一種建立急性病毒性肝炎動物模型的方法
【專利說明】
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及肝臟免疫學和實驗動物學技術領域，具體涉及一種建立急性病毒性肝炎動物模型的方法。
【【背景技術】】
[0002]肝炎是嚴重危害人民生命健康且死亡率較高的一種疾病，病因主要包括病毒感染、過度酒精攝入和服入化學毒物等造成肝臟實質細胞的破壞，其致病機制復雜。由于人體肝臟標本的缺乏以及體外研究的局限性，建立實驗性肝臟損傷動物模型，模擬人類肝臟疾病，研究肝炎的發(fā)病機制，篩選治療肝炎的藥物，具有十分重要的現(xiàn)實意義。
[0003]其中肝臟免疫損傷備受關注，特別是肝臟淋巴細胞參與的病理損傷已經(jīng)成為多種肝炎發(fā)病機制中至關重要的因素，現(xiàn)有技術中公開了由刀豆蛋白(concanavalin A)誘導的肝炎模型，該模型將刀豆蛋白以15微克/克體重(μ g/g.wt)靜脈注射小白鼠，導致T細胞依賴的肝損傷；現(xiàn)有技術中還公開了自然殺傷T細胞，即NKT細胞，通過Fas配體介導的細胞毒活性參與刀豆蛋白誘導的肝炎模型；以及巨噬細胞(肝臟內的Kupffer細胞)通過分泌腫瘤壞死因子TNF參與刀豆蛋白誘導的肝炎模型。
[0004]現(xiàn)有技術中的肝炎模型多為化學性損傷或免疫損傷，都無法很好的模擬病毒性感染引起的肝炎，因此無法指導病毒性肝炎的臨床研究及藥物的開發(fā)，而我國乙肝、甲肝、丙肝發(fā)病率居高，急需要病毒性肝炎模型支持對病毒性肝炎治療的研究。因此，現(xiàn)有技術中公開了 D-氨基半乳糖與微量細菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)共處理引起肝臟損傷的動物模型，該模型中D-氨基半乳糖與LPS處理小白鼠后，小白鼠對LPS敏感性明顯增強，弓丨起小白鼠急性肝臟損傷，伴有嚴重肝臟充血和壞死，甚至出現(xiàn)死亡，LPS可以通過與Toll樣受體2、4結合，刺激淋巴細胞分泌炎性淋巴因子，引起肝臟局部炎癥。
[0005]上述D-氨基半乳糖與LPS協(xié)同使用，雖然可以模擬病毒性肝炎，但該模型中LPS可刺激多種Toll樣受體，且誘導較慢，也無法模擬病毒性感染引起的急性肝損傷。
[0006]因此，建立出一種模擬效果好的急性病毒性肝炎動物模型成為亟待解決的問題。
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【發(fā)明內容】
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[0007]本發(fā)明的目的在于克服上述不足之處，提供一種建立急性病毒性肝炎動物模型的方法，解決現(xiàn)有技術中模擬病毒性感染引起的急性肝損傷效果不佳的技術問題。
[0008]本發(fā)明為解決上述技術問題所采用的方案如下:
[0009]一種建立急性病毒性肝炎動物模型的方法，包括以下步驟:
[0010]步驟1:從純系小白鼠(純系BALB/c小鼠)、純系B6小鼠(純系C57BL/6J小鼠)、純系嚴重聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)小鼠、純系裸鼠(純系BALB/c背景的裸鼠)或純系分化抗原Id (⑶)缺陷小鼠(純系BALB/c背景的小鼠)中選擇至少一組小鼠；
[0011]步驟2:用無菌磷酸緩沖溶液(PBS溶液)配制D-氨基半乳糖溶液，用無菌磷酸緩沖溶液配制多聚肌苷酸:多聚胞苷酸溶液；
[0012]步驟3:對步驟I所選的每組純系小鼠分別注射D-氨基半乳糖溶液和多聚肌苷酸:多聚胞苷酸溶液，其中，D-氨基半乳糖每克體重劑量范圍是0.15?0.5mg，多聚肌苷酸:多聚胞苷酸每克體重劑量范圍是0.03?0.5 μ g ;
[0013]步驟4:D-氨基半乳糖溶液和多聚肌苷酸:多聚胞苷酸溶液腹腔注射或靜脈注射后6?24小時，收集血液后分離血清，檢測血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)活性，結果為300?800U/L，則急性病毒性肝炎動物模型建立成功。
[0014]優(yōu)選地，所述步驟I中所選的為6?8周齡的純系小白鼠。
[0015]優(yōu)選地，所述步驟2中的D-氨基半乳糖溶液終濃度為15?30 μ g/μ 1，多聚肌苷酸:多聚胞苷酸溶液終濃度為5?1ng/μ I。
[0016]優(yōu)選地，所述步驟3中D-氨基半乳糖每克體重劑量是0.5mg，多聚肌苷酸:多聚胞苷酸每克體重劑量范圍是0.03 μ g。
[0017]優(yōu)選地，所述步驟4收集血清的時間為D-氨基半乳糖溶液和多聚肌苷酸:多聚胞苷酸溶液注射后12?18小時。
[0018]優(yōu)選地，所述步驟4除檢測血清丙氨酸轉移酶活性外還包括檢測血清天冬氨酸轉移酶(AST)活性；以及收集小鼠肝臟標本，顯微鏡下觀察肝臟組織學變化；血清丙氨酸氨基轉移酶活性和天冬氨酸轉移酶活性均為300?800U/L，肝臟組織學出現(xiàn)肝細胞點狀壞死，則急性病毒性肝炎動物模型建立成功。
[0019]優(yōu)選地，所述步驟4中D-氨基半乳糖溶液的注射方式為腹腔注射，多聚肌苷酸:多聚胞苷酸溶液的注射方式為尾靜脈注射。
[0020]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果在于，本發(fā)明的建立急性病毒性肝炎動物模型的方法通過D-氨基半乳糖和多聚肌苷酸:多聚胞苷酸協(xié)同作用，迅速誘導肝炎癥狀，對病毒性感染模擬效果好。
【【附圖說明】】
[0021]圖1是本發(fā)明實施例1的建立急性病毒性肝炎動物模型的方法的流程圖；
[0022]圖2是本發(fā)明實施例2的實驗組和對照組ALT活性對比圖；
[0023]圖3是本發(fā)明實施例2的實驗組和對照組AST活性對比圖。
【【具體實施方式】】
[0024]為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，下面結合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0025]本發(fā)明的建立急性病毒性肝炎動物模型的方法利用D-氨基半乳糖、多聚肌苷酸:多聚胞苷酸協(xié)同作用，能夠迅速引起肝炎，激活Toll受體信號通路，對病毒性感染模擬效果好。
[0026]其中，D-氨基半乳糖又稱半乳糖胺或軟骨糖胺，具有細胞毒性，其特異性導致肝損傷的機制尚不明確，D-氨基半乳糖通過消耗肝臟尿嘧啶三磷酸核苷酸，抑制肝細胞RNA合成；另外D-氨基半乳糖還可以引起肝細胞內Ca2+增多，Mg2+減少，Mg2VCa2+的比例失調，這可能也是D-氨基半乳糖導致肝細胞不可逆損害的因素之一；多聚肌苷酸:多聚胞苷酸溶液(polyinosinic acid-polycytidylic ac i d, po lyinos ini c-po Iycy tidy lie acid,簡稱 PolyIC)是一種人工合成的雙鏈核糖核酸(RNA)，能夠刺激、活化自然免疫細胞分泌干擾素，自然免疫細胞被過度活化導致肝臟實質細胞被破壞，本發(fā)明中所采用的多聚肌苷酸:多聚胞苷酸為病毒模擬物，其刺激機體產(chǎn)生的反應類似于病毒感染反應。
[0027]本發(fā)明的方法中一般選用純系BALB/c小鼠、純系C57BL/6J小鼠、純系嚴重聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)小鼠、純系BALB/c背景的裸鼠或純系分化抗原Id (CD)缺陷小鼠(純系BALB/c背景的小鼠)中的一組。作為一個優(yōu)選方案，選用6?8周齡的純系BALB/c小鼠或純系C57BL/6J小鼠，大于8周的小鼠肝臟損傷不明顯，更優(yōu)選地，選用6?8周齡的純系BALB/c 小鼠。
[0028]本發(fā)明的方法中D-氨基半乳糖溶液、多聚肌苷酸:多聚胞苷酸溶液的注射可以采用腹腔注射或者靜脈注射，采用腹腔注射較方便，在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，D-氨基半乳糖溶液采用腹腔注射，多聚肌苷酸:多聚胞苷酸溶液采用尾靜脈注射。
[0029]急性病毒性感染的效果與肝損傷的程度與D-氨基半乳糖溶液、多聚肌苷酸:多聚胞苷酸溶液的注射劑量有關，與D-氨基半乳糖與多聚肌苷酸:多聚胞苷酸的劑量比也有關，D-氨基半乳糖每克體重劑量范圍在0.15?0.5mg，多聚肌苷酸:多聚胞苷酸每克體重劑量范圍在0.03?0.5 μ g時，效果較佳，隨著劑量的增加，肝臟損傷較嚴重，死亡率急劇增力口，如果劑量較低，則達不到急性病毒性感染的效果。
[0030]D-氨基半乳糖溶液和多聚肌苷酸:多聚胞苷酸溶液注射后6?24小時，動物食量變差，毛發(fā)豎直，血清轉氨酶升高，此時，急性病毒性肝炎動物模型建立成功。一般情況下，ALT活性在300?800U/L時，動物模型建立成功；為了進一步增加動物模型的感染效果，注射后6?24小時收集血液后分離血清，檢測血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)活性和血清天冬氨酸轉移酶(AST)活性，收集小鼠肝臟標本，顯微鏡下觀察肝臟組織學變化，血清轉氨酶升高，肝臟組織學出現(xiàn)肝細胞點狀壞死，ALT活性和AST活性一般在300?800U/L，急性病毒性肝炎動物模型建立效果較好。
[0031]實施例1
[0032]本發(fā)明實施例1提供了一種建立急性病毒性肝炎動物模型的方法，如圖1所示，包括以下步驟:
[0033]步驟SlOl:不同純系小鼠的準