加入等體積20μl的2×Cracking緩沖液，劇烈振蕩2分鐘；12,000rpm離心5分鐘，取上清10～20μl上樣電泳，以藍(lán)斑的裂解物作對照，檢測質(zhì)粒是否有插入及其大致大小。
6.轉(zhuǎn)化從-70℃取出保存的感受態(tài)細(xì)胞，冰浴助融；200μl感受態(tài)細(xì)胞加入5μl連接產(chǎn)物，冰浴30分鐘；42℃水浴熱激90秒，冰浴2分鐘；加800μl LB，37℃水浴復(fù)活50分鐘；鋪200μl于含X-gal、IPTG、Amp的LB平板；37℃培養(yǎng)9-16小時。
7.篩選重組子接劃線菌于2ml LB中，過夜培養(yǎng)；堿變性提取重組質(zhì)粒；內(nèi)切酶消化0.5μgDNA；電泳檢查。
8.制備模板堿變性制備模板；調(diào)濃度至0.1-0.2μg/μl。
9.Dye Terminator對陽性克隆作部分測序(1)堿裂解法準(zhǔn)備模板，稀釋至0.1-0.2μg/μl；(2)克隆測序反應(yīng)體系見表2表2.克隆測序反應(yīng)體系組成
(3)PE9600 PCR反應(yīng)95℃，10秒；50℃，5秒；60℃，1分鐘；25個循環(huán)；4℃(4)沉淀PCR產(chǎn)物將反應(yīng)物加入到含100μl 95％乙醇，1.5ml離心管中；冰上放置15分鐘；12,000rpm，離心15分鐘；250μl 70％的乙醇洗一遍；抽干，-20℃保存，準(zhǔn)備測序上樣。
10.利用玻璃奶洗脫法回收PCR產(chǎn)物(1)從瓊脂糖凝膠上切下所需DNA片段，放在1.5ml Eppendorff管中搗碎，動作輕柔；(2)加入3倍體積的溶膠液，室溫下放置5分鐘(或50℃保溫3分鐘)，其間輕搖Eppendorff管幾次，使膠完全溶化；(3)加入10μl玻璃奶，顛倒混勻，冰浴下放置10分鐘。并且間隔2-3分鐘混勻一次；(4)12,000rpm離心30秒，吸棄上清；(5)加250μl漂洗液，用加樣器吸漂洗液輕柔地將玻璃奶沖散均勻，離心棄上清；(6)重復(fù)上述步驟(5)一次。吸取完漂洗液后，再離心10秒鐘，用Tip頭將最后一點(diǎn)兒漂洗液吸干凈。然后，放置于37℃溫箱干燥20分鐘；(7)加適量無菌蒸餾水或TE(10-30μl)，混勻。60℃水浴5分鐘；(8)12,000rpm離心1分鐘，回收上清備用，重復(fù)上述步驟(7)-(8)1-2次。
11.融合表達(dá)載體的構(gòu)建(參見附圖2)；12.非融合表達(dá)載體的構(gòu)建(參見附圖3)；13.外源片段在大腸桿菌中的表達(dá)挑取單菌落接種于5ml液體LB培養(yǎng)基中37℃震蕩過夜培養(yǎng)(14小時-16小時)；次日，按2％接種于100ml液體LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)至OD6000.9左右；補(bǔ)充38℃液體LB培養(yǎng)基20ml，加入IPTG至終濃度0.1Mm/L，繼續(xù)在37℃震蕩培養(yǎng)2-3小時；測OD600值，取1ml離心，棄上清，剩余培養(yǎng)物同樣離心備用。
14.SDS-PAGE電泳檢測SDS-PAGE電泳膠的灌制見表3表3.配制SDS-PAGE膠的組成
每毫升菌液按所測OD600值乘以141加入Loading緩沖液，混勻，于100℃加熱5-10分鐘，迅速冰浴，12,000rpm離心10分鐘，取5ul上樣。
15.包涵體的提取將表達(dá)的菌體用少量STE溶液懸浮，加入容菌酶，室溫放置15分鐘，置于-70℃超低溫冰箱中冷凍2小時，取出于室溫溶解；重復(fù)冷凍和溶解3次以上；加入STE溶液洗滌，離心12000rpm 10分鐘，收集沉淀，反復(fù)洗滌3次以上；收集沉淀的包涵體，備用。
16.表達(dá)產(chǎn)物的初步純化在1g包涵體中加入15ml 8M/L pH8.8尿素使包涵體裂解，蛋白變性，過夜；離心，12000rpm 10分鐘；吸取上清，準(zhǔn)確測量體積；在4℃環(huán)境下加入3倍體積的10mM/L PH8.3的乙醇胺溶液復(fù)性，放置1小時；將復(fù)性液于4℃環(huán)境下在10mM/L pH8.3的Tris緩沖液中透析36小時，透析液酶6小時換一次；取出透析產(chǎn)品，冷凍于-70℃?zhèn)溆谩?br> 17.抗體的制備用完全佐劑乳化包涵體；在兔子背部多點(diǎn)注射乳化劑，每點(diǎn)100ul，共20點(diǎn)；15天后，多點(diǎn)注射用不完全佐劑乳化的純化蛋白乳化劑，劑量和點(diǎn)數(shù)同上；用不完全佐劑乳化的純化蛋白乳化劑每10天多點(diǎn)注射一次，共注射3次；最后一次用純化蛋白直接在兔耳緣靜脈注射進(jìn)行免疫；免疫后第10天，通過心臟采血，置于50ml離心管中，37℃保溫；當(dāng)血液凝聚后，取出血清，加入0.1％的疊氮化鈉，冷凍于-70℃?zhèn)溆谩?br> 18.純化蛋白生物活性檢測將2月齡成年雌性小鼠隨機(jī)分為四組，每組注射相同的量1ml，對照組1不注射，對照組2注射10Mm/L PH8.3Tris緩沖液，實(shí)驗(yàn)組注射純化產(chǎn)品，每天早晚各注射一次，注射量hOB10mg/次，pOB5mg/次，注射時間相隔10小時，共注射7天，每天晚上注射前稱量體重。
19.Western印漬檢測SDS-PAGE電泳；轉(zhuǎn)膜(2小時)；取出膜加入封閉液封閉(2小時)；棄去封閉液，按0.1ml/cm2加入封閉液和制備的抗血清(1∶200)，4℃輕搖2小時；PBS洗三次，每次10分鐘；將膜放入含有辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶50)的溶液(5％脫脂奶粉、150mMNaCl、50mMTris PH7.5)室溫1小時；洗滌液洗滌(150mMNaCl，50mMTris PH7.5)四次，每次10分鐘；將膜放入顯色液(使用前將溶于20ml冰甲醇的60mg4-氯-1-萘酚和100ml含60ul 30％H2O2的10mMTris PH7.5、150mMNaCl混合)中，顯影后，用蒸餾水洗兩遍停止顯色。
具體實(shí)施例方式1.人ob基因的融合表達(dá)(1)pGEMX-HOB在E.coli BL21中的表達(dá)據(jù)E.coli BL21生長曲線，在補(bǔ)給營養(yǎng)的條件下，pGEMX-HOB在E.coliBL21不同生長期間(OD6000.25-1.73)表達(dá)量掃描結(jié)果如表4所示，OD600在0.25-1.73之間時表達(dá)量變化無明顯差異，表明在營養(yǎng)充分的條件下，pGEMX-HOB在E.coli BL21中均能高效表達(dá)。
表4 pGEMX-HOB在E.coli BL21中的表達(dá)
(2)pGEMX-HOB在不同菌株中的表達(dá)不同菌株中pGEMX-HOB誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果見表5，其中E.coli BL21、JM107、c600較高，E.coli DH5α較低，表明pGEMX-HOB在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)對菌株有一定選擇性。
表5 pGEMX-HOB在不同菌株中的表達(dá)
(3)不同濃度IPTG誘導(dǎo)pGEMX-HOB在E.coli BL21中的表達(dá)不同濃度IPTG誘導(dǎo)pGEMX-HOB在E.coli BL21中表達(dá)量見表6，結(jié)果表明IPTG濃度從0.1-10mM對pGEMX-HOB誘導(dǎo)表達(dá)無明顯差異，IPTG濃度在此間對表達(dá)量影響不大。
表6不同濃度IPTG誘導(dǎo)pGEMX-HOB在E.coli BL21中的表達(dá)1 2 3 4 5 6不同濃度IPTG(mM)0.050.11.02.05.0 10.0表達(dá)量(％) -33.345.4 43.7 44.9 47.0 49.8(4)pGEMX-HOB在E.coli BL21中不同誘導(dǎo)時間的表達(dá)pGEMX-HOB在E.coli BL21中不同誘導(dǎo)時間表達(dá)量見表7，結(jié)果表明在菌體生長至OD600為0.9左右時，加入.0.1mM IPTG和補(bǔ)充培養(yǎng)基，誘導(dǎo)0.5小時-1.5小時表達(dá)量較低，誘導(dǎo)2小時后表達(dá)量較高，隨著誘導(dǎo)時間的延長，表達(dá)量也較高。
表7 不同誘導(dǎo)時間pGEMX-HOB在E.coli BL21中的表達(dá)
(5)重組蛋白提取pGEMX-HOB在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)融合蛋白表達(dá)量為28.3％，經(jīng)裂解細(xì)胞STE洗滌三次后其占菌體蛋白的37.1％，經(jīng)變性和復(fù)性后其純度達(dá)91.8％。掃描蛋白圖譜見附圖4。2.人ob基因非融合表達(dá)(1)pET-HOB在E.coli BL21中的表達(dá)據(jù)E.coli BL21生長曲線，在補(bǔ)給營養(yǎng)的條件下，pET-HOB在E.coli BL21不同生長期間(OD6000.3-1.8)表達(dá)量掃描結(jié)果列于表8。結(jié)果顯示，在OD600處于0.30-1.8之間其表達(dá)量變化無明顯差異，這說明在營養(yǎng)充分的條件下pET-HOB在E.coli BL21中均能高效表達(dá)。
表8 pET-HOB在E.coli BL21中的表達(dá)
(2)不同濃度IPTG誘導(dǎo)pET-HOB在E.coli BL21中的表達(dá)不同濃度IPTG誘導(dǎo)pET-HOB在E.coli BL21中表達(dá)量見表9，結(jié)果表明IPTG濃度從0.05-5mM對pET-HOB誘導(dǎo)表達(dá)無明顯差異，IPTG濃度在此間對表達(dá)量影響不大。
表9不同濃度IPTG誘導(dǎo)pET-HOB在E.coli BL21中的表達(dá)
(3)pET-HOB在E.coli BL21中不同誘導(dǎo)時間的表達(dá)pET-HOB在E.coli BL21中不同誘導(dǎo)時間表達(dá)量見表10，結(jié)果表明在菌體生長至OD600為0.9左右時，加入0.1mM IPTG和補(bǔ)充培養(yǎng)基，誘導(dǎo)0.5小時-1.5小時表達(dá)量較低，誘導(dǎo)2小時后表達(dá)量較高，隨著誘導(dǎo)時間的延長，表達(dá)量也較高。
表10不同誘導(dǎo)時間pET-HOB在E.coli BL21中的表達(dá)
(4)重組蛋白純化pET-HOB在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)融合蛋白表達(dá)量為46.6％，經(jīng)裂解細(xì)胞STE洗滌，變性和復(fù)性后其純度達(dá)96.4％。掃描蛋白圖譜見附圖5。3.豬ob基因融合表達(dá)(1)pGEMX-POB在E.coli BL21中的表達(dá)據(jù)E.coli BL21生長曲線，在補(bǔ)給營養(yǎng)的條件下，pGEMX-POB在E.coliBL21不同生長期間(OD6000.2-1.9)的表達(dá)量掃描結(jié)果如表11所示，OD600在0.2-1.9之間其表達(dá)量變化無明顯差異，說明在營養(yǎng)充分的條件下pGEMX-POB在E.coli BL21中均能高效表達(dá)。
表11 pGEMX-POB在E.coli BL21中的表達(dá)
(2)pGEMX-POB在不同菌株中的表達(dá)不同菌株中pGEMX-POB誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果見表12，其中pGEMX-POB在E.coliBL21、JM83中表達(dá)較高，在E.coli DH5α較低，表明pGEMX-POB的誘導(dǎo)表達(dá)對菌株有一定選擇性。
表12 pGEMX-POB在不同菌株中的表達(dá)
(3)不同濃度IPTG誘導(dǎo)pGEMX-POB在E.coli BL21中的表達(dá)不同濃度IPTG誘導(dǎo)pGEMX-OB在E.coli BL21中表達(dá)量見表13，結(jié)果表明IPTG濃度從0.01-10mM對pGEMX-POB誘導(dǎo)表達(dá)無明顯差異，濃度過高或過低表達(dá)量都有下降，本實(shí)驗(yàn)在誘導(dǎo)IPTG濃度0.01時未檢測到蛋白表達(dá)帶。
表13 不同濃度IPTG誘導(dǎo)pGEMX-POB在E.coli BL21中的表達(dá)1 2 3 4 5 6 7 8 9 10不同濃度IPTG(mM) 0.01 0.05 0.10 0.20 0.40 0.60 0.8 1.0 5.0 10.0表達(dá)量(％) - 33.9 46.3 47.5 46.4 49.1 47.1 48.1 39.8 38.6(4)pGEMX-POB在E.coli BL21中不同誘導(dǎo)時間的表達(dá)pGEMX-POB在E.coli BL21中不同誘導(dǎo)時間表達(dá)量見表14，結(jié)果表明在菌體生長至OD600為0.9左右時，加入.0.1mM IPTG和補(bǔ)充培養(yǎng)基，誘導(dǎo)0.5小時-1.5小時表達(dá)量較低，誘導(dǎo)2小時后表達(dá)量較高，隨著誘導(dǎo)時間的延長，表達(dá)量也較高。
表14 不同誘導(dǎo)時間pGEMX-POB在E.coli BL21中的表達(dá)1 2 3 4 5 6誘導(dǎo)時間(小時)0.51 1.52.02.53表達(dá)量(％) 12517.0 20.4 22.7 27.4 29.1(5)蛋白質(zhì)純化pGEMX-POB在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)融合蛋白表達(dá)量為27.0％，經(jīng)裂解細(xì)胞STE洗滌其純度達(dá)42.5％，經(jīng)變性和復(fù)性后其純度達(dá)92.7％。掃描蛋白圖譜見附圖6。4.豬ob基因的非融合表達(dá)(1)pET-POB在E.coli BL21中的表達(dá)據(jù)E.coli BL21生長曲線，在補(bǔ)給營養(yǎng)的條件下，pET-POB在E.coli BL21不同生長期間(OD6000.30-1.33)的表達(dá)量掃描結(jié)果如表15所示，OD600在0.30-1.33之間其表達(dá)量變化無明顯差異，說明在營養(yǎng)充分的條件下pET-POB在E.coli BL21中均能高效表達(dá)。
表15 pET-POB在E.coli BL21中的表達(dá)1234 5不同OD600值 0.2950.4970.8711.167 1.334表達(dá)量(％)33.3 35.9 29.5 29.232.1(2)不同濃度IPTG誘導(dǎo)pET-POB在E.coli BL21中的表達(dá)不同濃度IPTG誘導(dǎo)pGEMX-OB在E.coli BL21中表達(dá)量見表16，結(jié)果表明IPTG濃度從0.05-5.0mM對pET-POB誘導(dǎo)表達(dá)無明顯差異。
表16 不同濃度IPTG誘導(dǎo)pET-POB在E.coli BL21中的表達(dá)1 2 3 4 5不同濃度IPTG(mM)0.050.100.501.005.00表達(dá)量(％)31.131.237.736.038.1(3)pET-POB在E.coli BL21中不同誘導(dǎo)時間的表達(dá)pET-POB在E.coli BL21中不同誘導(dǎo)時間表達(dá)量見表17，結(jié)果表明在菌體生長至OD600為0.9左右時，加入0.1mM IPTG和補(bǔ)充培養(yǎng)基，誘導(dǎo)0.5小時-1.5小時表達(dá)量較低，誘導(dǎo)2小時后表達(dá)量較高，隨著誘導(dǎo)時間的延長，表達(dá)量也較高。
表17 不同誘導(dǎo)時間pET-POB在E.coli BL21中的表達(dá)1 2 3 4 5 6誘導(dǎo)時間(小時)0.51 1.52.02.53表達(dá)量(％) 16.9 21.1 28.9 45.5 48.6 47.0(4)蛋白質(zhì)純化pET-POB在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)融合蛋白表達(dá)量為41.0％，經(jīng)裂解細(xì)胞STE洗滌變性和復(fù)性后其純度達(dá)95.6％。掃描蛋白圖譜見附圖7。5.表達(dá)蛋白的Western-blotting檢測(1)融合蛋白Western-blotting檢測把在大腸桿菌中融合表達(dá)的人和豬Leptin電泳轉(zhuǎn)膜，同時加入人和豬Leptin抗體，進(jìn)行雜交。其Western-blotting檢測結(jié)果見附圖8。
(2)人非融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物及血清Western-blotting檢測人血清及表達(dá)的人非融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，加入兔抗人Leptin抗血清和標(biāo)有辣根過氧化物酶的二抗，再經(jīng)顯色。其Western-blotting檢測結(jié)果見附圖9。
(3)豬非融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物及血清Western-blotting檢測豬血清及表達(dá)的豬非融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，加入兔抗豬Leptin抗血清和標(biāo)有辣根過氧化物酶的二抗，再經(jīng)顯色。其Western-blotting檢測結(jié)果見附圖10。6.Leptin的生物學(xué)活性檢測將提取的人和豬的Leptin按上述實(shí)驗(yàn)方法注射小鼠，以檢測Leptin的生物學(xué)活性。結(jié)果如表18所示。
表18 Leptin生物學(xué)活性的檢測結(jié)果
根據(jù)以上結(jié)果作圖，結(jié)果見附圖11。
方差分析結(jié)果見表19。
表19 方差分析結(jié)果
注最小二乘均值比較時相同字母的差異不顯著(P＞0.05)附錄本發(fā)明所涉及的序列SEQ NO 1 GTGCCCATCCAAAAAGTCCAAGATGACACCAAAACCCTCATCAAGACAATTGTCACCAGGATCAATGACATTTCACACACGCAGTCAGTCTCCTCCAAACAGAAAGTCACCGGTTTGGACTTCATTCCTGGGCTCCACCCCATCCTGACCTTATCCAAGATGGACCAGACACTGGCAGTCTACCAACAGATCCTCACCAGTATGCCTTCCAGAAACGTGATCCAAATATCCAACGACCTGGAGAACCTCCGGGATCTTCTTCACCTGCTGGCCTTCTCTAAGAGCTGCCACTTGCCCTGGGCCAGTGGCCTGGAGACCTTGGACAGCCTGGGGGGTGTCCTGGAAGCTTCAGGCTACTCCACAGAGGTGGTGGCCCTGAGCAGGCTGCAGGGGTCTCTGCAGGACATGCTGTGGCAGCTGGACCTCAGCCCTGGGTGCTGASEQ NO 2GTGCCGATCCAAAAAGTCCAAGATGACACCAAAACCCTCATCAAGACAATTGTCACCAGGATCAATGACATTTCACACACGCAGTCAGTCTCCTCCAAACAGAAAGTCACCGGTTTGGACTTCATTCCTGGGCTCCACCCCATCCTGACCTTATCCAAGATGGACCAGACACTGGCAGTCTACCAACAGATCCTCACCAGTATGCCTTCCAGAAACGTGATCCAAATATCCAACGACCTGGAGAACCTCCGGGATCTTCTTCACCTGCTGGCCTTCTCTAAGAGCTGCCACTTGCCCTGGGCCAGTGGCCTGGAGACCTTGGACAGCCTGGGGGGTGTCCTGGAAGCTTCAGGCTACTCCACAGAGGTGGTGGCCCTGAGCAGGCTGCAGGGGTCTCTGCAGGACATGCTGTGGCAGCTGGACCTCAGCCCTGGGTGCTGASEQ NO 3GTGCCGATCTGGAGAGTCCAGGATGACACCAAAACCCTCATCAAGACGATTGTCACCAGGATCAGTGACATTTCACACATGCAGTCTGTCTCCTCCAAACAGAGGGTCACCGGTTTGGACTTCATCCCTGGGCTCCATCCTGTCCTGAGTTTGTCCAAGATGGACCAGACCCTGGCGATCTACCAACAGATCCTCACCAGTCTGCCTTCCAGAAATGTGATCCAAATATCGAATGACCTGGAGAACCTCCGGGACCTTCTCCACCTGCTGGCCTCCTCCAAGAGCTGCCCCTTGCCCCAGGCCAGGGCCCTGGAGACCTTGGAGAGCCTGGGCGGCGTCCTGGAAGCCTCCCTCTACTCCACGGAGGTGGTGGCCCTGAGCAGGCTGCAGGGGGCTCTGCAGGACATGCTGCGGCAGCTGGACCTCAGCCCTGGCTGCTGA附圖及其說明1、圖1至圖4為經(jīng)修飾的人和豬ob cDNA融合和非融合表達(dá)電泳圖；其中圖1為經(jīng)修飾的人ob cDNA融合表達(dá)電泳圖；其中圖2為經(jīng)修飾的人ob cDNA非融合表達(dá)電泳圖；其中圖3為經(jīng)修飾的豬ob cDNA融合表達(dá)電泳圖；其中圖4為經(jīng)修飾的豬ob cDNA非融合表達(dá)電泳圖；可以看出，融合表達(dá)有一條42KD的表達(dá)電泳帶，非融合表達(dá)有一條16KD的表達(dá)電泳帶，表達(dá)電泳帶均是對照中所沒有的。2、圖5為融合表達(dá)載體的構(gòu)建；3、圖6為非融合表達(dá)載體的構(gòu)建；4、圖7為重組蛋白純化的SDS-PAGE電泳圖譜；其中1為pGEMX-POB在E.coli BL21中的表達(dá)，2和3為包涵體，4為洗滌包涵體上清，5為純化的包涵體，MW為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。5、圖8為提取重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜；其中1E.coli BL21總蛋白；2pET-HOB在E.coli BL21中總蛋白；3pET-HOB在E.coli BL21中的表達(dá)；4-6純化的HOB；MW蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。6、圖9為純化的蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳圖譜其中1pGEMX-POB在E.coli BL21中的表達(dá)；2和3包涵體；4裂解細(xì)胞上清；5純化的蛋白質(zhì)；M蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。7、圖10為純化的蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳圖譜其中ck1E.coli BL21總蛋白ck2pET-POB在E.coli BL21中總蛋白；1pET-HOB在E.coli BL21中的表達(dá)；2，3純化的POB；MW蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。8、圖11為融合蛋白的Western-blotting檢測圖其中1人ob基因融合表達(dá)蛋白；2豬ob基因融合表達(dá)蛋白；MW分子量標(biāo)準(zhǔn)。9、圖12為人ob基因表達(dá)產(chǎn)物及人血清Western-blotting檢測其中1人血清；2HOB在E.coli中的表達(dá)產(chǎn)物；MW分子量標(biāo)準(zhǔn)。10、圖13為豬ob基因表達(dá)產(chǎn)物及人血清Western-blotting檢測其中1豬血清；2POB在E.coli中的表達(dá)；MW分子量標(biāo)準(zhǔn)。11、圖14為Leptin生物學(xué)活性檢測分析圖說明系列1非注射系列2注射10mM Tris；系列3注射POB；系列4注射HOB。
權(quán)利要求
1.一種修飾瘦蛋白(leptin)基因cDNA序列的方法，其特征在于該方法包括改變該基因cDNA序列的某些核苷酸組成，并增強(qiáng)該基因的表達(dá)；
2.權(quán)利要求1的修飾瘦蛋白基因cDNA序列的方法，其中所說的瘦蛋白基因是人瘦蛋白基因；
3.權(quán)利要求1的修飾瘦蛋白基因cDNA序列的方法，其中所說的瘦蛋白基因是豬瘦蛋白基因；
4.權(quán)利要求1的修飾瘦蛋白基因cDNA序列的方法，其中所說的改變該基因cDNA序列的某些核苷酸組成包括改變該基因cDNA序列的一個核苷酸組成；
5.權(quán)利要求1的修飾瘦蛋白基因cDNA序列的方法，其中所說的改變該基因cDNA序列的某些核苷酸組成包括改變該基因cDNA序列中編碼第二個氨基酸中的一個核苷酸組成；
6.權(quán)利要求1的修飾瘦蛋白基因cDNA序列的方法，其中所說的改變該基因cDNA序列的某些核苷酸組成包括把該基因cDNA序列中編碼第二個氨基酸脯氨酸的CCC改變?yōu)镃CG；
7.權(quán)利要求1的修飾瘦蛋白基因cDNA序列的方法，其中所說的該基因的表達(dá)包括該基因的融合表達(dá)和非融合表達(dá)；
8.權(quán)利要求1的修飾瘦蛋白基因cDNA序列的方法，其中所說的增強(qiáng)該基因的表達(dá)包括增強(qiáng)該基因在大腸桿菌(E.coli)中的表達(dá)；
9.權(quán)利要求1的修飾瘦蛋白基因cDNA序列的方法，其中所說的增強(qiáng)該基因的表達(dá)包括其增強(qiáng)效率最高可達(dá)49％-55％；
10.一種降低個體體重的方法，其特征是使用由上述權(quán)利要求1的修飾瘦蛋白基因的方法產(chǎn)生的瘦蛋白；
11.權(quán)利要求10的降低個體體重的方法，其中所說的降低個體體重是通過減少脂肪沉積和能量消耗實(shí)現(xiàn)的；
12.一種提高飼料利用率的方法，其特征是使用由上述權(quán)利要求1的修飾瘦蛋白基因的方法產(chǎn)生的瘦蛋白；
13.一種提高瘦肉率的方法，其特征是使用由上述權(quán)利要求1的修飾瘦蛋白基因的方法產(chǎn)生的瘦蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供了瘦蛋白基因的一種修飾方法,該方法能有效地增加瘦蛋白基因的表達(dá),其最大表達(dá)量可達(dá)49%－55%;并且,利用該方法的產(chǎn)物可有效地降低個體體重、提高飼料利用率和瘦肉率。
文檔編號C07K14/435GK1366051SQ0110046
公開日2002年8月28日 申請日期2001年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月15日
發(fā)明者李寧, 昔奮攻, 吳常信 申請人:李寧