專利名稱：昆蟲(chóng)病毒載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明在美國(guó)政府資助下完成(環(huán)保局的資助號(hào)為CR822902，美國(guó)農(nóng)業(yè)部的資助號(hào)為58-3148-6-029和94-34190-1204，AGRICCREE的授予號(hào)為94-39210-0559)。美國(guó)政府在本發(fā)明中具有一定的權(quán)益。
背景技術(shù)：
植物中有用化合物(例如治療劑、化學(xué)原料、化妝品和其它消費(fèi)品)的合成以及用于作物改良的遺傳工程(例如遺傳工程抗病原體植物)是在全世界具有日益增加的經(jīng)濟(jì)重要性和研究?jī)r(jià)值的植物生物技術(shù)的兩個(gè)領(lǐng)域(Miele，1997；Franken等，1997；Beachy，1997；Ma等，1996；Estruch等，1997；Palmgren，1997)。另外，植物基因組文庫(kù)和EST文庫(kù)的可用性正在改變著商業(yè)植物生物技術(shù)的潛力(Briggs等，1997；McKusick，1997；和Evans等，1997)。特別是，因?yàn)樵S多植物性狀例如產(chǎn)量、收獲指數(shù)、雜種優(yōu)勢(shì)和環(huán)境脅迫耐性受幾種基因協(xié)同作用的調(diào)節(jié)，所以利用基因序列標(biāo)志和基因組文庫(kù)，提供了具有商業(yè)價(jià)值的基因的鑒定方法或所述基因的現(xiàn)成資源。
正在開(kāi)發(fā)基于幾種植物病毒的載體，所述植物病毒例如煙草花葉病毒(TMV)、豇豆花葉病毒(CpMV)、雀麥花葉病毒(例如BMV)和馬鈴薯Y病毒組(Yusibov等，1997；Reimann-Phillip等，1993；Porta等，1996；Johnson等，1997；Kollar等，1993；Pruss等，1997)，以將選定基因?qū)胫参镏?，以進(jìn)行有用化合物的合成?；诓《镜妮d體為基因轉(zhuǎn)移提供了補(bǔ)充農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化和粒子轟擊法的幾個(gè)不同的優(yōu)點(diǎn)。病毒載體易于操作，它們可以通過(guò)簡(jiǎn)單的接種而轉(zhuǎn)移，并且它們?cè)谵D(zhuǎn)染的植物中允許高水平的表達(dá)。然而，現(xiàn)有的基于植物病毒的載體系統(tǒng)有其限制。它們?cè)谄渲参锛闹髦锌梢砸鸩『?，范圍從較輕的病害至災(zāi)難性病害。此外，它們本質(zhì)上在田間是從一個(gè)植株自然傳播至另一個(gè)植株，并且在某些情況下它們可以通過(guò)花粉或種子傳播至下一代。而且，這些病毒的許多病毒的寄主范圍窄，并且由于外源基因的可變表達(dá)而具有有限的實(shí)用性。
羅達(dá)病毒(Nodavirus)是小的昆蟲(chóng)來(lái)源的無(wú)包被二十面體病毒。蚊子(三帶喙庫(kù)蚊(Culex tritaeniorhynchus)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)、跗斑庫(kù)蚊(Culex tarsalis)、白紋伊蚊(Aedes albopictus)和Toxorhynchitesamboinesis)、印度谷斑螟和黑皮蠹(Plodia interpunctella鱗翅目和Attagenus piceus鞘翅目)的幼蟲(chóng)、蠟螟(Galleria mellonella鱗翅目)和蜜蜂(意大利蜜蜂(Apis mellifera)的幼蟲(chóng)是已知被羅達(dá)病毒感染、并且其中病毒感染引起麻痹和死亡的其中某些昆蟲(chóng)寄主(Tesh，1980；Bailey和Scott，1972)。代表性羅達(dá)病毒包括黑甲蟲(chóng)病毒(BBV)、禽獸棚病毒(FHV)、布拉拉病毒(BOV)和野田村病毒(Nodamura virus)(NOV)。這些病毒是僅有的已知信使有義的、高等或低等動(dòng)物的二分基因組RNA病毒(關(guān)于綜述，參見(jiàn)Hendry，1991)。二分基因組植物病毒是已知的，但其基因組部分在分開(kāi)的病毒體中包衣殼(Bruening，1977)。
羅達(dá)病毒的天然寄主是昆蟲(chóng)，然而羅達(dá)病毒可以在動(dòng)物中繁殖(例如，NOV可以感染小鼠并且可能感染豬，參見(jiàn)Bailey和Scott，1972；Scherer和Hurlbut，1967；Scherer等，1968)，最近已經(jīng)在海洋魚類中發(fā)現(xiàn)羅達(dá)病毒(Mori等，1992；Nishizawa等，1995；Frerichs等，1996)，盡管FHV根本不在高等動(dòng)物細(xì)胞中繁殖。另外，F(xiàn)HV在植物中快速繁殖，而不引起病癥(Selling等，1990)。FHV可以通過(guò)機(jī)械摩擦葉片而被導(dǎo)入植物，或者可以通過(guò)用含病毒的溶液噴灑葉片而被導(dǎo)入。然而，F(xiàn)HV移動(dòng)差，或根本不從感染部位轉(zhuǎn)移。
因此，需要將所需的或預(yù)選的核酸區(qū)段或序列系統(tǒng)或局部轉(zhuǎn)移至植物、而不引起那些植物病害的載體。
發(fā)明概述本發(fā)明提供一種可用于將基因轉(zhuǎn)移至植物和動(dòng)物(例如昆蟲(chóng))的基于重組病毒核酸的基因轉(zhuǎn)移載體。最好是，所述載體衍生自具有一個(gè)二分基因組包括單鏈線性RNA的病毒，例如羅達(dá)病毒(Hendry，1991)、香石竹病毒組(Dianthovirus)、煙草脆裂病毒組(Tobravirus)(Matthews，1991)等。因此，本發(fā)明提供一種包含連接的核酸序列的生物活性基因轉(zhuǎn)移載體。所述連接的核酸序列包括一段來(lái)源于病毒核酸5’端(例如羅達(dá)病毒RNA-1或羅達(dá)病毒RNA-2的5’端)的核酸序列；一段包含至少一個(gè)目的核酸區(qū)段的核酸序列；和一段來(lái)源于病毒核酸3’端(例如羅達(dá)病毒RNA-1或羅達(dá)病毒RNA-2的3’端)的核酸序列。所述包含目的核酸區(qū)段的核酸序列最好編碼植物病毒移動(dòng)蛋白、植物病毒外殼蛋白(例如天然外殼蛋白或具有與天然外殼蛋白不同特性的修飾外殼蛋白)、生長(zhǎng)激素、毒素(例如亞致死毒素，如生長(zhǎng)素或Photorhabdus毒素)、細(xì)胞因子、抗病性、抗蟲(chóng)性、雄性不育性、可用于疫苗生產(chǎn)的病毒表面上的抗原性部位、或殺蟲(chóng)劑抗性；和/或包含一個(gè)合成基因、導(dǎo)向反義RNA序列/修飾植物特性的酶、標(biāo)記基因或選擇標(biāo)記、或它們的任何組合。最好是，核酸區(qū)段包含經(jīng)修飾以在植物中增強(qiáng)表達(dá)的序列。所述核酸區(qū)段最好是連接的，以便產(chǎn)生融合多肽?；蛘撸梢詫⒕幋a蛋白酶解部位的核酸序列導(dǎo)入每種核酸區(qū)段之間。任選的是，每種核酸區(qū)段可以操作性地連接于一個(gè)轉(zhuǎn)錄控制單位，例如啟動(dòng)子。本發(fā)明的載體可以與以下載體組合其它基于動(dòng)物病毒的載體、基于植物病毒的載體或其它基于昆蟲(chóng)病毒的載體，例如基于煙草花葉病毒的載體(Beachy，1997)、基于桿狀病毒的載體(Schneemann等，1993)或基于痘苗病毒的載體(Ball，1992)。
本發(fā)明的一種優(yōu)選載體在所述載體的5’端和3’端包含羅達(dá)病毒核酸，并且編碼植物病毒移動(dòng)蛋白(MP)。MP有助于病毒或病毒核蛋白(遺傳物質(zhì)加“載體蛋白”)從植物細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)至植物細(xì)胞。因此，MP在具有本發(fā)明載體的植物細(xì)胞中的表達(dá)，導(dǎo)致載體序列傳播至周圍植物細(xì)胞，這導(dǎo)致那些序列的局部或瞬時(shí)傳播和表達(dá)。因此，當(dāng)需要瞬時(shí)或定位表達(dá)并且所述表達(dá)足夠(如在高通量篩選/基因組學(xué)(genomics)中)時(shí)，與轉(zhuǎn)基因法相比，本發(fā)明載體的傳播可以顯著減少表達(dá)篩選時(shí)間。另外，由于羅達(dá)病毒、香石竹病毒組和煙草脆裂病毒組可以通過(guò)簡(jiǎn)單地機(jī)械摩擦葉片而傳播，因此基于這些病毒的載體可以用于現(xiàn)有的植物品種上，而無(wú)需制備轉(zhuǎn)基因形式。特別是，本發(fā)明提供了一種作物改良方法，所述方法避免了制備轉(zhuǎn)基因作物所需的耗時(shí)且昂貴的方法，并且避免了與轉(zhuǎn)基因法相關(guān)的種子庫(kù)和種質(zhì)保藏中心的外源基因污染的可能性。
本發(fā)明還提供一種將預(yù)選核酸序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法。該方法包括使宿主細(xì)胞與表達(dá)所述預(yù)選核酸序列有效量的本發(fā)明載體接觸，而無(wú)需產(chǎn)生感染性病毒粒子。如果所述宿主是一種有機(jī)體，沒(méi)有感染性病毒則完全消除了任何意外的和不希望有的對(duì)宿主(例如昆蟲(chóng)或人類)的威脅。最好是，對(duì)于植物宿主而言，所述接觸包括機(jī)械摩擦例如葉片。
本發(fā)明還提供可用于將基因轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞的組合物。本發(fā)明組合物的一個(gè)實(shí)施方案包括(a)一定量的編碼病毒聚合酶(復(fù)制酶)的核酸，例如羅達(dá)病毒RNA-1；和(b)一定量的重組核酸。所述重組核酸包含一段衍生自病毒核酸5’端(例如羅達(dá)病毒RNA-2的5’端)的核酸序列；包含至少一種目的核酸區(qū)段的核酸序列；和一段衍生自病毒核酸3’端(例如羅達(dá)病毒RNA-2的3’端)的核酸序列。在本發(fā)明組合物中存在編碼病毒復(fù)制酶的核酸(例如羅達(dá)病毒的RNA-1)，使得與編碼所述復(fù)制酶的核酸共轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞的核酸分子能夠擴(kuò)增。另一方面，復(fù)制酶可以由宿主細(xì)胞編碼。編碼復(fù)制酶的優(yōu)選核酸序列包括FHVRNA-1。RNA分子可以在體外制備，例如用T7、T3或SP6聚合酶制備，或者通過(guò)從病毒體中分離或從培養(yǎng)的已經(jīng)用本發(fā)明的RNA或DNA分子或組合物轉(zhuǎn)染或已經(jīng)接觸所述RNA或RNA分子或組合物的細(xì)胞(例如嚙齒動(dòng)物、果蠅屬(Drosophilia)或昆蟲(chóng)細(xì)胞)中分離，制備RNA分子。
如果需要系統(tǒng)轉(zhuǎn)移目的基因，則本發(fā)明組合物中的核酸序列之一最好編碼一種CP，并且任選地也編碼一種MP，使得所述載體傳播至維管組織(韌皮部)。CP和MP的表達(dá)可以允許高產(chǎn)量地合成所需化合物，并且可能導(dǎo)致賦予所有植物組織抗病性。如下所述，可以制備用于系統(tǒng)感染植物的基于FHV的載體，所述載體包括煙草花葉病毒的30kDa移動(dòng)蛋白(TMV MP；Deom等，1992)和紅三葉草壞死花葉病毒(RCNMV；Xiong等，1993)的外殼蛋白。為了監(jiān)測(cè)載體通過(guò)植物的移動(dòng)，可以將標(biāo)記基因例如編碼綠色熒光蛋白(GFP，Epel等，1996；和Casper等，1996)的基因?qū)胨鲚d體中。GFP是一種最早從水母(維多利亞水母(Aequorea victoria))(Av)中分離的具有238個(gè)氨基酸殘基的蛋白。它吸收藍(lán)光，在395nm有最大吸收，并且發(fā)射發(fā)射峰在590nm的綠光。當(dāng)GFP在或者原核細(xì)胞或者真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，它能夠在用藍(lán)光激發(fā)時(shí)產(chǎn)生強(qiáng)綠色熒光，并且這種熒光不需要來(lái)自其宿主的額外基因產(chǎn)物。
因此，本發(fā)明的載體和組合物可以用來(lái)合成所需的藥理學(xué)化合物或其它因子，例如編碼抗蟲(chóng)性的因子，還可以用于高通量篩選尚未鑒定的遺傳物質(zhì)，例如來(lái)自抗殺蟲(chóng)劑植物的尚未鑒定的遺傳物質(zhì)或編碼有用性狀的昆蟲(chóng)核酸。例如，將尚未鑒定的來(lái)自抗蟲(chóng)植物的遺傳物質(zhì)導(dǎo)入本發(fā)明載體中，然后由其表達(dá)RNA，并且制備本發(fā)明的組合物。使易感所述害蟲(chóng)的植物接觸所述組合物，最好通過(guò)噴灑接觸，然后將其暴露于害蟲(chóng)侵襲。表現(xiàn)出抗性跡象的葉片指示出所導(dǎo)入的遺傳物質(zhì)可以編碼抗蟲(chóng)性。
因此，本發(fā)明也提供一種用于昆蟲(chóng)和人類的發(fā)育基因、調(diào)節(jié)基因以及抗藥性基因和毒性基因的快速檢測(cè)系統(tǒng)。
對(duì)于其中要表達(dá)重組蛋白、然后從所述宿主植物中分離所述重組蛋白(例如藥用化合物)的應(yīng)用，最好將本發(fā)明的組合物通過(guò)摩擦或噴灑施用于所述植物。例如，所述植物的接觸區(qū)可以使得僅所述植物的葉片接觸所述組合物，例如，其葉片沒(méi)有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物，如塊莖作物。所述蛋白一經(jīng)在該植物中表達(dá)，就可以從所述植物或其組織中分離和/或純化所述重組蛋白。
也提供了一種在宿主細(xì)胞或宿主中表達(dá)預(yù)選核酸分子的方法。所述方法包括使宿主細(xì)胞或宿主與一定量的本發(fā)明組合物接觸。優(yōu)選的組合物包括重組病毒、分離的病毒體RNA、體外制備的RNA轉(zhuǎn)錄物或它們的任何組合。然后檢測(cè)或測(cè)定目的基因的表達(dá)。因此，本發(fā)明還提供一種轉(zhuǎn)基因宿主，其基因組增加了本發(fā)明的載體。
對(duì)于本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)移載體和組合物的優(yōu)選植物宿主包括轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因的單子葉植物和雙子葉植物，例如蕓苔屬(Brassica)、甜玉米、黃瓜、大麥、土荊芥例如雜配藜(Chenopofium hybridum)、豇豆、煙草和Nicotiana benthamiana等。所述植物宿主最好是對(duì)羅達(dá)病毒感染易感的。
附圖簡(jiǎn)述


圖1.禽獸棚病毒(FHV)的基因組組構(gòu)。FHV是一種直徑為30nin、具有二分基因組的小二十面體病毒。RNA-1是加帽的，長(zhǎng)約3.1kb，并且編碼一種約112kDa的復(fù)制酶。RNA-2是加帽的，長(zhǎng)約1.4kb，并且編碼一種44kDa的外殼/衣殼蛋白前體。RNA-3也是加帽的，長(zhǎng)約0.39kb，編碼一種11.6kDa蛋白。3’末端的實(shí)心圓表示這些末端是遮蔽或封閉的。RNA-1和RNA-2兩者在同一病毒體中包衣殼。
圖2.FHV RNA-2和缺陷干擾型RNA DI-634的結(jié)構(gòu)。DI-634是一種RNA-2的634b自發(fā)缺失產(chǎn)物，該產(chǎn)物被有效地復(fù)制并包裝到病毒體中。標(biāo)記I、II、III的區(qū)段對(duì)應(yīng)于來(lái)自FHV RNA-2的5’端、中部和3’端的序列；細(xì)線代表從RNA-2缺失的區(qū)域。
圖3.FHV RNA-2復(fù)制所需的順式作用序列。(A)實(shí)心帶表示FHVRNA-2的全長(zhǎng)cDNA克隆或缺失突變體中存在的cDNA的序列。細(xì)線代表缺失的(Δ)堿基，所述缺失的堿基示于每個(gè)構(gòu)建體的右側(cè)。如Zhong等(1992)所述，測(cè)定相對(duì)于全長(zhǎng)克隆(100％)的缺失突變體的復(fù)制效率。復(fù)制效率非常差的突變體用箭頭指示。(B)實(shí)心塊表示FHVRNA-2復(fù)制必需的三個(gè)區(qū)段。
圖4.羅達(dá)病毒的RNA-2s中推定包衣殼序列的計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。FHV、BBV、BOV和NOV的RNA-2s總長(zhǎng)分別是1400、1399、1305和1355個(gè)堿基(Dasgupta和Sgro，1989)。
圖5.顯示植物中FHV合成的檢測(cè)方法的示意圖。如Selling等(1990)所述，用FHV RNA接種多種植物種的單個(gè)葉片。通過(guò)噬斑測(cè)定檢測(cè)，在得自大麥、土荊芥、豇豆和Nivotiana brnthamiana的接種葉片的大多數(shù)勻漿中發(fā)現(xiàn)FHV的感染性。
圖6.RCNMV的基因組組構(gòu)。RNA-1和RNA-2以實(shí)線表示，而ORF以空心框表示。ORF之上或之下的數(shù)字表示ORF起始密碼子和終止密碼子的位置。RNA-1中的核糖體移碼區(qū)以陰影框標(biāo)記。預(yù)測(cè)并觀察到的蛋白產(chǎn)物以實(shí)心框表示。RCNMV蛋白的已知功能(Matthews，1991)在每種蛋白之下描述。
圖7.載體構(gòu)建、RNA制備、接種和檢測(cè)的一般策略。
圖8.編碼綠色熒光蛋白(GFP)的基于羅達(dá)病毒RNA-2的載體的構(gòu)建。用含NsiI位點(diǎn)的引物，通過(guò)PCR從TMV cDNA克隆p30BGFPC3中擴(kuò)增GFP序列。用NsiI消化這種PCR產(chǎn)物和FHV cDNA克隆pBWD2，然后進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生FHV RNA-2GFP嵌合體pF2G3。顯示了核苷酸位置和特有限制位點(diǎn)。
圖9.編碼煙草花葉病毒移動(dòng)蛋白(TMV MP)和GFP的基于羅達(dá)病毒DI的載體的構(gòu)建。用含Sac I位點(diǎn)的引物，通過(guò)PCR從TMVcDNA克隆p30BGFPC3中擴(kuò)增GFP序列和MP序列。用Sac I消化這種PCR產(chǎn)物和FHV DI cDNA克隆pD1634，然后進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生FHV DITMV MPGFP嵌合體pFdTmG3。顯示了核苷酸位置和特有限制位點(diǎn)。
圖10.編碼TMV MP、紅三葉草壞死花葉病毒外殼蛋白(RCNMVCP)和GFP的基于羅達(dá)病毒DI的載體的構(gòu)建。從RCNMV cDNA克隆pRC1中擴(kuò)增RCNMV外殼蛋白序列，將其插入上述pFdTmG3的MP和GFP序列之間，產(chǎn)生pFdTmRcG3。T3＝T3啟動(dòng)子；T7＝T7啟動(dòng)子；RBZ＝核酶。
圖11.基于FHV的載體構(gòu)建體在Nicotiana benthamiana植株上的監(jiān)視表達(dá)。用利用T3或T7 RNA聚合酶體外制備的RNA轉(zhuǎn)錄物摩擦葉片，接種葉片。所有植物用作為FHV復(fù)制酶來(lái)源的FHV RNA-1共同接種。
圖12.從TMV MP轉(zhuǎn)基因植株或RCNMV MP轉(zhuǎn)基因植株的N.benthamiana接種葉片和從第二片葉片提取的RNA的RT-PCR。1道；用作模板的純化的FHV RNA-2(800ng)。2道；模擬(緩沖液)接種的葉片。3道；野生型(非轉(zhuǎn)基因)植株的接種葉片。4道；野生型植株的非接種第二片葉片。5道；TMV MP轉(zhuǎn)基因植株的接種葉片。6道；TMV MP轉(zhuǎn)基因植株的非接種第二片葉片。7道；RCNMV MP轉(zhuǎn)基因植株的接種葉片。8道；RCNMV MP轉(zhuǎn)基因植株的非接種第二片葉片。9道；標(biāo)記。箭頭表示對(duì)應(yīng)于全長(zhǎng)FHV RNA-2(1.4kb)的PCR產(chǎn)物。TMV MP和RCNMV MP都使FHV移動(dòng)至非接種的第二片葉片。
圖13A.表達(dá)GFP的N.benthamiana植株的葉片。用來(lái)自TMV表達(dá)載體30BGFPC3(一種10.4kb質(zhì)粒，含有TMV復(fù)制酶、所述30kDa MP、GFP和CP)的1μgRNA轉(zhuǎn)錄物接種表達(dá)TMV MP的2周齡轉(zhuǎn)基因植株。接種后10天，將植株置于兩個(gè)長(zhǎng)波UV燈之間，并且用Sony 3CCD彩色攝像機(jī)(DXC-960MD型)拍攝照片。
圖13B.表達(dá)GFP的N.benthamiana植株的照片。條件與
圖13A中的條件一樣，只是用Minolta MaMaxxum 7000i照相機(jī)和1000 ASAKodak Ectachrome膠片拍照。將膠片曝光4秒。
圖14.在與
圖13所述的相同條件下培養(yǎng)和拍照的未接種N.benthamiana植株的葉片。請(qǐng)注意，葉片由于UV燈而呈紫色，但沒(méi)有觀察到綠色熒光。
圖15.一種含系統(tǒng)獲得性抗性基因SAR 8.2的質(zhì)粒pCGN1788A的圖譜。將BamHI-SstI片段(529bp)引入基于FHV的載體pFdTmRcG3中。
圖16.四種Photorhabdus毒素(Pht)基因座-tca、tcb、tcc和tcd的圖譜。在每個(gè)基因座之下顯示了用于基因破壞的限制位點(diǎn)。陰影顯示假定蛋白酶切割位點(diǎn)周圍的TcaB、TcbA和TcdA之間相似性的區(qū)域。將來(lái)自基因座tca和tcd的片段(Bowen等，1998)亞克隆到我們的基于FHV的載體pFdTmRcG3中，并測(cè)試其毒性。
圖17.植株中FHV的產(chǎn)量。通過(guò)在果蠅屬細(xì)胞單層上進(jìn)行葉片勻漿的噬斑測(cè)定，測(cè)定產(chǎn)量。產(chǎn)量以每mg葉片組織(100-500mg)的噬斑形成單位(pfu)表示。注意到與非轉(zhuǎn)化(野生型)植株相比，在轉(zhuǎn)基因N.benthamiana植株中100倍的增加。
發(fā)明詳述I.羅達(dá)病毒的復(fù)制和傳播A.羅達(dá)病毒的基因組組構(gòu)
圖1顯示了代表性羅達(dá)病毒FHV的基因組策略。RNA-1和RNA-2是在一個(gè)病毒體中包衣殼的有義RNA。FHV RNA-1(3106個(gè)堿基)編碼稱為A的蛋白(112kDa)，該蛋白負(fù)責(zé)聚合酶(復(fù)制酶)活性。FHVRNA-2(1400個(gè)堿基)指導(dǎo)稱為α的病毒體衣殼前體(44kDa)的合成，該前體被加工成成熟外殼蛋白(稱為β；39kDa)和一個(gè)小的4.4kDa蛋白，稱為γ。感染FHV的細(xì)胞產(chǎn)生一個(gè)額外的信使-RNA-3(389個(gè)堿基)，編碼一種稱為B的蛋白(11.6kDa)。RNA-3是一種在RNA-1的3’端含有的亞基因組信使RNA，它不被包衣殼到病毒體中。B蛋白參與聚合酶的功能。所有羅達(dá)病毒RNA都在其5’端加帽(m7GpppGp)，并且與任何其它已知的RNA病毒不同，它們的3’末端是被遮蔽或封閉的，如甚至在變性條件下都抗修飾所證實(shí)的(Dasgupta等，1984)。
兩種基因組RNA的cDNA克隆都可得到，并且由這些克隆制備的體外RNA轉(zhuǎn)錄物都具有感染性，并且產(chǎn)生真正的后代病毒體(Dasmahapatra等，1986)。
B.持久性感染和DI RNA的產(chǎn)生在體外，羅達(dá)病毒在黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)細(xì)胞中生長(zhǎng)旺盛(Friesen和Rueckert，1981)，并且可以通過(guò)噬斑形成定量測(cè)定(Selling和Rueckert，1984)。當(dāng)用FHV以低感染復(fù)數(shù)(m.o.i.)或高感染復(fù)數(shù)例如0.1-10感染黑腹果蠅細(xì)胞時(shí)，病毒引起廣泛的細(xì)胞病效應(yīng)并且細(xì)胞在3天內(nèi)死亡。然而，在每輪感染循環(huán)中有約1％的感染細(xì)胞存活。這些細(xì)胞抗FHV和其它相關(guān)羅達(dá)病毒如BBV(Longworth和Archibald，1975)和BOV(Reinganum等，1985)的超感染。這些感染細(xì)胞是病毒源，可以以相似的效率裂解新鮮細(xì)胞。因此，這些細(xì)胞是以非裂解方式持久性感染的。
來(lái)自10個(gè)這些持久性感染細(xì)胞系的病毒RNA在放線菌素D存在下用3H-尿苷標(biāo)記，并且在瓊脂糖凝膠上分析。放射自顯影圖表明，在10個(gè)系中的至少4個(gè)系中，除基因組RNA外還存在小RNA(Selling，1986)。這些較小的RNA中的某些在從持久性感染細(xì)胞中純化的病毒體中發(fā)現(xiàn)，表明這些較小的RNA含有復(fù)制和包裝信號(hào)。新鮮的果蠅屬細(xì)胞用這些RNA加病毒體RNA轉(zhuǎn)染，與野生型FHV相比，引起對(duì)噬斑形成的1000倍抑制。這提示，這些RNA與基因組RNA競(jìng)爭(zhēng)復(fù)制，并且干擾基因組RNA的復(fù)制，并且可能是復(fù)制和包衣殼的更好的模板。這些RNA稱為缺陷干擾性(DI)RNA分子。
C.DI RNA的結(jié)構(gòu)DI RNA的酶測(cè)序(Dasgupta等，1980)表明，它們保留與病毒體RNA 3’端和5’端相同的序列。對(duì)應(yīng)于FHV RNA-1序列(Dasmahapatra等，1985)和RNA-2序列(Dasgupta和Sgro，1989)的末端的寡核苷酸引物用來(lái)在pUC13和pBS+載體中制備cDNA克隆。然后通過(guò)雙脫氧核苷酸鏈終止法，用測(cè)序酶(United States Biochemicals，Kraft等，1988)對(duì)這些cDNA測(cè)序。對(duì)7種DI RNA分子進(jìn)行測(cè)序。其中6種衍生自基因組RNA-2，而其中一種衍生自基因組RNA-1。根據(jù)其結(jié)構(gòu)，衍生自RNA-2的DI RNA分為三組最簡(jiǎn)單形式的DI(DI-634)，示于圖2，由于RNA-2中的兩個(gè)主要缺失而產(chǎn)生；它保留了得自RNA-25’端的前249個(gè)堿基、中部(堿基517-728)和3’端(堿基1228-1400)。沒(méi)有序列重排。
另一種類型的RNA-2衍生的DI RNA序列具有更為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。它們保留了得自基因組RNA 5’端的前15個(gè)或41個(gè)堿基，然后是得自基因組RNA-2中部的堿基75-249和堿基517-728。這些DI分子的3’一半包括得自RNA-2的5’端和3’端的序列重排。3’端的48個(gè)堿基(1353-1400)與基因組RNA-2共線性。
再一種形式的RNA-2衍生的DI保留一段得自5’端的249個(gè)堿基，而結(jié)構(gòu)的其余部分包括上述的重排。
衍生自RNA-1的DI RNA保留了得自基因組RNA的三個(gè)部分兩個(gè)末端和中部。有趣的是，雖然結(jié)構(gòu)有變異，但所有這些DI RNA均具有相似的長(zhǎng)度；約一半與其相應(yīng)的基因組RNA一樣長(zhǎng)。例如，衍生自基因組RNA-2的DI長(zhǎng)630-680個(gè)堿基，衍生自RNA-1的一個(gè)DI長(zhǎng)1395個(gè)堿基(基因組RNA-1和RNA-2分別為3106個(gè)堿基和1400個(gè)堿基)。
D.FHV RNA-2的復(fù)制和包衣殼信號(hào)通過(guò)一系列缺失和體外誘變，修飾FHV RNA-2以及DI RNA的cDNA克隆，并且分析其復(fù)制和包衣殼活性。圖3是顯示由RNA-2的cDNA克隆構(gòu)建的缺失突變體的示意圖。得自這些突變體的轉(zhuǎn)錄物用來(lái)轉(zhuǎn)染果蠅屬細(xì)胞，并且測(cè)定12小時(shí)后合成的RNA(Zhong等，1992)。發(fā)現(xiàn)得自5’端的60個(gè)堿基、147個(gè)堿基的內(nèi)部區(qū)(堿基470-616)和3’端最后51個(gè)堿基(1350-1400)的一段序列對(duì)于FHV RNA-2的有效復(fù)制是重要的(B圖；分別為區(qū)段I、II和III)。當(dāng)缺失這些區(qū)時(shí)，RNA-2的體內(nèi)復(fù)制非常差(在圖3A中由箭頭表示)。
用DI RNA(DI 634，示于圖2)對(duì)包衣殼信號(hào)的相似研究表明，RNA-2的32堿基區(qū)(堿基186-217)是有效包裝到病毒體中所需的。該區(qū)的缺失完全消除了DI RNA包裝到病毒體中，但對(duì)復(fù)制沒(méi)有影響。已經(jīng)預(yù)測(cè)到該序列形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)(示于圖4)，莖環(huán)結(jié)構(gòu)在所有羅達(dá)病毒RNA-2s中是保留的(Zhong等，1992)。也發(fā)現(xiàn)相似的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)在酵母的L-A病毒噬菌體Qβ和R17中以及在日冕病毒(Coronaviruses)中用作包裝信號(hào)。
F.FHV在植物中的繁殖病毒在宿主植物中的繁殖涉及在各種各樣組織中的病毒移動(dòng)/復(fù)制。病毒在感染后進(jìn)入受傷細(xì)胞，并且合成其自身的蛋白。病毒編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白之一-移動(dòng)蛋白(MP)使得感染性核蛋白得以在細(xì)胞之間移動(dòng)，直至感染達(dá)到維管組織。
在稱為微管或長(zhǎng)距離移動(dòng)的第二個(gè)步驟中，整株植株被感染。為此，感染性核蛋白必須進(jìn)入維管組織、在維管組織中移動(dòng)并離開(kāi)維管組織。研究表明，MP是細(xì)胞至細(xì)胞移動(dòng)所需的，但僅MP不足以引起系統(tǒng)感染。在大多數(shù)植物病毒中，長(zhǎng)距離移動(dòng)需要外殼蛋白(CP)和宿主因子(關(guān)于綜述，參見(jiàn)Seron等，1996；Deom等，1992)。
為了確定FHV是否在植株中復(fù)制，用FHV RNA接種該植株。在暴露于FHV RNA的大麥(Hordeum vulgare)、豇豆(Vigna sinensis)、土荊芥(雜配藜)、Nicotianabenthamiana(Selling，1990)、水稻、苜蓿、甜玉米、蕓苔屬植物、黃瓜和擬南芥屬(
圖17，數(shù)據(jù)未顯示)的整株植株中以及在得自大麥葉片和煙草葉片的原生質(zhì)體(圖5和表1)中，已經(jīng)檢測(cè)到新合成的病毒體。
表1接觸病毒后的病毒體產(chǎn)生+
+得自Selling，1990在大麥原生質(zhì)體中，病毒的產(chǎn)量是每個(gè)原生質(zhì)體130pfu，這代表估計(jì)最小約3％的原生質(zhì)體合成病毒體。植株中產(chǎn)生的病毒體含有新合成的RNA以及新合成的衣殼蛋白。時(shí)程實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)HV在大麥原生質(zhì)體中的合成與FHV天然昆蟲(chóng)細(xì)胞系宿主(黑腹果蠅)在相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染條件下發(fā)現(xiàn)的合成相當(dāng)(Selling等，1990)。由1g大麥原生質(zhì)體產(chǎn)生約1.4mg FHV，這證明非常高表達(dá)水平。
在兩片接種的大麥葉片中，F(xiàn)HV產(chǎn)量為每片葉片180和3800pfu(基于果蠅屬細(xì)胞上的標(biāo)準(zhǔn)FHV噬斑測(cè)定)。用FHV感染的土荊芥、豇豆和N.benthamiana觀察到的最大平均產(chǎn)量，分別為每片葉片3.4×105、4.2×105和1.2×105pfu(
圖17)。
在N.benthamiana中，用FHV RNA接種產(chǎn)生的病毒體不僅在接種葉片中檢測(cè)到，而且在接種植株的其它葉片中檢測(cè)到，表明病毒體可以在該植物種中移動(dòng)。然而，在N.benthamiana中，這種移動(dòng)限于接種葉片之上和之下的三個(gè)葉片。此外，感染性隨時(shí)間而降低。這可能是由于病毒體在植物中的不穩(wěn)定性和/或病毒體傳播離開(kāi)接種部位。這些結(jié)果表明，植物中的胞內(nèi)環(huán)境適合于僅對(duì)昆蟲(chóng)正常固有的病毒的合成，雖然在植物中細(xì)胞至細(xì)胞移動(dòng)所必需的病毒編碼的蛋白可能不由FHV編碼。
II.本發(fā)明的載體A.病毒序列本發(fā)明的載體包含那些序列傳播至細(xì)胞所必需的病毒序列以及與所述病毒序列連接的目的序列。因此，所述載體包含順式的必需非編碼序列，即羅達(dá)病毒、煙草脆裂病毒組或香石竹病毒組核酸的5’端和3’端；和該載體傳播至其它細(xì)胞所必需的反式作用序列，即編碼病毒MP和/或CP的序列。香石竹病毒組包括香石竹環(huán)斑病毒、紅三葉草壞死花葉病毒、草木樨壞死花葉病毒和furcraea壞死線條病毒。煙草脆裂病毒組包括豌豆早枯病毒、胡椒環(huán)斑病毒、煙草脆裂病毒和哈特舌厥病毒。對(duì)于在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增載體序列，可以使用病毒復(fù)制酶。所述復(fù)制酶可以由宿主細(xì)胞基因組編碼、由在導(dǎo)入所述載體之前、同時(shí)或隨后導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的核酸序列編碼，或由所述載體編碼。
本發(fā)明的載體可以編碼任何病毒MP，包括但不限于以下病毒的移動(dòng)蛋白鴨跖草黃斑駁病毒(CoMYV)、CaMV、甘蔗桿狀病毒(ScBV)、東格魯水稻桿狀病毒(RTBV)、香石竹蝕環(huán)病毒(CERV)、玄參花葉病毒(FMV)、大豆褪綠斑駁病毒(SoyCMV)、菽麻花葉病毒(Deom等，1997)、煙草壞死病毒(Molnar等，1997)、煙草花葉病毒(Slovyev等，1996)、雙生病毒群(Sung等，1995)、馬鈴薯X病毒組、大麥病毒和甜菜黃化病毒(Agranovsky等，1998)、苜?；ㄈ~病毒(vander Vossen等，1995)、花生褪綠條線病毒(Ducasse等，1995)、菊芋斑皺病毒(Tavassa等，1994)、大麥條紋花葉病毒(Weiland等，1994)、豇豆花葉病毒(Wellink等，1993)、甜菜黃花葉病毒(Karasev等，1992)和蕪菁皺葉病毒(Hacker等，1992)。
對(duì)于植物的系統(tǒng)和/或局部感染，本發(fā)明的載體最好編碼一種植物病毒CP。典型的外殼蛋白包括但不限于以下病毒的外殼蛋白番茄叢矮病毒(TBSV)、大麥條紋花葉病毒(BSMV)、紅三葉草壞死花葉病毒(RCNMV)、黃瓜壞死病毒(CNV)、番茄金花葉病毒(TGMV)、菜豆金花葉病毒(BGMV)、番茄曲葉病毒(TLCV)、南瓜曲葉病毒(SqLCV)、非洲木薯花葉病毒(ACMV)、馬鈴薯Y病毒組、南瓜花葉病毒、大蒜病毒A(Helguera等，1997)、葡萄鉻黃花葉病毒(Torregrosa等，1997)、馬鈴薯病毒Y和馬鈴薯卷葉病毒(Zhang等，1997)、水稻矮縮病毒(Zheng等，1997)、甜菜壞死黃脈病毒(Fecker等，1996)、蒙大拿大麥黃矮病毒(Geske等，1996)、番木瓜環(huán)斑病毒(Scorza等，1995)、豌豆早枯病毒(MacFarlane等，1995)、水稻黃斑駁病毒(Brugidou等，1995)、蘋果和梨莖陷斑病毒(Jelkmann，1994)、萵苣侵染性黃化病毒、甜菜黃化病毒和柑橘衰退病毒(Klassen等，1994)、馬鈴薯病毒X(Truve等，1993)、洋李痘皰病毒(Ravelonandro等，1992)、建蘭花葉病毒和白三葉草花葉病毒(Chia等，1992)、黃瓜花葉病毒(Slightom，1991)、苜?；ㄈ~病毒(Neelman等，1991)、豇豆褪綠斑駁病毒(Allison等，1990)和鉻黃花葉病毒(Sacher等，1989)、煙草花葉病毒、花椰菜花葉病毒、蕪菁黃花葉病毒、番茄不孕病毒、甜菜壞死黃脈病毒、蕪菁皺縮病毒、煙草脆裂病毒、建蘭環(huán)斑病毒、豇豆褪綠斑駁病毒、煙草蝕紋病毒、甜菜西部黃化病毒、南部菜豆花葉病毒、菽麻花葉病毒、煙草蝕紋病毒、豇豆花葉病毒、玉米線條病毒、甜菜曲頂病毒和番茄卷葉病毒(參見(jiàn)例如Nelson和van Bel，1998的表1、2和3，所述文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。
B.用于在植物中表達(dá)的其它序列預(yù)選基因在植物中的表達(dá)可以通過(guò)多種元件或機(jī)制增強(qiáng)，包括加入啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、內(nèi)含子、前導(dǎo)序列和3’序列以及用植物中優(yōu)選的密碼子取代非植物基因中的天然密碼子(Murry等，1989；Perlak等，1991)和除去富含AT的序列、除去或改變隱蔽poly A序列和除去或改變mRNA去穩(wěn)定序列。
1.啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、內(nèi)含子、前導(dǎo)序列和其它調(diào)節(jié)序列本發(fā)明載體中的預(yù)選核酸區(qū)段最好有效連接于提供所述預(yù)選核酸區(qū)段表達(dá)的啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子最好是在引入所述載體的宿主細(xì)胞(例如植物和/或種子)中有功能的啟動(dòng)子。當(dāng)預(yù)選核酸序列位于所述啟動(dòng)子下游時(shí)，將預(yù)選核酸序列有效連接于所述啟動(dòng)子。
大多數(shù)基因具有稱為啟動(dòng)子的核酸區(qū)，啟動(dòng)子調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。對(duì)于基因組DNA所編碼的基因，在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中，啟動(dòng)子區(qū)都通常發(fā)現(xiàn)于編碼序列上游的側(cè)翼DNA中。啟動(dòng)子序列可供用于調(diào)節(jié)下游基因序列的轉(zhuǎn)錄，通常包括約50至約2,000個(gè)核苷酸堿基對(duì)。啟動(dòng)子序列也含有可以影響基因表達(dá)水平的調(diào)節(jié)序列，例如增強(qiáng)子序列。某些分離的啟動(dòng)子序列可供用于異源DNA的基因表達(dá)，異源DNA是一種不同于天然DNA或同源DNA的DNA。
也已知啟動(dòng)子序列有強(qiáng)啟動(dòng)子序列或弱啟動(dòng)子序列、或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列。強(qiáng)啟動(dòng)子提供高水平的基因表達(dá)，而弱啟動(dòng)子提供非常低水平的基因表達(dá)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是一種提供對(duì)外部加入的因子或?qū)Νh(huán)境刺激或發(fā)育刺激應(yīng)答的基因表達(dá)開(kāi)關(guān)的啟動(dòng)子。根據(jù)加入轉(zhuǎn)化細(xì)菌細(xì)胞的異丙基硫代半乳糖苷的水平，例如Ptac啟動(dòng)子的細(xì)菌啟動(dòng)子可以被誘導(dǎo)至不同的基因表達(dá)水平。啟動(dòng)子也可以提供組織特異性或發(fā)育調(diào)節(jié)。對(duì)于異源核酸為強(qiáng)啟動(dòng)子的分離的啟動(dòng)子序列是有利的，因?yàn)樗峁┳銐虻幕虮磉_(dá)水平，以使得易于檢測(cè)和選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并且當(dāng)需要時(shí)提供高水平的基因表達(dá)。
優(yōu)選的植物啟動(dòng)子包括但不限于例如以下的啟動(dòng)子CaMV 35S啟動(dòng)子(Odell等，1985)、增強(qiáng)的35S啟動(dòng)子(Kay等，1987)或其它啟動(dòng)子例如CaMV 19S(Lawton等，1987)、nos、Adhl(Walker等，1987)、蔗糖合酶(Yang等，1990)、α-微管蛋白、遍在蛋白、肌動(dòng)蛋白(Wang等，1992)、cab(Sullivan等，1989)、PEPCase(Hudspeth等，1989)或與R基因復(fù)合體相關(guān)的那些啟動(dòng)子(Chandler等，1989)。其它合適的啟動(dòng)子包括來(lái)自編碼Z4 22kDα-玉米醇溶蛋白的基因的Z4啟動(dòng)子、來(lái)自編碼10kD玉米醇溶蛋白的基因的Z10啟動(dòng)子、來(lái)自編碼27kD玉米醇溶蛋白的基因的Z27啟動(dòng)子、來(lái)自編碼19kDα-玉米醇溶蛋白的基因的A20啟動(dòng)子；誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如得自豌豆rbcS基因的光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Coruzzi等，1971)和水稻的肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(McElroy等，1990)；也可以使用種子特異性啟動(dòng)子，例如得自菜豆的菜豆蛋白啟動(dòng)子(Sengupta-Gopalan，1985)?？捎糜趯?shí)施本發(fā)明的其它啟動(dòng)子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
可以用標(biāo)準(zhǔn)方法，例如Sambrook等所述的方法(參見(jiàn)上文)，將預(yù)選核酸例如一種DNA序列與所述啟動(dòng)子結(jié)合，產(chǎn)生一種表達(dá)盒。簡(jiǎn)而言之，可以如Jefferson(1987)中所述，構(gòu)建含有啟動(dòng)子例如35SCaMV啟動(dòng)子的質(zhì)粒，或者可以從加州Palo Alto的Clontech Lab獲得所述質(zhì)粒(例如pBI121或pBI221)。通常，構(gòu)建這些質(zhì)粒，使其具有對(duì)啟動(dòng)子下游的不同限制性酶具有特異性的多克隆位點(diǎn)?？梢杂孟拗菩悦笇⑺鲱A(yù)選DNA序列亞克隆在所述啟動(dòng)子下游，并將其定位，以確保所述DNA以相對(duì)于所述啟動(dòng)子的正確方向插入，使得所述DNA可以作為有義或反義RNA表達(dá)。一旦將所述預(yù)選DNA序列有效連接于一個(gè)啟動(dòng)子，則可以將如此形成的表達(dá)盒亞克隆到本發(fā)明的載體中。
一旦獲得所述預(yù)選的有義DNA序列，則可以將全部或部分所述序列以相反方向(即3’至5’)亞克隆到一個(gè)表達(dá)載體(參見(jiàn)下文)中。同樣，可以將全部或部分所述預(yù)選DNA序列以有義方向(即5’至3’)亞克隆。將所述預(yù)選DNA序列亞克隆到啟動(dòng)子下游，以形成表達(dá)盒。
需要時(shí)，可以還包括調(diào)節(jié)元件，例如Adh內(nèi)含子1(Callis等，1987)、蔗糖合酶內(nèi)含子(Vasil等，1989)或TMVΩ元件(Gallie等，1989)以及病毒亞基因組序列，例如病毒亞基因組RNA序列。
由于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和編碼序列起始之間的DNA序列(即非翻譯前導(dǎo)序列)可以影響基因表達(dá)，因此人們也可能希望使用特定的前導(dǎo)序列。優(yōu)選的前導(dǎo)序列設(shè)計(jì)包括那些序列，所述序列包括預(yù)測(cè)指導(dǎo)所連接的基因最佳表達(dá)的序列，即包括可以增加或保持mRNA穩(wěn)定性并防止不當(dāng)起始翻譯的優(yōu)選的共有前導(dǎo)序列。根據(jù)本說(shuō)明書，這類序列的選擇是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。最優(yōu)選得自在植物中高表達(dá)基因的序列。
設(shè)想了可以構(gòu)建包括ocs增強(qiáng)子元件的按照本發(fā)明使用的載體。該元件最早鑒定為來(lái)自農(nóng)桿菌章魚堿合酶(ocs)基因的16bp回文增強(qiáng)子，并且存在于至少10個(gè)其它啟動(dòng)子中(Bouchez等，1989)。提出應(yīng)用增強(qiáng)子元件例如ocs元件、特別是多拷貝的該元件，將用來(lái)提高來(lái)自相鄰啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄水平。
最后，用于導(dǎo)入植物的最理想的核酸區(qū)段可以是編碼所需性狀(例如提高每公頃產(chǎn)量)的同源基因或基因家族，這類基因或基因家族被引入置于新型啟動(dòng)子或增強(qiáng)子等、或也許甚至是同源組織特異性(例如根特異性、根頸/鞘特異性、輪生體特異性、莖(stalk)特異性、耳柄(earshank)特異性、籽粒特異性或葉特異性)啟動(dòng)子或控制元件的控制之下。實(shí)際上，設(shè)計(jì)了本發(fā)明的一個(gè)具體應(yīng)用是以組織特異性方式引導(dǎo)基因。例如，可以在分別為第一窩和第二窩ECB的靶的輪生體和根頸/鞘組織中特異性地表達(dá)抗蟲(chóng)基因。同樣，可以將具有特定抗根蟲(chóng)活性的蛋白的編碼基因直接導(dǎo)向根組織。
用于將基因在轉(zhuǎn)基因植物中組織特異性導(dǎo)向的載體，通常包括組織特異性啟動(dòng)子，也可以包括其它組織特異性控制元件，例如增強(qiáng)子序列。根據(jù)本發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容，在某些植物組織中指導(dǎo)特異性的或增強(qiáng)的表達(dá)的啟動(dòng)子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這些包括例如rbcS啟動(dòng)子，它為綠色組織特異性的；ocs、nos和mas啟動(dòng)子，它們?cè)诟M織或受傷葉片組織中的活性較高；截短的(-90至+8)35S啟動(dòng)子，它指導(dǎo)根中增強(qiáng)的表達(dá)；指導(dǎo)在根中表達(dá)的α-微管蛋白基因和得自玉米醇溶蛋白貯藏蛋白基因的指導(dǎo)在胚乳中表達(dá)的啟動(dòng)子。特別考慮到，人們可以方便地利用得自章魚堿合酶(ocs)基因(Bonchez等，1989)的16bp ocs增強(qiáng)子元件，特別是當(dāng)以多拷貝存在時(shí)，以達(dá)到增強(qiáng)根中的表達(dá)。
也考慮了，通過(guò)導(dǎo)入與僅在不需要所述基因產(chǎn)物的組織中表達(dá)的反義基因結(jié)合的組成型表達(dá)的基因(所有組織)，可以功能性地完成組織特異性表達(dá)。例如，可以導(dǎo)入編碼蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)(Bt)晶體毒素的基因，使得利用花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子將其在所有組織中表達(dá)。利用例如玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子使所述Bt基因的反義轉(zhuǎn)錄物在玉米籽粒中表達(dá)，可能防止該Bt蛋白在種子中積累。因此，由所導(dǎo)入基因編碼的蛋白可以存在于除籽粒之外的所有組織中。
另一方面，人們可能希望獲得按照本發(fā)明使用的新型組織特異性啟動(dòng)子序列。為此，人們可以首先從所涉及的組織中分離cDNA克隆，并且例如應(yīng)用RNA印跡法鑒定在該組織中特異性表達(dá)的那些克隆。最好是，人們想要鑒定不以高拷貝數(shù)存在、但基因產(chǎn)物在特定組織中相對(duì)豐富的基因。然后可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)，將相應(yīng)的基因組克隆的啟動(dòng)子和控制元件定位。
設(shè)想了僅需要在特定條件下在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)某些基因。例如，提出賦予對(duì)環(huán)境脅迫因素(例如干旱)抗性的某些基因僅需要在真正的脅迫條件下表達(dá)。設(shè)想了這類基因在植物的整個(gè)發(fā)育期間的表達(dá)可能具有有害效應(yīng)。已知存在著大量對(duì)環(huán)境應(yīng)答的基因。例如，由光通過(guò)植物光敏素介導(dǎo)調(diào)節(jié)某些基因、例如編碼核酮糖二磷酸羧化酶小亞基的rbcS的表達(dá)。其它基因由次級(jí)刺激物誘導(dǎo)。例如，脫落酸(ABA)的合成由某些環(huán)境因素誘導(dǎo)，包括但不限于水脅迫。已經(jīng)表明許多基因由ABA誘導(dǎo)(Skriver和Mundy，1990)。也考慮了可以僅需要在實(shí)際遭受蟲(chóng)害的條件下表達(dá)賦予對(duì)昆蟲(chóng)捕食的抗性基因。因此，對(duì)于某些所需性狀，將需要在轉(zhuǎn)基因植物中誘導(dǎo)型地表達(dá)基因。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，提出僅需要在植物發(fā)育的某個(gè)時(shí)期在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)基因。發(fā)育的定時(shí)通常與組織特異性基因表達(dá)相關(guān)。例如，在傳粉后約15天在胚乳中啟動(dòng)玉米醇溶蛋白貯藏蛋白的表達(dá)。
2.胞內(nèi)或胞外導(dǎo)向序列另外，可以構(gòu)建表達(dá)盒，并用其將所述預(yù)選核酸序列或區(qū)段的產(chǎn)物導(dǎo)向植物細(xì)胞內(nèi)的胞內(nèi)區(qū)室，或?qū)⒌鞍讓?dǎo)向胞外環(huán)境。這通常可以通過(guò)將編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽或信號(hào)肽序列的DNA序列連接至所述預(yù)選DNA序列的編碼序列上來(lái)完成。所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)運(yùn)肽或信號(hào)肽分別將所述蛋白運(yùn)轉(zhuǎn)至特定的胞內(nèi)或胞外目的地，然后可以翻譯后除去所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽或信號(hào)肽。轉(zhuǎn)運(yùn)肽通過(guò)促進(jìn)蛋白穿過(guò)胞內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)(例如液泡、囊泡、質(zhì)體和線粒體膜)而起作用，而信號(hào)肽引導(dǎo)蛋白穿過(guò)胞外膜。這些序列通過(guò)促進(jìn)所述蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的區(qū)室中，可以在特定位點(diǎn)增加特定基因產(chǎn)物的積累。例如，參見(jiàn)美國(guó)專利第5,258,300號(hào)。
這種應(yīng)用的一個(gè)具體實(shí)例涉及將除草劑抗性基因(例如EPSPS基因)導(dǎo)向特定的細(xì)胞器，例如導(dǎo)向葉綠體，而不是導(dǎo)向胞質(zhì)。其實(shí)例是應(yīng)用提供蛋白質(zhì)體特異性導(dǎo)向的rbcS轉(zhuǎn)運(yùn)肽。另外，提出可能希望將負(fù)責(zé)雄性不育的某些基因?qū)蚓€粒體，或?qū)⒖怪轮参锊∮袡C(jī)體抗性的基因?qū)虬忾g隙，或?qū)⒌鞍讓?dǎo)向液泡。
也設(shè)想了將細(xì)胞內(nèi)的DNA本身定向可能是有用的。例如，將所導(dǎo)入的DNA導(dǎo)向細(xì)胞核可能是有用的，因?yàn)檫@可以提高轉(zhuǎn)化頻率。在細(xì)胞核本身中，使基因定向以便達(dá)到定點(diǎn)整合可能是有用的。例如，用通過(guò)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入的基因取代細(xì)胞中的現(xiàn)有基因可能是有用。
3.3’序列當(dāng)要將表達(dá)盒導(dǎo)入植物細(xì)胞中時(shí)，所述表達(dá)盒也可以可選地包括作為終止轉(zhuǎn)錄的信號(hào)并且使得所產(chǎn)生的mRNA聚腺苷酸化的3’非翻譯調(diào)節(jié)DNA序列。所述3’非翻譯調(diào)節(jié)DNA序列優(yōu)選包括約50個(gè)至約1,000個(gè)、更優(yōu)選約100個(gè)至約1,000個(gè)核苷酸堿基對(duì)，并且含有植物轉(zhuǎn)錄和翻譯終止序列。優(yōu)選的3’元件衍生自得自根癌農(nóng)桿菌的胭脂堿合酶基因的那些元件(Bevan等，1983)、得自根癌農(nóng)桿菌章魚堿合酶基因的T7轉(zhuǎn)錄物的終止子、和得自馬鈴薯或番茄的蛋白酶抑制劑I或II基因的3’端，雖然也可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它3’元件。這些3’非翻譯調(diào)節(jié)序列可以如An(1987)所述獲得，或已經(jīng)存在于可得自商業(yè)來(lái)源例如Clontech，Palo Alto，Califomia的質(zhì)粒?？梢杂脴?biāo)準(zhǔn)方法，將所述3’非翻譯調(diào)節(jié)序列有效連接于所述預(yù)選DNA序列的3’末端。
4.選擇標(biāo)記或可篩選標(biāo)記為了提高鑒定轉(zhuǎn)化子的能力，人們可能希望應(yīng)用選擇標(biāo)記基因或可篩選標(biāo)記基因，或者除所述預(yù)選核酸序列或區(qū)段以外，應(yīng)用選擇標(biāo)記基因或可篩選標(biāo)記基因?！皹?biāo)記基因”是賦予表達(dá)所述標(biāo)記基因的細(xì)胞特定表型、并因此使得這類轉(zhuǎn)化細(xì)胞區(qū)別于不具有所述標(biāo)記的細(xì)胞的基因。根據(jù)所述標(biāo)記是否賦予一種可以通過(guò)化學(xué)方法(即通過(guò)應(yīng)用選擇劑(例如除草劑、抗生素等))“選擇”的性狀、或者它是否是僅僅通過(guò)觀察或測(cè)試即通過(guò)“篩選”而鑒定的性狀(例如R基因座性狀)，這類基因可以編碼或者選擇標(biāo)記或者可篩選標(biāo)記。當(dāng)然，合適的標(biāo)記基因的許多實(shí)例是本領(lǐng)域已知的，并且可以用于實(shí)施本發(fā)明。
在術(shù)語(yǔ)選擇標(biāo)記基因或可篩選標(biāo)記基因中也包括編碼“可分泌標(biāo)記”的基因，可以檢測(cè)所述可分泌標(biāo)記的分泌，作為鑒定或選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的手段。實(shí)例包括編碼可以通過(guò)抗體相互作用鑒定的可分泌抗原的標(biāo)記、或甚至可以通過(guò)其催化活性檢測(cè)的可分泌的酶。可分泌蛋白屬于許多類別，包括可例如通過(guò)ELISA檢測(cè)的小的可擴(kuò)散蛋白；可在胞外溶液檢測(cè)的小的活性酶(例如α-淀粉酶、β-內(nèi)酰胺酶、膦絲菌素、乙酰轉(zhuǎn)移酶)；和插入或陷入細(xì)胞壁中的蛋白(例如包括例如在伸展蛋白的表達(dá)單位或煙草PR-S中發(fā)現(xiàn)的前導(dǎo)序列的蛋白)。
關(guān)于可分泌的選擇標(biāo)記，考慮到將匯集在細(xì)胞壁中的多肽的編碼基因的應(yīng)用特別有利，所述多肽包括獨(dú)特表位(unique epitope)。這種分泌的抗原標(biāo)記理想的是應(yīng)用在植物組織中提供低背景的表位序列、將賦予有效表達(dá)和引導(dǎo)跨越質(zhì)膜的啟動(dòng)子前導(dǎo)序列，并且將產(chǎn)生在細(xì)胞壁中結(jié)合的蛋白且不為抗體所及。經(jīng)修飾以包括一個(gè)獨(dú)特表位的正常分泌的胞壁蛋白，將滿足所有上述要求。
適合于以這種方式修飾的蛋白的一個(gè)實(shí)例是伸展蛋白或富羥脯氨酸糖蛋白(HPRG)。最好應(yīng)用玉米HipRG(Stiewfel等，1990)，因?yàn)樵摲肿右呀?jīng)在分子生物學(xué)、表達(dá)和蛋白結(jié)構(gòu)方面進(jìn)行了很好的表征。然而，可以通過(guò)加入抗原性位點(diǎn)以產(chǎn)生可篩選標(biāo)記，修飾多種伸展蛋白和/或富甘氨酸胞壁蛋白(Keller等，1989)中的任何一種。
通過(guò)應(yīng)用特定的標(biāo)記基因，詳細(xì)地例舉了本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容的元件。然而，根據(jù)本說(shuō)明書，除下文所提出的選擇標(biāo)記基因和/或可篩選標(biāo)記基因外，許多其它可能的選擇標(biāo)記基因和/或可篩選標(biāo)記基因?qū)τ诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。因此，人們會(huì)理解，以下討論是示例性的，而不是詳盡的。根據(jù)本文公開(kāi)的技術(shù)和本領(lǐng)域已知的一般重組技術(shù)，本發(fā)明使得有可能將任何基因(包括標(biāo)記基因)導(dǎo)入受體細(xì)胞中，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，例如單子葉植物細(xì)胞。
可能的結(jié)合本發(fā)明使用的選擇標(biāo)記包括但不限于neo基因(Potrykus等，1985)，它編碼卡那霉素抗性，并且可以根據(jù)應(yīng)用卡那霉素、G418進(jìn)行選擇；編碼博來(lái)霉素抗性的基因等等；bar基因，它編碼雙丙氨膦抗性；編碼改變的EPSP合酶蛋白(Hinchee等，1988)并因此賦予草甘膦抗性的基因；腈水解酶基因，例如來(lái)自鼻臭克雷伯氏菌(Klebsiella ozaenae)的bxn，它賦予溴苯腈抗性(Stalker等，1988)；突變的乙酰乳酸合酶基因(ALS)，它賦予對(duì)咪唑啉酮、磺酰脲或其它ALS抑制性化學(xué)物質(zhì)的抗性(歐洲專利申請(qǐng)154,204,1985)；氨甲蝶呤抗性DHFR基因(Thillet等，1988)；茅草枯脫鹵素酶基因，它賦予除草劑茅草枯的抗性；或突變的鄰氨基苯甲酸合酶基因，它賦予對(duì)5-甲基色氨酸的抗性。當(dāng)使用突變的EPSP合酶基因時(shí)，通過(guò)加入合適的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽CTP(歐洲專利申請(qǐng)0 218 571,1987)，可以獲得額外的益處。
能夠用于篩選轉(zhuǎn)化子的系統(tǒng)中的選擇標(biāo)記基因的一個(gè)說(shuō)明性實(shí)施方案，是編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因，例如來(lái)自吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因或來(lái)自綠色產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces viridochromogenes)的pat基因(美國(guó)專利第5,550,3 18號(hào)，該專利通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)將除草劑雙丙氨膦、膦絲菌素(PPT)中的有效成分失活。PPT抑制谷氨酰胺合成酶(Murakami等，1986；Twell等，1989)，引起氨的快速積累并引起細(xì)胞死亡。這種選擇系統(tǒng)在單子葉植物中成功的應(yīng)用尤其令人驚訝，因?yàn)閾?jù)報(bào)道在谷類作物轉(zhuǎn)化中有很大困難(Potrykus，1989)。
可以使用的可篩選標(biāo)記包括但不限于β-葡糖醛酸糖苷酶或uidA基因(GUS)，它編碼已知有各種生色底物的酶；R基因座基因，它編碼的產(chǎn)物調(diào)節(jié)植物組織中花色素苷色素(紅色)的產(chǎn)生(Dellaporta等，1988)；β-內(nèi)酰胺酶基因(Sutcliffe，1978)，它編碼的酶已知有各種生色底物(例如PADAC，一種生色頭孢菌素)；xylE基因(Zukowsky等，1983)，它編碼可以轉(zhuǎn)化生色兒茶酚的兒茶酚雙加氧酶；α-淀粉酶基因(Ikuta等，1990)；酪氨酸酶基因(Katz等，1983)，它編碼的酶能夠?qū)⒗野彼嵫趸癁镈OPA和dopaquinone，dopaquinone進(jìn)而縮合，形成易于檢測(cè)到的化合物黑色素；β-半乳糖苷酶基因，它編碼的酶有生色底物；熒光素酶(lux)基因(Ow等，1986)，它使得可以進(jìn)行生物發(fā)光檢測(cè)；或水母發(fā)光蛋白基因(Prasher等，1985)，它可以用于鈣敏感性生物發(fā)光檢測(cè)；或綠色熒光蛋白基因(Niedz等，1995)。
考慮到來(lái)自玉米R(shí)基因復(fù)合體的基因作為可篩選標(biāo)記特別有用。玉米中的R基因復(fù)合體編碼一種蛋白，該蛋白的作用是在大多數(shù)種子和植物組織中調(diào)節(jié)花色素苷色素的產(chǎn)生。玉米品系可以具有一個(gè)或多達(dá)4個(gè)R等位基因，它們結(jié)合在以發(fā)育和組織特異性方式調(diào)節(jié)色素形成。將來(lái)自R基因復(fù)合體的一個(gè)基因應(yīng)用于玉米轉(zhuǎn)化，因?yàn)樵摶蛟谵D(zhuǎn)化細(xì)胞中的表達(dá)不傷害所述細(xì)胞。因此，導(dǎo)入這種細(xì)胞中的一個(gè)R基因?qū)⒁鸺t色色素的表達(dá)，并且如果該基因穩(wěn)定摻入，則可以顯示記錄為紅色區(qū)域。如果一個(gè)玉米系帶有編碼花色素苷生物合成途徑中酶中間體的基因的顯性等位基因(C2、A1、A2、Bz1和Bz2)，但在該R基因座帶有一個(gè)隱性等位基因，則來(lái)自該系的任何細(xì)胞用R轉(zhuǎn)化都將導(dǎo)致紅色色素的形成。典型的系包括含有rg-Stadler等位基因的Wisconsin 22和一種K55衍生物TR112，TR112為r-g，b，P1。另一方面，如果將C1和R等位基因一起導(dǎo)入，則可以利用玉米的任何表型。
還提出，R基因調(diào)節(jié)區(qū)可以用于嵌合構(gòu)建體中，以便提供控制嵌合基因表達(dá)的機(jī)制。該R基因座的表型表達(dá)已知比任何其它基因座都更為多樣化(Coe等，1988)。設(shè)想了從該結(jié)構(gòu)R基因5’的區(qū)域獲得的調(diào)節(jié)區(qū)在指導(dǎo)例如抗蟲(chóng)性、抗旱性、除草劑耐性或其它蛋白編碼區(qū)的基因表達(dá)方面可能有價(jià)值。為了本發(fā)明的目的，認(rèn)為所述各個(gè)R基因家族成員中的任一個(gè)都可以成功地使用(例如P、S、Lc等)。然而，最優(yōu)選的一般是Sn(特別是Snbo13)。Sn是R基因復(fù)合體中的一個(gè)顯性成員，在功能上與所述R和B基因座相似，因?yàn)镾n控制花色素苷色素在某些幼苗和植物細(xì)胞中特異性沉積，因此其表型與R相似。
設(shè)想用于本發(fā)明中的再一個(gè)可篩選標(biāo)記是由lux基因編碼的螢火蟲(chóng)熒光素酶。可以采用例如X光膠片、閃爍計(jì)數(shù)、熒光分光光度法、低光視頻照相機(jī)、相片計(jì)數(shù)照相機(jī)或多孔發(fā)光法檢測(cè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞中l(wèi)ux基因的存在。也設(shè)想了該系統(tǒng)可以開(kāi)發(fā)用于例如組織培養(yǎng)板上生物發(fā)光的群體篩選，或甚至用于全株篩選。
5.質(zhì)粒和非病毒載體序列本發(fā)明的載體也可以還包含質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒載體包括可供用于使所表達(dá)盒在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中易于選擇、擴(kuò)增和轉(zhuǎn)化的額外的DNA序列，質(zhì)粒載體例如為pUC衍生載體，例如pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pUC23、pUC119和pUC120、pSK衍生載體、pGEM衍生載體、pSP衍生載體或pBS衍生載體。所述額外的DNA序列包括復(fù)制起點(diǎn)，提供所述載體自主復(fù)制；額外的選擇標(biāo)記基因，最好是編碼抗生素或除草劑抗性的基因；特有的多克隆位點(diǎn)，提供多個(gè)位點(diǎn)以插入表達(dá)盒中編碼的DNA序列或基因；和增強(qiáng)原核細(xì)胞和真核細(xì)胞轉(zhuǎn)化的序列。
可用于在植物細(xì)胞和原核細(xì)胞兩者中表達(dá)的另一種載體是雙元Ti質(zhì)粒(如Schilperoort等公開(kāi)的，美國(guó)專利第4,940,838號(hào))，實(shí)例為載體pGA582。該雙元Ti質(zhì)粒載體先前已經(jīng)由An進(jìn)行了表征(參見(jiàn)上文)，并且可從An博士獲得。該雙元Ti載體可以在原核細(xì)菌例如大腸桿菌(E.coli)和農(nóng)桿菌屬中復(fù)制。農(nóng)桿菌質(zhì)粒載體可以用來(lái)將表達(dá)盒轉(zhuǎn)移至雙子葉植物細(xì)胞，并且在某些條件下可以轉(zhuǎn)移至單子葉植物細(xì)胞，例如水稻細(xì)胞中。雙元Ti載體最好包括提供有效植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的胭脂堿T DNA右邊界和左邊界、一個(gè)選擇標(biāo)記基因、T邊界區(qū)中特有的多克隆位點(diǎn)、colE1復(fù)制起點(diǎn)和一個(gè)廣宿主范圍復(fù)制子。帶有本發(fā)明表達(dá)盒的雙元Ti載體既可以用來(lái)轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞，又可以用來(lái)轉(zhuǎn)化真核細(xì)胞，但最好用來(lái)轉(zhuǎn)化雙子葉植物細(xì)胞。
最后，任何DNA都可以用來(lái)傳遞至受體細(xì)胞，以最后產(chǎn)生按照本發(fā)明的能育轉(zhuǎn)基因植物。例如，可以使用載體和質(zhì)粒形式的DNA區(qū)段或線性DNA片段，所述DNA區(qū)段或片段在某些情況下僅含待在所述植物中表達(dá)的DNA元件。
當(dāng)然，用于轉(zhuǎn)化這類細(xì)胞的載體、質(zhì)粒、粘粒、YAC(酵母人工染色體)和DNA區(qū)段通常將包含人們希望導(dǎo)入所述細(xì)胞的cDNA或一種或多種基因。根據(jù)需要，這些DNA構(gòu)建體還可以包括例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、多接頭或甚至調(diào)節(jié)基因的結(jié)構(gòu)。選擇用于細(xì)胞導(dǎo)入的DNA區(qū)段或基因常常編碼將在所得的重組細(xì)胞中表達(dá)的蛋白，例如將產(chǎn)生可篩選或可選擇的性狀和/或?qū)①x予所再生的植株改進(jìn)的表型。然而，情況可能不總是如此，本發(fā)明也包括摻入非表達(dá)的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物。
6.其它預(yù)選核酸區(qū)段本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案提供一種載體方法，用于為植物編碼所需農(nóng)藝特性，例如用于作物產(chǎn)量相關(guān)性狀改良的單基因。例如，在例如Lundquist等(美國(guó)專利第5,484,956號(hào))、Lundquist等(美國(guó)專利第5,508,468號(hào))、Dobres(國(guó)際申請(qǐng)PCT/US95/11231)和K.Weising等((1988)，參見(jiàn)表1、2和3)中公開(kāi)了這類核酸區(qū)段或“基因”，所有所述文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。然而，本發(fā)明不限于編碼所需農(nóng)藝特性的預(yù)選核酸區(qū)段的范圍，因?yàn)榫幋a賦予植物所需特性的蛋白或RNA轉(zhuǎn)錄物的許多其它預(yù)選核酸區(qū)段屬于本發(fā)明的范圍。
待傳遞至受體細(xì)胞的特定核酸區(qū)段的選擇，通常將取決于轉(zhuǎn)化目的。作物轉(zhuǎn)化的一個(gè)主要目的是給所述植物加入某些商業(yè)上需要的農(nóng)藝上重要的性狀。人們可能需要摻入賦予任何一種或多種這種所需性狀(例如編碼除草劑抗性的一種或多種基因)的一種或多種基因。由所述預(yù)選DNA區(qū)段編碼的優(yōu)選農(nóng)藝特性包括但不限于抗蟲(chóng)性或耐蟲(chóng)性、除草劑抗性或耐性(Christou，1997)、抗病性或耐病性(例如煙草或馬鈴薯中的病原體抗性用例如Bt內(nèi)毒素基因抗病毒、真菌或細(xì)菌病原體(Schell，1997；Vaeck等，1987；和Lundquist等，美國(guó)專利第5,484,956號(hào))、由發(fā)光光桿狀菌(Photorhadbus luminescens)分泌的Pht毒素或病毒抗性的病毒衍生蛋白(Reimann-Phillip等，1993)、環(huán)境脅迫(包括但不限于干旱、過(guò)度潮濕、寒冷、嚴(yán)寒、高溫、鹽和氧化脅迫)、產(chǎn)量增加、食品含量和組成、物理外觀、雄性不育性、干化(drydown)、抗倒伏性(standability)、豐產(chǎn)性、淀粉特性、含油量(oil quantity)和油品質(zhì)等。例如，遺傳研究已經(jīng)表明，對(duì)于抗特定植物病原體侵染的植物而言，該植物一定具有一個(gè)抗病(R)基因，所述抗病基因直接或間接地與所述病原體基因組中存在的一個(gè)無(wú)毒(avr)基因相互作用。因此，將包含一個(gè)R基因的預(yù)選DNA區(qū)段導(dǎo)入缺乏該R基因的植物中，可以賦予所述植物對(duì)表達(dá)相應(yīng)的avr基因的病原體的抗性。
通過(guò)將編碼致病相關(guān)(PR)蛋白的預(yù)選DNA區(qū)段導(dǎo)入植物中，可以獲得對(duì)真菌侵染的增強(qiáng)的抗性。PR蛋白是由谷類作物對(duì)某些致病真菌侵染應(yīng)答而合成的蛋白(Scott，1994)。其它抗真菌基因包括但不限于殼多糖酶(例如外殼多糖酶和殼多糖酶G)；葡聚糖酶；蛋白質(zhì)合成抑制劑(PSI)或抗真菌蛋白(AFP)。
通過(guò)將編碼病毒外殼蛋白的預(yù)選DNA區(qū)段導(dǎo)致植物中，可以獲得對(duì)病毒感染的增強(qiáng)的抗性。例如，Nelson等(1988)公開(kāi)了煙草花葉病毒(TMV)外殼蛋白在番茄植株中的表達(dá)，賦予該植株對(duì)TMV的耐性以及對(duì)與TMV相關(guān)的病毒番茄花葉病毒(ToMV)的耐性。Clark等(國(guó)際申請(qǐng)PCT/EP92/03001)公開(kāi)了玉米矮花葉病毒外殼蛋白在玉米中的表達(dá)，產(chǎn)生當(dāng)接觸該病毒時(shí)表現(xiàn)出病癥減輕的植物。
此外，設(shè)想了可以將一種以上的預(yù)選核酸區(qū)段導(dǎo)入植物中。例如，可以將含有一個(gè)選擇標(biāo)記基因和賦予對(duì)特定病毒(例如大麥黃矮病毒、馬鈴薯卷葉病毒或煙草花葉病毒)抗性的基因的載體導(dǎo)入植物細(xì)胞中。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明考慮了用一種以上的優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞。兩種或兩種以上的轉(zhuǎn)基因可以用或者不同的轉(zhuǎn)基因編碼載體、或者用摻入兩種或兩種以上基因編碼序列的單一載體，在一個(gè)轉(zhuǎn)化事件中供應(yīng)。例如，認(rèn)為帶有趨同、趨異或共線性定向的bar和aroA表達(dá)單位的質(zhì)粒特別有用。其它優(yōu)選的組合是一種抗蟲(chóng)性基因(例如Bt基因)和一種蛋白酶抑制劑基因(例如pinII)或應(yīng)用bar與上述任一種基因的組合。當(dāng)然，根據(jù)需要，可以使用任何描述的任何兩種或兩種以上的轉(zhuǎn)基因，所述轉(zhuǎn)基因例如賦予除草劑抗性、抗蟲(chóng)性、抗病性(病毒、細(xì)菌、真菌、線蟲(chóng))或抗旱性、雄性不育、干化、抗倒伏性、豐產(chǎn)性、淀粉特性、含油量或油品質(zhì)的那些基因或那些提高產(chǎn)量或營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的基因。
a.除草劑抗性編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因(bar和pat)、草甘膦耐性EPSP合酶基因、編碼草甘膦氧化還原酶的草甘膦降解酶基因gox、deh(編碼使茅草枯失活的脫鹵素酶)、除草劑抗性(例如磺酰脲和咪唑啉酮)乙酰乳酸合酶、和bxn基因(編碼降解溴苯腈的腈水解酶)是用于轉(zhuǎn)化的除草劑抗性基因的良好的實(shí)例。bar和pat基因編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)，該酶使所述除草劑膦絲菌素失活，并且防止該化合物抑制谷氨酰胺合成酶。5-烯醇丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶(EPSP合酶)通常受除草劑N-(膦?；谆?甘氨酸(草甘膦)抑制。然而，已知編碼草甘膦抗性EPSP合酶的基因。特別考慮了將這些基因用于單子葉植物轉(zhuǎn)化。deh基因編碼茅草枯脫鹵素酶，并賦予對(duì)除草劑茅草枯的抗性。bxn基因編碼一種特異性的腈水解酶，該酶將溴苯腈轉(zhuǎn)化為非除草劑降解產(chǎn)物。
b.抗蟲(chóng)性本發(fā)明的一個(gè)重要方面涉及將賦予抗蟲(chóng)性的基因?qū)雴巫尤~植物例如玉米中?？梢詫?dǎo)入的潛在的抗蟲(chóng)性基因包括蘇云金芽孢桿菌晶體毒素基因或Bt基因(Watrud等，1985)。Bt基因可以提供對(duì)鱗翅目或鞘翅目害蟲(chóng)例如歐洲玉米螟(ECB)的抗性。用于這類實(shí)施方案的優(yōu)選Bt基因包括CrylA(b)和CrylA(c)基因。在該方面也可以使用來(lái)自蘇云金芽孢桿菌的其它菌種影響昆蟲(chóng)生長(zhǎng)或發(fā)育的內(nèi)毒素基因。
原核Bt毒素基因在植物中的表達(dá)差，這是一種廣泛記錄的現(xiàn)象，并且應(yīng)用不同啟動(dòng)子、融合蛋白和前導(dǎo)序列并不導(dǎo)致Bt蛋白表達(dá)的顯著增加(Barton等，1987)。因此，設(shè)想了本文公開(kāi)的用于轉(zhuǎn)化方案的最有利的Bt基因?qū)⑹撬鼍幋a序列已經(jīng)被修飾以實(shí)現(xiàn)在植物中表達(dá)增加的那些Bt基因，更特別是其中已經(jīng)使用玉米優(yōu)選密碼子的那些Bt基因。這類修飾過(guò)的Bt毒素基因的實(shí)例包括稱為IAb6的變異BtCrylA(b)基因(Perlak等，1991)和稱為1800a和1800b的合成CrylA(v)基因。
蛋白酶抑制劑也提供抗蟲(chóng)性(Johnson等，1989)，因此在玉米轉(zhuǎn)化中具有實(shí)用性。設(shè)想了來(lái)自番茄或馬鈴薯的蛋白酶抑制劑II基因pinII的應(yīng)用特別有用。甚至更優(yōu)選的是結(jié)合一種Bt毒素基因應(yīng)用pinII基因，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生協(xié)同殺蟲(chóng)活性的其聯(lián)合效應(yīng)。編碼昆蟲(chóng)消化系統(tǒng)抑制劑的其它基因或者編碼促進(jìn)抑制劑產(chǎn)生的酶或輔因子的那些基因也可能是有用。這種類別可以例舉的是oryzacystatin和淀粉酶抑制劑，例如來(lái)自小麥和大麥的oryzacystatin和淀粉酶抑制劑。
此外，編碼凝集素的基因可以賦予額外的或替代的殺蟲(chóng)劑特性。凝集素(最初稱為植物凝集素)是多價(jià)糖結(jié)合蛋白，它們能夠凝集來(lái)自多種物種的紅細(xì)胞。凝集素最近已經(jīng)被鑒定為具有抗象甲、ECB和根蟲(chóng)活性的殺蟲(chóng)劑(Murdock等，1990；Czapla和Lang，1990)。設(shè)想有用的凝集素基因包括例如大麥和小麥麥胚凝集素(WGA)和水稻凝集素(Gatehouse等，1984)，優(yōu)選WGA。
導(dǎo)入害蟲(chóng)時(shí)具抗蟲(chóng)活性的大多肽或小多肽例如為裂解性肽、肽類激素以及毒素和毒物，控制所述具抗蟲(chóng)活性的大多肽或小多肽產(chǎn)生的基因構(gòu)成本發(fā)明的另一個(gè)方面。例如，設(shè)想了針對(duì)特定害蟲(chóng)的保幼激素酯酶的表達(dá)也可能產(chǎn)生殺蟲(chóng)活性，或也許引起停止變態(tài)(Hammock等，1990)。
表達(dá)影響昆蟲(chóng)角質(zhì)層完整性的酶的編碼基因的轉(zhuǎn)基因玉米，構(gòu)成了本發(fā)明的再一個(gè)方面。這類基因包括編碼例如殼多糖酶、蛋白酶、脂酶的基因以及產(chǎn)生三國(guó)霉素(nikkomycin)的基因，三國(guó)霉素是一種抑制殼多糖合成的化合物，設(shè)想任何上述基因的導(dǎo)入將產(chǎn)生抗蟲(chóng)玉米植株。編碼影響昆蟲(chóng)蛻皮的活性的基因，例如影響蛻皮甾類UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生的那些基因，也屬于本發(fā)明的有用轉(zhuǎn)基因范圍內(nèi)。
本發(fā)明也包括編碼多種酶的基因，所述酶促進(jìn)降低宿主植物對(duì)害蟲(chóng)營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量的化合物的產(chǎn)生。例如，通過(guò)改變植物的甾醇組成賦予植物殺蟲(chóng)活性是可能的。昆蟲(chóng)通過(guò)攝食獲得甾醇，并且將甾醇用于激素合成和膜穩(wěn)定。因此，通過(guò)表達(dá)新基因例如直接促進(jìn)產(chǎn)生不希望有的甾醇或?qū)⑺桤薮嫁D(zhuǎn)化為不希望有的形式的基因，改變植物甾醇組成，可能對(duì)昆蟲(chóng)生長(zhǎng)和/或發(fā)育有負(fù)面影響，因此賦予植物殺蟲(chóng)活性。脂氧化酶是天然存在的植物酶，已經(jīng)表明所述酶表現(xiàn)出對(duì)昆蟲(chóng)的抗?fàn)I養(yǎng)效應(yīng)，并且降低其飲食的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量。因此，本發(fā)明的其它實(shí)施方案涉及脂氧化酶活性增強(qiáng)、可以抗昆蟲(chóng)攝食的轉(zhuǎn)基因植物。
本發(fā)明也提供了達(dá)到在性質(zhì)或數(shù)量上改變植物次級(jí)代謝物的方法和組合物。一個(gè)實(shí)例涉及轉(zhuǎn)化玉米，使其產(chǎn)生DIMBOA，設(shè)想這將提供對(duì)歐洲玉米螟、根蟲(chóng)和幾種其它玉米害蟲(chóng)的抗性。具體考慮用于該方面的候選基因包括bx基因座上已知參與合成DIMBOA途徑的那些基因。也考慮將可以調(diào)節(jié)maysin產(chǎn)生的基因以及參與高粱蜀黍苷產(chǎn)生的基因的導(dǎo)入分別用于促進(jìn)對(duì)穗蟲(chóng)(earworm)和根蟲(chóng)的抗性。
鴨茅狀磨擦禾(Tripsacum dactyloides)是一種抗包括根蟲(chóng)在內(nèi)的某些昆蟲(chóng)的草種。預(yù)期將從磨擦禾屬(Tripsacum)分離出編碼對(duì)昆蟲(chóng)有毒的蛋白或參與對(duì)昆蟲(chóng)有毒化合物生物合成的蛋白的基因，并且這些新基因?qū)⒖捎糜谫x予抗蟲(chóng)性。已知磨擦禾屬抗蟲(chóng)性的基礎(chǔ)是遺傳的，因?yàn)橐呀?jīng)將所述抗性通過(guò)有性雜交轉(zhuǎn)移至玉蜀黍(Zea mays)(Branson和Guss，1972)。
編碼鑒定為具有潛在殺蟲(chóng)活性的蛋白的其它基因也可以用作按照本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因。這類基因包括例如豇豆胰蛋白酶抑制劑(CpTI；Hilder等，1987)，它可以用作根蟲(chóng)拒食劑；編碼除蟲(chóng)菌素(AvermectinandAbamectin.，Campbell，W.C.編著，1989；Ikeda等，1987)，可以證明它作為南瓜十二星葉甲(com rootworm)拒食劑特別有用；核糖體失活蛋白基因；和甚至調(diào)節(jié)植物結(jié)構(gòu)的基因。也設(shè)想了轉(zhuǎn)基因玉米，所述轉(zhuǎn)基因玉米包含抗蟲(chóng)抗體基因以及可以將應(yīng)用于植物外部的無(wú)毒殺蟲(chóng)劑(原殺蟲(chóng)劑)轉(zhuǎn)化為所述植物體內(nèi)的殺蟲(chóng)劑的酶的編碼基因。
c.環(huán)境或脅迫抗性玉米耐受各種環(huán)境脅迫(例如但不限于干旱、過(guò)度潮濕、寒冷、嚴(yán)寒、高溫、鹽和氧化脅迫)能力的改進(jìn)也可以通過(guò)新基因的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。提出通過(guò)導(dǎo)入“抗凍”蛋白例如Winter Flounder的抗凍蛋白(Cutler等，1989)或其合成基因衍生物，可以在提高抗冷凍溫度方面獲益。通過(guò)提高葉綠體中甘油-3-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)，也可以使得耐寒性提高(Wolter等，1992)。通過(guò)表達(dá)超氧化物歧化酶，可以賦予對(duì)氧化脅迫(通常由于例如寒冷溫度結(jié)合高光強(qiáng)的條件而加劇)的抗性(Gupta等，1993)，并且所述抗性可以通過(guò)谷胱甘肽還原酶而得到改進(jìn)(Bowler等，1992)。這種策略可以為新出苗的大田提供耐凍力以及將晚熟高產(chǎn)品種擴(kuò)大至相對(duì)早熟的地區(qū)。
設(shè)想了有利地影響植物含水量、總水勢(shì)、滲透勢(shì)和充盈的新基因的表達(dá)，將增強(qiáng)植物的耐旱能力。本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗旱性”和“耐旱性”用來(lái)指與正常環(huán)境相比植物對(duì)水分有效性降低所誘導(dǎo)脅迫的增強(qiáng)的抗性或耐力，以及植物在較少水(lower-water)環(huán)境中行使功能和存活的能力。在本發(fā)明的該方面，提出例如滲透活性溶質(zhì)生物合成的編碼基因的表達(dá)可以賦予抗干旱的保護(hù)作用。在該類中有編碼甘露醇脫氫酶(Lee和Saier，1982)和海藻糖-6-磷酸合酶(Kaasen等，1992)的基因。通過(guò)細(xì)胞中天然磷酸酶的后續(xù)作用或通過(guò)導(dǎo)入和共表達(dá)特定的磷酸酶，這些導(dǎo)入的基因?qū)⒎謩e導(dǎo)致或者甘露醇或者海藻糖的積累，這兩種化合物已經(jīng)被大量記載為能夠減輕脅迫效應(yīng)的保護(hù)性化合物。已經(jīng)證實(shí)了轉(zhuǎn)基因煙草中甘露醇的積累，并且初步結(jié)果表明，表達(dá)高水平這種代謝物的植物能夠耐受所施加的滲透脅迫(Tarczynski等，1992，1993)。
同樣，已經(jīng)記載了其它代謝物保護(hù)任一種酶功能(例如alanopine或丙酸)或膜完整性(例如alanopine)的功效(Loomis等，1989)，因此這些化合物生物合成的編碼基因的表達(dá)可能以類似于甘露醇或補(bǔ)充甘露醇而賦予抗旱性。天然存在的具有滲透活性和/或在干旱和/或干燥期間提供某些直接保護(hù)性效應(yīng)的代謝物的其它實(shí)例，包括果糖、赤蘚糖醇(Coxson等，1992)、山梨糖醇、半乳糖醇(Karsten等，1992)、葡糖基甘油(Reed等，1984；Erdmann等，1992)、蔗糖、水蘇糖(Koster和Leopold，1988；Blackman等，1992)、棉子糖(Bemal-Lugo和Leopold，1992)、脯氨酸(Rensburg等，1993)和甜菜堿(Wyn-Jones和Storey，1982)、ononitol和右旋肌醇甲醚(Vemon和Bohnert，1992)。通過(guò)例如控制上述滲透活性化合物和其它這類化合物的基因的導(dǎo)入和表達(dá)，將增強(qiáng)逆境期間持續(xù)的株冠生長(zhǎng)和增加的生殖適度，其中所述這類化合物在一個(gè)典型實(shí)施方案中以肌醇0-甲基轉(zhuǎn)移酶為代表。
設(shè)想了特定蛋白質(zhì)的表達(dá)也可以提高耐旱性。根據(jù)結(jié)構(gòu)相似性，已經(jīng)確定了三類晚期胚胎發(fā)生蛋白(參見(jiàn)Dure等，1989)。在成熟(即干化)種子中已經(jīng)證實(shí)有所有三類LEA。在這三種類型的LEA蛋白中，II型(dehydrin型)通常涉及植物營(yíng)養(yǎng)部分中的耐旱性和/或耐燥性(即Mundy和Chua，1988；Piatkowski等，1990；Yamaguchi-Shinozaki等，1992)。最近，發(fā)現(xiàn)III型LEA(HVA-1)在煙草中的表達(dá)影響植物的株高、成熟度和耐旱性(Fitzpatrick，1993)。來(lái)自所有三類LEA的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)因此可以賦予耐旱性。在缺水期間誘導(dǎo)的其它類型的蛋白質(zhì)包括巰基蛋白酶、醛縮酶和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Guerrero等，1990)，它們?cè)诟珊得{迫期間可以賦予各種保護(hù)性功能和/或修復(fù)型功能。也設(shè)想了影響脂質(zhì)生物合成并因此影響膜組成的基因也可以用于賦予植物抗旱性。
這些基因中的許多基因也改善耐凍力(或抗凍性)；在嚴(yán)寒和干旱期間發(fā)生的物理脅迫(physical stress)在性質(zhì)上相似，并且可以以相似方式減輕。通過(guò)組成型表達(dá)這些基因可以提供益處，但表達(dá)這些新基因的優(yōu)選方式可以是通過(guò)應(yīng)用充盈誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(例如Guerrero等，1987和Shagan等，1993描述的充盈誘導(dǎo)基因的啟動(dòng)子，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。這些基因的時(shí)空表達(dá)模式可以使得玉米能夠更好地抵抗逆境。
一般認(rèn)為，涉及使從干燥土壤中提取的水分增加的特定形態(tài)性狀的基因的表達(dá)將是有益的。例如，改變根特征的基因的導(dǎo)入和表達(dá)可以增強(qiáng)水分吸收。也考慮了，在逆境期間增強(qiáng)生殖適度的基因的表達(dá)將具有重大價(jià)值。例如，提高花粉脫落和雌花部分(即花絲)受精同步的基因的表達(dá)將是有益的。另外，一般認(rèn)為在逆境期間使籽粒敗育最少的基因的表達(dá)，將增加收獲的谷粒量，因此也是有價(jià)值的。
已知水分在決定產(chǎn)量方面的總體作用，因此設(shè)想了通過(guò)導(dǎo)入并表達(dá)新基因使玉米能夠更加有效地利用水分，甚至當(dāng)土壤水分有效性無(wú)限制時(shí)也將改進(jìn)綜合性能。通過(guò)導(dǎo)入提高玉米在各種各樣的與水分相關(guān)的逆境中最大利用水分能力的基因，可以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)量的穩(wěn)定性或產(chǎn)量性能的一致性。
d.抗病性一般認(rèn)為，通過(guò)將基因?qū)雴巫尤~植物例如玉米中，可以實(shí)現(xiàn)抗病性的增強(qiáng)。有可能產(chǎn)生對(duì)病毒、細(xì)菌、真菌和線蟲(chóng)所致病害的抗性。也設(shè)想了，通過(guò)表達(dá)所導(dǎo)入的基因，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)產(chǎn)生真菌毒素的有機(jī)體的防治。
可以通過(guò)表達(dá)新基因產(chǎn)生對(duì)病毒的抗性。例如，已經(jīng)證明，病毒外殼蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)，可以賦予對(duì)該病毒以及也許其它密切相關(guān)的病毒感染所述植物的抗性(Cuozzo等，1988，Hemenway等，1988，Abel等，1986)。設(shè)想了，靶向病毒必需功能的反義基因的表達(dá)，可以賦予對(duì)所述病毒的抗性。例如，靶向負(fù)責(zé)病毒核酸復(fù)制的基因的反義基因，可以抑制所述復(fù)制，并導(dǎo)致對(duì)該病毒的抗性。人們相信，通過(guò)利用反義基因干擾其它病毒功能，也可以增強(qiáng)對(duì)病毒的抗性。此外，人們認(rèn)為，有可能通過(guò)其它途徑，包括但不限于利用衛(wèi)星病毒，達(dá)到對(duì)病毒的抗性。
人們認(rèn)為，通過(guò)導(dǎo)入新基因可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌和真菌所致病害的增強(qiáng)的抗性。設(shè)想了，編碼所謂“肽抗生素”、致病相關(guān)(PR)蛋白、毒素抗性和影響宿主-病原體相互作用(例如形態(tài)特征)的蛋白的基因?qū)⑹怯杏玫?。肽抗生素是抑制?xì)菌和其它微生物生長(zhǎng)的多肽序列。例如，稱為殺菌肽和爪蟾抗菌肽的肽類抑制許多細(xì)菌和真菌菌種的生長(zhǎng)。人們認(rèn)為，PR蛋白在單子葉植物(例如玉米)中的表達(dá)可以用于提供對(duì)細(xì)菌病害的抗性。在病原體對(duì)寄主植物攻擊后這些基因被誘導(dǎo)，這些基因分為至少5類蛋白(Bol，Linthorst，和Comelissen，1990)。PR蛋白中包括β-1，3-葡聚糖酶、殼多糖酶和滲透蛋白以及據(jù)信在植物致病有機(jī)體抗性方面起作用的其它蛋白。已經(jīng)鑒定出具有抗真菌特性的其它基因，例如UDA(異株蕁麻凝集素)和橡膠蛋白(Broakaert等，1989；Barkai-Golan等，1978)。已知某些植物病害是由于產(chǎn)生毒植物素引起的。人們認(rèn)為，對(duì)這些病害的抗性可以通過(guò)表達(dá)編碼能夠使毒植物素降解或者失活的酶的新基因而獲得。也設(shè)想了。改變寄主植物和病原體之間相互作用的新基因的表達(dá)，可以用來(lái)降低致病有機(jī)體侵入寄主植物組織的能力，例如增強(qiáng)葉片角質(zhì)層的蠟質(zhì)或其它形態(tài)特征。
植物寄生線蟲(chóng)是包括玉米在內(nèi)的許多植物的病因。人們認(rèn)為，有可能通過(guò)表達(dá)新基因而產(chǎn)生抗這些有機(jī)體的玉米植株。我們?cè)O(shè)想了，通過(guò)改變線蟲(chóng)識(shí)別或附著到寄主植物和/或使植物能夠產(chǎn)生殺線蟲(chóng)化合物(包括但不限于蛋白)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)線蟲(chóng)侵襲的防治。
e.真菌毒素的減小/消除與單子葉植物例如玉米相關(guān)的真菌產(chǎn)生真菌毒素(包括黃曲霉毒素和串珠鐮孢菌素)是使谷粒不能使用的重要因素。這些真菌有機(jī)體不引起病癥和/或干擾植物的生長(zhǎng)，但它們產(chǎn)生對(duì)動(dòng)物有毒的化學(xué)物質(zhì)(真菌毒素)。我們?cè)O(shè)想了，抑制這些真菌的生長(zhǎng)將減少這些有毒物質(zhì)的合成，并因此減少了由于真菌毒素污染引起的谷物損失。也提出有可能將新基因?qū)雴巫尤~植物例如玉米中，抑制真菌毒素合成而不干擾真菌生長(zhǎng)。此外，設(shè)想了為了達(dá)到減少真菌毒素對(duì)谷物的污染，表達(dá)編碼能夠使真菌毒素?zé)o毒的酶的新基因?qū)⑹怯杏玫摹Ｈ魏紊鲜鰴C(jī)制的結(jié)果都將是減少谷物上真菌毒素的存在。
f.谷粒組成或品質(zhì)可以將基因?qū)雴巫尤~植物中，特別是導(dǎo)入商業(yè)上重要的谷類作物例如玉米中，以改良主要培育的谷類作物的谷粒。根據(jù)所述谷粒特定的最終用途，可以設(shè)計(jì)以這種方式產(chǎn)生的各種各樣的新轉(zhuǎn)基因植物。
玉米谷粒的最大用途是用于飼料或食品。導(dǎo)入改變谷粒組成的基因，可以大大增加飼料或食品的價(jià)值。玉米谷粒的主要組成是淀粉、蛋白質(zhì)和油。玉米谷粒的每種這些主要組分都可以通過(guò)改變其含量或組成而可以改進(jìn)?？梢蕴峒皫讉€(gè)實(shí)例用于說(shuō)明，但決不是提供詳盡的所有可能性一覽表。
包括玉米在內(nèi)的谷物谷粒的蛋白對(duì)于飼料和食品目的是亞適的，尤其是當(dāng)給予豬、家禽和人類時(shí)。這種蛋白缺乏幾種這些物種飲食中必需的氨基酸，需要在這種谷粒中添加增補(bǔ)劑。限制性的必需氨基酸可以包括賴氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、精氨酸和組氨酸。某些氨基酸僅在玉米補(bǔ)充其它添加物用于飼料配制后成為限制性的。例如，當(dāng)玉米補(bǔ)充大豆餅粕以滿足賴氨酸需求時(shí)，甲硫氨酸成為限制性的。通過(guò)包括但不限于導(dǎo)入基因以增加所述這些必需氨基酸的生物合成、減少所述氨基酸的降解、增強(qiáng)所述氨基酸在蛋白中的貯藏或增加所述氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)到種子或谷粒中的機(jī)制，可以提高這些必需氨基酸在種子和谷粒中的含量。
增加所述氨基酸生物合成的一種機(jī)制是導(dǎo)入去調(diào)節(jié)所述氨基酸生物合成途徑的基因，使得所述植物不再充分控制所產(chǎn)生的水平。通過(guò)去調(diào)節(jié)或繞過(guò)所述氨基酸生物合成途徑中通常受該途徑的氨基酸終產(chǎn)物調(diào)節(jié)的步驟，可以做到這一點(diǎn)。實(shí)例包括導(dǎo)入去調(diào)節(jié)形式的天冬氨酸激酶或二氫吡啶二羧酸(DHDP)合酶的編碼基因，以增加賴氨酸和蘇氨酸的產(chǎn)生，以及導(dǎo)入去調(diào)節(jié)形式的鄰氨基苯甲酸合酶的編碼基因以增加色氨酸的產(chǎn)生。通過(guò)導(dǎo)入降低或消除分解代謝途徑中催化步驟的酶(例如賴氨酸-α-酮戊二酸還原酶)編碼基因的表達(dá)的DNA序列，可以達(dá)到所述氨基酸分解代謝的減少。
可以改變谷粒的蛋白組成，以多種方式改善氨基酸的平衡，所述方式包括提高天然蛋白的表達(dá)、降低組成不好的蛋白的表達(dá)、改變天然蛋白的組成或?qū)刖哂袃?yōu)良組成的全新蛋白的編碼基因。實(shí)例可以包括導(dǎo)入降低貯藏蛋白玉米醇溶蛋白家族成員表達(dá)的DNA。這種DNA可以編碼針對(duì)削弱的玉米醇溶蛋白的表達(dá)或玉米醇溶蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)劑(例如不透明二號(hào)基因產(chǎn)物)的表達(dá)的核酶或反義序列。也提出，可以通過(guò)共抑制現(xiàn)象，即通過(guò)表達(dá)經(jīng)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入的相同結(jié)構(gòu)基因或基因片段而抑制內(nèi)源基因的表達(dá)(Goring等，1991)，可以改變谷粒的蛋白組成。另外，所導(dǎo)入的DNA可以編碼降解玉米醇溶蛋白的酶。達(dá)到的玉米醇溶蛋白表達(dá)的降低可能伴隨著含更需要的氨基酸組成的蛋白的增加或者其它種子組分例如淀粉的增加。另一方面，可以導(dǎo)入嵌合基因，所述嵌合基因包含具有合適氨基酸組成的天然蛋白編碼序列和啟動(dòng)子或設(shè)計(jì)用以提高所述蛋白表達(dá)的其它調(diào)節(jié)序列，其中所述蛋白例如為球蛋白之一或者玉米的10kD玉米醇溶蛋白。所述基因的編碼序列可以包括必需氨基酸的其外的密碼子或替代的密碼子。此外，可以使用得自另一物種的編碼序列或編碼完全獨(dú)特的肽序列、設(shè)計(jì)用以增強(qiáng)種子氨基酸組成的部分合成或全合成的序列。
導(dǎo)入改變谷粒含油量的基因可能是有價(jià)值的。含油量的增加可能導(dǎo)致用于飼料和食品的種子的可代謝-能量含量或密度的增加。所導(dǎo)入的基因可以編碼去除或減少脂肪酸或脂質(zhì)生物合成中限速步驟或調(diào)節(jié)步驟的酶。這類基因可以包括但不限于編碼乙酰CoA羧化酶、ACP?；D(zhuǎn)移酶、β-酮?；?ACP合酶、加其它熟知的脂肪酸生物合成活性的基因。其它可能的是編碼不具酶活性的蛋白(例如?；d體蛋白)的基因?？梢詫?dǎo)入改變油中存在的脂肪酸平衡的基因，提供更為健康或更具營(yíng)養(yǎng)的飼料。所導(dǎo)入的DNA也可以編碼阻斷參與脂肪酸生物合成的酶表達(dá)、例如下述的改變谷粒中存在的脂肪酸比例的序列。
可以導(dǎo)入增強(qiáng)谷粒淀粉組分營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的基因，例如通過(guò)提高分支程度，由于延遲淀粉代謝而導(dǎo)致改善奶牛對(duì)淀粉的利用。
除影響谷粒的主要組分以外，可以導(dǎo)入影響多種其它營(yíng)養(yǎng)、加工或其它谷粒用作飼料或食品的品質(zhì)方面的基因。例如，可以增強(qiáng)或減少谷粒的色素形成。在某些動(dòng)物飼料中希望黃色色素形成的增強(qiáng)和穩(wěn)定性，這可以通過(guò)導(dǎo)入基因而實(shí)現(xiàn)，所述基因通過(guò)消除葉黃素和胡蘿卜素產(chǎn)生中的限速步驟，導(dǎo)致增強(qiáng)的葉黃素和胡蘿卜素產(chǎn)生。這類基因可以編碼改變形式的八氫番茄紅素合酶、八氫番茄紅素去飽和酶或番茄紅素合酶。另一方面，對(duì)于許多食品的生產(chǎn)而言，需要無(wú)色素形成的白玉米，可以通過(guò)導(dǎo)入阻斷或消除色素產(chǎn)生途徑中的步驟的DNA，產(chǎn)生所述白玉米。
主要包含玉米或其它谷粒的飼料或食品的維生素量不足，必須進(jìn)行添加以提供合適的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值?？梢栽O(shè)想導(dǎo)入增強(qiáng)種子中維生素生物合成的基因，包括例如維生素A、E、B12、膽堿等。對(duì)于最佳營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而言，玉米谷粒也不具有對(duì)于最佳營(yíng)養(yǎng)價(jià)值足夠的礦物質(zhì)含量。影響含尤其是磷、硫、鈣、錳、鋅和鐵的化合物的積累和有效性的基因可能是有價(jià)值的。一個(gè)實(shí)例是可以導(dǎo)入減少植酸產(chǎn)生或編碼增強(qiáng)植酸分解的植酸酶的基因。這些基因可能提高飲食中可利用的磷酸鹽的水平、減少補(bǔ)充礦物質(zhì)磷酸鹽的需求。
可以描述用于飼料和食品的玉米或其它谷物改良的許多其它實(shí)例。所述改良甚至不必涉及谷粒，但可以利用提高青貯飼料用玉米的價(jià)值。導(dǎo)入DNA以實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，可以包括改變木質(zhì)素產(chǎn)生的序列，例如產(chǎn)生與優(yōu)良牛用飼料價(jià)值有關(guān)的“褐色中脈(brown midrib)”表型的那些序列。
除直接提高飼料或食品價(jià)值外，也可以導(dǎo)入改進(jìn)玉米加工和提高由所述加工產(chǎn)生的產(chǎn)品價(jià)值的基因。玉米的主要加工方法是通過(guò)濕磨法。可以通過(guò)表達(dá)例如通過(guò)減少浸漬時(shí)間提高加工效率和降低加工成本的新基因，改良玉米。
提高濕磨制品的價(jià)值可以包括改變淀粉、油、玉米面筋粉或玉米黃漿飼料組分的量和品質(zhì)。通過(guò)鑒定并消除淀粉生物合成中的限速步驟，或通過(guò)降低谷粒其它組分含量而導(dǎo)致淀粉比例增加，可以達(dá)到改進(jìn)淀粉。前者的一個(gè)實(shí)例可以是導(dǎo)入編碼具有改變調(diào)節(jié)活性或以較高水平表達(dá)的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的基因。后者的實(shí)例可以包括例如籽粒發(fā)育較晚期表達(dá)的蛋白或油生物合成的選擇性抑制劑。
通過(guò)改變直鏈淀粉與支鏈淀粉之比、淀粉分子的大小或其分支模式，可以有益地改變淀粉特性。通過(guò)這些改變，可以對(duì)各種各樣的特性進(jìn)行修飾，包括但不限于糊化溫度、糊化熱、膜和糊料的澄清、流變學(xué)特性等的改變等。為了達(dá)到這些特性的改變，可以單獨(dú)或組合導(dǎo)入編碼顆粒結(jié)合的或可溶性淀粉合酶活性或分支酶活性的基因。例如反義構(gòu)建體的DNA也可以用來(lái)降低這些酶的內(nèi)源活性水平。所導(dǎo)入的基因或構(gòu)建體可以具有將其表達(dá)定時(shí)到淀粉生物合成中特定間隔和淀粉粒發(fā)育的調(diào)節(jié)序列。此外，導(dǎo)入并表達(dá)導(dǎo)致淀粉分子的葡萄糖部分體內(nèi)衍生化或其它修飾的基因，可能是有價(jià)值的?？梢栽O(shè)想任何分子的共價(jià)連接，這僅受催化衍生化的酶的存在以及淀粉粒中合適底物的可及性的限制。重要的衍生化的實(shí)例可以包括加入提供用于隨后體外衍生化或通過(guò)引入離子電荷影響淀粉特性的功能團(tuán)，例如胺、羧基或磷酸酯基團(tuán)。其它修飾的實(shí)例可以包括直接改變葡萄糖單位，例如失去羥基或?qū)⑵溲趸癁槿┗螋然?br> 油是玉米濕磨的另一種制品，其價(jià)值可以通過(guò)導(dǎo)入并表達(dá)基因而得到提高。通過(guò)以上描述的用于飼料和食品的方法，可以提高通過(guò)濕磨提取的油量。也可以改變油的特性，以改進(jìn)其在生產(chǎn)和應(yīng)用烹飪用油、起酥油、潤(rùn)滑油或其它油衍生制品方面或用于食品相關(guān)應(yīng)用時(shí)其健康特性改進(jìn)方面的性能。也可以合成在提取時(shí)可以用作化學(xué)合成原材料的新型脂肪酸。通過(guò)改變油中存在的脂肪酸的類型、含量或脂質(zhì)分布(lipid arrangement)，可以達(dá)到油特性的改變。這進(jìn)而可以通過(guò)加入編碼催化新脂肪酸和具有所述新脂肪酸的脂質(zhì)的合成的酶的基因、或通過(guò)增加天然脂肪酸含量而同時(shí)可能降低前體水平而達(dá)到。另一方面，可以導(dǎo)入減慢或阻斷脂肪酸生物合成中的步驟而導(dǎo)致前體脂肪酸中間體增加的DNA序列?？梢约尤氲幕虬ㄈワ柡兔?、環(huán)氧酶、水合酶、脫水酶和催化涉及脂肪酸中間體的反應(yīng)的其它酶?？梢宰钄嗟拇呋襟E的典型實(shí)例包括將硬脂酸去飽和為油酸以及將油酸去飽和為亞麻酸，導(dǎo)致相應(yīng)的硬脂酸和油酸的積累。另一實(shí)例是阻斷延伸步驟，導(dǎo)致C8-C12飽和脂肪酸的積累。
通過(guò)導(dǎo)入基因以獲得新型玉米植株，也可以達(dá)到其它主要玉米濕磨制品、玉米面筋粉和玉米黃漿飼料方面的改進(jìn)。代表性的可能改進(jìn)包括但不限于上述關(guān)于食品和飼料價(jià)值提高的那些改進(jìn)。
另外，還可以考慮使用玉米植株生產(chǎn)先前在玉米植株中根本不產(chǎn)生或不是以同一水平產(chǎn)生的有用生物學(xué)化合物。通過(guò)用玉米轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入并表達(dá)基因，有可能創(chuàng)造產(chǎn)生這些化合物的新型玉米植株。多種多樣的可能性包括但不限于目前用任何有機(jī)體生產(chǎn)的任何生物學(xué)化合物，例如蛋白質(zhì)、核酸、初級(jí)代謝物和中間代謝物、糖聚合物等。所述化合物可以用植物生產(chǎn)，在收獲和/或加工時(shí)進(jìn)行提取，并且可以用于任何目前認(rèn)為有用的目的，例如藥物、香料、工業(yè)用酶，這僅提及了幾個(gè)目的。
例舉在轉(zhuǎn)基因植物中可能由所導(dǎo)入基因編碼的谷粒性狀或特性范圍的其它可能性包括通過(guò)導(dǎo)入增強(qiáng)γ-玉米醇溶蛋白合成的基因而碎粒敏感性較低以用于出口目的或當(dāng)干磨加工時(shí)粗谷粉大小較大的谷粒；通過(guò)增加粒殼(pericarp)厚度的基因而具有改進(jìn)爆花質(zhì)量和膨脹體積的爆花用玉米；通過(guò)導(dǎo)入有效阻斷參與色素產(chǎn)生途徑的酶表達(dá)的基因而具有較白谷粒的食品用玉米；和通過(guò)導(dǎo)入影響甜玉米香味的基因例如皺縮基因(編碼蔗糖合酶)而改良的酒精飲料或甜玉米的品質(zhì)。
g.植物農(nóng)藝特性決定是否可以種植玉米的兩個(gè)因素是生長(zhǎng)季節(jié)的日平均溫度和霜凍之間的時(shí)間長(zhǎng)度。在可能種植玉米的地區(qū)內(nèi)，允許生長(zhǎng)至成熟和收獲的最大時(shí)間限制是不同的。根據(jù)玉米在獲得最大可能產(chǎn)量所需的時(shí)間內(nèi)成熟和干化至可收獲含水量的能力，選擇在特定地區(qū)種植的玉米。因此，對(duì)于不同的產(chǎn)區(qū)，開(kāi)發(fā)不同成熟度的玉米。除需要足夠干化以允許收獲之外，客觀上需要在田間發(fā)生最大干化，以最大限度地減少收獲后額外干化所需的精力。此外，谷粒越快干化，則可用于生長(zhǎng)和籽粒灌漿的時(shí)間則越多。考慮到，可以鑒定影響成熟度和/或干化的基因，并且用轉(zhuǎn)化技術(shù)將其導(dǎo)入玉米系中，以創(chuàng)造適于不同產(chǎn)區(qū)或同一產(chǎn)區(qū)但在收獲時(shí)具有改進(jìn)的產(chǎn)量與水分比的新玉米品種。參與調(diào)節(jié)植物發(fā)育的基因的表達(dá)可能尤其有用，例如已經(jīng)在玉米中鑒定的無(wú)葉舌和糙鞘(rough sheath)基因。
設(shè)想了可以將能夠提高抗倒伏性和其它植物生長(zhǎng)特性的基因?qū)胗衩字?。賦予更強(qiáng)壯莖桿、改善的根系或者防止或減少果穗脫落的新基因的表達(dá)，對(duì)于農(nóng)民將具有重大價(jià)值。人們認(rèn)為，通過(guò)例如增加光的配給(light distribution)和/或截留(interception)而增強(qiáng)有效光同化作用總量的基因的導(dǎo)入和表達(dá)將是有利的。另外，提高光合效率和/或葉冠的基因的表達(dá)，將進(jìn)一步提高谷粒的生產(chǎn)率。這類方法將使得能夠在田間增加植物群體。
延遲晚熟營(yíng)養(yǎng)體的老化(late season vegetative senescence)將增加同化物流到谷粒中，并因此提高產(chǎn)量。人們認(rèn)為，在玉米中與“保青(stay green)”有關(guān)的基因的超量表達(dá)或延遲老化的任何基因的表達(dá)將是有利的。例如，在牛尾草(Festuca pratensis)中已經(jīng)鑒定出非黃化突變體(Davies等，1990)。該基因以及其它基因的表達(dá)可以防止葉綠素的早熟分解，并因此可以保持林冠功能。
h.養(yǎng)分利用利用有效養(yǎng)分的能力在單子葉植物例如玉米的生長(zhǎng)中是一個(gè)限制因素。人們認(rèn)為，有可能通過(guò)導(dǎo)入新基因，改變養(yǎng)分的吸收、耐受極限pH、改變整個(gè)植株的養(yǎng)分流動(dòng)、養(yǎng)分貯庫(kù)以及代謝活性的有效性。這些修飾將允許植物例如玉米更有效地利用土壤有效養(yǎng)分。設(shè)想了，提高例如植物中正常存在并且參與養(yǎng)分利用的酶的活性，將提高養(yǎng)分的有效性。這種酶的一個(gè)實(shí)例是植酸酶。也設(shè)想了，新基因的表達(dá)可以創(chuàng)造先前不可利用的有效營(yíng)養(yǎng)源，例如是從更復(fù)雜的分子(也許是大分子)中釋放一種有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的組分的酶。
i.雄性不育性雄性不育性可用于生產(chǎn)雜交種子。認(rèn)為可以通過(guò)表達(dá)新基因產(chǎn)生雄性不育性。例如，已經(jīng)表明，干擾雄性花序和/或配子體發(fā)育的蛋白的編碼基因的表達(dá)，導(dǎo)致雄性不育性。在轉(zhuǎn)基因煙草和油料種子用油菜(oilseed rape)的花藥中表達(dá)的嵌合核糖核酸酶基因，已經(jīng)證明導(dǎo)致雄性不育性(Mariani等，1990)。
在玉米中發(fā)現(xiàn)了許多賦予細(xì)胞質(zhì)雄性不育性的突變。特別是，一個(gè)稱為T細(xì)胞質(zhì)的突變也與對(duì)玉米小斑病的感病性有關(guān)。鑒定出與T細(xì)胞質(zhì)有關(guān)的名為TURF-13(Levings，1990)的DNA序列。人們認(rèn)為，有可能通過(guò)經(jīng)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入TURF-13將感病性與雄性不育性分離。因?yàn)閷?duì)于育種目的和谷物生產(chǎn)而言，能夠恢復(fù)雄性能育性是必不可少的，因此認(rèn)為也可以導(dǎo)入恢復(fù)雄性能育性的編碼基因。
i.負(fù)選擇標(biāo)記導(dǎo)入可以選擇抵抗的性狀的編碼基因，可以用來(lái)消除不希望有的連鎖基因。設(shè)想了，當(dāng)通過(guò)共轉(zhuǎn)化一起導(dǎo)入兩個(gè)或兩個(gè)以上基因時(shí)，所述基因?qū)⒃谒拗魅旧w上連接在一起。例如，可以將賦予植物抗蟲(chóng)性的Bt基因的編碼基因與可用作選擇標(biāo)記并賦予植物對(duì)除草劑Ignite抗性的bar基因一起導(dǎo)入植物。然而，可能不希望有也抗除草劑Ignite的抗蟲(chóng)植物。認(rèn)為人們也可以導(dǎo)入在不需要bar基因表達(dá)的那些組織中(例如在整株植株部分中)表達(dá)的反義bar基因。因此，雖然bar基因表達(dá)并且可用作選擇標(biāo)記，但它對(duì)于賦予整株植株除草劑抗性是無(wú)用的。bar反義基因是一種負(fù)選擇標(biāo)記。
也設(shè)想了，為了在轉(zhuǎn)化體群體中篩選通過(guò)基因打靶產(chǎn)生稀有同源重組體，負(fù)選擇是必不可少的。例如，通過(guò)使先前在該細(xì)胞中表達(dá)的基因失活，可以鑒定同源重組體。在煙草(Nicotiana tabacum)和擬南芥中已經(jīng)將新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(nptII)的反義基因作為負(fù)選擇標(biāo)記進(jìn)行了研究(Xiang C.和Guerra，D.J.1993)。在該實(shí)例中，將有義和反義nptII基因通過(guò)轉(zhuǎn)化都導(dǎo)入一個(gè)植株中，所產(chǎn)生的植株對(duì)抗生素卡那霉素敏感。在反義nptII基因位點(diǎn)整合到宿主細(xì)胞染色體中并且使所述反義基因失活的所導(dǎo)入基因，將使得植物抗卡那霉素和其它氨基糖苷類抗生素。因此，通過(guò)篩選抗生素抗性，可以鑒定出稀有的定點(diǎn)重組體。同樣，將對(duì)植物天然的或通過(guò)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入的失活時(shí)賦予對(duì)一種化合物抗性的任何基因，可以用作負(fù)選擇標(biāo)記。
設(shè)想了，負(fù)選擇標(biāo)記也可以以其它方式應(yīng)用。一種應(yīng)用是構(gòu)建人們可以根據(jù)轉(zhuǎn)座至非連鎖位點(diǎn)而選擇的轉(zhuǎn)基因系。在標(biāo)記過(guò)程中，最常見(jiàn)的是轉(zhuǎn)座因子轉(zhuǎn)移至同一染色體上的遺傳上連鎖的位點(diǎn)。用于回收已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)座至非連鎖基因座的稀有植物的選擇標(biāo)記將是有用的。例如，胞嘧啶脫氨酶可用于該目的(Stouggard，J.，1993)。在該酶存在時(shí)，化合物5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化為對(duì)植物和動(dòng)物細(xì)胞有毒的5-氟尿嘧啶。如果將轉(zhuǎn)座因子與胞嘧啶脫氨酶的基因連接，人們則可以通過(guò)選擇所產(chǎn)生的植株現(xiàn)在抗5-氟胞嘧啶的轉(zhuǎn)座事件來(lái)篩選到非連鎖位點(diǎn)的轉(zhuǎn)座。親本植株和含有轉(zhuǎn)座至連鎖位點(diǎn)的植株將仍對(duì)5-氟胞嘧啶敏感。對(duì)5-氟胞嘧啶的抗性是由于通過(guò)轉(zhuǎn)座因子和胞嘧啶脫氨酶基因的遺傳分離而喪失了胞嘧啶脫氨酶基因所致。其它使植物對(duì)某種化合物敏感的蛋白的編碼基因也可用于該方面。例如，來(lái)自根癌農(nóng)桿菌的T-DNA基因2編碼一種蛋白，該蛋白催化α-萘乙酰胺(NAM)轉(zhuǎn)化為α-萘乙酸(NAA)，使植物細(xì)胞對(duì)高濃度的NAM敏感。
也設(shè)想了，負(fù)選擇標(biāo)記可以用于轉(zhuǎn)座子標(biāo)記系的構(gòu)建。例如，通過(guò)用負(fù)選擇標(biāo)記來(lái)標(biāo)記一種自主轉(zhuǎn)座因子例如Ac、Master Mu或En/Spn，人們則可以選擇其中所述自主元件不穩(wěn)定整合到基因組中的轉(zhuǎn)化體。認(rèn)為，例如，在需要瞬時(shí)表達(dá)所述自主元件以反式激活一種缺陷型轉(zhuǎn)座因子例如Ds轉(zhuǎn)座，但不需要所述自主元件穩(wěn)定整合時(shí)，這可能是需要的。為了穩(wěn)定所述缺陷型元件，即防止它進(jìn)一步轉(zhuǎn)座，可能不希望所述自主元件的存在。然而，認(rèn)為如果在植物中需要自主轉(zhuǎn)座因子的穩(wěn)定整合，則負(fù)選擇標(biāo)記的存在則可以使得有可能在育種過(guò)程中消除所述自主元件。
k.非蛋白質(zhì)表達(dá)序列1.RNA表達(dá)可以將核酸導(dǎo)入玉米和其它單子葉植物中，以表達(dá)不被翻譯為蛋白質(zhì)的、影響植物表型的RNA轉(zhuǎn)錄物。兩個(gè)實(shí)例是反義RNA和具有核酶活性的RNA。這兩種RNA在降低或消除天然或所導(dǎo)入的植物基因表達(dá)方面都可能起作用。
可以構(gòu)建或分離在轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生與整個(gè)或部分靶信使RNA互補(bǔ)的反義RNA的基因。反義RNA減少信使RNA多肽產(chǎn)物的產(chǎn)生。多肽產(chǎn)物可以是由植物基因組編碼的任何蛋白質(zhì)。將上述基因稱為反義基因。因此可以將反義基因通過(guò)轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入植物中，以產(chǎn)生所選目的蛋白表達(dá)減少的新型轉(zhuǎn)基因植物。例如，所述蛋白質(zhì)可以是催化植物中一個(gè)反應(yīng)的酶。所述酶活性的降低可以減少或消除該反應(yīng)產(chǎn)物，所述反應(yīng)產(chǎn)物包括所述植物中酶促合成的化合物，例如脂肪酸、氨基酸、糖類、核酸等。另一方面，所述蛋白質(zhì)可以是貯藏蛋白例如玉米醇溶蛋白或結(jié)構(gòu)蛋白，其表達(dá)的減少可以分別導(dǎo)致種子氨基酸組成或植物形態(tài)的改變。提供上述可能性僅作為實(shí)例，并不代表所有應(yīng)用范圍。
也可以構(gòu)建或分離當(dāng)轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生RNA酶或核酶的基因，所述RNA或核酶可以用作內(nèi)切核糖核酸酶，并催化具有選定序列的RNA分子的切割。選定信使RNA的切割可以導(dǎo)致其編碼的多肽產(chǎn)物的產(chǎn)生減少。這些基因可以用來(lái)制備具有所述核酶的新型轉(zhuǎn)基因植物。轉(zhuǎn)基因植物可以具有水平降低的多肽，所述多肽包括但不限于可以受反義RNA影響的上述多肽。
也有可能將基因?qū)耄援a(chǎn)生由于共抑制機(jī)制使天然基因產(chǎn)物表達(dá)降低的新型轉(zhuǎn)基因植物。在煙草、番茄和矮牽牛(Goring等，1991；Smith等，1990；Napoli，C.等，1990；van der Krol等，1990)中已經(jīng)證明，天然基因有義轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)將以類似于反義基因觀察到的方式減少或消除所述天然基因的表達(dá)。所導(dǎo)入的基因可以編碼全部或部分的靶天然蛋白，但其翻譯可能不是該天然蛋白水平降低所需的。
2.非RNA表達(dá)例如，可以將DNA元件插入基因中并引起突變，所述DNA元件包括轉(zhuǎn)座因子，例如Ds、Ac或Mu?？梢圆迦脒@些DNA元件，以使基因失活(或激活)，并由此“標(biāo)記”一種特定性狀。在這種情況下，轉(zhuǎn)座因子不引起所標(biāo)記突變的不穩(wěn)定性，因?yàn)樗鲆蜃拥膶?shí)用性不依賴于其在基因組中的移動(dòng)能力。一旦所需性狀被標(biāo)記，則可以例如用所導(dǎo)入的DNA序列作為PCR引物，并且采用PCR基因克隆技術(shù)因，用所導(dǎo)入的DNA序列來(lái)克隆相應(yīng)的基因(Shapiro，1983；Dellaporta等，1988)。所述特定性狀的完整基因(需要時(shí)包括控制區(qū)或調(diào)節(jié)區(qū))一經(jīng)鑒定，則可以將其分離、克隆并根據(jù)需要進(jìn)行操作。導(dǎo)入有機(jī)體中以進(jìn)行基因標(biāo)記的DNA元件的實(shí)用性與所述DNA序列無(wú)關(guān)，并且不依賴于所述DNA序列的任何生物活性，即轉(zhuǎn)錄為RNA或翻譯為蛋白質(zhì)。所述DNA元件的唯一功能是破壞所述基因的DNA序列。
設(shè)想了，非表達(dá)的DNA序列，包括新合成的序列，可以導(dǎo)入細(xì)胞中作為那些細(xì)胞和植物及其種子的專有“標(biāo)記”。對(duì)于一個(gè)標(biāo)記DNA元件而言，破壞宿主有機(jī)體內(nèi)源基因的功能可能不是必需的，因?yàn)樵揇NA的唯一功能是鑒定出所述有機(jī)體的起源。例如，人們可以將一種獨(dú)特DNA序列導(dǎo)入植物中，該DNA元件將所有細(xì)胞、植物和這些細(xì)胞的后代鑒定為是由該標(biāo)記來(lái)源產(chǎn)生的。認(rèn)為包括標(biāo)記DNA，將使得人們能夠辨別專有種質(zhì)或者來(lái)源于這類專有種質(zhì)的種質(zhì)、來(lái)源于非標(biāo)記種質(zhì)的種質(zhì)。
可以導(dǎo)入的另一種可能的元件是基質(zhì)附著區(qū)元件(MAR)，例如雞溶菌酶A元件(Stief，1989)，該元件可以定位在可表達(dá)目的基因周圍，以實(shí)現(xiàn)該基因總體表達(dá)的增加，并且在摻入植物基因組中時(shí)減少依賴于位置的效應(yīng)(Stief，1989；Phi-Van等，1990)。
有利地影響植物含水量、總水勢(shì)、滲透勢(shì)和充盈的新型預(yù)選DNA區(qū)段的表達(dá)，可以增強(qiáng)植物的耐旱能力。本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗旱性”和“耐旱性”用來(lái)指與正常環(huán)境相比植物對(duì)水分有效性降低所誘導(dǎo)的脅迫的增強(qiáng)抗性或耐力，以及植物在少水(lower-water)環(huán)境中行使功能和存活以及以相對(duì)優(yōu)越的方式表現(xiàn)的能力。在本發(fā)明的該方面，提出例如編碼滲透活性溶質(zhì)生物合成的預(yù)選DNA區(qū)段的表達(dá)可以賦予抗干旱的保護(hù)作用。在該類預(yù)選DNA區(qū)段中有編碼甘露醇脫氫酶(Lee和Saier，1982)和海藻糖-6-磷酸合酶(Kaasen等，1992)的DNA。通過(guò)細(xì)胞中天然磷酸酶的后續(xù)作用或通過(guò)導(dǎo)入和共表達(dá)特定的磷酸酶，這些導(dǎo)入的預(yù)選DNA將分別導(dǎo)致或者甘露醇或者海藻糖的積累，這兩種化合物已經(jīng)被大量記載為能夠減輕脅迫效應(yīng)的保護(hù)性化合物。已經(jīng)證實(shí)了轉(zhuǎn)基因煙草中甘露醇的積累，并且初步結(jié)果表明，表達(dá)高水平這種代謝物的植物能夠耐受所施加的滲透脅迫(Tarczynski等，參見(jiàn)上文(1992)，(1993))。
同樣，已經(jīng)記載了其它代謝物保護(hù)任一種酶功能(例如alanopine或丙酸)或膜完整性(例如alanopine)的功效(Loomis等，1989)，因此表達(dá)編碼這些化合物生物合成的預(yù)選DNA區(qū)段可能以類似于甘露醇或補(bǔ)充甘露醇而賦予抗旱性。天然存在的具有滲透活性和/或在干旱和/或干燥期間提供某些直接保護(hù)性效應(yīng)的代謝物的其它實(shí)例，包括糖和糖衍生物，例如果糖、赤蘚糖醇(Coxson等，1992)；山梨糖醇、半乳糖醇(Karsten等，1992)；葡糖基甘油(Reed等，1984；Erdmann等，1992)；蔗糖、水蘇糖(Koster和Leopold，1988)；(Blackman等，1992)；ononitol和右旋肌醇甲醚(Vemon和Bohnert，1992)；和棉子糖(Bemal-Lugo和Leopold，1992)。不是糖的其它滲透活性溶質(zhì)包括但不限于脯氨酸(Rensburg等，1993)和甜菜堿(Wyn-Jones和Storey，1981)。通過(guò)例如控制上述滲透活性化合物和其它這類化合物的預(yù)選DNA區(qū)段的導(dǎo)入和表達(dá)，將增強(qiáng)逆境期間持續(xù)的株冠生長(zhǎng)和增加的生殖適度，其中所述這類化合物在一個(gè)典型實(shí)施方案中以肌醇0-甲基轉(zhuǎn)移酶為代表。
設(shè)想了特定蛋白質(zhì)的表達(dá)也可以提高耐旱性。根據(jù)結(jié)構(gòu)相似性，已經(jīng)確定了三類晚期胚胎發(fā)生蛋白(參見(jiàn)Dure等，1989)。在成熟(即干化)種子中已經(jīng)證實(shí)有所有三類這些蛋白質(zhì)。在這三種類型的蛋白中，II型(dehydrin型)通常涉及植物營(yíng)養(yǎng)部分的耐旱性和/或耐燥性(即Mundy和Chua，(1988)；Piatkowski等，(1990)；Yamaguchi-Shinozaki等，(1992))。最近，發(fā)現(xiàn)III型LEA(HVA-1)在煙草中的表達(dá)影響植物的株高、成熟度和耐旱性(Fitzpatrick，(1993))。來(lái)自所有三類的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)因此可以賦予耐旱性。在缺水期間誘導(dǎo)的其它類型的蛋白質(zhì)包括巰基蛋白酶、醛縮酶和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Guerrero等，1990)，它們?cè)诟珊得{迫期間可以賦予各種保護(hù)性功能和/或修復(fù)型功能。影響脂質(zhì)生物合成并因此影響膜組成的預(yù)選DNA區(qū)段的表達(dá)也可以用于賦予植物抗旱性。
改善抗旱性的許多基因具有互補(bǔ)的作用方式。因此，這些基因的組合在改善玉米抗旱性方面可能具有相加效應(yīng)和/或協(xié)同效應(yīng)。這些基因中的許多基因也改善耐凍性(或抗凍性)；在嚴(yán)寒和干旱期間發(fā)生的物理脅迫在性質(zhì)上相似，并且可以以相似方式減輕。通過(guò)組成型表達(dá)這些基因可以提供益處，但表達(dá)這些新基因的優(yōu)選方式可以是通過(guò)應(yīng)用充盈誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(例如Guerrero等(1990)和Shagan等(1993)描述的充盈誘導(dǎo)基因的啟動(dòng)子，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。這些基因的時(shí)空表達(dá)模式可以使得玉米能夠更好地抵抗逆境。
一般認(rèn)為，涉及使從干燥土壤中提取的水分增加的特定形態(tài)性狀的基因的表達(dá)將是有益的。例如，改變根特征的基因的導(dǎo)入和表達(dá)可以增強(qiáng)水分吸收。也考慮了，在逆境期間增強(qiáng)生殖適度的DNA的表達(dá)將具有重大價(jià)值。例如，提高花粉脫落和雌花部分(即花絲)受精同步的DNA的表達(dá)將是有益的。另外，一般認(rèn)為在逆境期間使籽粒敗育最少的基因的表達(dá)，將增加收獲的谷粒量，因此也是有價(jià)值的。還設(shè)想了，通過(guò)導(dǎo)入和表達(dá)具有合適調(diào)節(jié)序列的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因，調(diào)節(jié)單子葉植物(例如玉米)中的細(xì)胞因子水平，可以改善單子葉植物抗逆性和提高產(chǎn)量(Gan等Science，270，1986(1995))。
已知水分在決定產(chǎn)量方面的總體作用，因此設(shè)想了通過(guò)導(dǎo)入并表達(dá)新基因，使玉米能夠更加有效地利用水分，甚至當(dāng)土壤水分有效性無(wú)限制時(shí)也將改進(jìn)綜合性能。通過(guò)導(dǎo)入提高玉米在各種各樣的與水分有效性相關(guān)的逆境中最大利用水分能力的基因，可以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)量的穩(wěn)定性或產(chǎn)量性能的一致性。
III.將本發(fā)明載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞本發(fā)明一般包括涉及將預(yù)選核酸序列導(dǎo)入受體細(xì)胞(例如植物細(xì)胞)以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞的步驟。雖然最好是通過(guò)噴灑或摩擦使本發(fā)明的載體或組合物與植物、植物部分或植物組織接觸，但是可以將所述載體或組合物通過(guò)其它方法體外導(dǎo)入植物細(xì)胞中。為此，所述植物組織源的細(xì)胞最好是可以再生能育轉(zhuǎn)基因植株和/或種子的胚胎發(fā)生細(xì)胞或細(xì)胞系。所述細(xì)胞可以得自或者單子葉植物或者雙子葉植物。植物種的合適實(shí)例包括小麥、水稻、擬南芥屬、煙草、玉米、大豆等。優(yōu)選的細(xì)胞類型是單子葉植物細(xì)胞，例如玉米細(xì)胞，所述細(xì)胞可以在懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物中，或者可以在完整的植物部分中，例如未成熟胚，或在特化的植物組織中，例如愈傷組織，例如I型或II型愈傷組織。
所述植物組織源的細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法中的任一種進(jìn)行。實(shí)例是經(jīng)電穿孔直接將DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化(美國(guó)專利第5,384,253號(hào)和美國(guó)專利第5,472,869號(hào)，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中；Dekeyser等，1990)；通過(guò)PEG沉淀直接將DNA轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞(Hayashimoto等，1990)；通過(guò)微彈轟擊直接將DNA轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞(McCabe等，1988；Gordon-Kamm等1990；美國(guó)專利第5,489,520號(hào)；美國(guó)專利第5,538,877號(hào)；和美國(guó)專利第5,538,880號(hào)，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中)；脂質(zhì)體；和通過(guò)用農(nóng)桿菌感染將DNA轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞?？梢杂闷渲袃H僅在大腸桿菌衍生質(zhì)?？寺≥d體上攜帶表達(dá)盒的“裸露”的DNA，進(jìn)行例如微彈轟擊或電穿孔的方法。在病毒載體的情況下，理想的是所述系統(tǒng)保留復(fù)制功能，但缺乏誘導(dǎo)病害的功能。
雙子葉植物轉(zhuǎn)化的優(yōu)選方法是通過(guò)采用葉圓片方案(Horsch等，1985)用根癌農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞。單子葉植物例如玉蜀黍(Zea mays)可以通過(guò)微彈轟擊胚發(fā)生愈傷組織或未成熟胚，或通過(guò)在用含果膠酶的酶部分酶降解細(xì)胞壁后進(jìn)行電穿孔(美國(guó)專利第5,384,253號(hào)和美國(guó)專利第5,472,869號(hào))進(jìn)行轉(zhuǎn)化。例如，按照以下文獻(xiàn)所述的方法，進(jìn)行加速離子處理，可以轉(zhuǎn)化得自玉蜀黍未成熟胚的胚發(fā)生細(xì)胞系，所述文獻(xiàn)為上述Gordon-Kamm等(1990)或美國(guó)專利第5,489,520號(hào)；美國(guó)專利第5,538,877號(hào)和美國(guó)專利第5,538,880號(hào)。切下的未成熟胚也可以用作轉(zhuǎn)化的靶，然后進(jìn)行組織培養(yǎng)物誘導(dǎo)、選擇和再生，如美國(guó)申請(qǐng)序號(hào)08/112,245和PCR公布號(hào)WO 95/06128所描述的方法。此外，利用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法已經(jīng)由Hiei等(歐洲專利0604 662，1994)和Saito等(歐洲專利0 672 752，1995)描述。
用其中所述表達(dá)盒可以單獨(dú)地載于任何大腸桿菌衍生質(zhì)?？寺≥d體的“裸露”DNA，進(jìn)行例如微彈轟擊或電穿孔的方法。在病毒載體的情況下，理想的是所述系統(tǒng)保留復(fù)制功能，但缺乏誘導(dǎo)病害的功能。
為了實(shí)現(xiàn)通過(guò)電穿孔進(jìn)行轉(zhuǎn)化，人們可以利用易碎的組織，例如懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物或胚發(fā)生愈傷組織，或者，人們可以直接轉(zhuǎn)化未成熟胚或其它組構(gòu)的組織?？梢酝ㄟ^(guò)將預(yù)選細(xì)胞或器官的細(xì)胞壁暴露于果膠降解酶(果膠酶或果膠溶酶)或以控制方式對(duì)其進(jìn)行機(jī)械損傷，部分降解預(yù)選細(xì)胞或器官的細(xì)胞壁。這類細(xì)胞則為感受態(tài)，易于經(jīng)電穿孔吸收DNA，電穿孔可以在該階段進(jìn)行，然后根據(jù)新?lián)饺氲腄NA的性質(zhì)，通過(guò)合適的選擇或篩選方案鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
將轉(zhuǎn)化DNA區(qū)段傳遞至植物細(xì)胞的再一個(gè)優(yōu)選方法是微彈轟擊。在該方法中，可以用DNA包被微粒，并通過(guò)推進(jìn)力將微粒傳遞到細(xì)胞中。典型的粒子包括由鎢、金、鉑等構(gòu)成的粒子。
設(shè)想了，在某些情況下，對(duì)于用微彈轟擊將DNA傳遞至受體細(xì)胞而言，將DNA沉淀在金屬粒子上可能是必不可少的。也設(shè)想了所述粒子可以含有DNA，而不是包被有DNA。因此提出，粒子可以提高DNA傳遞的水平，但粒子本身卻不是將DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞所必需的。
微彈轟擊除了是可重現(xiàn)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化單子葉植物的有效方法外，微彈轟擊的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是需要分離原生質(zhì)體(Christou等，1988)、形成部分降解的細(xì)胞或?qū)r(nóng)桿菌感染的敏感性。用于通過(guò)加速將DNA傳遞到玉米細(xì)胞中的方法的一個(gè)說(shuō)明性實(shí)施方案是基因槍粒子(BiolisticsParticle)傳遞系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以用來(lái)將包有DNA或細(xì)胞的粒子通過(guò)篩網(wǎng)例如不銹鋼篩網(wǎng)或Nytex篩網(wǎng)發(fā)射到覆蓋有懸浮培養(yǎng)的玉米細(xì)胞的濾紙表面上(Gordon-Kamm等，1990)。篩網(wǎng)將粒子分散，使得它們不會(huì)以大的聚集體傳遞至受體細(xì)胞。人們認(rèn)為，間插在發(fā)射裝置和待轟擊細(xì)胞之間的篩網(wǎng)，減少轟擊粒子聚集體的大小，并且可能通過(guò)減少聚集的轟擊粒子對(duì)受體細(xì)胞施加的損傷，而導(dǎo)致更高的轉(zhuǎn)化頻率。
關(guān)于所述轟擊，最好是將懸浮液中的細(xì)胞在濾膜或固體培養(yǎng)基上濃縮?；蛘撸梢栽诠腆w培養(yǎng)基上布置未成熟胚或其它靶細(xì)胞。待轟擊的細(xì)胞位于macroprojectile阻擋板之下適當(dāng)?shù)木嚯x處。如有需要，還可在加速裝置和待轟擊細(xì)胞之間放置一個(gè)或多個(gè)篩網(wǎng)。通過(guò)利用本文敘述的技術(shù)，人們可以獲得高達(dá)1000個(gè)或更多的瞬時(shí)表達(dá)標(biāo)記基因的細(xì)胞轉(zhuǎn)化灶。在轟擊后48小時(shí)在轉(zhuǎn)化灶中表達(dá)所述外源基因產(chǎn)物的細(xì)胞數(shù)范圍通常為約1-10個(gè)，平均約1-3個(gè)。
在轟擊轉(zhuǎn)化中，人們可以優(yōu)化轟擊前培養(yǎng)條件和轟擊參數(shù)，以產(chǎn)生最大數(shù)目的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體。轟擊的物理參數(shù)和生物學(xué)參數(shù)在該技術(shù)中均是重要的。物理因素是涉及操作所述DNA/微彈沉淀或影響大彈(macroprojectile)或微彈射程和速度的因素。生物學(xué)因素包括涉及在轟擊之前以及緊隨轟擊后的細(xì)胞操作的所有步驟、有助于減輕與轟擊相關(guān)創(chuàng)傷的靶細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)以及轉(zhuǎn)化DNA的性質(zhì)，例如線性化DNA或完整的超螺旋質(zhì)粒DNA。人們認(rèn)為轟擊前操作對(duì)于成功轉(zhuǎn)化未成熟胚尤為重要。
因此，設(shè)想了人們可能需要在小規(guī)模研究中調(diào)節(jié)各種轟擊參數(shù)，以全面優(yōu)化所述條件。人們可能特別希望調(diào)節(jié)諸如間距(gap)距離、飛行距離、組織距離和氦氣壓之類的物理參數(shù)。人們也可以通過(guò)修改影響受體細(xì)胞生理狀態(tài)和可能因此影響轉(zhuǎn)化和整合效率的條件，使創(chuàng)傷減少因素(TRF)最小化。例如，可以調(diào)節(jié)滲透狀態(tài)、組織水合作用和受體細(xì)胞的傳代培養(yǎng)階段或細(xì)胞周期，以使轉(zhuǎn)化最佳。本文公開(kāi)的這類小規(guī)模優(yōu)化研究結(jié)果，根據(jù)本說(shuō)明書，其它常規(guī)調(diào)節(jié)的實(shí)施是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
用于轉(zhuǎn)化的植物組織來(lái)源的選擇將取決于宿主植物的性質(zhì)和轉(zhuǎn)化方案。有用的組織來(lái)源包括愈傷組織、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、原生質(zhì)體、葉段、莖段、穗、花粉、胚、下胚軸、塊莖段、分生組織區(qū)等。選擇并轉(zhuǎn)化組織來(lái)源，使得它在轉(zhuǎn)化后保留再生能育全株的能力，即含有全能細(xì)胞。I型或II型胚性玉米愈傷組織和未成熟胚是優(yōu)選的玉蜀黍組織來(lái)源。在美國(guó)申請(qǐng)序號(hào)08/112,245和PCT公布號(hào)WO 95/06128中詳細(xì)描述了用于單子葉植物轉(zhuǎn)化的組織來(lái)源的選擇(所述文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。
在針對(duì)選擇的植物組織的條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將植物細(xì)胞或組織暴露于帶有預(yù)選DNA序列的DNA一段有效的時(shí)間。這可以從不足1秒的用于電穿孔的電脈沖至2-3天的在含質(zhì)粒的農(nóng)桿菌細(xì)胞存在下的共培養(yǎng)。所用緩沖液和培養(yǎng)基也隨植物組織來(lái)源和轉(zhuǎn)化方案而變化。許多轉(zhuǎn)化方案利用固體培養(yǎng)基平板表面上由無(wú)菌濾紙圓片與從待轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織分離的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的飼養(yǎng)層(例如，煙草或黑墨西哥甜玉米)。
將預(yù)選核酸序列轉(zhuǎn)移至植物的一個(gè)優(yōu)選方法是用本發(fā)明的組合物噴灑或摩擦植物或植物部分。優(yōu)選的單子葉植物包括甜玉米、燕麥、水稻、玉米、小麥、苜蓿、三葉草、羊茅、高粱、小米、大麥、黑麥或梯牧草。優(yōu)選的雙子葉植物包括蕓苔屬、黃瓜、煙草、馬鈴薯、番茄、歐洲油菜、草莓、大豆、向日葵、擬南芥、矮牽牛、豌豆、canola、菜豆、萵苣、芹菜、苜蓿、棉花、羽扇豆和胡蘿卜。
IV.預(yù)選核酸區(qū)段的檢測(cè)為了確證再生植物中預(yù)選核酸區(qū)段或“轉(zhuǎn)基因”的存在，可以進(jìn)行多種測(cè)定。這類測(cè)定包括例如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的“分子生物學(xué)”測(cè)定，例如DNA印跡法和RNA印跡法、原位雜交和基于核酸的擴(kuò)增法，例如PCR或RT-PCR；“生化”測(cè)定，例如檢測(cè)蛋白產(chǎn)物的存在，例如通過(guò)免疫學(xué)方法(ELISA和蛋白質(zhì)印跡法)或通過(guò)酶功能檢測(cè)；植物部分測(cè)定，例如葉測(cè)定或根測(cè)定；以及通過(guò)分析再生全株的表型，例如分析抗病性或抗蟲(chóng)性。
可以從細(xì)胞系或任何植物部分分離出DNA，以通過(guò)應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)確定預(yù)選核酸區(qū)段的存在。請(qǐng)注意，不總是存在完整的序列，推測(cè)是由于序列在細(xì)胞中的重排或缺失引起的。
通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)確定通過(guò)本發(fā)明方法導(dǎo)入的核酸元件的存在。用該技術(shù)，擴(kuò)增預(yù)估核酸片段，并通過(guò)凝膠電泳檢測(cè)。該類型的分析使得人們可以確定預(yù)選核酸區(qū)段是否存在于穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體中，但不證明所導(dǎo)入的預(yù)選核酸區(qū)段整合到宿主細(xì)胞的基因組中。另外，用PCR技術(shù)不可能確定轉(zhuǎn)化體是否具有導(dǎo)入基因組中不同位點(diǎn)的外源基因，即轉(zhuǎn)化體是否具有獨(dú)立的來(lái)源。設(shè)想了。用PCR技術(shù)，有可能克隆與所引入的預(yù)選DNA區(qū)段相鄰的宿主基因組DNA片段。
采用DNA印跡雜交技術(shù)，可以確定DNA整合到宿主基因組的陽(yáng)性證明以及轉(zhuǎn)化體的獨(dú)立身份。用該技術(shù)，可以鑒定出導(dǎo)入宿主基因組中的特定DNA序列以及側(cè)翼宿主DNA序列。因此，給定轉(zhuǎn)化體的DNA印跡雜交模式用作該轉(zhuǎn)化體的鑒別特征。另外，有可能通過(guò)DNA印跡雜交，證實(shí)在高分子量DNA中存在所導(dǎo)入的預(yù)選DNA區(qū)段，即證實(shí)所導(dǎo)入的預(yù)選DNA區(qū)段已經(jīng)整合到宿主細(xì)胞基因組中。DNA印跡雜交技術(shù)提供了用PCR獲得的信息，例如預(yù)選DNA區(qū)段的存在，但也證明整合到基因組中，并且特征鑒定了每個(gè)個(gè)別的轉(zhuǎn)化體。
設(shè)想了，用DNA印跡雜交技術(shù)的改進(jìn)技術(shù)-斑點(diǎn)印跡雜交或狹線印跡雜交，人們可以獲得得自PCR的同樣的信息，例如預(yù)選DNA區(qū)段的存在。
PCR和DNA印跡雜交技術(shù)都可以用來(lái)證實(shí)預(yù)選DNA區(qū)段傳播至后代。在大多數(shù)情況下，給定轉(zhuǎn)化體的特征性DNA印跡雜交模式將如一種或多種孟德?tīng)柣蛞粯釉谧哟蟹蛛x(Spencer等，1992)；Laursen等，1994)，表明該基因的穩(wěn)定遺傳。種系傳播和同樣的DNA印跡雜交模式和轉(zhuǎn)化DNA在愈傷組織、R0植株和該轉(zhuǎn)化基因分離的R1子代中的強(qiáng)度，表明愈傷組織和親代轉(zhuǎn)化體(R0)的非嵌合性質(zhì)。
鑒于可以用從植物任何部分分離出的DNA進(jìn)行DNA分析技術(shù)，RNA可以僅在特定細(xì)胞或組織類型中表達(dá)，因此，有必要從這些組織中制備RNA用于分析。PCR技術(shù)也可以用來(lái)對(duì)由所導(dǎo)入的預(yù)選DNA區(qū)段產(chǎn)生的RNA進(jìn)行檢測(cè)和定量。在PCR的這種應(yīng)用中，首先有必要用例如反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA，然后通過(guò)應(yīng)用常規(guī)的PCR技術(shù)擴(kuò)增所述DNA。在大多數(shù)情況下，PCR技術(shù)雖然是有用的，但不證明所述RNA產(chǎn)物的完整性。關(guān)于所述RNA產(chǎn)物性質(zhì)的進(jìn)一步的信息可以通過(guò)RNA印跡法獲得。該技術(shù)將證明一種RNA的存在并且給出關(guān)于該RNA完整性的信息。一種RNA的存在與否也可以通過(guò)斑點(diǎn)或狹線RNA印跡雜交得以證實(shí)。這些技術(shù)是RNA印跡法的改進(jìn)技術(shù)，并且將僅證明一種RNA的存在是否。
雖然可以用DNA印跡法和PCR檢測(cè)上述預(yù)選DNA區(qū)段，但它們不提供關(guān)于所述預(yù)選DNA區(qū)段是否表達(dá)的信息。通過(guò)具體鑒定所導(dǎo)入的預(yù)選DNA區(qū)段的蛋白產(chǎn)物或評(píng)估由所述DNA區(qū)段的表達(dá)產(chǎn)生的表型變化，可以評(píng)估表達(dá)。
關(guān)于特定蛋白質(zhì)的產(chǎn)生和鑒定的測(cè)定可以利用所述蛋白質(zhì)的物理化學(xué)特性、結(jié)構(gòu)特性、功能特性或其它特性。獨(dú)特的物理化學(xué)特性或結(jié)構(gòu)特性可使得所述蛋白質(zhì)得以分離，并通過(guò)電泳法(例如非變性或變性凝膠電泳或等電聚焦)鑒定，或通過(guò)層析技術(shù)(例如離子交換或凝膠排阻層析)鑒定。個(gè)別蛋白質(zhì)的特有結(jié)構(gòu)提供在例如ELISA測(cè)定的形式中利用特異性抗體檢測(cè)其存在的可能?？梢允褂枚喾N方法的組合，而特異性甚至更強(qiáng)，其中用抗體定位已經(jīng)用電泳技術(shù)分離的個(gè)別基因產(chǎn)物的蛋白質(zhì)印跡法?？梢杂闷渌夹g(shù)來(lái)絕對(duì)證實(shí)目的產(chǎn)物的身份，例如在純化后通過(guò)氨基酸測(cè)序進(jìn)行評(píng)價(jià)。雖然這些是其中最常用的技術(shù)，但還可以使用其它方法。
也可以用多種測(cè)定法，根據(jù)蛋白質(zhì)的功能性、特別是酶催化涉及特定底物和產(chǎn)物的特定化學(xué)反應(yīng)的能力，鑒定蛋白質(zhì)的表達(dá)。在這些反應(yīng)后可以用物理方法或化學(xué)方法提供并定量測(cè)定底物的損失或反應(yīng)產(chǎn)物的生成。實(shí)例隨待分析的酶的變化而變化，可以包括根據(jù)由膦絲菌素和14C-乙酰CoA產(chǎn)生放射標(biāo)記的乙酰化膦絲菌素測(cè)定PAT酶活性，或根據(jù)鄰氨基苯甲酸熒光的損失測(cè)定鄰氨基苯甲酸合酶活性，以上僅例舉了兩個(gè)實(shí)例。
通常通過(guò)評(píng)價(jià)基因產(chǎn)物表達(dá)的表型結(jié)果，來(lái)確定基因產(chǎn)物的表達(dá)。這些測(cè)定也可以采用許多形式，包括但不限于分析所述植物的化學(xué)組成、形態(tài)或生理特性的改變。由于編碼酶或貯藏蛋白預(yù)選DNA區(qū)段的表達(dá)，改變了氨基酸組成，因此可以改變化學(xué)組成，通過(guò)氨基酸分析，或通過(guò)可以用近紅外反射光譜法分析改變淀粉量的酶，改變所述化學(xué)組成。形態(tài)改變可以包括體型更大或莖桿更粗。在稱為生物測(cè)定的小心控制的條件下，評(píng)估植物或植物部分對(duì)所施加處理應(yīng)答的最常見(jiàn)的變化。
預(yù)期此中產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)于多種商業(yè)和研究目的是有用的?？梢詣?chuàng)造轉(zhuǎn)基因植物以用于傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)，以具有對(duì)載培者有益的性狀(例如農(nóng)藝性狀，例如對(duì)缺水的抗性、抗蟲(chóng)性、除草劑抗性或產(chǎn)量提高)、對(duì)從所述植物收獲的谷物的消費(fèi)者有益的性狀(例如人類食品或動(dòng)物飼料營(yíng)養(yǎng)物含量提高)、或?qū)κ称芳庸ふ哂幸娴男誀?例如加工性狀的改進(jìn))。在這類應(yīng)用中，通常培育所述植物，以將其谷粒用于人類或動(dòng)物食品中。然而，植物的其它部分包括莖桿、外殼、營(yíng)養(yǎng)體部分等也具有實(shí)用性，包括用作動(dòng)物青貯飼料或用于觀賞目的。通常，提取玉米和其它作物的化學(xué)組分(例如油或淀粉)以用于食品或工業(yè)應(yīng)用，并且可以創(chuàng)造這類組分含量提高或改進(jìn)的轉(zhuǎn)基因植物。
轉(zhuǎn)基因植物也可以應(yīng)用于蛋白質(zhì)或其它分子的商業(yè)生產(chǎn)，其中從植物部分、種子等中提取目的分子并將其純化。也可以在體外培養(yǎng)來(lái)自所述植物的細(xì)胞或組織，或讓所述細(xì)胞或組織進(jìn)行發(fā)酵，以生產(chǎn)這類分子。
所述轉(zhuǎn)基因植物也可以用于商業(yè)育種程序，或可以與相關(guān)物種作物的植株雜交或配種。由所述預(yù)選DNA區(qū)段編碼的改進(jìn)可以例如從玉米細(xì)胞傳遞至其它物種的細(xì)胞，例如通過(guò)原生質(zhì)體融合進(jìn)行傳遞。
所述轉(zhuǎn)基因植物在研究或育種方面有許多應(yīng)用，包括通過(guò)插入誘變創(chuàng)造新的突變植物，以便鑒定隨后可能通過(guò)傳統(tǒng)突變和選擇產(chǎn)生的有益突變體。一個(gè)實(shí)例將是導(dǎo)入編碼轉(zhuǎn)座因子、可以用來(lái)產(chǎn)生遺傳變異的重組DNA序列。本發(fā)明的方法也可以用來(lái)創(chuàng)造具有特有“標(biāo)記(signature)序列”或可以用來(lái)鑒定專有系或品種的其它標(biāo)記序列的植物。
本發(fā)明將通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步描述，所述實(shí)施例并不限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1用于在植物中局部或系統(tǒng)傳播的基于FHV的表達(dá)載體為了解決與現(xiàn)有的基于植物病毒的載體相關(guān)的問(wèn)題，并且開(kāi)發(fā)用于植物基因表達(dá)的高度有效的病毒載體系統(tǒng)，制備了一種基于羅達(dá)病毒的載體。所述載體(圖8)包括FHVRNA-2序列，其中將稱為綠色熒光蛋白(GFP；Epel等，1996；Casper等，1996)的標(biāo)記基因?qū)胍職で绑w的切割位點(diǎn)(β/γ，
圖1)中，使得通過(guò)在不同的時(shí)間間隔測(cè)定接種葉片中的綠色熒光，可以監(jiān)測(cè)FHV或者FHV RNAsFHV外殼蛋白GFP核蛋白復(fù)合體的表達(dá)和移動(dòng)。GFP是一種最初從水母-維多利亞水母(Aequorea victoria)(Av)中分離的具有238個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。它吸收藍(lán)光，在395nm有最大吸收，并且發(fā)射發(fā)射峰在509nm的綠光。當(dāng)GFP在或者原核細(xì)胞或者真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，它能夠在用藍(lán)光(紫外線)激發(fā)時(shí)產(chǎn)生強(qiáng)綠色熒光，并且這種熒光不需要來(lái)自其宿主的額外基因產(chǎn)物。
為了構(gòu)建載體pF2G3(圖8)，使用一種Bluescript噬菌粒載體(Stratagene，Califomia)中的FHV RNA-2的cDNA克隆(pBWD2)。用限制性酶NsiI將該質(zhì)粒在切割位點(diǎn)打開(kāi)。用含有NsiI位點(diǎn)的特異性引物從TMV cDNA克隆p30BGFPC3(在pUC19噬菌粒載體中含有TMVRNA序列加GFP序列)中經(jīng)PCR擴(kuò)增GFP序列(cycle 3 GFP，707bp，對(duì)于在植物中表達(dá)優(yōu)化的)。將該P(yáng)CR產(chǎn)物純化，并插入pBWD2的NsiI位點(diǎn)中(圖8)。
用100μl的10ng/μl FHV RNA或100μl的50ng/μl從pF2G3制備的RNA轉(zhuǎn)錄物加10ng/μl FHV RNA-1作為FHV復(fù)制酶來(lái)源，接種2周齡的野生型(TRS1)和表達(dá)TMV MP(H3NB3)或RCNMV MP的轉(zhuǎn)基因Nicotiana benthamiana植株。用T3或T7RNA聚合酶，由所述載體DNA制備體外轉(zhuǎn)錄的RNA。使用TMV MP轉(zhuǎn)基因N.benthamiana植株，是因?yàn)橐呀?jīng)確定用FHV RNA接種表達(dá)TMV MP的轉(zhuǎn)基因N.benthamiana植物，導(dǎo)致與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因N.benthamiana葉片中FHV積累水平高100倍(
圖17)。該結(jié)果表明，TMVMP促進(jìn)FHV的細(xì)胞至細(xì)胞的移動(dòng)?？俁NA的RT-PCR證實(shí)了這一結(jié)果。
在23-25℃、12小時(shí)光照期的生長(zhǎng)室中培育植物。平行進(jìn)行一個(gè)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，其中用由p30BGFPC3制備的RNA轉(zhuǎn)錄物接種葉片。通過(guò)(1)從葉片提取的總RNA的反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)，和(2)以不同時(shí)間間隔通過(guò)手持UV燈在葉片上照射測(cè)量綠色熒光，監(jiān)測(cè)葉片的FHV RNA以及GFP的合成。
接種后15天收獲葉片，并且通過(guò)勻漿從100mg葉片(在液氮中冷凍)，然后通過(guò)熱苯酚抽提，提取總RNA(Verwoerd等，1989)。用SuperscriptII(Gibco/BRL，Bethesda，MD)和Taq聚合酶(Promega，Madison，WI)，分別將其反轉(zhuǎn)錄(RT)為cDNA和通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增。RT反應(yīng)在42℃進(jìn)行1小時(shí)。PCR的循環(huán)參數(shù)為94℃1分鐘，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)94℃30秒、55℃1分鐘、72℃1.5分鐘，然后進(jìn)行一個(gè)循環(huán)72℃2分鐘。所用引物是FHV2R1400 (SEQ ID NO1ACCTTAGTCTGTTGAC)和FHV2F1(SEQ ID NO2；GTAAACAATTCCAAG)。將PCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上電泳(
圖12)。
如上所述，已經(jīng)觀察到FHV在TMV MP轉(zhuǎn)基因植株中的滴度增加100倍。通過(guò)對(duì)來(lái)自接種的TMV MP轉(zhuǎn)基因植株和RCNMV MP轉(zhuǎn)基因植株的RNA進(jìn)行的RT-PCR分析，證實(shí)了這一結(jié)果。TMV MP和RCNMV MP均使FHV移動(dòng)至未接種的第二片葉片(
圖12，5-8道)。在非轉(zhuǎn)基因植株中，F(xiàn)HV序列僅在接種葉片中檢測(cè)到，沒(méi)有在未接種的第二片葉片中檢測(cè)到(
圖12，3道和4道)。當(dāng)在接種后的不同時(shí)間監(jiān)測(cè)FHVRNA合成時(shí)，野生型植物中FHV序列的存在在7dpi時(shí)達(dá)到高峰，但在14dpi和12dpi時(shí)實(shí)際上檢測(cè)不到。這可能是由于在缺乏細(xì)胞至細(xì)胞移動(dòng)時(shí)病毒或病毒核蛋白的失活所致。然而，在轉(zhuǎn)基因植物中，由于FHV通過(guò)接種葉片移動(dòng)，合成從10dpi持續(xù)至21dpi。用FHV RNA接種一半的葉片，然后通過(guò)RT-PCR監(jiān)測(cè)，也表明FHV序列在轉(zhuǎn)基因植物中移動(dòng)至未接種的一半葉片，但與野生型植物相比移動(dòng)非常差。用FHV RNA-1特異性引物和FHV RNA-2特異性引物，通過(guò)RT-PCR確定植物中存在FHV序列。
也用RT-RCR分析來(lái)檢測(cè)NOV在N.benthamiana細(xì)胞中以及第一片(感染的)葉片中的復(fù)制。用NOV RNA接種野生型植株和表達(dá)RCNMV MP的轉(zhuǎn)基因植株，并且在7-10天后收集第一片、第二片和第三片葉片。在第二片或第三片葉片中沒(méi)有檢測(cè)到病毒，雖然來(lái)自轉(zhuǎn)基因植株的第一片葉片相對(duì)于非轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出較高量的病毒(比非轉(zhuǎn)基因植株高約5-10倍)。
通過(guò)綠色熒光測(cè)量GFP，從10dpi開(kāi)始在用由F2G3(參見(jiàn)圖8)制備的RNA轉(zhuǎn)錄物接種的葉片中顯示出斑駁綠色熒光的小區(qū)。相比之下，未接種的植株沒(méi)有表現(xiàn)出任何這類熒光。已經(jīng)構(gòu)建了能夠高表達(dá)GFP的載體，例如基于FHVDI 634的載體(圖7和圖9)。用這些構(gòu)建體顯示出綠色熒光(如
圖13中所示，來(lái)自用30BGFPC3的RNA轉(zhuǎn)錄物接種的植株的葉片；與
圖14中未接種的葉片進(jìn)行比較)證明FHV序列以及MP和GFP在這種植株中表達(dá)。
已經(jīng)表明植物病毒通過(guò)該植物的長(zhǎng)距離移動(dòng)依賴于外殼蛋白。因此，基于FHV的載體的系統(tǒng)傳播可以通過(guò)將植物病毒的外殼蛋白(CP)導(dǎo)入所述載體中而得到增強(qiáng)。因此，可以將基因組策略與FHV相似的一種植物病毒-紅三葉草壞死花葉病毒(RCNMV)的CP導(dǎo)入pF2TmG3中，產(chǎn)生pFdTmRcG3(
圖10)。RCNMV是一種球狀植物病毒，其基因組分為兩個(gè)信使RNA(Xiong等，1993)。RCNMV RNA-1(3.9kb)編碼外殼蛋白(CP，37kDa)，而RNA-2(1.5kb)編碼RCNMV移動(dòng)蛋白(35kDa)。
在所述基于FHV的載體中TMV MP、RCNMV CP和GFP序列可以作為融合蛋白表達(dá)。或者，可以將蛋白酶解切割序列導(dǎo)入這些基因之間，使得所表達(dá)蛋白在翻譯后加工各個(gè)蛋白。最初，將GFP序列置于3’端，使得GFP的表達(dá)作為上游序列(即TMV MP和RCNMV CP)完全表達(dá)的指示。然而，本發(fā)明不限于所導(dǎo)入基因的任何特定順序。
實(shí)施例2應(yīng)用基于FHV的載體將抗病性導(dǎo)入植物系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)是植物用來(lái)抗病原體感染的許多機(jī)制中的一種。在煙草中，編碼致病相關(guān)(PR)蛋白的9個(gè)基因家族在SAR期間被協(xié)同誘導(dǎo)(關(guān)于綜述，參見(jiàn)Ryals等，1996)。已經(jīng)表明某些SAR相關(guān)蛋白(PR1a和SAR 8.2)抑制煙草中由卵菌綱寄生疫霉(Phytophthoraparasitica)(Alexander等，1992；Alexander等，1993，Alexander等，1993)和簇囊腐霉(Pythium torulosum)所致的植物病害。因此，通過(guò)本發(fā)明的載體將SAR相關(guān)蛋白導(dǎo)入煙草或?qū)腭R鈴薯中，可能對(duì)于抑制或防治煙草或馬鈴薯的所述卵菌綱所致植物病害(例如由致病疫霉(Phytophthora infestans)引起的晚疫病)有作用。
為了將SAR基因?qū)氡景l(fā)明的載體中，可以使用在有已知序列和限制位點(diǎn)(
圖15)的質(zhì)粒(pCGN1788A)中的SAR 8.2基因的cDNA克隆。從該質(zhì)粒中經(jīng)PCR擴(kuò)增含SAR 8.2基因的BamHI-SstI片段(529bp)，并將該P(yáng)CR產(chǎn)物連接到基于FHV的載體中。3-6周齡植株的煙草葉片或馬鈴薯葉片用得自該載體的RNA和FHV RNA-1共轉(zhuǎn)染。以規(guī)定的間隔，通過(guò)熒光測(cè)量和RT-PCR監(jiān)測(cè)CPMPSAR8.2GFP融合蛋白的表達(dá)。在SAR開(kāi)始表達(dá)時(shí)，通過(guò)用蒸餾水中的腐霉屬或疫霉屬游動(dòng)孢子(300個(gè)孢子/ml)澆灌土壤或噴灑葉片，接種植物(Alexander等，1993；Chen等，1996)。不用FHV-SAR8.2嵌合體轉(zhuǎn)染的對(duì)照植株以相似方式也用游動(dòng)孢子接種。感染的植株保持在溫室中7-9天，溫度為23-25℃，光照期為12小時(shí)，并且比較對(duì)例如猝倒、枯萎或矮化的病癥的抑制。
實(shí)施例3應(yīng)用FHV衍生載體對(duì)殺蟲(chóng)蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域作圖出現(xiàn)的功能基因組學(xué)領(lǐng)域要求用于測(cè)試編碼序列和基因調(diào)節(jié)序列的推定生物學(xué)功能的高通量系統(tǒng)?；蚪M學(xué)對(duì)其特別有用的三種技術(shù)包括反義失效(knockout)、RNA干擾(共抑制)和大基因的結(jié)構(gòu)域作圖(Briggs等，1997；McKusick，1997；Evans等，1997)。四種長(zhǎng)7-10kb的Pht(由細(xì)菌發(fā)光光桿狀菌分泌的一種殺蟲(chóng)蛋白)基因與毒素特性相關(guān)，但毒性必需的最小序列尚未鑒定出。已知四種毒素復(fù)合位點(diǎn)tca、tcb、tcc和tcd的遺傳圖譜(
圖16)。為了確定這些基因的哪些區(qū)域是毒性必需的，將所述Pht基因的特定序列及其組合導(dǎo)入基于FHV的載體中，以篩選Pht的功能區(qū)(Bowen等，1998)。特別是，由于已經(jīng)表明tca和tcd的缺失消除了毒性(Bowen，1998)，因此將這些基因亞克隆到FHV衍生的載體中。最初，將通過(guò)部分或完全限制性消化產(chǎn)生的tca和tcd基因的約500-1500bp片段導(dǎo)入該載體中。用由這些構(gòu)建體制備的RNA轉(zhuǎn)錄物接種N.Benthamiana植株，并且通過(guò)將植物部分飼喂昆蟲(chóng)(煙草天蛾(Manduca sexta))，然后測(cè)量所述昆蟲(chóng)在48小時(shí)內(nèi)的體重降低，監(jiān)測(cè)所述毒素基因的表達(dá)。
實(shí)施例4本發(fā)明的載體應(yīng)用于昆蟲(chóng)功能基因組學(xué)為了用昆蟲(chóng)細(xì)胞系或昆蟲(chóng)作為本發(fā)明載體的宿主，根據(jù)對(duì)感染或轉(zhuǎn)染后細(xì)胞病效應(yīng)即裂解的抗性，選擇修飾的病毒、修飾的昆蟲(chóng)細(xì)胞系或非天然昆蟲(chóng)宿主，例如果蠅。一個(gè)途徑是通過(guò)突變或通過(guò)多次傳代將病毒減毒。另一種途徑是選擇經(jīng)受住裂解的細(xì)胞系。約1％的果蠅屬細(xì)胞在FHV感染后經(jīng)受住裂解，成為持續(xù)感染。存活的細(xì)胞帶有FHV，抗羅達(dá)病毒的超感染，并且能夠在新鮮細(xì)胞中繁殖(Dasgupta等，1994)。對(duì)FHV基因組RNA的序列分析表明，在持續(xù)感染建立期間在病毒基因組中沒(méi)有突變，表明不是病毒基因組的修飾，而可能果蠅屬細(xì)胞中的修飾(總?cè)后w的1％)導(dǎo)致持續(xù)感染。一種替代途徑是用來(lái)自FHV和NOV的外殼蛋白序列構(gòu)建雜種病毒。NOV RNA可以在轉(zhuǎn)染的昆蟲(chóng)細(xì)胞中繁殖，而不產(chǎn)生細(xì)胞病效應(yīng)(Ball等，1992)。由RNA-1編碼的聚合酶識(shí)別來(lái)自或者FHV或者NOV的序列。
對(duì)于這些途徑中的任一途徑而言，通過(guò)感染/轉(zhuǎn)染將具有目的基因或基因文庫(kù)的基于FHV的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，并且檢測(cè)表型的變化。因此，可以在短時(shí)間內(nèi)鑒定和分析例如蛋白產(chǎn)物導(dǎo)致病害增強(qiáng)或抑制、眼形狀和顏色改變、發(fā)育改變、生長(zhǎng)改變和體重改變等的基因。
實(shí)施例5參考文獻(xiàn)Abel等，Science，232738(1986)。
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所有出版物、專利和專利申請(qǐng)都通過(guò)引用結(jié)合到本文中。雖然在上述詳細(xì)描述中在本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案方面已經(jīng)描述了本發(fā)明，而且已經(jīng)敘述許多細(xì)節(jié)用于說(shuō)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，本發(fā)明可以容許其它實(shí)施方案，并且在不偏離本發(fā)明的基本原理的情況下，可以對(duì)本文描述的某些細(xì)節(jié)作相當(dāng)大的改變。
權(quán)利要求
1.一種生物活性基因轉(zhuǎn)移載體，所述載體包含連接的核酸序列，所述核酸序列包含(a) 一段來(lái)源于羅達(dá)病毒RNA-1或羅達(dá)病毒RNA-2的5’端的核酸序列；(b) 一段包含至少一個(gè)目的核酸區(qū)段的核酸序列；和(c) 一段來(lái)源于羅達(dá)病毒RNA-1或羅達(dá)病毒RNA-2的3’端的核酸序列。
2.權(quán)利要求1的載體，其中所述(b)的核酸序列包含一個(gè)具有多克隆位點(diǎn)的核酸區(qū)段。
3.權(quán)利要求2的載體，其中所述(b)的核酸序列還包含一個(gè)編碼植物病毒移動(dòng)蛋白的第二核酸區(qū)段。
4.權(quán)利要求2的載體，其中所述(b)的核酸序列還包含一個(gè)編碼植物病毒外殼蛋白的第二核酸區(qū)段。
5.權(quán)利要求2的載體，其中所述(b)的核酸序列還包含一個(gè)含標(biāo)記基因或選擇標(biāo)記的第二核酸區(qū)段。
6.權(quán)利要求3或4的載體，其中所述(b)的核酸序列還包含一個(gè)含標(biāo)記基因或選擇標(biāo)記的第三核酸區(qū)段。
7.權(quán)利要求3或5的載體，其中所述(b)的核酸序列還包含一個(gè)編碼植物病毒外殼蛋白的第三核酸區(qū)段。
8.權(quán)利要求4或5的載體，其中所述(b)的核酸序列還包含一個(gè)編碼植物病毒移動(dòng)蛋白的第三核酸區(qū)段。
9.權(quán)利要求1的載體，其中所述(b)的核酸序列包含一個(gè)編碼植物病毒移動(dòng)蛋白的核酸區(qū)段。
10.權(quán)利要求1的載體，其中所述(b)的核酸序列包含一個(gè)含標(biāo)記基因或選擇標(biāo)記的核酸區(qū)段。
11.權(quán)利要求1的載體，其中所述(b)的核酸序列包含一個(gè)編碼植物病毒外殼蛋白的核酸區(qū)段。
12.權(quán)利要求6的載體，其中將所述核酸區(qū)段連接，以產(chǎn)生一種融合多肽。
13.權(quán)利要求7的載體，其中將所述核酸區(qū)段連接，以產(chǎn)生一種融合多肽。
14.權(quán)利要求8的載體，其中將所述核酸區(qū)段連接，以產(chǎn)生一種融合多肽。
15.權(quán)利要求1的載體，所述載體是RNA。
16.權(quán)利要求1的載體，其中所述(b)的核酸序列包含一個(gè)反義核酸區(qū)段。
17.權(quán)利要求3的載體，其中所述核酸區(qū)段編碼煙草花葉病毒的移動(dòng)蛋白。
18.權(quán)利要求8的載體，其中所述核酸區(qū)段編碼煙草花葉病毒的移動(dòng)蛋白。
19.權(quán)利要求9的載體，其中所述核酸區(qū)段編碼煙草花葉病毒的移動(dòng)蛋白。
20.權(quán)利要求1的載體，其中所述(b)的核酸序列包含一個(gè)編碼毒素的核酸區(qū)段。
21.權(quán)利要求20的載體，其中所述核酸區(qū)段編碼發(fā)光光桿狀菌(Photorhabdus luminescens)毒素、致病桿菌屬(Xenorhabdus)毒素、肉毒桿菌(Botulinum)毒素或霍亂毒素。
22.一種核酸組合物，所述核酸組合物包含(a) 一定量的羅達(dá)病毒RNA-1；和(b) 一定量的權(quán)利要求15的載體。
23.一種核酸組合物，所述核酸組合物包含(a) 一定量的羅達(dá)病毒RNA-1；和(b) 一定量的包含連接的RNA序列的重組RNA分子，所述RNA序列包含來(lái)源于羅達(dá)病毒RNA-1或羅達(dá)病毒RNA-2的5’端的RNA；編碼植物病毒移動(dòng)蛋白的RNA；和來(lái)源于羅達(dá)病毒RNA-1或羅達(dá)病毒RNA-2的3’端的RNA。
24.一種核酸組合物，所述核酸組合物包含(a) 一定量的羅達(dá)病毒RNA-1；和(b) 一定量的包含連接的RNA序列的重組RNA分子，所述RNA序列包含來(lái)源于羅達(dá)病毒RNA-1或羅達(dá)病毒RNA-2的5’端的RNA；編碼植物病毒外殼蛋白的RNA；和來(lái)源于羅達(dá)病毒RNA-1或羅達(dá)病毒RNA-2的3’端的RNA。
25.一種在宿主細(xì)胞中表達(dá)由重組RNA分子編碼的蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括(a) 使宿主細(xì)胞與一定量的權(quán)利要求23或24的組合物接觸；和(b) 檢測(cè)或測(cè)定所述蛋白質(zhì)是否表達(dá)。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述宿主細(xì)胞是雙子葉植物細(xì)胞。
27.權(quán)利要求25的方法，其中所述宿主細(xì)胞是單子葉植物細(xì)胞。
28.權(quán)利要求25的方法，其中所述宿主細(xì)胞是昆蟲(chóng)細(xì)胞。
29.權(quán)利要求25的方法，其中所述宿主細(xì)胞是動(dòng)物細(xì)胞。
30.一種在宿主細(xì)胞中表達(dá)包含核酸區(qū)段的核酸序列的方法，所述方法包括(a) 使宿主細(xì)胞與一定量的權(quán)利要求1的載體接觸；和(b) 檢測(cè)或測(cè)定所述核酸區(qū)段是否表達(dá)。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述宿主細(xì)胞是雙子葉植物細(xì)胞。
32.權(quán)利要求30的方法，其中所述宿主細(xì)胞是單子葉植物細(xì)胞。
33.權(quán)利要求30的方法，其中所述宿主細(xì)胞是昆蟲(chóng)細(xì)胞。
34.權(quán)利要求30的方法，其中所述宿主細(xì)胞是動(dòng)物細(xì)胞。
35.一種將包含核酸區(qū)段的核酸序列導(dǎo)入植物的方法，所述方法包括使植物接觸一定量的權(quán)利要求1的載體接觸，以便產(chǎn)生其細(xì)胞包含權(quán)利要求1的載體的植物。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述核酸區(qū)段編碼生長(zhǎng)激素、毒素、細(xì)胞因子、抗病性、抗蟲(chóng)性、雄性不育性或殺蟲(chóng)劑抗性。
37.權(quán)利要求35的方法，其中所述植物通過(guò)噴灑或摩擦進(jìn)行接觸。
38.一種將重組RNA分子導(dǎo)入植物的方法，所述方法包括使植物與一定量的權(quán)利要求23或24的組合物接觸，以便產(chǎn)生其細(xì)胞包含所述重組RNA分子的植物。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述重組RNA分子編碼生長(zhǎng)激素、毒素、細(xì)胞因子、抗病性、抗蟲(chóng)性、雄性不育性或殺蟲(chóng)劑抗性。
40.權(quán)利要求38的方法，其中所述植物通過(guò)噴灑或摩擦進(jìn)行接觸。
41.一種將核酸區(qū)段導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞的方法，所述方法包括(a) 使動(dòng)物細(xì)胞與一定量的權(quán)利要求1的載體接觸；和(b) 檢測(cè)或測(cè)定在所述動(dòng)物細(xì)胞中所述核酸區(qū)段的存在。
42.一種將核酸區(qū)段導(dǎo)入昆蟲(chóng)細(xì)胞的方法，所述方法包括(a) 使昆蟲(chóng)細(xì)胞與一定量的權(quán)利要求1的載體接觸；和(b) 檢測(cè)或測(cè)定在所述昆蟲(chóng)細(xì)胞中所述核酸區(qū)段的存在。
43.權(quán)利要求41或42的方法，其中所述核酸區(qū)段編碼生長(zhǎng)激素、毒素或細(xì)胞因子。
44.一種重組羅達(dá)病毒，所述重組羅達(dá)病毒包含一個(gè)感染性的第一RNA分子；和一個(gè)第二重組RNA分子，所述第二重組RNA分子編碼病毒外殼蛋白、病毒移動(dòng)蛋白或其組合。
45.一種轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的基因組增加了權(quán)利要求1的載體。
46.一種植物部分，所述植物部分來(lái)自權(quán)利要求45的植物。
47.權(quán)利要求46的植物部分，所述植物部分是種子。
48.一種植物，所述植物由權(quán)利要求47的種子產(chǎn)生。
49.一種植物，所述植物用權(quán)利要求35的方法產(chǎn)生。
50.一種植物部分，所述植物部分用權(quán)利要求49的植物產(chǎn)生。
51.權(quán)利要求50的植物部分，所述植物部分是種子。
52.一種植物，所述植物由權(quán)利要求51的種子產(chǎn)生。
53.一種植物，所述植物用權(quán)利要求36的方法產(chǎn)生。
54.一種植物部分，所述植物部分用權(quán)利要求53的植物產(chǎn)生。
55.權(quán)利要求54的植物部分，所述植物部分是種子。
56.一種植物，所述植物由權(quán)利要求55的種子產(chǎn)生。
57.權(quán)利要求3的載體，其中所述核酸區(qū)段編碼紅三葉草壞死花葉病毒的外殼蛋白。
58.權(quán)利要求8的載體，其中所述核酸區(qū)段編碼紅三葉草壞死花葉病毒的外殼蛋白。
59.權(quán)利要求9的載體，其中所述核酸區(qū)段編碼紅三葉草壞死花葉病毒的外殼蛋白。
60.接觸了羅達(dá)病毒的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物的基因組增加了編碼煙草花葉病毒外殼蛋白的DNA。
61.接觸了權(quán)利要求1的載體的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物的基因組增加了編碼煙草花葉病毒外殼蛋白的DNA。
62.接觸了羅達(dá)病毒的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物的基因組增加了編碼紅三葉草壞死花葉病毒外殼蛋白的DNA。
63.接觸了權(quán)利要求1的載體的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物的基因組增加了編碼煙草花葉病毒外殼蛋白的DNA。
64.權(quán)利要求60、61、62或63的轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物是Nicotiana benthamiana。
65.權(quán)利要求61或63的轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物接觸了羅達(dá)病毒。
全文摘要
本發(fā)明提供可用于將基因轉(zhuǎn)移至植物、昆蟲(chóng)和其它宿主的昆蟲(chóng)病毒載體。
文檔編號(hào)C12N15/86GK1352693SQ00808087
公開(kāi)日2002年6月5日 申請(qǐng)日期2000年3月29日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月31日
發(fā)明者R·K·達(dá)斯古普塔, R·古德曼 申請(qǐng)人:威斯康星舊生研究基金會(huì)