專利名稱：在硫代磷酸酯化引物存在下用核酸外切酶進行聚合酶鏈反應擴增前消毒的方法
聚合酶鏈反應(PCR)能夠擴增和測定少量的靶核酸。PCR的實際操作局限性包括由前次反應遺留的擴增核酸造成的污染，導致假陽性結果，以及其它非特異性產物如引物二聚體的生產和擴增導致假陰性結果。本發(fā)明提供了一種能克服這些局限性的PCR方法，這種PCR方法使用了硫代磷酸酯化的引物，并且在核酸外切酶存在下進行了擴增前的消毒。
PCR技術能夠擴增并隨后測定少量的靶核酸。現(xiàn)有技術如Mullis等的U.S 4,683,195，Mullis等人的US 4,683,202和Mullis等的4,965,188中詳細描述了PCR的細節(jié)。一般是把寡聚核苷酸引物退火形成靶核酸的變性鏈，用聚合酶聚合三磷酸脫氧核苷形成引物擴大產物。典型的PCR方法包括在一種熱穩(wěn)定性聚合酶作用下重復循環(huán)模板核酸變性，引物退火和該退火引物的擴大。這些步驟使得靶核酸指數(shù)擴增，并由此可以測定以非常低的濃度存在于樣品中的靶物質。
PCR可廣泛應用于各種不同領域如生物技術研究，臨床診斷和法醫(yī)中。盡管如此，該方法因受到使用局限性的影響而不能達到最理想的效率和特異性。具體來說，在PCR實驗的第一步循環(huán)(即″零循環(huán)″)前，一般要混合擴增試劑并在室溫或更低溫度下存放。因為象Thermus aquaticus(Taq)聚合酶這樣的熱穩(wěn)定性聚合酶即使在0℃下仍有殘存的活性，經低約束的活化和擴大能夠形成相對大量的非特異性產物。已知是零循環(huán)人為構造的這些非特異性產物包括連接在3＇-末端有同源性的引物所形成的引物二聚體。由于相對于通常靶物質的低濃度而言PCR中所用引物只是毫摩爾濃度，引物二聚體的形成是顯著的。因此引物-二聚體是尤其普遍的零循環(huán)人為構造。基于其他引物的擴增系統(tǒng)，如固相擴增，同樣也會受到引物-二聚體人為構造的影響。
在擴增過程中形成零循環(huán)人為構造會帶來實際操作的后果。一些試劑，包括引物和脫氧核苷，會被減少。而非特異性副產物就靶物質而言會作為聚合酶的競爭性抑制劑和該反應的其他限制性成份。結果，放大效率降低，而檢測的準確性也降低。同樣，由于以前放大樣本遺留下來造成的引物-二聚體的存在也是有害的。任何擴增效率的降低都會不利地影響這種測定方法的測定限度，并且由此可能會引起假陰性結果。引物二聚體的形成能夠把靶物質擴增效率降低到這樣一種程度，即所擴增的產物在染色凝膠上測定不到。在病原體如HIV的檢測試驗中，這種結果很明顯是不理想的。
在同源性PCR反應中特異性是非常重要的。參見，如Mitoma的EPA 487218；Higuchi的EPA 512334。在同源的測定中，擴增過程中或擴增后把反應混合物與一種熒光顏料接觸就能夠偶聯(lián)PCR擴增和測定反應，其中的熒光顏料一旦與雙股核酸反應就能夠產生可測定的熒光變化。例如，在溴化乙錠存在下進行PCR時，雙股DNA的產生與游離溴化乙錠插入雙股DNA中形成的熒光增強相關聯(lián)。通常在同一容器中進行擴增和測定。熒光的變化可用分光光度測定測得，因此這樣的測定既不需要分離PCR的產物也不需要雜交。因為測定一般是以雙股DNA的形成為基礎的，并且在靶DNA和非特異性產物之間難以辨別，所以雙股人為構造引物二聚體的形成對同源測定法的特異性是影響極大的。
PCR的其它顯著的操作局限性是由實驗室環(huán)境中的外源DNA污染或者由能在后擴增中作模板的前次擴增DNA(擴增子)攜帶所產生的污染造成的。擴增子遺留物一般會造成假陽性結果，而引物二聚體的遺留會造成假陰性結果。
人們已經開發(fā)了各種方法來克服這些局限性，并且因此也增加了PCR的特異性和效率。理論上認為選擇無3′-互補性的引物就能把引物二聚體人為構造降到最低。但是，實際上，特別是在使用所需的引物混合物中，一些3′-互補性是不可避免的。通常在共同擴增許多菌株或靶物質等位基團時要使用大量的引物。
通過增加嚴格性條件，例如通過增加退火溫度或加入變性劑也能夠改良特異性。但是，由于降低了對在較低嚴格性條件下可以擴增的靶物質突變型的實驗檢測能力，所以增加嚴格性條件會產生假陰性結果。
在減少零循環(huán)人為構造的其它方法中，所謂的PCR熱啟動方法，是向熱試劑混合物中加入聚合酶來開始反應的。(參見，如Erlich等人(1991)Science 2521642)。因為引物間的交叉反應所形成的反應中間體對熱不穩(wěn)定，所以減少了引物二聚體。盡管如此，這種方法卻在室溫下制備是不方便的，并且把聚合酶手工加入多個(一般是96個)PCR試管所造成的時間誤差會帶來復雜性。另外，因加入酶必須打開試管，所以″熱啟動″會增加由擴增子和/或引物二聚體攜帶污染的可能性。
人們已經利用熱不穩(wěn)定物理障礙，如石蠟珠或包裹層(overlays)把一種或多種PCR組份與其它組份進行物理分離，直到達到適合高嚴格條件下活化的溫度為止(參見，如Hebert等(1993)Molecular andCellular Probes I249)。但是，這些方法一般都不很方便，并且需要很好的手工熟練性。
人們已經使用Taq聚合酶的熱不穩(wěn)定抗體在低溫下抑制Taq聚合酶，來試圖限制零循環(huán)的人為構造(參見，如Sharkey等(1994)Bio/Technology 12506；Scalice等的US 5,338,671)。在PCR熱循環(huán)中升高溫度時，該抗體會發(fā)生熱變性，并且釋放出活性聚合酶。但是，即使親合性的抗體也不能完全抑制聚合酶的活性。例如，1毫摩爾具有1010M-1親和力的抗體作用于100毫升10納摩爾濃度的聚合酶達到平衡時會留下6千萬個游離活性聚合酶分子。由于PCR中所用的引物濃度相對較大，因而不管怎樣都會形成并擴增數(shù)目可觀的引物二聚體中間體。
人們已經開發(fā)出各種擴增前消毒的方法來把擴增子遺留降到最低。在擴增前步驟中，已經使用尿嘧啶-N-糖基酶(UNG)來裂解在零循環(huán)過程中摻入尿嘧啶殘余物時所制備的產物。(參見，如，Longo等(1990)Gene 93125；Espy等(1993)J.Clin Microbiol 312361。)在PCR中三磷酸脫氧尿苷(dUTP)取代了三磷酸脫氧胸苷(dTTP)，這樣能夠將模板DNA與PCR的產物區(qū)別開。把UNG酶包括在預混物中，并且由它催化從PCR第一循環(huán)前反應中存在的單膠或雙膠DNA上切割尿嘧啶。所得到的非堿性(abasic)聚核苷酸容易水解，并且在PCR過程中不能起模板作用。當UNG經熱變性顯示出失活性，殘余的活性仍可以降低PCR過程中所合成產物的擴增。而且，Longo等已比較過有UNG處理和無UNG處理時擴增產物的相對量，并且已報道在有UNG處理的反應中該擴增靶物的密度下降。所以不能期望UNG處理來解決產物擴增效率低的問題。此外，據(jù)報道UNG不能有效地作用于少于100個堿基對的擴增子，例如引物二聚體(Espy等)。
也有報道用核酸外切酶進行擴增前消毒。Muralidhar等人(1992)Gene 117107公開了噬菌體T7核酸外切酶能使PCR攜帶產物的分子失活，但據(jù)報道它卻能使基因組DNA靶物質完整無損。由于污染的擴增子相對于基因組靶分子是對稱的幾何學結構，所以據(jù)報道它優(yōu)先失活。Zhu等人(1991)Nucleic Acids Res，19251報道在PCR前用核酸外切酶III(ExoIII)消毒能降低擴增子和引物二聚體的延續(xù)。Exo III能夠催化5個單核苷酸從雙螺旋DNA的3′羥基端的順序裂解，并且據(jù)報道由于側鏈DNA序列的長度也能使基因組DNA保持較大程度的完整。
擴增前用核酸外切酶如Eox III消毒是基于已報道的該核酸外切酶對雙股DNA的特異性。特別是就Exo III而言，現(xiàn)有技術已經清楚ExoIII不能降解單股靶DNA。參見，如Zhu等人；PromegaCatalog，1994，136。任何單股核酸外切酶活性都能降解單一的引物鏈，因而降低了擴增效率，并增加了假陰性結果的可能性。
按照本發(fā)明人們已經發(fā)現(xiàn)由Zhu等所描述的擴增前用核酸外切酶如ExoIII消毒會導致來自低含量基因組靶物質信號的降低。這種信號降低的后果是增加了假陰性結果的可能性，特別在疾病的診斷中它會伴隨著嚴重的一系列影響。靶信號的損失，歸因于基因組靶物質的降解。按照本發(fā)明人們已經發(fā)現(xiàn)擴增效率的下降應歸因于單股引物的降解，與本領域教導的有關Exo III的雙股特異性相反。所以本發(fā)明提供了對以前未意識到的問題的識別，并且還針對該問題提供了一種解決辦法以及一種增加PCR效率的方法。
本發(fā)明教導了一種擴增靶核酸的方法，它包括把一種可能含有靶核酸的樣品與至少兩種寡聚核苷酸引物接觸，這些引物與雜交到其上的靶核酸區(qū)充分互補。其中各個寡聚核苷酸引物含有至少一個硫化磷酸酯鍵，另外該樣品還要與至少四個不同的三磷酸核苷，一種熱穩(wěn)定性聚合劑以及一種核酸外切酶接觸來形成一種反應混合物；把該反應混合物加熱使核酸外切酶失活，并且形成引物擴大產物。
本發(fā)明還提供了一種擴增靶核酸的藥盒，它在同一個或不同的容器中含有一種熱穩(wěn)定性聚合劑，一種核酸外切酶以及至少兩種引物，該引物與雜交到其上的核酸區(qū)充分互補，其中各個寡核苷酸引物至少含有一個硫化磷酸酯鍵。
在另外一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于PCR的混合物，它含有一種核酸外切酶和至少兩種寡聚核苷酸引物，其中各個寡聚核苷酸引物含有至少一個硫化磷酸酯鍵。該混合物也含有一種熱穩(wěn)定性聚合劑，三磷酸核苷，抗該聚合劑的一種單克隆抗體以及PCR的其它試劑。
本發(fā)明提供了一種擴增靶核酸的方法，該方法在不影響擴增效率的前提下比PCR的常規(guī)法降低了擴增子和引物二聚體以及零循環(huán)的其它人為構造的攜帶污染。具體地說，本發(fā)明方法在擴增前步驟中使用一種核酸外切酶來降解攜帶的DNA和零循環(huán)人為構造，并且使用硫化磷酸酯化引物來避免在這之前因核酸外切酶產生的意外引物降解。
在本領域中大家都熟知PCR的原理和擴增及測定靶核酸的條件，并且它們都可在本領域熟練技術人員所熟知的大量文獻中找到，例如Mullis等的US4,683,195，Mullis等的US 4,683,202以及Mullis等的US 4,965,188。簡要地說，在能夠與擴增區(qū)側面的靶序列互補的兩種寡聚核苷酸引物存在下，把可能含有靶核酸的樣本加熱使雙股核酸變性。引物退火形成分離的靶鏈，并用一種聚合劑如一種熱穩(wěn)定性聚合酶從各個3′羥基端延伸。用PCR能夠擴增雙股或單股的DNA。經過RNA反轉錄成cDNA的方法，RNA也能作為一種靶物質。在不連續(xù)的溫度下進行變性，引物退火和DNA合成步驟，并且重復這一循環(huán)使得該靶核酸呈指數(shù)累積。PCR的容器一般是一種帶塞的塑料容器或一種小杯或者如美國專利US 5,229,297中所描述的小盒。PCR擴增試劑典型地混合在一個容器中，一般包括引物，三磷酸核苷(一般是dATP，dCTP，dGTP和dTTP或dUTP)，熱穩(wěn)定性DNA聚合酶，含鎂的緩沖液以及靶核酸。PCR的試劑和條件對本領域普通技術人員是熟知的，并且能在如Guatelli等(1989)Clin Microbiol Rev 2217中找到。對RNA靶物質的擴增來說，除了熱穩(wěn)定性DNA聚合酶外還可以使用一種反轉錄酶或者用反轉錄酶替代熱穩(wěn)定DNA聚合酶。特別適用的是熱穩(wěn)定性反轉錄酶，具有反轉錄酶活性的熱穩(wěn)性DNA聚合酶也是適用的。RNA靶物質的PCR擴增方法對本領域普通技術人員是熟知的，并且在例如美國專利US 5,176,995，5,310,652和5,322,770中進行了描述。本發(fā)明也可用于以其它引物為主的核酸擴增方法，例如在國際專利中請WO 9300447中所述的LCR和缺隙LCR中使用。
本發(fā)明提供了一種已知核酸擴增方法的改良方法，從而提高了靶核酸的擴增效率，并減少了假陰性和假陽性結果。具體地說，本發(fā)明方法降低了零循環(huán)人為構造的形成，包括引物二聚體的形成，同時增加了靶DNA的擴增效率。引物二聚體可以是由兩個引物及其互補序列組成的雙股PCR產物。引物間可以插入其它堿基。(Erlich等人，(1991)Science 2521643)。當引物在3′端有互補性時特別有利于引物二聚一體的形成，引物二聚體的形成使擴增效率降低到這樣一種程度，即測定不出所擴增的靶物，從而造成了假陰性結果。用本發(fā)明方法克服的PCR常規(guī)方法的其它局限性是樣品攜帶污染的擴增。PCR樣品可被前次PCR中產生的擴增子或可擴增的產物分子或引物二聚體分子所污染。這類分子的擴增常常會造成錯誤的結果。
所以本發(fā)明方法也使假陰性和假陽性結果得到減少并使擴增的效率得到提高。
按照本發(fā)明的方法，在一種3′核酸外切酶存在下進行擴增前消毒。優(yōu)選優(yōu)先降解雙股DNA的核酸外切酶。這種擴增前消毒是降解雙螺旋結構的人工產物如引物二聚體以及攜帶的擴增子。在一個優(yōu)選方案中，3′核酸外切酶選自于核酸外切酶I，核酸外切酶III(ExoIII)，核酸外切酶VIII以及核糖核酸酶II。在最佳方案中核酸外切酶是Exo III。這些核酸外切酶對本領域普通技術人員是熟知的，并且從商業(yè)上可以得到。
按照本發(fā)明意外地發(fā)現(xiàn)對雙股DNA具有特異性的核酸外切酶還能夠降解單股DNA引物。對單股引物的降解可以達到這種程度，即減少或中止靶序列的擴增，從而導致無效擴增或假陰性結果。本發(fā)明方法在PCR中使用硫化磷酸酯化引物解決了這個問題。由于保護了硫化磷酸酯化引物不受核酸外切酶的消化，所以PCR中使用這類引物可以在每個樣品中使用增加量的核酸外切酶和/或增加孵育時間。反過來，使用增加量的核酸外切酶和/或增加孵育時間。提高了核酸酶前處理的效率，從而進一步提供保護，不受引物二聚體分子和PCR產物遺留的有害影響。
硫化磷酸酯化引物是寡聚核苷酸引物，其中用硫取代了核苷酸磷酸基團中的一個或兩個非橋接的氧。寡聚核苷酸中硫代磷酸酯核苷酸間鍵合的存在可引起對核酸外切酸的抑制，因此減緩或中止了硫化磷酸酯化引物的降解。硫化磷酸酯化引物可由本領域中熟知的化學或酶的方法制得，并且已公開于例如Eckstein(1985)Ann，Rev Biochem54367，Zon等(1991)Anti-Canc，Drug Des 6539，和Olsen等(1990)，Proc Natl Acad Sci USA 871451，以及US 5,003,097中。硫化磷酸酯化的核苷酸衍生物也可以從商業(yè)上獲得。
該引物的一個或多個或全部核苷酸間鍵合可以是硫化磷酸酯部分。在一個優(yōu)選方案中，該寡聚核苷酸含有一到四個硫化磷酸酯鍵。在距該引物的3′末端，次末端，第三位，第四或第五位上優(yōu)選有至少一個硫化磷酸酯鍵。該硫化磷酸酯鍵可以相互間隔或相鄰。在一個優(yōu)選方案中，該鍵相鄰并位于引物的3′端，在另一個優(yōu)選方案中，該引物至少在距其3′端的末端和次末端位置上含有一個硫化磷酸酯鍵。在另一個優(yōu)選方案中，該引物至少在距其3′端的末端位置上含有一個硫化磷酸酯鍵。在一個模型系統(tǒng)中，如實施例1和3所述的系統(tǒng)中，本領域普通技術人員可以通過在硫化磷酸酯化引物和一種3′核酸外切酶存在下測定擴增來確定硫化磷酸酯殘基的適當數(shù)目和位置。
在本發(fā)明的方法中，PCR擴增是在一種核酸外切酶和硫化磷酸酯化引物存在下預保溫所有的PCR試劑和含有靶核酸的樣品來實現(xiàn)的。在足以使該核酸外切酶失活的條件下加熱所得到的反應混合物，然后形成和擴增引物擴大產物。
本發(fā)明方法主要適用于本領域已知是同源性測試或同源性檢測系統(tǒng)的PCR擴增和測定方法中。這些系統(tǒng)在本領域中是眾所周知的，并且在例如已公布的歐洲專利申請91310062.4(487218)和92106989.4(512334)中進行了描述。在同源性系統(tǒng)中，擴增DNA的測定是基于結合在雙股DNA中的熒光化合物所產生的熒光變化而進行。因為測定一般是基于雙股DNA的形成，并且一般不能分辨出靶DNA和非特異性產物，所以雙股人為構造如引物二聚體的形成對該同源測定法的特異性是不利的。按照本發(fā)明，減少了引物二聚體，從而增加了該同源測定方法的特異性。
PCR所需要的試劑對本領域普通技術人員是熟知的，它一般包括至少兩種足以與雜交到其上的靶核酸，保守區(qū)域互補的寡聚核苷酸引物，四種不同的三磷酸核苷，一種熱穩(wěn)定性聚合劑和該聚合劑所必需的任何輔助因子。優(yōu)選的三磷酸核苷是三磷酸脫氧核苷dATP，dCTP，dGTP和dTTP或dUTP，共同稱之為dNTPs。三磷酸核苷從商業(yè)上可以獲得。
引物包括天然產生的或合成生產的寡聚核苷酸，在適當條件下，即有三磷酸核苷，一種聚合劑，適當溫度，pH和緩沖液存在下，它能夠使靶核酸退火并且作為核酸合成的起點。引物具有與雜交到其上的靶核酸足夠互補的序列，并且足夠長，一般10-60個核苷酸，能夠在聚合劑存在下引導擴大產物的合成。引物可以由本領域普通技術人員所熟知的方法自動合成生產。上文已描述了硫化磷酸酯化引物的合成。
引物設計的一些因素是本領域中所熟知的。選擇基本上與所擴增的具體核酸鏈序列互補的引物，使得由一個引物合成的擴大產物當從它的補體中分離出來時能夠作為其它引物擴大產物的模板。優(yōu)選的引物具有與靶區(qū)精確的互補性。
聚合劑是能夠實現(xiàn)引物擴大產物合成的化合物，這種聚合劑是熱穩(wěn)定的，即在PCR中使DNA鏈變性的常用溫度如93-95℃期間加熱時并不是永久性失活的，并且優(yōu)選高溫時具有活性。在一個優(yōu)選方案中該聚合劑是一個熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，例如包括從嗜熱細菌如Thermococcus Litoralis，Bacillus Stearothermophilus，Methanothermus fervidus，水生棲熱菌，T.filiformis，T.flavus，T.1acteus，T.rubens，T.ruber和T.thermophilus；或者從嗜熱的古細菌如Desulfurococcus mobilis，熱自養(yǎng)甲烷桿菌，Sulfolobussolfataricus，S.acidocaldarius和嗜酸熱原體中得到的DNA聚合酶。在最佳方案中，該聚合劑是水生棲熱菌(Taq)聚合酶，T.themophilus(Tth)聚合酶或Thermococcus litoralis聚合酶。熱穩(wěn)定的反轉錄酶，有反轉錄酶活性的DNA聚合酶也作為聚合劑。
這種熱穩(wěn)定聚合酶可以從商業(yè)上獲得或者用本領域中已知方法得到。特別是Taq聚合酶能以重組體和天然形式從商業(yè)上獲得(Perkin Elmer-Cetus)或者用Lawyer等人(1989)J.Biol.Chem.2646427或美國專利US 4,889,818中所述的方法生產。Tth聚合酶在商業(yè)上可以從芬蘭的Finnzyme公司和日本的Toyobo Co.公司獲得。Thermococcus litoralis聚合酶在商業(yè)上可以從NewEngland Biolabs獲得，并且能夠用美國專利US 5,322,785中所述的方法生產。
在擴增前步驟中可以包含有該熱穩(wěn)定聚合劑的特異性抗體在擴增前抑制該聚合劑。這些抗體能夠用本領域普通技術人員所熟知的方法生產，并且在例如Harlowe等人(1988)AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY中可以發(fā)現(xiàn)。按照本發(fā)明，術語抗體包括用常規(guī)方法生產的單克隆和多克隆抗體，重組法生產的抗體，以及化學方法或重組法生產的抗體片段，如Fab片段。在優(yōu)選方案中該抗體是單克隆抗體。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，抗體是抗Taq聚合酶，Tth聚合酶，或者Thermococcus litoralis聚合酶的單克隆抗體。在更為優(yōu)選的方案中，抗體是抗Taq聚合酶的單克隆抗體?？筎aq聚合酶的單克隆抗體在現(xiàn)有技術中是已知的，并且在例如美國專利US 5,338,671中進行了描述。按照本發(fā)明，定義為對聚合劑有特異性的抗體是那些能夠在20-40℃左右的溫度下抑制該聚合劑酶活性的抗體。在PCR熱循環(huán)中用升高溫度的方法使本發(fā)明的抗體失活。用如Sharkey等(1994)Biotechnology 12506中所述的本領域普通技術人員已知的測定方法能夠測出抗體抑制聚合酶酶活性的能力。
按照本發(fā)明中所用的核酸外切酶可以從商業(yè)上得到或者用現(xiàn)有技術中的已知方法獲得，它包括如，核酸外切酶III(Exo III)，核酸外切酶I、核酸外切酶VIII以及核糖核酸酶II。核酸外切酶對本領域普通技術人員是熟知的，并且由如Fasman ed，(1989)Practical Handbock of Biochemistry and MolecularBiologyCRC Press，BocaRaton，F(xiàn)L.進行過描述。按照本發(fā)明優(yōu)先使用3′核酸外切酶。也可以使用優(yōu)先作用了雙股DNA或單股DNA的核酸外切酶。優(yōu)選的是優(yōu)先作用于雙股DNA的核酸外切酶在一個優(yōu)選方案中，核酸外切酶是Exo III。在另一個優(yōu)選方案中，使用一種以上的核酸外切酶。例如，把優(yōu)先降解雙股DNA的一種核酸外切酶混合物與優(yōu)先降解單股DNA的一種核酸外切酶混合物如Exo I一起使用。在95℃使該核酸外切酶失活能進一步防止熱循環(huán)過程中核酸外切酶的活性，所以該核酸外切酶必須能在95℃失活。
本發(fā)明提供了一種在可疑含有靶核酸的樣品中擴增靶核酸，并可以隨后測定該核酸的方法，該樣品可以是懷疑含有靶核酸的任意樣品，它包括如，組織樣品，血，頭發(fā)，體液，細菌，病毒、真菌，細菌感染的細胞，病毒感染的細胞等等。靶核酸可以是DNA或RNA。在被擴增的序列兩端必須知道足夠數(shù)目的堿基對以設計能夠在適當位置雜交到靶核酸不同鏈的PCR擴增引物。在PCR前通過，例如，從樣品中除去蛋白或細胞物可以把靶核酸從組織樣品中提取或部分提取出來。從樣品中提取核酸的方法對本領域普通技術人員來說是熟知的，并且可以在例如Sambrook等(1989)Molecular CloningALaboratory Manualcold Spring Harbor Laboratory Press，Cold，Spring Harbor，NY和Saiki等，(1985)Bio Technology 31008中找到。
在本發(fā)明的擴增方法中，把樣品或從該樣品中提取的核酸制劑與PCR常用的試劑接觸來形成一種反應混合物，這種PCR的常用試劑包括至少兩種改良的含有至少一種硫化磷酸酯鍵，寡聚核苷酸引物，四種不同的三磷酸核苷，一種熱穩(wěn)定聚合劑，以及一種適當?shù)木彌_液，并且還含有一種核酸外切酶。在另一個實施方案中，這混合物中還包含了對聚合劑有特異性的抗體。
這些常用的PCR試劑，包括引物，三磷酸核苷，聚合劑以及適當?shù)木彌_液是以適合于PCR的常用濃度來使用的，并且對本領域普通技術人員是熟知的。在一個優(yōu)選方案中，三磷酸核苷是dATP，dCTP，dGTP和dTTP。在一個優(yōu)選方案中，該聚合劑是一種熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，優(yōu)選的DNA聚合酶是Taq聚合酶，Tth聚合酶和Thermococcus lito-rals聚合酶。Taq聚合酶是最佳的。
對聚合劑特異性的抗體是以室溫下有效抑制聚合劑的濃度來使用的。這種抗體可以是單克隆或多克隆，或一種抗體的片段。在一個優(yōu)選方案中，該抗體是單克隆抗體，并且是以高于該聚合劑5到500左右的摩爾比來使用的。在一個最佳方案中，該聚合劑是Taq聚合酶；該抗體是對Taq聚合酶有特異性的單克隆抗體。
核酸外切酶可以0.001單位/微升到10單位/微升左右的濃度來使用。一個優(yōu)選方案中，核酸外切酶是Exo III，并且是以0.01單位/微升到0.5單位/微升左右的濃度使用。在一個最佳的方案中，ExoIII是以0.2單位/微升使用。一個單位的ExoIII被定義為37℃30分鐘內從氘標記的DNA雙螺旋中生產1納摩爾該可溶性核苷酸所需的Exo III的量。本領域熟練技術人員能夠測定出核酸外切酶的適當濃度，該濃度可隨靶物質的濃度和其它試驗條件的變化而改變。
把樣品與PCR試劑，硫化磷酸酯化引物和核酸外切酶接觸之后，在熱循環(huán)前，把該反應混合物加熱使核酸外切酶失活。在一個優(yōu)選方案中，把混合物加熱到85℃-95℃約3到約10分鐘。在最優(yōu)選的方案中，把該混合物存放在室溫下0-8小時，然后在40℃左右孵育約5分鐘，再加熱到85℃到95℃左右至少3分鐘。
加熱變性后，進行退火。續(xù)展和變性的標準PCR循環(huán)。循環(huán)參數(shù)對本領域普通技術人員是已知的，并且對特殊條件要求能夠很容易地進行調整。這種擴增方法最好以一種連續(xù)自動的方式進行。進行自動PCR的適當儀器對本領域普通技術人員是熟知的，并且在例如美國專利US 4,965,188，5,089,233和5,229,297中進行了描述。本領域的熟練技術人員也能夠很容易地測出所擴增的產物，例如用瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物，并且用溴化乙錠染色法顯影，或者用能夠與所擴增的核酸雜交的標記探針雜交法或者本領域普通技術人員所熟知的其它各種方法測定。
本發(fā)明還提供了一種PCR藥盒，它在同一個或不同容器中含有一種熱穩(wěn)定聚合劑，一種核酸外切酶以及至少兩種引物，各個引物含有至少一個硫化磷酸酯鍵。在另一個方案中，該藥盒還含有一種對該聚合劑有特異性的抗體。還可以有其它容器以用于包含，例如，對PCR聚合劑特異性的其它抗體和PCR試劑，例如包括三磷酸核苷，引物和緩沖液。
在一個優(yōu)選方案中聚合劑是一種DNA聚合酶。在更為優(yōu)選的方案中聚合酶是Taq聚合酶，Tth聚合酶或Thermococcus litoralis聚合酶。Taq聚合酶是最佳的。優(yōu)選的抗體是對Taq聚合酶有特異性的單克隆抗體。
在另一個優(yōu)選方案中，核酸外切酶是核酸外切酶I，Exo III，核酸外切酶VIII或核糖核酸酶II。Exo III是最佳的。寡聚核苷酸引物最好在距3′末端的前5位的至少一個位置上，并且最好在至少距3′末端的末端位上含有一個硫化磷酸酯鍵。本發(fā)明的藥盒可用于提高PCR試驗方法中靶核酸的擴增效率。
本發(fā)明還提供了一種用于PCT擴增的混合物，特別是適用于PCR過程中減少非特異性核酸的形成和攜帶污染物擴增的混合物。該混合物含有一種核酸外切酶和至少兩種PCR引物，其中各個引物含有至少一個硫化磷酸鍵。該混合物也可以含有其它PCR試劑，如一種熱穩(wěn)定性聚合劑，三磷酸核苷，抗該聚合劑的抗體，緩沖液等等。在一個優(yōu)選方案中，該反應混合物含有Exo III和至少兩種寡聚核苷酸引物，其中各個寡聚核苷酸引物至少在距其3′端的末端位置上含有一個硫化磷酸酯鍵。
下面實施例將進一步詳細闡明本發(fā)明。
實施例 1核酸外切酶III對PCR的影響在一個測定HIV的模型系統(tǒng)中檢測相對較低濃度的Exo III對一種基因組靶物質的PCR擴增作用。該模型系統(tǒng)使用了具有下列序列的引物SK 38和BW 17來檢測定從含有一個HIV-1基因組單一整合拷貝的8E5 HUT/HIV細胞系獲得的HIV靶物質引物SK 385′-ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT-3′(SEQID NO1)引物BW 175′-TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC-3′(SEQID NO2)。按照美國專利US 5,003,097使用一臺Perkin-Elmer/AppliedBiosystems Division Model 380B三粒DNA合成儀用固相磷酰胺(Phosporamidite)化學法制備寡聚核苷酸引物。按照美國專利US 5,3 38,671中所述制備對Taq聚合酶有特異性的單克隆抗體。按照EP-A-0482 714中所述以重組方法制備Taq聚合酶。
PCR混合物含有下列試劑(1)1.0x PCR緩沖液(10mM Tris HCl，pH8.0，含有50mM KCl和5mM MgCl2)；(2)SK38 PCR引物；(3)BW 17 PCR引物；(4)dATP，dCTP和dGTP各0.2mM；(5)dUTP 0.4mM；(6)每100μL PCR混合物中有8個單位的Taq聚合酶(一個單位被定義為在74℃ 30分鐘內把10納摩爾總核苷酸摻入一個擴大的核酸鏈中所需酶活性的量)；(7)與Taq聚合酶的摩爾比為5∶1(TP4-9.2 ATCC HB11807)和50∶1(TP1-12.2 ATCCHB11127)的Taq抗體；(8)每100μl PCR混合物中有1μG的鯡魚精子DNA；(9)100個拷貝的HIV(8E5 HUT/HIV細胞系)；(10)TE緩沖液(10mM Tris HCl，1mM EDTA)以下列濃度分別使用各PCR引物(1)400mM；(2)100nM；(3)40nM；(4)20nM(5)10nM；(6)4nM；(7)1nM；(8)0.4nM；在如上所述的引物濃度下，并且在每μL PCR混合物有0.02單位的核酸外切酶III(Promega Lot，# 32000)[每100μL PCR混合物2個單位]存在下或無核酸外切酶III存在下進行PCR。
使用美國專利US 5,089,233中所述的原型分析儀在美國專利US 5,229,297中所述的臨床診斷PCR試劑盒條件下進行PCR擴增。全部樣品重復進行兩次，并且在PCR前將其在室溫下放置2小時，以使核酸外切酯III在PCR混合物中保持活性。孵育2小時后，為了使核酸外切酶III和Taq抗體熱變性，樣品要經受由95℃ 3分鐘預熱組成的標準PCR循環(huán)條件，然后進行40次PCR循環(huán)(每個循環(huán)95℃15秒熔化步驟和64℃ 35秒退火/擴大步驟)。用臨床診斷試劑盒檢測系統(tǒng)測定該PCT產物。用從0(白色少量或無擴增)到10(深藍色最大擴增)的藍色增長的比色標準能直觀地解讀這些測定點。這些直觀的結果在下列表格中以對比樣品+/-核酸外切酶III(100μL PCR混合物中2個單位)的比色值表示。引物含量+Exo III- Exo III400nM 7，6.5 7，6.5100nM 0，07，7.540nM 0，07，6.520nM 0，02，410nM 0，00，04nM 0，00，01nM 0，00，04nM 0，00，0
引物濃度下降4倍會在含有核酸外切酶III的樣品中產生陰性結果，而引物濃度下降10倍對不含核酸外切酶III的樣品沒有影響。引物濃度下降20倍仍然在不含核酸外切酶III的樣品中具有PCR擴增。從這些結果中很明顯地看出當PCR混合物的引物濃度下降時核酸外切酶III對PCR擴增具有負影響。從這一結果可以推測出在有核酸外切酶III的樣品中，甚至引物濃度為400nM時，PCR擴增效率會因此下降。
實施例2Exo III降解雙股和單股DNA對與生產者所聲稱的和相關的科技文獻(Zhu等，(1991)Nucleic Acids Res 19251)所相反的核酸外切酶III降解單股DNA的可能性進行研究。
把單股DNA靶物質，雙股DNA靶物質，和單股寡聚核苷酸引物單獨或不同混合物經受有或沒有核酸外切酶III存在的擴增前消毒步驟。
以1×10-10M濃度使用單股100聚體DNA靶物質，該靶物質被定義為Syn-1的一種合成模型系統(tǒng)。Syn-1靶物質具有下列序列5′-AAT-CGA-GTA-AGA-CTT-CAC-TGC-TGA-GAA-TCT-CAG-AGA-ATC-TAG-ATA-TCC-TGC-ATG-TCT-AAA-TAT-TGA-ATA-CGA-CAT-TAC-ACG-AGT-CAA-GAC-TCA-CTA-GAC-A-3′(SEO ID NO3)以1×10-8M的濃度使用實施例1中所述的HIV模型系統(tǒng)雙股靶物質。PCR引物Syn-1正向5′-GTA-AGA-CTT-CAC-TGC-TGA-GAA-TCT-CAG-3′(SEQ ID NO4)Syn-1反向，5′-TGT-CTA-GTG-AGT-CTT-GAC-TCG-TGT-AAT-3′(SEQ ID NO5)以總濃度2μM(即含有一個引物的2μM引物樣品，含有兩個引物的樣品各有1μM)使用SK38和BW 17。以每50μL樣品，0，10或20個單位使用核酸外切酶III(Promega，Lot # 32000)。
在典型的擴增前消毒條件(30℃ 30分件)下孵育樣品。通過在95℃保溫5分鐘來抑制酶介導的水解以使核酸外切酶III熱變性。在常規(guī)條件下把少量等份反應混合物(16μL)在4％瓊脂糖凝膠上電泳，并用溴化乙錠顯影。在該凝膠上觀察到的結果顯示于表I中。
表 I
表 I (續(xù))
在樣品2和3中，凝膠上的靶物質譜帶相對于樣品1下移，這表明Exo III降解減少了單股靶物的分子量。樣品2和3中的靶物質譜帶信號也比樣品1的減低，這又表明Exo III降解了單股靶物質。
該試驗表明Exo III既能夠降解單股DNA又能降解雙股DNA。
在所有樣品類型中陽性對照(與Exo III不反應)給出了強信號帶。除了樣品2和3外，用Exo III以每50μL樣品(單股DNA，雙螺旋DNA，短PCR引物和100聚體靶序列；雙螺旋DNA是SK 18/BW17系統(tǒng)中的一個PCR產物)10或20個單位處理各種DNA，它們都被降解了，并且在電泳凝膠上測定不出來。這種外切酶III對單股DNA的降解對實施例1中所見到的外切酶III對PCR的負影響提供了一種解釋。在PCR反應中PCR引物這種關鍵的試劑的破壞降低了引物的濃度并從而降低了PCR的擴增效率。
實施例3硫化磷酸酯化引物可以保護免遭核酸外切酶III的降解本實驗中使用了實施例1中所述的SK 38/BW 17 HIV PCR模型系統(tǒng)。在PCR中用硫化磷酸酯化引物代替了未改良的引物來測定改良的引物是否可以保護免遭外切酶III的降解。在沒有靶DNA存在下進行平行樣品的操作以排除外切酶III對靶DNA的降解。
用美國專利US 5,003,097的方法用H-磷酸鹽化學方法制備距3′-羥基末端和次末端具有硫化磷酸酯鍵的PCR引物SK38和BW17，在technical bulletin accompanying Cat.No.40-4036-XX，Glen Research，Sterling，Va中對此進行了描述。
全部樣品包括下列試劑含有5mM鎂的1.0×PCR緩沖液；濃度為400nM的未改良的(SOA)或硫化磷酸酯化(thio)的SK38PCR引物；濃度為400nM的未改良的(SOA)或硫化磷酸酯化(thio)的BW17PCR引物；dATP，dCTP和dGTP各0.2mM；dUTP 0.4mM；每100μL PCR混合物含8個單位的Taq聚合酶；與Taq聚合酶摩爾比為5∶1(TP 4-9.2)和50∶1(TP1-12.2)的Taq抗體；每100μL PCR混合物1μg的鯡精子DNA；TE緩沖液。
樣品1-10含有從8E5 HUT/HIV細胞系中獲得的10個拷貝的HIV基因組靶物質。
如表II所示樣品含有各種濃度的外切酶III(每100μL PCR混合物中含0，5，10，15，20個單位)。
PCR擴增中使用臨床診斷PCR試劑盒和原型分析儀(Prototype Analyzer)。把所有樣品進行兩次操作，在室溫下放置1小時后進行PCR以使外切酶III在PCR混合物中保持活性。在樣品11-18中，用外切酶III孵育1小時后，向混合物中加入基因組靶DNA。在1小時孵育之后，使樣品經受3分鐘95℃的預加熱標準PCR循環(huán)條件，使外切酶III和Taq抗體熱變性，然后進行40個PCR循環(huán)(每個循環(huán)包括95℃15秒的熔化步驟和64℃ 35秒的退火/續(xù)展步驟)。PCR擴增后，每個樣品的一個復制品經受臨床診斷試劑盒測定系統(tǒng)的檢測。用從0(白色)到10(深藍色)的藍色增長比色標準能直觀地解讀這些測定點。從PCR試劑盒中收集其它復制品中的PCR產物，并且在2/5％瓊脂糖凝膠上電泳，用溴化乙錠染色，進行測定。用紫外光將這些凝膠曝光，并用于制得Polaroid照片。
表 II
表 II(續(xù))
*aExo III孵育后加入的靶物質；bExo III孵育前加入的靶物質。
表II中顯示了試劑盒測定和凝膠觀察結果。樣品2-5的結果表明，當使用常規(guī)引物時，外切酶III使得PCR擴增檢測不出來。外切酶III對PCR的負影響歸因于未改良PCR引物的降解，與基因組靶DNA的降解相反，用樣品11-14中的陰性結果可證明這一點，其中在外切酶II孵育后加入了靶DNA。
如樣品6-10和15-18的結果所證實的，硫化磷酸酯化PCR引物不能抑制PCR，但它卻很容易被擴增，所以能夠常規(guī)使用。而且，硫化磷酸酯化PCR引物受到了保護，免遭外切酶III的降解，而未改良的引物卻不能。
把外切酶III與硫化磷酸酯化PCR 引物一起使用導致了產物產率的提高，這一點用樣品7-10中凝膠帶的密度與樣品1和6的相比得到證實。這些結果可以解釋為擴增前用外切酶III降解PCR引物二聚體的能力增加了PCR的擴增效率，也歸因于硫化磷酯酯化的PCR引物保護免遭核酸外切酶III降解的作用。
實施例4外切酶III不能降解低濃度的基因組靶DNA在該試驗中使用了實施例1所述的SK 38/BW17 HIV模型系統(tǒng)。如實施例3中所述，在不同濃度的外切酶III和未改良(SOA)或硫化磷酸酯化(thio)引物存在下擴增兩種含量的基因組靶物質(來自8E5 HUT/HIV細胞系中的10個拷貝和100個拷貝的HIV基因靶物質)。
所有的樣品包括下列試劑含有5mM鎂的1.0xPCR緩沖液；400nM的實施例3中所述的未修飾的(50A)或硫化磷酸酯化的(thio)SK 38 PCR引物；400nM的實施例3中所述的未修飾的(SOA)或硫化磷酸酯化的(thio)BW 17 PCR引物；各0.2mM的dATP，dCTP和dGTP；0.4mM的dUTP；每100μL PCR混合物8個單位的Taq聚合酶；與Taq聚合酶摩爾比為5∶1(TP4-9.2)和50∶1(TP1-12.2)的Taq抗體；每100μL PCR混合物1μg的鯡精子DNA；TE緩沖液。
樣品1-16含有10個HIV靶物質的拷貝。樣品17-32含有100個HIV靶物質的拷貝。樣品1-8和17-24含有未修飾的(SOA)引物，樣品9-16和25-32含有硫化磷酸酯化(thio)引物。如表III所示這些樣品中含有不同濃度的外切酶III。
表 III
表 III(續(xù))
表 III(續(xù))
*不可見，樣品17-25得不到試劑盒結果。
PCR擴增中使用了臨床診斷試劑盒和原型分析儀。把所有樣品重復操作，并且在PCR前保留在室溫下2小時以激活PCR混合物中的外切酶III。孵育2小時后，在40次PCR循環(huán)(每次循環(huán)有95℃15秒的烷化步驟和64℃ 35秒退火/擴大步驟)之前，樣品經經受由3分鐘95℃預熱組成的標準PCR循環(huán)以使外切酶III和Taq抗體熱變性。PCR擴增后，每種樣品的一個復制品經受該臨床診斷試劑盒測定系統(tǒng)的檢測。用從0(白色)到10(深藍)之間的顏色增長的比色標準可直觀地解讀出測定點。從PCR試劑盒中收集其它復制品的PCR產物，并在2.5％瓊脂糖凝膠上電泳，用溴化乙錠染色來測定。用紫外光照射該凝膠，并拍得Polaroid照片。
表III顯示了結果，這些結果證實實施例2的結論，即外切酶III能夠降解未修飾的單股PCR引物，使得產物不可測定，而且硫化磷酸酯化PCR引物受到了保護，免遭外切酶III的消化。所以，硫化磷酸酯化PCR引物的使用使得每個樣品中使用了增長量的外切酶III，并且增加了孵育時間。反過來，增長量的外切酶III提供了更多的保護，以抵抗引物二聚體分子以及PCR產物和引物二聚體形式的PCR樣品遺留物的抑制作用。
在含有硫化磷酸酯化PCR引物和所試驗的各個濃度的外切酶III的樣品中，以及在含有SOA未修飾的引物和含每100μL PCR混合物中2或4個單位的外切酶III的樣品中，與不含外切酶III的兩種引物類型的樣品相比較，可以看到由凝膠譜帶密度所證實的產物產率的提高。這應歸因于PCR開始前外切酶III降解PCR引物二聚體分子的能力，從而提高了PCR反應的PCR擴增效率。盡管如此，在含有SOA未修飾PCR引物的樣品中，由于外切酶III對單股DNA的降解活性，它在稍微高的濃度時會成為PCR的一種抑制劑。
在濃度增高時，核酸外切酶III不能降解基因組靶DNA，即使樣品中拷貝數(shù)較少，這一點可用對10個HIV拷貝樣品的一致PCR試劑盒比色值和凝膠產物譜帶得到證實，其中使用硫化磷酸酯化引物。
實施例5用核酸外切酶III和硫化磷酸酯化引物一起進行PCR樣品攜帶產物的消毒本試驗測定每100μL PCR混和物中20個單位的外切酶III與硫化磷酸酯化PCR引物的消毒效率。而且，把外切酶III和硫化磷酸酯引物對PCR擴增子的消毒能力與尿嘧啶-N-糖基酶(UNG)對PCR擴增子的消毒能力進行比較，其中已報道UNG具有消毒106左右擴增子的能力(Longo等)。
將從前次擴增中收集的PCR樣品攜帶物用SK38/BW17 HIV PCR模型系統(tǒng)進行PCR反應。這種PCR樣品攜帶物是全部長度的預擴增PCR產物，估計濃度為1011擴增子/μL，其中在擴增中用dUTP取代dTTP，從而使產物含有尿嘧啶而不是胸腺嘧啶。把這種預擴增產物在4％瓊脂糖電泳凝膠上跑帶來從非特異性產物上分離該產物。然后從該瓊脂糖凝膠上切割該產物譜帶，并用Qiagen氏凝膠純化藥盒進行純化。然后進行這種PCR產物的稀釋，每種烯釋每μL估計有下列PCR樣品樣品攜帶物擴增子。
(1)10×稀釋＝每μL 1010個擴增子；(2)103×稀釋＝每μL 108個擴增子；(3)105×稀釋＝每μL 106個擴增子；
(4)107×稀釋＝每μL 104個擴增子；(5)109×稀釋＝每μL 102個擴增子；把每種樣品攜帶物稀釋液各1μL加入到100μl PCR混合物中，該PCR混合物不含有基因組靶物質，(除每100μL PCR混合物中含有10個拷貝基因組HIV靶物質的陽性對照樣品之外)，只含有下列常規(guī)PCR試劑含有5mM鎂的1.0×PCR緩沖液；SK38 PCR引物(如實施例3中所述的硫化磷酸酯化的)；BW 17 PCR引物(如實施例3中所述的硫化磷酸酯化的)；dATP，dCTP和dGTP各0.2mM；dUTP 0.4mM；每100μL PCR混合物8個單位的Taq聚合酶；與Taq聚合酶摩爾比為5∶1(TP4-9.2)和50∶1(TP1-2.2)的Taq抗體；每100μL PCR混合物中1μG的鯡精子DNA；TE緩沖液。
對不含消毒試劑的樣品，或者單獨或一起含有外切酶III(每100μL PCR混合物20個單位，由Promega獲得的，Lot # 32000)或UNG(第100μL PCR混合物1個單位，由Perkin Elmer AppliedBiosystems獲得的，Lot # 0642)的樣品，如表IV所示。
表 IV
表 IV (續(xù))
使用臨床診斷PCR試劑盒和原型分析儀(PrototypeAnalyzetrer)進行PCR擴增。擴增前把全部樣品放置在室溫下2小時來激活PCR混合物中的外切酶III和UNG。孵育2小時后，使樣品經受10分鐘95℃的預熱以使UNG，外切酶III和Taq抗體熱變性。然后用PCR循環(huán)的常規(guī)條件(每次循環(huán)有95℃ 15秒的熔化步驟和64℃ 35秒的退火/擴大步驟)進行40次PCR循環(huán)。PCR擴增后，把每個樣品經受臨床診斷試劑盒測定系統(tǒng)的檢測。用0(白色)到10(深藍)顏色增長的比色標準直觀地解讀測定位點。表IV中顯示了各個樣品的結果。
這些結果證實了每100μL含有硫化磷酸酯化引物的PCR混合物中20個單位的外切酶III能夠消毒至少10,000個擴增子。這種消毒法可以比得上用UNG所達到的水平。表明硫化磷酸酯化引物不干擾消毒。
實施例6UNG和外切酶III在消除引物二聚體樣品攜帶物方面的作用比較從含有SK38/BW17引物但不含靶物質(即利于引物二聚體形成)的擴增混和物中得到引物二聚體樣品攜帶物，將其以1×10到1×108的不同稀釋度向PCR樣品中加入。然后進行室溫下孵育。用這種方法所產生的引物二聚體太弱而不能顯示在溴化乙錠染色的凝膠譜帶上，但它的存在是清楚顯現(xiàn)的，正如下文所闡明的。除了用硫化磷酸酯化引物外，該PCR混合物含有如實施例1中所述的試劑。除了樣品1外，所有的樣品都含有從8E5 HUT/HIV細胞系中所得到的100個拷貝的HIV基因組靶物質。樣品2不含有樣品攜帶物，而把樣品3暴露在環(huán)境樣品攜帶物中。在下列條件下對樣品進行三次重復測試A)無樣品攜帶物的預防方法；B)1單位/100μL PCR反應物中的UNG(Perkin-Elmer Lot # 0642)；以及c)20單位/100μL PCR的反應物的外切酶III。在各種情況下都用硫化磷酸酯化引物。把A組中的樣品在室溫下孵育10分鐘，然后進行PCR常規(guī)循環(huán)，在50℃2分鐘孵良前把B組中的樣品在室溫下孵育10分鐘，然后在PCR標準循環(huán)后，保持在72℃。把C組中的樣品在室溫下孵育2小時，然后進行PCR的常規(guī)循環(huán)。在常規(guī)條件下把各樣品等分在4％瓊脂糖凝膠上電泳，并用溴化乙錠染色顯影。觀察到下列結果。
A組-未處理
A組-未處理(續(xù))
*數(shù)字表示引物二聚體樣品攜帶物的稀釋度。
B組-UNG處理
B組-UNG處理(續(xù))
C組-EXO III處理
C組-EXO III處理(續(xù))
用UNG處理，在1×106倍稀釋的引物二聚體樣品攜帶物時測定產物的譜帶，比未處理的有1000倍的提高。(上述試驗已證實沒有處理存在時，在1×1010稀釋的引物二聚體樣品攜帶物時產物譜帶可被測得)。在硫化引物存在下用Exo III處理，在1×103倍稀釋引物二聚體樣品攜帶物時測得產物譜帶，比UNG處理的提高1000倍，并且比沒處理的提高1×107倍。所以在消除引物二聚體樣品攜帶物方面Exo III優(yōu)于UNG或優(yōu)于沒有處理。
序列表(1)一般信息(i)申請人 Backus，John W.
Patterson，David R.
Sutherland，John W.H(ii)發(fā)明名稱在硫化磷酸酯化引物存在下用核酸外切酶進行聚合酶鏈反應擴增前的消毒方法(iii)序列數(shù) 5(iv)聯(lián)系地址(A)地址Johnson和Johnson(B)街道One Johnson和Johnson Plaza(C)城市New Brunswick(D)州New Jersey(E)國家U.S.A(F)郵區(qū)編號08933(V)計算機可讀形式
(A)媒介類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patent In Release #1.0，Version #1.25(Vi)當前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類(Viii)律師/代理人資料(A)姓名Ciamporcero，Audley A.
(B)登記號26，051(C)資料/案卷CDS-19(ix)通訊資料(A)電話(908)524-2803(B)電傳(908)524-2803(2)SEQ ID NO1的資料(i) 序列特征(A)長度28個堿基對(B)類型核酸(C)股數(shù)單股(D)拓撲學結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO1
ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT28(2) SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度28個堿基對(B)類型核酸(C)股數(shù)單股(D)拓撲學結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO2TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC28(2) SEQ ID NO3資料；(i)序列特征(A)長度100個堿基對(B)類型核酸(C)股數(shù)單股(D)拓撲學結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO3AATCGAGTAA GACTTCACTG CTGAGAATCT CAGAGAATCTAGATATCCTG CATGTCTAAA 60
TATTGAATAC GACATTACAC GAGTCAAGAC TCACTAGACA 100(2) SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)股數(shù)單股(D)拓撲學結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO4GTAAGACTTC ACTGCTGAGA ATCTCAG 27(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)股數(shù)單股(D)拓撲學結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO5TGTCTAGTGA GTCTTGACTC GTGTAAT 2權利要求
1.一種擴增靶核酸的方法，它包括(a)把懷疑含有該靶核酸的樣品與(i)至少兩種寡聚核苷酸引物，它們足以與雜交到其上的雜交靶核酸區(qū)域互補，其中各個寡聚核苷酸引物至少含有一個硫化磷酸酯鍵，(ii)至少四種不同的三磷酸核苷，(iii)一種熱穩(wěn)定性聚合劑，以及(iv)至少一種3′核酸外切酶接觸來形成一種反應混合物；(b)把該反應混合物加熱使該核酸外切酶失活；以及(c)形成引物擴大產物。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述的靶核酸是DNA或RNA。
3.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述的三磷酸核苷是dATP，dGTP，dCTP和dTTP。
4.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述的聚合劑是一種DNA聚合酶。
5.根據(jù)權利要求4的方法，其中所述的DNA聚合酶是選自于水生棲熱菌(Taq)聚合酶，Thermus thermophilus聚合酶和Thermococcus litoralis聚合酶。
6.根據(jù)權利要求1的方法，還包括把該樣品與該聚合劑的特異性抗體相接觸來形成所述的反應混合物。
7.根據(jù)權利要求6的方法，其中所述的聚合劑是Taq聚合酶，所述的抗體是Taq聚合酶的一種單克隆抗體。
8.根據(jù)權利要求1的方法，其中所樣的3′核酸外切酶選自于核酸外切酶I，核酸外切酶III，核酸外切酶VIII和核糖核酸酶II。
9.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述的引物至少在距該引物3′端的末端含有一個硫化磷酸酯鍵。
10.根據(jù)權利要求1的方法，其中各個引物至少在距該引物3′端的末端和次末端含有一個硫化磷酸酯鍵。
11.根據(jù)權利要求1，9和10中任何一種方法，其中所述的3′核酸外切酶是核酸外切酶III。
12.根據(jù)權利要求11的方法，其中所述的核酸外切酶III是以每毫升反應混合物約0.001個單位到約10個單位的濃度存在的。
13.根據(jù)權利要求12的方法，其中所述的核酸外切酶III是以每毫升反應混合物中約0.2個單位的濃度存在的。
14.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述的反應混合物含有兩種3′核酸外切酶。
15.根據(jù)權利要求14的方法，其中所述的一個3′核酸外切酶優(yōu)先降解雙股DNA，而另一個優(yōu)先降解單股DNA。
16.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述的加熱是從85℃左右到95℃左右。
17.根據(jù)權利要求1的方法，還包括測定引物擴大產物。
18.根據(jù)權利要求17的方法，其中所述的測定是用測量結合到雙股DNA中的熒光化合物所產生的熒光變化來實現(xiàn)的。
19.一種擴增靶核酸的藥盒，它在同一個或不同容器中含有一種熱穩(wěn)定聚合劑，至少一種3′核酸外切酶以及至少兩種寡聚核苷酸引物，這些引物應當足以與雜交到其上的所述核酸的區(qū)域互補，其中各個寡聚核苷酸引物至少含有一個硫化磷酸酯鍵。
20.根據(jù)權利要求19的藥盒，它在同一或不同容器中還含有所述聚合劑的一種特異性抗體。
21.根據(jù)權利要求19的藥盒，其中所述的聚合劑選自Taq聚合酶，Thermus thermophilus聚合酶，和Thermococcus litoralis聚合酶。
22.根據(jù)權利要求19的藥盒，其中所述的核酸外切酶選自核酸外切酶I，核酸外切酶III，核酸外切酶VIII和核糖核酸酶II。
23.根據(jù)權利要求19的藥盒，其中所述的3′核酸外切酶是核酸外切酶III。
24.根據(jù)權利要求19的藥盒，其中各個引物至少在距其3′端的末端位置上含有一個硫化磷酸酯鍵。
25.根據(jù)權利要求19的藥盒，其中所述的各個引物至少在距其5′端的次末端和末端位置上含有一個硫化磷酸酯鍵。
26.一種用于PCR的混合物，它包括至少一種3′核酸外切酶和至少兩種寡聚核苷酸引物，其中所述的各個寡聚核苷酸引物至少含有一個硫化磷酸酯鍵。
27.根據(jù)權利要求26的混合物，它還含有一種熱穩(wěn)定的聚合劑。
28.根據(jù)權利要求27的混合物，其中所述的熱穩(wěn)定聚合劑是一種DNA聚合酶。
29.根據(jù)權利要求28的混合物，其中所述的聚合酶選自于水生棲熱菌(Taq)聚合酶，Thermus thermophilus聚合酶和Thermococcus litoralis聚合酶。
30.根據(jù)權利要求26的混合物，它還含有至少四種不同的三磷酸核苷。
31.根據(jù)權利要求26的混合物，其中所述的核酸外切酶是選自于核酸外切酶I，核酸外切酶III，核酸外切酶VIII以及核糖核酸酶II。
32.一種用于PCR的混合物，它含有核酸外切酶III和至少兩種寡聚核苷酸引物，其中所述的各個寡聚核苷酸引物至少在距其3′端的末端位置含有一個硫化磷酸酯鍵。
全文摘要
本發(fā)明提供了PCR擴增靶核酸的混合物和方法，其中用含有硫化磷酸酯化寡聚核苷酸引物和一種核酸外切酶的PCR反應混合物增加擴增效率。本發(fā)明還提供了擴增靶核酸的藥盒。
文檔編號C12Q1/68GK1140762SQ96110078
公開日1997年1月22日 申請日期1996年5月22日 優(yōu)先權日1995年5月22日
發(fā)明者J·W·貝卡斯, D·R·帕特森, J·W·H·蘇瑟蘭 申請人:莊臣臨床診斷有限公司