專利名稱：：經(jīng)修飾的hpve6-e7融合基因及其編碼蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因工程和腫瘤治療領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及密碼子優(yōu)化型的HPV16E6E7融合基因及其編碼蛋白，以及對(duì)所述密碼子優(yōu)化型的HPV16E6E7融合基因定點(diǎn)誘變得到的三種消除了潛在致癌性的融合基因及其編碼蛋白。
背景技術(shù)：
：人乳頭瘤病毒(HumanPapillomavires,HPV)是一類具有嚴(yán)格宿主范圍和組織特異性的DNA病毒，主要感染人的皮膚或粘膜上皮細(xì)胞，引起感染部位發(fā)生良性和惡性病變。隨著對(duì)HPV研究的深入，發(fā)現(xiàn)在約80X的宮頸癌與四個(gè)型別的HPV感染有關(guān)，分別是HPV16、18、31禾tM5型，其中50^的宮頸癌與HPV16感染有關(guān)(MHStoler.IntJGynecolPatho,2000,19(1):16-28)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年約有51萬(wàn)新發(fā)的宮頸癌病例，有20多萬(wàn)婦女死于宮頸癌。雖然通HPV檢測(cè)可提高宮頸癌前病變篩查的敏感性,檢出率可達(dá)到85%95%(HSCronje.IntJGynaecolObstet,2004,84(2):101-108)，但在不發(fā)達(dá)國(guó)家尚難普及，而且并不能消除HPV16的感染。盡管目前臨床上普遍采用的手術(shù)治療、放療和化療等方法對(duì)早期宮頸癌的治愈率已達(dá)90%以上，但治療中創(chuàng)傷性大，不能防止HPV16再感染的可能，并且技術(shù)條件要求相對(duì)較高，不宜在落后地區(qū)和發(fā)展中國(guó)家推廣應(yīng)用，而對(duì)中晚期宮頸癌的治療則尚無(wú)良策。因此研制針對(duì)HPV16的治療性疫苗對(duì)預(yù)防HPV感染和宮頸癌的治療將具有十分重要的意義。目前研制的針對(duì)HPV16相關(guān)宮頸癌的治療性疫苗主要有重組腺病毒載體疫苗(AAstua，etal.JVirol,2005,79(20):12807-12817)、重組痘苗病毒載體疫苗(ANFiander，etal.IntJGynecolCancer，2006,16(3):1075-1081)、蛋白質(zhì)疫苗(XQian,etal.ImmunolLett，2006,102(2):19卜201)、樹突狀細(xì)胞疫苗(THKang,etal,ImmunolLett,2006，106(2):126-134)、自我復(fù)制型RNA疫苗(WFCheng，etal.CancerGeneTher,2006，13(9):873-885)和DNA疫苗等。與其它類型疫苗相比，DNA疫苗有諸多優(yōu)點(diǎn)，因而其研究更為引人注目。由于E6和E7在大多數(shù)宮頸癌及其癌前病變中可以持續(xù)表達(dá)，而在正常組織中并不存在，這種表達(dá)特性使得這兩種蛋白成為發(fā)展HPV相關(guān)宮頸癌及癌前病變治療性疫苗的理想靶抗原(CGUllmanandVCEmery.RevMedVirol,1996,6(l):39-55)?，F(xiàn)已有多種方式嘗試提高DNA疫苗的免疫效果，如將E7基因與LAMP-1基因融合制成的DNA疫苗Sig/E7/LAMP-1增強(qiáng)MHC-1和MHC-II兩類抗原的呈遞，同時(shí)活化E7特異性的CD8+和CD4+T細(xì)胞，比單獨(dú)采用野生型E7基因制備的DNA疫苗具有更好的抗腫瘤效果(HJi，etal.HumGeneTher,1999,10(17):2727-2740);將E7基因與熱休克蛋白(heatshockproteins,HSP)基因融合也可以增強(qiáng)E7特異性CD8+T細(xì)胞的活性及抗腫瘤效果(YLi,etal.Vaccine,2006，24(25):5360-5370);融合鈣網(wǎng)蛋白基因的DNA疫苗CRT/E6(SPeng,etal.JVirol,2004,78(16):8468-8476)和CRT/E7(JWKim,etal.GeneTher，2004,11(12):1011-1018)疫苗單獨(dú)使用時(shí)均可以產(chǎn)生抗腫瘤效果，而同時(shí)使用CRT/E6和CRT/E7的抗腫瘤效果要比遠(yuǎn)比單用CRT/E6或CRT/E7的效果好(SPeng,etal.GeneTher，2006,13(3):257-265)。因此，本發(fā)明嘗試使用E6-E7融合基因和/或其編碼蛋白作為目的抗原。由于野生型HPV16E6和E7基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)量很低，所以首先參照人類基因中的優(yōu)勢(shì)密碼子，在不改變野生型HPV16E6蛋白(GenebankACCESSION:AAA46939)和E7蛋白(GenebankACCESSION:AAA46940)氨基酸序列的前提下，對(duì)HPV16E6和E7基因以融合基因的方式進(jìn)行優(yōu)化合成(其中E6基因位于5'端，E7基因位于3'端，兩部分基因之間沒(méi)有任何多余的核苷酸作為連接子)，以增強(qiáng)HPV16E6E7基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。另外，由于HPV]6的E6和E7基因都是癌基因，二者的融合基因必然具有潛在的致癌性。本發(fā)明通過(guò)定點(diǎn)誘變對(duì)E6-E7融合基因進(jìn)行修飾，在保證該融合基因高表達(dá)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞同時(shí)，消除其潛在的致癌性。為進(jìn)一步幵發(fā)HPVI6疫苗提供良好的抗原基因和/或抗原蛋白。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了經(jīng)修飾的HPVE6-E7融合基因及其編碼蛋白。所述經(jīng)修飾的融合基因包括密碼子優(yōu)化型的HPVE6-E7融合基因，以及在此基礎(chǔ)上定點(diǎn)誘變消除了潛在致癌性的融合基因。一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種密碼子優(yōu)化型的HPV16E6-E7融合基因，該融合基因中使用的密碼子為人類基因中使用頻率最高或次高的密碼子。該融合基因能夠高表達(dá)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞。我們?cè)诠_的野生型HPV16E6蛋白(GenebankACCESSION:AAA46939)和E7蛋白(GenebankACCESSION:AAA46940)的氨基酸序列基礎(chǔ)上，根據(jù)人類基因中的密碼子使用頻率(參考數(shù)據(jù)來(lái)源:2006年4月14日的Kazusa數(shù)據(jù)庫(kù)，網(wǎng)址為1^:〃麗&&2113&.01"化/(:0(1011/)，利用人類基因中使用頻率最高和次高的密碼子取代HPV16E6和E7基因序列的密碼子得到密碼子優(yōu)化型的HPV16E6-E7融合基因，命名為offi6E7。該融合基因編碼的氨基酸序列包含完整的HPV16E6和E7蛋白的氨基酸序列。本發(fā)明中，所述密碼子優(yōu)化型E6-E7融合基因中，E6和E7編碼基因可以分別位于5'和3'端或者3'和5'端。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，E6編碼基因位于5'端，E7編碼基因位于3'端，所述密碼子優(yōu)化型融合基因具有SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。另一方面，本發(fā)明提供了消除潛在致癌性的密碼子優(yōu)化型融合基因，該融合基因是在對(duì)本發(fā)明所述密碼子優(yōu)化型融合基因進(jìn)行定點(diǎn)誘變制備得到的。所述定點(diǎn)誘變后的融合基因編碼的氨基酸序列包括下列位點(diǎn)突變L57G(CTG—GGC)和C113R(TGC—AGA)(E6部分的2個(gè))，以及C182G(TGC—GGC)、E184G(GAG—GGC)、C216G(TGC—GGC)和C249G(TGC—GGC)〔E7部分的4個(gè))中的至少2個(gè)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，E6編碼部分位于融合基因的5'端，E7編碼部分位于3'端，所述消除潛在致癌性的密碼子優(yōu)化型融合基因具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。另一個(gè)實(shí)施方案中，E6部分位于融合基因的5'端，E7部分位于3'端，所述消除潛在致癌性的密碼子優(yōu)化型融合基因具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列。另一個(gè)實(shí)施方案中，E6部分位于融合基因的5'端，E7部分位于3'端，所述消除潛在致癌性的密碼子優(yōu)化型融合基因具有SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明所述定點(diǎn)誘變消除潛在致癌性的密碼子優(yōu)化型融合基因編碼的融合蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，E6部分位于融合基因的5'端，E7部分位于3'端，所述融合蛋白中的突變位點(diǎn)包括L57G、C113R、C182G(對(duì)應(yīng)于E7蛋白的第24位殘基)和E184G(對(duì)應(yīng)于E7蛋白的第26位殘基)，具有SEQIDNO:5所示的氨基酸序列。另一個(gè)實(shí)施方案中，E6部分位于融合基因的5'端，E7部分位于3'端，所述融合蛋白中的突變位點(diǎn)包括L57G、C113R、C182G(對(duì)應(yīng)于E7部分的第24位殘基)、E184G(對(duì)應(yīng)于E7部分的第26位殘基)和C216G(對(duì)應(yīng)于E7部分的第58位殘基)，具有SEQIDNO:6所示的氨基酸序列。另一個(gè)實(shí)施方案中，E6部分位于融合基因的5'端，E7部分位于3'端，所述融合蛋白中的突變位點(diǎn)包括L57G、C113R、C182G(對(duì)應(yīng)于E7部分的第24位殘基)、E184G(對(duì)應(yīng)于E7部分的第26位殘基)、C216G(對(duì)應(yīng)于E7部分的第58位殘基)和C249G(對(duì)應(yīng)于E7部分的第91位殘基)，具有SEQIDNO:7所示的氨基酸序列。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)試驗(yàn)證明與野生型融合基因相比，本發(fā)明所述的經(jīng)修飾的融合基因(例如，SEQIDNOs:1-4)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著提髙。細(xì)胞轉(zhuǎn)化檢測(cè)(軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)和裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn))證明本發(fā)明所述的定點(diǎn)誘變消除潛在致癌性的密碼子優(yōu)化型融合基因(例如，SEQIDNOs:2-4)失去了對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化活性，具有生物安全性，為構(gòu)建相關(guān)的DNA疫苗提供了良好的抗原基因。同時(shí)，所述消除潛在致癌性的密碼子優(yōu)化型融合基因編碼的融合蛋白也為開發(fā)疫苗提供了很好的重組多肽抗原。因此，另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明所述經(jīng)修飾的融合基因在制備HPV16DNA疫苗侯選抗原基因中的用途。圖1顯示的是VR質(zhì)粒的質(zhì)粒圖譜。圖2顯示的是重組質(zhì)粒pUC-offi6E7的雙酶切鑒定結(jié)果。其中泳道1是DNAMarkerDL15000，泳道2是pUCl8質(zhì)粒的五coJV和Bg/II雙酶切產(chǎn)物，泳道3是pUC-offi6E7質(zhì)粒的《p"I+力"I雙酶切產(chǎn)物。圖3顯示的是重組質(zhì)粒VR-o伍6E7、VR-om伍6E7-2、VR-om伍6E7-3、VR-om伍6E7-4的￡coWV和Sg/II雙酶切鑒定結(jié)果。其中泳道1是DNAMarkerDL15000，泳道2是VR質(zhì)粒的五co/V禾BSg/II雙酶切產(chǎn)物，泳道3是VR-offi6E7質(zhì)粒的&o/V和Sg/II雙酶切產(chǎn)物，泳道4是VR-omffi6E7-2質(zhì)粒的￡coiV禾B5g/II雙酶切產(chǎn)物，泳道5是VR-omffi6E7-3質(zhì)粒的￡co/V禾Q5g/II雙酶切產(chǎn)物，泳道6是VR陽(yáng)om伍6E7-4質(zhì)粒的五co/V禾B5g/II雙酶切產(chǎn)物圖4顯示的是重組質(zhì)粒VR-wffi6E7、VR-職伍6E7-2、VR-糧伍6E7-3、VR-wmffi6E7-4的￡co/V和5g/II雙酶切鑒定結(jié)果。其中泳道1是DNAMarkerDL15000，泳道2是VR質(zhì)粒的EcoiV禾卩Bg/II雙酶切產(chǎn)物，泳道3是VR-wfE6E7質(zhì)粒的￡co/V禾HBg/II雙酶切產(chǎn)物，泳道4是VR-職伍6E7-2質(zhì)粒的V禾卩Sg/II雙酶切產(chǎn)物，泳道5是VR-wm伍6E7-3質(zhì)粒的五co/V禾n5g/II雙酶切產(chǎn)物，泳道6是VR-wm伍6E7-4質(zhì)粒的五coiV禾Q5g/II雙寧切產(chǎn)物。圖5顯示的是使用WesternBlot檢測(cè)質(zhì)粒VR-ofE6E7、VR-om伍6E7-2、VR-om伍6E7-3、VR-om伍6E7-4與VR-wffi6E7、VR-wm伍6E7-2、VR-職fE6E7曙3、VR-wm伍6E7-4在NIH3T3細(xì)胞中表達(dá)的融合蛋白，使用p-肌動(dòng)蛋白作為對(duì)照。其中泳道1是用作陰性對(duì)照的正常NIH3T3細(xì)胞的裂解物，泳道2是VR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞的裂解物，泳道3是VR-wffi6E7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞的裂解物，泳道4是VR-ofE6E7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞的裂解物，泳道5是VR-wm伍6E7-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞的裂解物，泳道6是VR-om伍6E7-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞的裂解物，泳道7是VR-wmffi6E7-3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞的裂解物，泳道8是VR-omffi6E7-3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MH3T3細(xì)胞的裂解物，泳道9是VR-wmffi6E7-4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞的裂解物，泳道10是VR-omffi6E7-4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞的裂解物。圖6顯示的是重組質(zhì)粒pcDNA-o伍6E7、pcDNA-omffi6E7-2、pcDNA-om伍6E7-3、pcDNA-om伍6E7-4的X/"I禾UWflI雙酶切鑒定結(jié)果。其中泳道1是DNAMarkerDL15000，泳道2是pcDNA3.1(+)質(zhì)粒的￡coiV和Sg/II雙酶切產(chǎn)物，泳道3是pcDNA-o伍6E7質(zhì)粒的A:戶II雙酶切產(chǎn)物，泳道4是pcDNA-om伍6E7-2質(zhì)粒的K;"I十力flI雙酶切產(chǎn)物，泳道5是pcDNA-omffi6E7-3質(zhì)粒的K/wI+力"I雙酶切產(chǎn)物，泳道6是pcDNA-om伍6E7-4質(zhì)粒的尺/"I+I雙酶切產(chǎn)物圖7顯示的是使用WesternBlot檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞克隆3T3-o伍6E7、3T3-om伍6E7-2、3T3-omffi6E7-3和3T3-omffi6E7-4中表達(dá)的融合蛋白。其中泳道1是用作陰性對(duì)照的正常NIH3T3細(xì)胞的裂解物，泳道2是3T3-neo細(xì)胞的裂解物，泳道3是3T3-offi6E7細(xì)胞的裂解物，泳道4是3T3-omfE6E7-2細(xì)胞的裂解物，泳道5是3T3-omffi6E7-3細(xì)胞的裂解物，泳道6是3T3-omffi6E7-4細(xì)胞的裂解物。圖8顯示的是細(xì)胞3T3-o伍6E7、3T3-omffi6E7-2、3T3-om伍6E7-3、3T3-om伍6E7-4、3T3-neo以及NIH3T3細(xì)胞(陰性對(duì)照)、TC-1細(xì)胞(陽(yáng)性對(duì)照)在軟瓊脂中集落的形成情況。其中A是NIH3T3細(xì)胞在軟瓊脂中集落的形成情況，B是3T3-neo細(xì)胞在軟瓊脂中集落的形成情況，C是3T3-offi6E7細(xì)胞在軟瓊脂中集落的形成情況，D是3T3-omffi6E7-2細(xì)胞在軟瓊脂中集落的形成情況，E是3T3-omffi6E7-3細(xì)胞在軟瓊脂中集落的形成情況，F(xiàn)是3T3-om正6E7-4細(xì)胞在軟瓊脂中集落的形成情況，G是TC-1細(xì)胞在軟瓊脂中集落的形成情況。圖9顯示細(xì)胞3T3-o伍6E7、3T3-omffi6E7-2、3T3-omffi6E7-3、3T3-omffi6E7-4、3T3-neo以及NIH3T3細(xì)胞(陰性對(duì)照)、TC-1細(xì)胞(陽(yáng)性對(duì)照)對(duì)SICD小鼠的致瘤情況以及所形成的腫瘤，其中箭頭所指示的位置為腫瘤生長(zhǎng)的位置。圖A部分中1為NIH3T3細(xì)胞接種的SCID小鼠，2為3T3-neo細(xì)胞接種的SCID小鼠，3為3T3-o伍6E7細(xì)胞接種的SCID小鼠，4為3T3-omffi6E7-2細(xì)胞接種的SCID小鼠，5為3T3-omffi6E7-3細(xì)胞接種的SCID小鼠，6為3T3-omfE6E7-4細(xì)胞接種的SCID小鼠，7為TC-1細(xì)胞接種的SCID小鼠。圖B部分中1-6為3T3-offi6E7細(xì)胞接種的六只SCID小鼠分別形成的腫瘤，7為TC-1細(xì)胞接種的SCID小鼠所形成的腫瘤。圖10顯示細(xì)胞3T3-o伍6E7對(duì)SICD小鼠所形成的腫瘤(對(duì)應(yīng)圖9中圖B部分1所示的腫瘤)的病理切片，顯示了所形成腫瘤的是梭形細(xì)胞肉瘤。實(shí)施例材料和方法含有野生型HPV16E6基因和E7基因的pUC-E6E7質(zhì)粒(插入位點(diǎn)為KpnI禾口Xba.L酶切位點(diǎn)之間，插入序列是GenebankACCESSION:K02718所示核苷酸序列中第83-858位核苷酸部分，其中第83-559位核苷酸序列為E6基因核苷酸序列，第562-858位核苷酸序列為E7基因核苷酸序列)、VR質(zhì)粒、pcDNA3.1(+)質(zhì)粒、大腸桿菌DH5a、NIH3T3細(xì)胞以及SCID小鼠，由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所腫瘤病毒室所有。質(zhì)粒大量提取試劑盒QIAGENPlasmidMidiKits購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司。常用限制性內(nèi)切酶和T4DNALigase購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。pfu聚合酶、核酸凝膠純化試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，無(wú)血清培養(yǎng)基Opti-MEM購(gòu)自美國(guó)Gibico公司。ProteaseInhibitorCocktail購(gòu)于SIGMA公司。G418購(gòu)自美國(guó)Merck公司。軟瓊脂SeaPrepAgarose購(gòu)自美國(guó)Cambrex公司。PCR反應(yīng)儀為美國(guó)ABI公司的GeneAmpPCRSystem2700。本發(fā)明所涉及的分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)如核酸操作技術(shù)、蛋白質(zhì)定性等在科學(xué)文獻(xiàn)中都已有充分描述(如參見^薩姆布魯克Ef弗里奇T，曼尼要蒂斯，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版))。涉及到各種試劑(或試劑盒)的具體操作，按照各試劑(或試劑盒)的使用說(shuō)明書進(jìn)行。實(shí)施例1:HPV16E6E7的密碼子最優(yōu)化為了提高HPV16E6E7基因在哺乳類動(dòng)物細(xì)胞特別是人類細(xì)胞中的表達(dá)，本實(shí)施例對(duì)HPV16E6E7基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化。根據(jù)人類基因密碼子的偏嗜性，利用人類基因中使用頻率最高和次高的密碼子設(shè)計(jì)出一條經(jīng)密碼子優(yōu)化的HPV16E6E7融合基因，命名為offi6E7，其編碼的氨基酸序列包含完整的野生型HPV16E6蛋白(GenebankACCESSION:AAA46939)和E7蛋白(GenebankACCESSION:AAA46940)的氨基酸序列，并以E6蛋白氨基酸序列在氨基端、E7蛋白氨基酸序列在羧基端的方式直接融合，其中的E6蛋白氨基酸序列中第136位精氨酸和E7蛋白氨基酸序列中第32位絲氨基分別使用人類基因中使用頻率次高的密碼子AGG和TCC，其余均為人類基因中使用頻率最高的密碼子。所述offi6E7基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。實(shí)施例2:合成密碼子最優(yōu)化的HPV16E6E7融合基因本實(shí)施例通過(guò)重疊延伸PCR(overlapextensionPCR,OEPCR)拼接合成實(shí)施例1中所述的offi6E7基因。引物設(shè)計(jì)參照密碼子最優(yōu)化后的o伍6E7核苷酸序列，設(shè)計(jì)合成10條含有重疊序列的長(zhǎng)度為89個(gè)寡核苷酸左右的長(zhǎng)鏈引物(A1、A2、Bl、B2、Cl、C2、Dl、D2),以及10條用于連接這些長(zhǎng)鏈引物的長(zhǎng)度為25個(gè)寡核苷酸左右的短鏈引物(pl、p2、p2、p4、p5、ql、q2、q3、q4、q5)，其中的兩條短鏈引物(pl和qlO)含有限制性內(nèi)切酶A>nI和力aI的酶切位點(diǎn)。所述引物委托北京擎科生物技術(shù)有限公司合成，溶于ddH20中，長(zhǎng)鏈引物濃度為lOpmol，短鏈引物濃度為25pmo1，引物序列見表l。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>引物的拼接使用重疊延伸PCR(overlapextensionPCR,OEPCR)來(lái)拼接合成offi6E7序列，方法如下:(1)由相鄰的兩條含有重疊序列的長(zhǎng)鏈引物和位于這兩條長(zhǎng)引物兩端的相應(yīng)的短鏈引物，合成五條雙鏈DNA，依次編號(hào)為A(使用引物pl+Al+A2+ql)、B(使用引物p2+Bl+B2+q2)、C(使用引物p3+Cl+C2+q3)、D(使用引物p4+Dl+D2+q4)、E(使用引物p5+El+E2+q5)。在200iilPCR反應(yīng)管中，加入以下反應(yīng)物lpl(2.5U)pfuDNA聚合酶、5(alpful0x緩沖液、4^1dNTP(2.5mMeach)、1^1每條長(zhǎng)鏈引物和lpM每條短鏈引物，使用ddH20補(bǔ)充到50W。在PCR儀上進(jìn)行如下的PCR反應(yīng)94°C5分鐘，40°C2分鐘，72°CIO秒鐘；94°C15秒鐘，40°C30秒鐘，72°C20秒鐘+每個(gè)循環(huán)2秒鐘(共進(jìn)行10個(gè)循環(huán))；94°C30秒鐘，60'C30秒鐘，72°C45秒鐘(共進(jìn)行25個(gè)循環(huán))；72°CIO分鐘。PCR反應(yīng)后取全量PCR反應(yīng)液進(jìn)行DNA凝膠電泳并切膠回收目的DNA片段。(2)使用引物和上一步回收的有重疊序列的DNA片段來(lái)拼接延伸DNA。具體的說(shuō)，由pl+A+B+p2合成DNA片段AB，由p3+C+D+p4合成DNA片段CD，由p3+CD+E+p5合成DNA片段CDE，最后由pl+AB+CDE+p5合成全基因(包含兩端的酶切位點(diǎn)部分)。在200nlPCR反應(yīng)管中，加入以下反應(yīng)物lpl(2.5U)pftiDNA聚合酶、5plpful0x緩沖液、4^1dNTP(2.5mMeach)、lpl每種短鏈引物(如合成AB時(shí)使用pl和p2)、等量的0.20.5pg回收的每種DNA片段(如合成AB時(shí)使用A禾口B)，使用ddH20補(bǔ)充到50^1。在PCR儀上進(jìn)行如下的PCR反應(yīng)94°C5分鐘；94°C30秒鐘，60°C30秒鐘，72°C1分鐘(共進(jìn)行30個(gè)循環(huán))；72°C10分鐘。PCR反應(yīng)后取全量PCR反應(yīng)液進(jìn)行DNA凝膠電泳并切膠回收，目的DNA大小為780bp左右。質(zhì)粒PUC-offi6E7的構(gòu)建將最后回收所得的PCR產(chǎn)物全量進(jìn)行《/7wI和^&aI雙酶切，酶切產(chǎn)物純化回收后連接同樣進(jìn)行雙酶切的pUC18質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)所選擇克隆的質(zhì)粒使用《p"I和JftflI雙酶切，挑選含有780bp左右片段的陽(yáng)性克隆，對(duì)插入片段DNA進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示為如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。選擇出含有offi6E7基因的重組質(zhì)粒，命名為pUC-offi6E7。質(zhì)粒pUC-offi6E7的酶切鑒定結(jié)果分別如圖2所示。結(jié)果表明拼接合成的o伍6E7基因正確地插入到pUC18質(zhì)粒中的A:;wI和W"I酶切位點(diǎn)。實(shí)施例3:ofE6E7基因的定點(diǎn)誘變本實(shí)施例對(duì)所得到的優(yōu)化融合HPV16E6E7基因offi6E7基因進(jìn)行定點(diǎn)誘變，制備密碼子優(yōu)化型的突變HPV16E6E7融合基因，消除HPV16E6E7基因的致癌性，以消除HPV16E6-E7融合基因的致癌性。具體為，在E6蛋白氨基酸序列部分中57Leu(CTG)—Gly(GGC)和113Cys(TGC)—Arg(AGA)，在E7蛋白氨基酸序列部分中24Cys(TGC)—Gly(GGC)、26Glu(GAG)—Gly(GGC)、58Cys(TGC)—Gly(GGC)和91Cys(TGC)—Gly(GGC)。上述E6蛋白的L57G、C113R和E7蛋白的C24G、E26G、C58G、C91G在融合蛋白的氨基酸序列(E6位于5，端，E7位于3'端，)中的相應(yīng)殘基位置為L(zhǎng)57G、C113R、C182G、E184G、C216G和C249G。本實(shí)施例共制備三種定點(diǎn)誘變后的密碼子優(yōu)化型融合基因1)4個(gè)位點(diǎn)突變的突變形式，其中E6編碼部分2個(gè)(L57G、CU3R)，E7編碼部分2個(gè)(C182G和E184G)，命名為om伍6E7-2;2)5個(gè)位點(diǎn)突變的突變形式，其中E6編碼部分2個(gè)(L57G、C113R)，E7編碼部分3個(gè)(C182G、E184G和C216G)，命名為om伍6E7-3;3)6個(gè)位點(diǎn)突變的突變形式，其中E6編碼部分2個(gè)(L57G、C113R)，E7編碼部分4個(gè)(C182G、E184G、C216G禾口C249G),命名為omffi6E7-4。引物設(shè)計(jì)以omffi6E7-4為模板，設(shè)計(jì)九條含有突變位點(diǎn)的引物(Q57U、Q57L、Q113U、Q113L、Q24U、Q24L、Q58U、Q58L和Q91L)以及擴(kuò)增全基因序列的上游引物E6Ueco和下游引物E7Lbgl，其中E6Ueco含有￡coAV酶切位點(diǎn)，E7Lbgl和Q91L含有Sg/II酶切位點(diǎn)。引物序列見表2。表2:向密碼子優(yōu)化型融合基因引入突變位點(diǎn)用引物:<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>突變位點(diǎn)的引入以實(shí)施例2中制備得到的pUC-offi6E7為模板，使用重疊延伸PCR依次引入所設(shè)計(jì)的突變位點(diǎn)。具體的說(shuō)，以offi6E7為模板，使用引物Q57U和Q57L引入L57G，使用引物Q113U和Q113引入C113R，使用引物Q24U和Q24L同時(shí)引入C182G和E184G,使用引物Q58U和Q58L引入C216G,使用引物Q91L引入C249G。同時(shí)使用引物E6Ueco和E7Lbgl擴(kuò)增o正6E7。每一步的PCR反應(yīng)條件均相同。在200plPCR反應(yīng)管中，加入以下反應(yīng)物lM(2.5U)pfuDNA聚合酶、5Mlpftil0x緩沖說(shuō)明書第10/25頁(yè)液、4pldNTP(2.5mMeach)、lpl每條短鏈引物、等量的0.20.5嗎回收的每種DNA片段，使用ddH2O補(bǔ)充到50pl。在PCR儀上進(jìn)行如下的PCR反應(yīng)94°C5分鐘；94°C30秒鐘，60'C30秒鐘，72'C1分鐘(共進(jìn)行30個(gè)循環(huán))；72'CIO分鐘。最后一次PCR反應(yīng)后取全量PCR反應(yīng)液進(jìn)行DNA凝膠電泳并切膠回收，目的DNA大小為780bp左右?；厥账玫腜CR產(chǎn)物ofE6E7、omfE6E7-2、omfE6E7-3和omffi6E7-4全量進(jìn)行￡co/V和Sg/II雙酶切，酶切產(chǎn)物純化回收后連接同樣進(jìn)行雙酶切的VR質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)所選擇克隆的質(zhì)粒使用五coiV和5g/II雙酶切，挑選含有780bp左右片段的陽(yáng)性克隆，對(duì)插入片段DNA進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示為分別如SEQIDNO:1-4所示。選擇出含有o伍6E7、om伍6E7-2、omffi6E7-3和omfE6E7-4基因的重組質(zhì)粒，分別命名為VR-o伍6E7、VR-omffi6E7-2、VR-om伍6E7-3和VR-om伍6E7-4。酶切鑒定結(jié)果圖3所示。結(jié)果表明ofE6E7、omffi6E7-2、om伍6E7-3和omffi6E7-4基因都正確地插入到VR質(zhì)粒的￡co/V和5g/II酶切位點(diǎn)中。實(shí)施例4:野生型重組HPV16E6E7基因的構(gòu)建為了檢測(cè)優(yōu)化型重組HPV16E6E7基因的在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)效果，本實(shí)施例構(gòu)建與ofE6E7、om伍6E7-2、om伍6E7-3、om伍6E7-4相對(duì)應(yīng)的野生型重組HPV16E6E7融合基因wffi6E7、wmffi6E7-2、wm伍6E7-3和wm伍6E7-4共四種基因。其中E6蛋白氨基酸部分突變位點(diǎn)包括57Leu(TTA)—Gly(GGC)和113Cys(TGT)—Arg(AGA)，E7蛋白氨基酸部分突變位點(diǎn)包括24Cys(TGT)—Gly(GGC)、26Glu(GAG)—Gly(GGC)、58Cys(TGT)—Gly(GGC)和91Cys(TGC)—Gly(GGC)。以上所述的E6蛋白的L57G、C113R和E7蛋白的C24G、E26G、C58G、C91G依次對(duì)應(yīng)于融合蛋白氨基酸序列中的L57G、C113R、C182G、E184G、C216G和C249G。相對(duì)于wflE6E7，畫ffi6E7-2的突變位點(diǎn)包含L57G、C113R、C182G和E184G，wmffi6E7-3的突變位點(diǎn)包含L57G、C113R、C182G、E184G和C216G，wmffi6E7-4的突變位點(diǎn)包含L57G、C113R、C182G、E184G、C216G和C249G。引物設(shè)計(jì)以wffi6E7為模板，設(shè)計(jì)上游引物wE6Ueco和下游引物wE7Lbgl以及使E6E7基因融合的引物E6L和E7U。以垂ffi6E7-4為模板，設(shè)計(jì)九條含有突變位點(diǎn)的引物(57U、57L、113U、113L、24U、24L、58U、58L和91L),其中wE6Ueco含有￡co/V酶切位點(diǎn)，wE7Lbgl和91L含有5g/II酶切位點(diǎn)。引物序列見表3。表3.構(gòu)建野生型對(duì)照融合基因用引物<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>基因的融合與突變使用引物E6L和E7U消除野生型HPV16E6基因的終止密碼子TAA及E6基因與E7基因之間連接的兩個(gè)脫氧核核苷酸TC，從而產(chǎn)生野生融合HPV16E6E7基因wfE6E7，再以wffi6E7為模板，依次引入所設(shè)計(jì)的突變位點(diǎn)。方法如下(1)擴(kuò)增E6基因和E7基因以pUC-E6E7為模板，使用引物wE6Ueco和E6L擴(kuò)增E6基因，wE7Lbgl和E6E7擴(kuò)增E7U。在200^1PCR反應(yīng)管中，加入以下反應(yīng)物lpl(2.5U)pfuDNA聚合酶、5plpftil0x緩沖液、4pldNTP(2.5mMeach)、0.5叫左右的質(zhì)粒pUC-E6E7，使用ddH20補(bǔ)充到50|xl。在PCR儀上進(jìn)行如下的PCR反應(yīng)94'C5分鐘；94°C30秒鐘，60°C30秒鐘，72'C1分鐘(共進(jìn)行30個(gè)循環(huán))；72°C10分鐘PCR反應(yīng)后取全量PCR反應(yīng)液進(jìn)行DNA凝膠電泳并切膠回收，目的DNA大小分別為480bp左右(E6)和300bp左右(E7)。(2)E6基因與E7基因的融合以回收純化的E6和E7基因?yàn)槟０澹褂靡飛E6Ueco和wE7Lbgl擴(kuò)增野生融合HPV16E6E7基因wffi6E7。在200^1PCR反應(yīng)管中，加入以下反應(yīng)物lfil(2.5U)pfuDNA聚合酶、5plpfal0x緩沖液、4^1dNTP(2.5mMeach)、l[il每條短鏈引物、等量的0.20.5嗎回收的每種DNA片段，使用ddH20補(bǔ)充到50^1。在PCR儀上進(jìn)行如下的PCR反應(yīng)94°C5分鐘；94'C30秒鐘，60°C30秒鐘，72'C1分鐘(共進(jìn)行30個(gè)循環(huán))；72°C10分鐘。PCR反應(yīng)后取全量PCR反應(yīng)液進(jìn)行DNA凝膠電泳并切膠回收，目的DNA大小780bp左右。(3)突變位點(diǎn)的引入以上一步回收后所得到的DNA為模板，使用重疊延伸PCR依次引入所設(shè)計(jì)的突變位點(diǎn)。具體的說(shuō)，以wffi6E7模板，使用引物57U和57L引入L57G,使用引物113U和113引入C113R，使用引物24U和24L同時(shí)引入C182G和E184G，使用引物58U和58L引入C216G,使用引物91L引入C249G。每一步的PCR反應(yīng)條件均相同。在200WPCR反應(yīng)管中，加入以下反應(yīng)物lnl(2.5U)pfuDNA聚合酶、5(xlpftilOx緩沖液、4pldNTP(2.5mMeach)、lpl每條短鏈引物、等量的0.20.5嗎回收的每種DNA片段，使用ddH20補(bǔ)充到50pl。在PCR儀上進(jìn)行如下的PCR反應(yīng)94°C5分鐘；94°C30秒鐘，6(TC30秒鐘，72°C1分鐘(共進(jìn)行30個(gè)循環(huán))；72°CIO分鐘。最后一次PCR反應(yīng)后取全量PCR反應(yīng)液進(jìn)行DNA凝膠電泳并切膠回收，目的DNA大小為780bp左右?；厥账玫腜CR產(chǎn)物wffi6E7、wmffi6E7-2、wm伍6E7-3和wm伍6E7-4全量進(jìn)行￡coiV和萬(wàn)g/II雙酶切，酶切產(chǎn)物純化回收后連接同樣進(jìn)行雙酶切的VR質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)所選擇克隆的質(zhì)粒使用五co/V和5g/II雙酶切，挑選含有780bp左右片段的陽(yáng)性克隆，對(duì)插入片段DNA進(jìn)行測(cè)序(測(cè)序結(jié)果未列出)。選擇出含有wffi6E7、wmffi6E7-2、wmffi6E7-3和wmffi6E7-4基因的重組質(zhì)粒，分別命名為VR-wffi6E7、VR-wm伍6E7-2、VR隱wmffi6E7-3禾QVR國(guó)麗伍6E7-4。質(zhì)粒VR-wfE6E7、VR-wm伍6E7-2、VR-寵伍6E7隱3禾口VR-麵ffi6E7-4的酶切鑒定結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明wfE6E7、wmffi6E7-2、wmffi6E7-3和wm伍6E7-4基因均正確地插入到VR質(zhì)粒的五coiV和萬(wàn)g/II酶切位點(diǎn)中。實(shí)施例5:優(yōu)化型重組HPV16E6E7基因在NIH3T3細(xì)胞中的表達(dá)本實(shí)施例使用WesternBlot檢測(cè)優(yōu)化型重組HPV16E6E7基因在NIH3T3細(xì)胞中的表達(dá)，方法如下所述。用QIAGENPlasmidMidiKits質(zhì)粒純化試劑盒大量制備純化優(yōu)化型重組HPV16E6E7基因重組質(zhì)粒(VR-o伍6E7，VR-omffi6E7-2，VR-omffi6E7-3，VR-omffi6E7-4)和野生型重組HPV16E6E7基因重組質(zhì)粒(VR-wffi6E7，VR-麗伍6E7-2，VR-職伍6E7-3，VR-wm伍6E7-4)，以及VR質(zhì)粒。使用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法按Lipofectamine2000的使用說(shuō)明進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后裂解所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，將裂解液與適當(dāng)比較的5xSDS凝膠加樣緩沖液混勻后進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)，其中積層膠為5%,分離膠為12%，在110V條件下電泳1.5小時(shí)。電泳結(jié)束后，通過(guò)半干式電轉(zhuǎn)印法將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，在為36V條件下電轉(zhuǎn)1小時(shí)。將硝酸纖維素膜按分子量大小進(jìn)行適當(dāng)裁剪后依次進(jìn)行封閉、加入一抗(其中重組基因表達(dá)產(chǎn)物部分加入1:200稀釋的羊抗HPV16E6多抗，卩-actin表達(dá)產(chǎn)物部分加入l:500稀釋的兔抗卩-actin抗體)、加入二抗(對(duì)應(yīng)的分別加入1:2500HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG和1:2500HRP標(biāo)記羊抗兔IgG)，最后進(jìn)行DAB顯色。結(jié)果如圖24所示。結(jié)果表明優(yōu)化型重組HPV16E6E7基因offi6E7、omfE6E7-2,、omffi6E7-3和om伍6E7-4都可以在NIH3T3中可以表達(dá)出與理論值大小相同的36KD大小的目的蛋白，而且檢測(cè)到的蛋白條帶明顯，表達(dá)量很高；而野生型重組HPV16E6E7基因wffi6E7、wm伍6E7-2、wm伍6E7-3和wmffi6E7-4由于表達(dá)量低而未達(dá)到可檢測(cè)的水平，沒(méi)有檢測(cè)到相應(yīng)的目的蛋白(如圖5所示)。由此可見，與野生型HPV16E6-E7融合基因相比，密碼子優(yōu)化型HPV16E6-E7融合基因在NIH3T3中的表達(dá)量得到了極為顯著的提高，從而說(shuō)明基因優(yōu)化后對(duì)重組HPV16E6E7基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)效果的提高是十分明顯的，同時(shí)也表明所構(gòu)建的優(yōu)化突變?nèi)诤螲PV16E6E7基因可以表達(dá)出穩(wěn)定的融合蛋白。實(shí)施例6:含有優(yōu)化重組基因的pcDNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建本實(shí)施例以VR-offi6E7、VR-omffi6E7-2、VR-om伍6E7-3、VR-om伍6E7-4為模板，使用引物pl和p5分別擴(kuò)增o伍6E7、om伍6E7-2、omffi6E7-3和omffi6E7-4基因。在200plPCR反應(yīng)管中，加入以下反應(yīng)物lpl(2.5U)pfuDNA聚合酶、5plpful0x緩沖液、4^1dNTP(2.5mMeach)、0.5嗎左右的質(zhì)粒，使用ddH20補(bǔ)充到50)al。在PCR儀上進(jìn)行如下的PCR反應(yīng)94'C5分鐘；94°C30秒鐘，6(TC30秒鐘，72°C1分鐘(共進(jìn)行30個(gè)循環(huán))；72'C10分鐘。PCR反應(yīng)后取全量PCR反應(yīng)液進(jìn)行DNA凝膠電泳并切膠回收，目的DNA大小分別為780bp左右。回收所得的PCR產(chǎn)物offi6E7、om伍6E7-2、omffi6E7-3和omffi6E7-4全量進(jìn)行V和5g/II雙酶切，酶切產(chǎn)物純化回收后連接同樣進(jìn)行雙酶切的VR質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)所選擇克隆的質(zhì)粒使用V和Sg/II雙酶切，挑選含有780bp左右片段的陽(yáng)性克隆，對(duì)插入片段DNA進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示為分別如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。選擇出含有o伍6E7、omffi6E7-2、om伍6E7-3和om伍6E7-4基因的重組質(zhì)粒，分別命名為VR-o伍6E7、VR-om伍6E7-2、VR-om伍6E7-3和VR-om伍6E7-4。酶切鑒定結(jié)果圖3所示。結(jié)果表明VR-o伍6E7、VR-om伍6E7-2、VR-omffi6E7-3和VR-om伍6E7-4基因都正確地插入到VR質(zhì)粒的￡coiV和Sg/II酶切位點(diǎn)中?；厥账玫腜CR產(chǎn)物offi6E7、omffi6E7-2、omffi6E7-3和om伍6E7-4全量進(jìn)行K;^I和^Z^I雙酶切，酶切產(chǎn)物純化回收后連接同樣進(jìn)行雙酶切的pcDNA3.1(+)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)所選擇克隆的質(zhì)粒使用尺p"I和力aI雙酶切，挑選含有780bp左右片段的陽(yáng)性克隆，對(duì)插入片段DNA進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示為分別如SEQIDNO:1、SEQ1DNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。選擇出含有o伍6E7、om伍6E7-2、om伍6E7-3和omffi6E7-4基因的重組質(zhì)粒，分別命名為pcDNA-o伍6E7、pcDNA-om正6E7-2、pcDNA-omffi6E7-3和pcDNA-omf6E7-4。質(zhì)粒pcDNA-of6E7、pcDNA-omf6E7-2、pcDNA-omffi6E7-3和pcDNA-omffi6E7-4的酶切鑒定結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明offi6E7、omffi6E7-2、omffi6E7-3和omffi6E7-4基因都正確地插入到pcDNA3.1(+)質(zhì)粒的KpnI和XbaI酶切位點(diǎn)中。實(shí)施例7:對(duì)經(jīng)密碼子最優(yōu)化的重組HPV16E6E7基因的軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)為了檢測(cè)優(yōu)化型重組基因的安全性，本實(shí)施例對(duì)經(jīng)密碼子最優(yōu)化的重組HPV16E6E7基因進(jìn)行軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)。用QIAGENPlasmidMidiKits質(zhì)粒純化試劑盒大量制備純化pcDNA-o伍6E7、pcDNA-omfE6E7-2、pcDNA-om伍6E7-3和pcDNA-omfE6E7-4重組質(zhì)粒以及pcDNA3.1(+)質(zhì)粒。使用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法按Lipofectamine2000的使用說(shuō)明進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染24h時(shí)將細(xì)胞按l:20傳代于一新的六孔板中，每種轉(zhuǎn)染的細(xì)胞傳6孔，繼續(xù)培養(yǎng)至48h時(shí)換為含300ng/mlG418的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)三周后換為含150嗎/mlG418的細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至第四周(共28天)，此吋各組均可見抗性細(xì)胞克隆的形成。每組各挑取20個(gè)細(xì)胞克隆，吸取轉(zhuǎn)移到24孔板中，使用含150pg/mlG418的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。使用WesternBlot來(lái)檢測(cè)含有offi6E7、om伍6E7-2、omffi6E7-3和omffi6E7-4基因表達(dá)產(chǎn)物的陽(yáng)性細(xì)胞克隆，分別命名為3T3-offi6E7、3T3-omffi6E7-2、3T3-omffi6E7-3、3T3-omffi6E7-4。pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染后篩選出的抗G418的細(xì)胞系命名為3T3-neo。WesternBlot檢測(cè)結(jié)果如圖7所示。消化離心并收集五種細(xì)胞克隆(3T3-offi6E7、3T3-om伍6E7-2、3T3-om伍6E7-3、3T3-omffi6E7-4、3T3-neo)和NIH3T3細(xì)胞(陰性對(duì)照)、TC-1細(xì)胞(陽(yáng)性對(duì)照)于含20%小牛血清的2xDMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為2xl0"后，與等量的在40'C水浴的0.6%的瓊脂混勻，快速加入到六孔板中，lml/孔，使每孔最終的細(xì)胞數(shù)為1><104個(gè)，每種細(xì)胞接種三個(gè)孔，常溫下自然凝固后置于37'C、5%(302孵箱中培養(yǎng)，每3天向瓊脂表面滴加35滴細(xì)胞培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)21天后計(jì)數(shù)軟瓊脂中細(xì)胞集落形成數(shù)目。各種細(xì)胞系在軟瓊脂中形成的集落的如圖8所示。軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明3T3-omffi6E7-2、3T3-omffi6E7-3、3T3-om伍6E7-4、3T3-neo和NIH3T3細(xì)胞均不能在軟瓊脂中形成3個(gè)細(xì)胞以上的克隆，而3T3-o伍6E7細(xì)胞和TC-1細(xì)胞均可以在軟瓊脂上形成含有50個(gè)細(xì)胞以上的細(xì)胞克隆。由此可以說(shuō)明3T3-offi6E7細(xì)胞具有在軟瓊脂上形成克隆的能力，而T3-omffi6E7-2、3T3-om伍6E7-3和3T3-omffi6E7-4等三種細(xì)胞沒(méi)有在軟瓊脂上形成克隆的能力，沒(méi)有表現(xiàn)出惡性轉(zhuǎn)化的性質(zhì)。從而說(shuō)明offi6E7基因?qū)IH3T3細(xì)胞具有轉(zhuǎn)化作用，而omffi6E7-2、omffi6E7-3和omffi6E7-4基因則沒(méi)有對(duì)NIH3T3細(xì)胞的轉(zhuǎn)化作用，消除了潛在致癌性，具有良好的生物安全性。實(shí)施例8:對(duì)經(jīng)密碼子最優(yōu)化的重組HPV16E6E7基因的裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn)為了進(jìn)一步檢測(cè)優(yōu)化型重組基因的安全性，本實(shí)施例對(duì)經(jīng)密碼子最優(yōu)化的重組HPV16E6E7基因進(jìn)行軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)。收集五種細(xì)胞克隆(3T3-o伍6E7、3T3-omffi6E7-2、3T3-omffi6E7-3、3T3-omffi6E7-4、3T3-neo)和NIH3T3細(xì)胞(陰性對(duì)照)、TC-1細(xì)胞(陽(yáng)性對(duì)照)，lxPBS清洗三次，調(diào)整細(xì)胞濃度為lxl(^個(gè)/ml，接種于SCID小鼠右前肢腋下皮下，lxl()S個(gè)細(xì)胞/鼠，每組6只SCID小鼠，培養(yǎng)兩個(gè)月后，觀察有無(wú)移植瘤的形成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示3T3-offi6E7和TC-1細(xì)胞接種的SCID小鼠均有腫瘤形成，成瘤率100%，而3T3-omffi6E7-2、3T3-om伍6E7-3、3T3-omfE6E7-4、3T3-neo和NIH3T3細(xì)胞接種的SCID小鼠均無(wú)腫瘤形成，成瘤率為0%。從而說(shuō)明3T3-offi6E7具有對(duì)SCID小鼠致瘤的能力，而3T3-omffi6E7-2、3T3-omffi6E7-3禾口3T3-omffi6E7-4則沒(méi)有對(duì)SCID小鼠致瘤的能力。各組SCID小鼠及其體內(nèi)瘤塊如圖9所示。取出3T3-offi6E7接種的SCID小鼠的腫瘤組織(對(duì)應(yīng)圖9中B部分編號(hào)為1的腫瘤)，HE染色后顯微鏡下可見梭狀瘤細(xì)胞呈紡織狀重疊排列，瘤細(xì)胞異型性明顯，呈纖維肉瘤樣外觀(如圖10所示)，鑒定為梭形細(xì)胞肉瘤。從而進(jìn)一步說(shuō)明offi6E7基因?qū)IH3T3細(xì)胞具有轉(zhuǎn)化作用，而om伍6E7-2、omfE6E7-3和omffi6E7-4基因則沒(méi)有對(duì)NIH3T3細(xì)胞的轉(zhuǎn)化作用，消除了潛在致癌性，具有良好的生物安全性。序列表<110〉曾毅<120〉經(jīng)修飾的HPVE6-E7融合基因及其編碼蛋白<130〉<160>7〈170>Patentlnversion3.4<210>1<211>771<212>DNA<213>HPV<220><221>融合基因〈222>(1)..(771)<1atgcaccagaagagaaccgccatgttccaggacccccaggagagacccagaaagctgccc60cagctgtgcaccgagctgcagaccaccatccacgacatcatcctggagtgcgtgtactgc120aagcagcagctgctgagaagagaggtgtacgacttcgccttcagagacctgtgcatcgtg180tacagagacggcaacccctacgccgtgtgcgacaagtgcctgaagttctacagc犯gatc240agcgagtacagacactactgctacagcctgtacggcaccaccctggagcagcagtacaac300aagcccctgtgcgacctgctgatcagatgcatcaactgccagaagcccctgtgccccgag360gagaagcagagacacctggacaagaagcagagattccacaacatcaggggcagatggacc420ggcagatgcatgagctgctgcagaagcagcagaaccagaagagagacccagctgatgcac480ggcgacacccccaccctgcacgagtacatgctggacctgcagcccgagaccaccgacctg540tactgctacgagcagctgaacgacagctccgaggaggaggacgagatcgacggccccgcc600ggccaggccgagcccgacagagcccactacaacatcgtgaccttctgctgcaagtgcgac660agcaccctgagactgtgcgtgcagagcacccacgtggacatcagaaccctggaggacctg720ctgatgggcaccctgggcatcgtgtgccccatctgcagccagaagccctga771〈210〉2〈211〉771<212〉DNA<213〉HPV〈220〉〈221〉定點(diǎn)誘變?nèi)诤匣?lt;222〉(1)..(771)<400〉2atgcaccagaagagaaccgccatgttccaggacccccaggagagacccagaaagctgccc60cagctgtgcaccgagctgcagaccaccatccacgacatcatcctggagtgcgtgtactgc120aagcagcagctgctgaagagaggtgtacgacttcgccttcagagacggctgcatcgtg180tacagagacggcaacccctacgccgtgtgcgacaagtgcctgaagttctacagcaagatc240agcgagtacagacactactgctacagcctgtacggcaccaccctggagcagcagtacaac300aagcccctgtgcgacctgctgatcagatgcatcaacagacagaagcccctgtgccccgag360gagaagcagagacacctggacaagaagcagagattccacaacatcaggggcagatggacc420ggcagatgcatgagctgctgcagaagcagcagaaccagaagagagacccagctgatgcac480ggcgacacccccaccctgcacgagtacatgctggacctgcagcccgagaccaccgacctg540tacggctacggccagctgaacgacagctccgaggaggaggacgagatcgacggccccgcc600ggccaggccgagcccgacagagcccactacaacatcgtgaccttctgctgcaagtgcgac660agcaccctgagactgtgcgtgcagagcacccacgtggacatcagaaccctggaggacctg720ctgatgggcaccctgggcatcgtgtgccccatctgcagccagaagccctga771〈210〉3〈211〉771〈212〉腿<213>HPV〈220〉<221〉定點(diǎn)誘變?nèi)诤匣颉?22〉(l)..(771)〈400〉3atgcaccagaagagaaccgccatgttccaggacccccaggagagacccagaaagctgccc60cagctgtgcaccgagctgcagaccaccatccacgacatcatcctggagtgcgtgtactgc120aagcagcagctgctgagaagagaggtgtacgacttcgccttcagagacggctgcatcgtg180tacagagacggcaacccctacgccgtgtgcgacaagtgcctgaagttctacagcaagatc240agcgagtacagacactactgctacagcctgtacggcaccaccctggagcagcagtacaac300aagcccctgtgcgacctgctgatcagatgcatcaacagacagaagcccctgtgccccgag360gagaagcagagacacctggacaagaagcagagattccacaacatcaggggcagatggacc420ggcagatgcatgagctgctgcagaagcagcag犯ccagaagagagacccagctgatgcac480ggcgacacccccaccctgcacgagtacatgctggacctgcagcccgagaccaccgacctg540tacggctacggccagctgaacgacagctccgaggaggaggacgagatcgacggccccgcc600ggccaggccgagcccgacagagcccactacaacatcgtgaccttcggctgcaagtgcgac660agcaccctgagactgtgcgtgcagagcacccacgtggacatcagaaccctggaggacctg720ctgatgggcaccctgggcatcgtgtgccccatctgcagccagaagccctga771<210〉4<211〉771<212〉DNA<213〉HPV〈220〉〈221〉定點(diǎn)誘變?nèi)诤匣颉?22〉(l)..(771)<400〉4atgcaccagaagagaaccgccatgttccaggacccccaggagagacccagaaagctgccc60cagctgtgcaccgagctgcagaccaccatccacgscatcatcctggagtgcgtgtactgc120aagcagcagctgctgagaagagaggtgtacgacUcgccttcagagacggctgcatcgtg180tacsgagacggcaacccctacgccgtgtgcgacaagtgcctgaagttctacagcaagatc240agcgagtacagacactactgctaceigcctgtacggcaccaccctggagcagcagtacaac300aagcccctgtgcgacctgctgatcagatgcatcaacagacagaagcccctgtgccccgag360gagsagcagagacacctggacaag犯gcag卿ttccac3acatcaggggcagatggacc420gg卿atgcatgagctgctgcagaagcagcagaaccagaagagagacccagctgatgcac480ggcgacaxxcccaccctgcacgagtacatgctggac"gcagcccgagaccaccgacctg540tacggctacggccagctgaacgacagctccgaggaggaggacgagatcgacggccccgcc600ggccsggccgagcccgacagagcccactacaacatcgtgaccttcggctgcaagtgcgac660agcaccctgagactgtgcgtgcagagcacccacgtggacatcagaaccctggaggacctg720ctgatgggcaccctgggcatcgtgggccccatctgcagccagaagccctga771<210>5<211>256<212>PRT<213>HPV<220><221>定點(diǎn)誘變?nèi)诤系鞍?lt;222>(1)..(256)〈400〉5MetHisGinLysArgThrAlaMetPheGinAspProGinGluArgPro151015ArgLysLeuProGinLeuCysThrGluLeuGinThrThrlieHisAsp202530lielieLeuGluCysValTyrCysLysGinGinLeuLeuArgArgGlu354045ValTyrAspPheAlaPheArgAspGlyCyslieValTyrArgAspGly505560AsnProTyrAlaValCysAspLysCysLeuLysPheTyrSerLyslie6570758022SerGluTyrArgHisTyrCys'TyrSerLeuTyrGlyTh.rThrLeuGlu859095GinGinTyrAsnLysProLeuCysAspLeuLeulieArgCyslieAsn100105110ArgGinLysProLeuCysProGluGluLysGinArgHisLeuAspLys115120125LysGinArgPheHisAsnlieArgGlyArgTrpThrGlyArgCysMet130135140SerCysCysArgSerSerArgThrArgArgGluThrGinLeuMetHis145150155160GlyAspThrProThrLeuHisGluTyrMetLeuAspLeuGinProGlu165170175ThrThrAspLeuTyrGlyTyrGlyGinUuAsnAspSerSerGluGlu180185190GluAspGlulieAspGlyProAlaGlyGinAlaGluProAspArgAla195200205HisTyrAsnlieValThrPheCysCysLysCysAspSerThrLeuArg210215220LeuCysValGinSerThrHisValAsplieArgThrLeuGluAspLeu225230235240LeuMetGlyThrLeuGlylieValCysProlieCysSerGinLysPro245250255<210〉6〈211〉256<212〉PRT<213〉HPV〈220><221>定點(diǎn)誘變?nèi)诤系鞍?lt;222>(1)..(256)<400>6MetHisGinLysArgThrAlaMetPheGinAspProGinGluArgPro151015ArgLysLeuProGinLeuCysThrGluLeuGinThrThrlieHisAsp202530lielieLeuGluCysValTyrCysLysGinGinLeuLeuArgArgGlu354045ValTyrAspPheAlaPheArgAspGlyCyslieValTyrArgAspGly505560AsnProTyrAlaValCysAspLysCysLeuLysPheTyrSerLyslie65707580SerGluTyrArgHisTyrCysTyrSerLeuTyrGlyThrThrLeuGlu859095GinGinTyrAsnLysProLeuCysAspLeuLeulieArgCyslieAsn100105110ArgGinLysProLeuCysProGluGluLysGinArgHisLeuAspLys115120125L.ysGinArgPheHisAsnlieArgGlyArgTrpThrGlyArgCysMet130135140SerCysCysArgSerSerArgThrArgArgGluThrGinLeuMetHis145150155160GlyAspThrProThrLeuHisGluTyrMetLeuAspLeuGinProGlu165170175ThrThrAspLeuTyrGlyTyrGlyGinLeuAsnAspSerSerGluGlu180185190GluAspGlulieAspGlyProAlaGlyGinAlaGluProAspArgAla195200205HisTyrAsnlieValThrPheGlyCysLysCysAspSerThrLeuArg210215220LeuCysValGinSerThrHisValAsplieArgThrLeuGluAspLeu225230235240LeuMetGlyThrLeuGlylieValCysProlieCysSerGinLysPro245250255<210>7<211>256<212>PRT<213>HPV<220><221〉定點(diǎn)誘變?nèi)诤系鞍?lt;222>(1)..(256)<400〉7MetHisGinLysArgThrAlaMetPheGinAspProGinGluArgPro151015ArgLysLeuProGinLeuCysThrGluLeuGinThrThrlieHisAsp202530lielieLeuGluCysValTyrCysLysGinGinLeuLeuArgArgGlu354045ValTyrA印PheAlaPheArgAspGlyCyslieValTyrArgAspGly505560AsnProTyrAlaValCysAspLysCysLeuLysPheTyrSerLyslie65707580SerGluTyrArgHisTyrCysTyrSerLeuTyrGlyThrThrLeuGlu859095GinGinTyrAsnLysProLeuCysAspLeuLeulieArgCyslieAsn100105110ArgGinLysProLeuCysProGluGluLysGinArgHisLeuAspLys115120125LysGinArgPheHisAsnlieArgGlyArgTrpThrGlyArgCysMet130135140SerCysCysArgSerSerArgThrArgArgGluThrGinLeuMetHis145150155160GlyAspThrProThrLeuHisGluTyrMetLeuAspLeuGinProGlu165170175ThrThrAspLeuTyrGlyTyrGlyGinLeuAsnAspSerSerGluGlu180185190GluAspGlulieAspGlyProAlaGlyGinAlaGluProAspArgAla195200205HisTyrAsnlieValThrPheGlyCysLysCysAspSerThrLeuArg210215220LeuCysValGinSerThrHisValAsplieArgThrLeuGluAspLeu225230235240LeuMetGlyThrLeuGlylieValGlyProlieCysSerGinLysPro24525025權(quán)利要求1.一種密碼子優(yōu)化型的HPV16E6-E7融合基因，該融合基因具有SEQIDNO1所示的核苷酸序列。2.消除潛在致癌性的密碼子優(yōu)化型融合基因，該融合基因是在對(duì)權(quán)利要求1所述融合基因定點(diǎn)誘變制備得到的，定點(diǎn)誘變后的融合基因所編碼的氨基酸序列中包括下列位點(diǎn)突變:L57G和C113R，以及C182G、E184G、C216G和C249G中的至少2個(gè)。3.權(quán)利要求2所述的融合基因，該融合基因具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。4.權(quán)利要求2所述的融合基因，該融合基因具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列。5.權(quán)利要求2所述的融合基因，該融合基因具有SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。6.權(quán)利要求2所述融合基因編碼的HPV16E6-E7融合蛋白。7.權(quán)利要求6所述的融合蛋白，其具有SEQIDNO:5所示的氨基酸序列。8.權(quán)利要求6所述的融合蛋白，其具有SEQIDNO:6所示的氨基酸序列。9.權(quán)利要求6所述的融合蛋白，其具有SEQIDNO:7所示的氨基酸序列。10.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的融合基因在制備HPV16DNA疫苗侯選抗原基因中的用途。全文摘要本發(fā)明提供了一種密碼子優(yōu)化型的HPV16E6-E7融合基因，和在此基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)定點(diǎn)誘變消除了潛在致癌性的融合基因，及其編碼的融合蛋白。與相應(yīng)野生型融合基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)量極低相比，這些經(jīng)修飾(包括密碼子優(yōu)化及在此基礎(chǔ)上定點(diǎn)誘變)的融合基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)顯著升高。另外，經(jīng)過(guò)定點(diǎn)誘變消除了潛在致癌性的HPV16E6-E7融合基因失去了對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化活性，具有生物安全性，為構(gòu)建相關(guān)的DNA疫苗提供了良好的侯選抗原基因。文檔編號(hào)C07K19/00GK101100672SQ20071010026公開日2008年1月9日申請(qǐng)日期2007年6月6日優(yōu)先權(quán)日2007年6月6日發(fā)明者玲周,毅曾,李澤林,望盛,強(qiáng)謝申請(qǐng)人:毅曾