專利名稱：轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞的重組dna病毒載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞的重組DNA病毒載體。更具體地講，本發(fā)明涉及含重組酶基因或編碼重組酶識別序列之DNA序列的重組DNA病毒載體，用所述載體向動(dòng)物細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因的方法，及其在基因治療中的用途。
經(jīng)常使用逆轉(zhuǎn)錄病毒作為基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的病毒載體。但是逆轉(zhuǎn)錄病毒只轉(zhuǎn)染有絲分裂細(xì)胞，并整合在宿主細(xì)胞的染色體中，因此，逆轉(zhuǎn)錄病毒作為病毒載體遇到了安全性問題，特別是在基因治療中。因此人們認(rèn)為應(yīng)限制使用逆轉(zhuǎn)錄病毒作為病毒載體。
腺病毒有許多優(yōu)勢，如在許多種動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)效率幾乎為100％，不像逆轉(zhuǎn)錄病毒，它沒有整合入染色體中的陽性機(jī)制，甚至可以向靜止細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)基因。由于這些優(yōu)點(diǎn)，腺病毒被認(rèn)為可應(yīng)用于進(jìn)行外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的極廣泛的領(lǐng)域中。在不久的將來將確立腺病毒載體用作基因治療的主要技術(shù)之一。
腺病毒載體已廣泛用作一種基因治療技術(shù)或用于對高度分化細(xì)胞如神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中表達(dá)的研究。對于基因治療技術(shù)，已廣泛研究了體內(nèi)基因治療，其中通過向細(xì)胞所存在的組織中直接注射基因，將在活細(xì)胞中有缺陷的基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞中。在美國，已允許五個(gè)研究機(jī)構(gòu)進(jìn)行用基因治療方法治療囊性纖維變性病人的臨床試驗(yàn)。而且，基因治療的研究已擴(kuò)展到了肌肉營養(yǎng)不良、高脂蛋白血(II型)、和腦瘤。另一方面，腺病毒載體使得甚至能向靜止細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)基因。因此，在進(jìn)行向初級培養(yǎng)細(xì)胞或動(dòng)物體轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的試驗(yàn)時(shí)，已應(yīng)用了腺病毒載體向分化細(xì)胞，特別是向神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)基因。
鑒于上述原因，人們特別希望腺病毒載體能實(shí)際應(yīng)用于特別是基因治療中，因?yàn)榇溯d體能使基因在直接注射或施于動(dòng)物體內(nèi)時(shí)表達(dá)，并能向各種分化和未分化細(xì)胞(包括神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞)中轉(zhuǎn)導(dǎo)基因。
但不像逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒載體缺少向染色體中整合的陽性機(jī)制，結(jié)果在此載體中基因的表達(dá)只是暫時(shí)的。即，表達(dá)僅持續(xù)少數(shù)幾周，至多約2個(gè)月。因此，當(dāng)要保持治療效果時(shí)，為了持續(xù)表達(dá)應(yīng)重復(fù)注射或施用此載體。但重復(fù)注射或施用可能會誘導(dǎo)產(chǎn)生減低療效的抗體。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種重組腺病毒載體系統(tǒng)，其中通過腺病毒載體將外源基因轉(zhuǎn)入動(dòng)物細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)化成一種能夠在此細(xì)胞中自主復(fù)制的形式。本發(fā)明的另一目的是提供用于基因治療的這種系統(tǒng)。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明者進(jìn)行了廣泛的研究，并成功地得到了一種重組腺病毒載體系統(tǒng)其中用腺病毒載體將帶有外源基因的表達(dá)單元轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，然后利用重組酶基因和重組酶識別序列將其轉(zhuǎn)化成環(huán)形DNA分子，和其中已向這樣形成的環(huán)形DNA分子中引入了復(fù)制起點(diǎn)，從而帶有外源基因的表達(dá)單元能夠自主復(fù)制以在此細(xì)胞中連續(xù)表達(dá)外源基因。
本文中，“重組酶”指特異的重組DNA酶，它能夠識別由幾十個(gè)堿基對組成的特異DNA序列并裂解該序列，能夠改變由這種裂解形成的DNA片段并將這種片斷連接形成新的DNA序列。因此，同時(shí)構(gòu)建了一個(gè)表達(dá)重組酶的重組腺病毒載體和一個(gè)在相同方向具有兩個(gè)拷貝重組酶識別序列的重組腺病毒載體，這兩個(gè)載體共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，其中重組酶在載體中表達(dá)以裂解另一載體中的兩個(gè)重組酶識別序列，然后從存在于兩個(gè)重組酶識別序列之間并已被重組酶從載體中切下的DNA片斷重建，形成環(huán)形DNA分子。因此，這樣的DNA片段具有外源基因的表達(dá)單元和復(fù)制起點(diǎn)，當(dāng)它轉(zhuǎn)化成環(huán)形DNA分子后就可自主復(fù)制并永恒保持在轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中連續(xù)表達(dá)外源基因。這樣，如果將這種重組腺病毒載體系統(tǒng)應(yīng)用于基因治療中，一次注射或施用這種載體能夠在長時(shí)間內(nèi)保持療效。
基于這些新發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行了進(jìn)一步研究完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞的重組DNA病毒載體(1)，它包括啟動(dòng)子、重組酶基因和poly(A)序列。
本發(fā)明的另一目的是提供一種按照上述載體(1)的重組DNA病毒載體(2)，其中所述DNA病毒載體為腺病毒載體。
再者，本發(fā)明的另一目的是提供一種按照上述載體(2)的重組DNA病毒載體(3)，其中所述重組酶基因是得自E.Coli P1噬菌體的重組酶Cre基因。
再者，本發(fā)明的另一目的是提供一種轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞的重組DNA病毒載體(4)，它包括兩個(gè)重組酶識別序列、在動(dòng)物細(xì)胞中可操作的復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、外源基因和poly(A)序列，所述復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、外源基因和poly(A)序列都位于兩個(gè)重組酶識別序列之間。
再者，本發(fā)明的另一目的是提供一種按照上述載體(4)的重組DNA病毒載體(5)，其中所述DNA病毒載體為腺病毒載體。
再者，本發(fā)明的另一目的是提供一種按照載體(5)的重組DNA病毒載體(6)，其中所述復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、外源基因和poly(A)序列依此順序位于兩個(gè)重組酶識別序列之一的上游。
再者，本發(fā)明的另一目的是提供一種按照上述載體(5)的重組DNA病毒載體(7)，其中所述外源基因、poly(A)序列、復(fù)制起點(diǎn)、和啟動(dòng)子依此順序位于兩個(gè)重組酶識別序列之一的上游。
再者，本發(fā)明的另一目的是提供一種按照上述載體(4)-(7)之任一的重組DNA病毒載體(8)，其中所述重組酶識別序列是編碼loxP的DNA序列，它是重組酶Cre的底物。
再者，本發(fā)明的另一目的是提供一種按照上述載體(4)-(8)之任一的重組DNA病毒載體(9)，其中所述復(fù)制起點(diǎn)來自病毒或動(dòng)物細(xì)胞。
再者，本發(fā)明的另一目的是提供一種按照上述載體(9)的重組DNA病毒載體(10)，其中所述復(fù)制起點(diǎn)選自乳多空病毒、皰疹病毒、腺病毒、痘病毒和細(xì)小病毒的復(fù)制起點(diǎn)。
再者，本發(fā)明的另一目的是提供一種按照上述載體(1)-(10)之任一的重組DNA病毒載體(11)，其中所述啟動(dòng)子和poly(A)序列包含在一雜合啟動(dòng)子(CAG啟動(dòng)子)中，后者包括巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子、雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、和兔β-珠蛋白縫接受體和poly(A)序列。
再者，本發(fā)明的另一目的是提供一種向動(dòng)物細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因的方法(12)，其包括下列步驟用含啟動(dòng)子、重組酶基因和poly(A)序列的重組DNA病毒載體，和含有兩個(gè)重組酶識別序列、在所述動(dòng)物細(xì)胞中可操作的復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、外源基因和poly(A)序列的重組DNA病毒載體共轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞，所述復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、外源基因和poly(A)序列位于兩個(gè)重組酶識別序列之間；切下含有所述復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、外源基因和poly(A)序列的DNA片段，形成環(huán)形DNA分子；及所述環(huán)形DNA分子在共轉(zhuǎn)染的動(dòng)物細(xì)胞中自主復(fù)制。
再者，本發(fā)明的另一目的是提供一種按照上述方法(12)的向動(dòng)物細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因的方法(13)，其中兩個(gè)DNA病毒載體均為腺病毒載體。
再者，本發(fā)明的另一目的是提供一種向細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)人基因的方法，其包括在基因治療中使用上述方法(12)或(13)。


圖1表示用各種重組腺病毒載體結(jié)合轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞或CV-1細(xì)胞，從轉(zhuǎn)染細(xì)胞中回收DNA，用HindIII消化所回收的DNA，處理后的DNA進(jìn)行電泳，分離DNA片段，并進(jìn)行Southern印跡分析所得到的結(jié)果。圖中符號的意義如下M道分子標(biāo)識1道僅加培養(yǎng)基的CV-1細(xì)胞；2道用缺失E3、E1A和E1B區(qū)且無外源基因的腺病毒載體和實(shí)施例1中構(gòu)建的其中已插入了重組酶Cre基因和CAG啟動(dòng)子的重組腺病毒載體共同轉(zhuǎn)染的CV-1細(xì)胞；3道用實(shí)施例2中構(gòu)建的腺病毒載體AdexlLCAHBsSL和缺失E3、E1A和E1B區(qū)且無外源基因的腺病毒載體共同轉(zhuǎn)染的CV-1細(xì)胞；4道用載體AdexlLCABsSL和實(shí)施例1中構(gòu)建的其中已插入了重組酶Cre基因和CAG啟動(dòng)子的重組腺病毒載體一起轉(zhuǎn)染的CV-1細(xì)胞；5道同1道方法轉(zhuǎn)染的COS-1細(xì)胞；6道同2道方法轉(zhuǎn)染的COS-1細(xì)胞；7道同3道方法轉(zhuǎn)染的COS-1細(xì)胞；8道同4道方法轉(zhuǎn)染的COS-1細(xì)胞。
下面將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
本發(fā)明中所用的DNA病毒載體可以是來自諸如腺病毒的DNA病毒，感染后可僅在染色體外生存的任何載體。可以不加任何限制地使用這種DNA病毒衍生的載體。這種載體的實(shí)例包括腺病毒載體、牛痘苗病毒載體和乳多空病毒載體。
以下將用腺病毒載體來說明本發(fā)明，它是轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞的DNA病毒載體的優(yōu)選實(shí)例，而且它帶有重組酶基因或重組酶識別序列。
用于本發(fā)明的腺病毒是利用動(dòng)物作為天然宿主的腺病毒，特別優(yōu)選的腺病毒是以人為宿主的人腺病毒。人腺病毒基因組是一約36kbp的雙鏈線性DNA，它具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，在兩端都有一約100bp的反向重復(fù)序列，此DNA鏈還有兩個(gè)由E2B基因產(chǎn)物加工而成的55K蛋白，它們共價(jià)連結(jié)在DNA鏈的兩個(gè)5’末端。
用于本發(fā)明的腺病毒基因組缺失E1區(qū)，特別是E1A區(qū)。這是因?yàn)镋1A區(qū)與腺病毒的腫瘤轉(zhuǎn)形變異(trcansformation)活性有關(guān)，通過缺失E1A區(qū)，使得腺病毒成為非毒性的，僅選擇性地表達(dá)整合在基因組中的外源基因。不必要缺失整個(gè)E1A區(qū)，僅缺失部分E1A區(qū)，特別是僅缺失E1A區(qū)中1.3％到9.3％的片段就可以達(dá)到上述所需目的。
而且，用于本發(fā)明的腺病毒基因組還可缺失E3區(qū)。特別是，優(yōu)選缺失E3區(qū)的79.6％到84.8％的片段，因?yàn)檫@些節(jié)段對腺病毒的復(fù)制不是必需的。
因此，本發(fā)明所用腺病毒的特征在于該腺病毒在一般宿主細(xì)胞中不能繁殖，但來自人胎兒腎的細(xì)胞系(293細(xì)胞系)除外，在此細(xì)胞系中持續(xù)表達(dá)E1A和E1B基因。
本發(fā)明所用的重組腺病毒載體顆?？梢愿哌_(dá)108-109pfu〔(空斑形成單位)/ml〕的滴度水平在293細(xì)胞系中繁殖，如同在野生細(xì)胞株中一樣。當(dāng)在其它細(xì)胞或動(dòng)物組織上轉(zhuǎn)染時(shí)，此病毒顆粒高效侵襲到細(xì)胞中，病毒基因組轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中。但是此腺病毒載體缺少E1基因，要由E1A基因產(chǎn)物激活的腺病毒自身啟動(dòng)子因而無法操作。另一方面，整合在腺病毒基因組中的外源基因可由同樣整合在腺病毒基因組中的外源啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。因此，本發(fā)明所用的重組腺病毒顆?？蓪⑻烊幌俨《净蚪M引起的不利影響減至最小，而重組腺病毒載體中的外源基因可在各種動(dòng)物細(xì)胞中有效地表達(dá)。
雖然人腺病毒野生株感染后僅在人細(xì)胞中繁殖，但本發(fā)明的重組腺病毒中的外源基因可在寬范圍的細(xì)胞和組織中表達(dá)。這是因?yàn)楸景l(fā)明的重組腺病毒可有效地作為表達(dá)載體，甚至在一般腺病毒無法繁殖的細(xì)胞中也是如此，只要此重組腺病毒顆粒能感染并侵入此細(xì)胞。
本發(fā)明的重組腺病毒的基因組不能在染色體外復(fù)制，僅在細(xì)胞核中保持兩周到兩個(gè)月。因此，為了在長時(shí)間內(nèi)表達(dá)外源基因，要求重復(fù)施用重組腺病毒。但這樣就可能引起誘導(dǎo)形成抗體的問題。
根據(jù)本發(fā)明，構(gòu)建了一種含重組酶基因的新重組腺病毒，另一方面，還構(gòu)建了另一種新重組腺病毒，它含有兩個(gè)作為重組酶底物的重組酶識別序列，還含有目標(biāo)外源基因和復(fù)制起點(diǎn)，兩者均位于兩個(gè)重組酶識別序列之間。
兩種重組腺病毒共轉(zhuǎn)染到動(dòng)物細(xì)胞中，在其中將表達(dá)重組酶。然后，重組酶作用到兩個(gè)重組酶識別序列上。將其裂解，再形成環(huán)狀DNA分子。這樣，所形成的環(huán)狀DNA分子含有復(fù)制起點(diǎn)和外源基因，可以在共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中自主復(fù)制，連續(xù)表達(dá)外源基因。
用于本發(fā)明的啟動(dòng)子有動(dòng)物病毒基因啟動(dòng)子和動(dòng)物細(xì)胞基因啟動(dòng)子。動(dòng)物病毒基因啟動(dòng)子的實(shí)例包括SV40基因啟動(dòng)子和腺病毒主要晚期基因啟動(dòng)子。動(dòng)物細(xì)胞基因啟動(dòng)子的實(shí)例包括胸苷激酶基因啟動(dòng)子、金屬硫蛋白(metallothionein)基因啟動(dòng)子和免疫球蛋白基因啟動(dòng)子。本發(fā)明中特別有利的啟動(dòng)子是CAG啟動(dòng)子。CAG啟動(dòng)子是一種雜合啟動(dòng)子，它含有巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子、雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、和兔β-株蛋白縫接受體和poly(A)序列。日本專利申請公開No.3(1991)-168087中報(bào)導(dǎo)CAG啟動(dòng)子是一種高度表達(dá)載體?？赏ㄟ^從以上公開說明書第13頁22行到第20頁14行及第22頁第1行到第25頁第6行中描述的質(zhì)粒pCAGGS，用限制酶SalI和HindIII將其切下，來構(gòu)建CAG啟動(dòng)子。如此構(gòu)建的CAG啟動(dòng)子可用于本發(fā)明。
用于本發(fā)明的重組酶是一種特異性DNA重組酶，能夠識別并裂解特異DNA序列，交換所形成的DNA片段并將它們重新連結(jié)。這種酶例如有E.Coli的噬菌體P1編碼的重組酶Cre。此酶的底物是噬菌體P1中LoxP的DNA序列〔Abremski等，J.Biol.Chem.，1984，1509-1514和Hoess等，P.N.A.S.，1984，81，1026-1029〕。即，LoxP DNA序列是重組酶Cre的識別序列。重組酶的另一實(shí)例是由來自酵母2μ-質(zhì)粒的FLP基因編碼的重組酶〔JamesR.Broarch等，Cell，29，227-234〕。另外，還可以使用來自Luxii裂殖酵母的pSR1質(zhì)粒的重組酶。該重組酶是由R基因編碼的〔Matsuzaki等，Molecular and Cellular Biology，8，955-962(1988)〕。本發(fā)明特別優(yōu)選來自噬菌體P1的重組酶，即重組酶Cre。
用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增噬菌體P1 DNA中編碼重組酶基因的序列，可制備重組酶Cre基因。以相似方式，用PCR方法可制備其它重組酶基因。選擇用于PCR方法中的引物，使得能夠擴(kuò)增編碼整個(gè)重組酶基因序列的序列。為了方便地構(gòu)建重組腺病毒載體，優(yōu)選在每個(gè)引物末端提供一個(gè)適當(dāng)?shù)南拗菩晕稽c(diǎn)。
重組酶的識別序列一般是幾十個(gè)bp的序列。例如，LoxP序列由34bp組成，由Abremski等(J.Biol.Chem.，1984，1509-1514)和Hoess等(P.N.A.S.，1984，81，1026-1029)鑒別了其核苷酸序列。因此，可以按常規(guī)方法化學(xué)合成此重組酶基因供本發(fā)明使用。
對本發(fā)明中所用的poly(A)序列沒有特別限制，但特別優(yōu)選兔β-珠蛋白衍生的序列。
在本發(fā)明中，將一核轉(zhuǎn)移信號序列與重組酶基因一起引入腺病毒載體是有利的。腺病毒載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中后，在細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄重組酶，然后分泌到核外。因此，為了使表達(dá)后的重組酶作用于另一腺病毒載體中的重組酶識別序列，必須將重組酶再轉(zhuǎn)移回細(xì)胞核中。核轉(zhuǎn)移信號序列加速重組酶向細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)移〔Daniel Kalderson等，Cell，39，499-509(1984)〕。
用于本發(fā)明的可在動(dòng)物細(xì)胞中操作的復(fù)制起點(diǎn)可以來自病毒和動(dòng)物細(xì)胞。病毒來源的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例包括來自乳多空病毒、皰疹病毒、腺病毒、痘病毒和細(xì)小病毒的那些。作為來自乳多空病毒的復(fù)制起點(diǎn)，有來自SV40的復(fù)制起點(diǎn)。
將這些復(fù)制起點(diǎn)引入本發(fā)明的重組腺病毒載體中，從而用重組酶切下的環(huán)狀DNA分子可以在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中自主復(fù)制。
對用于本發(fā)明的外源基因沒有特別限制，只要此基因在上述雜合啟動(dòng)子(CAG啟動(dòng)子)或其它啟動(dòng)子控制下可表達(dá)即可。鑒于實(shí)用性，優(yōu)選實(shí)例包括在患者體內(nèi)有缺陷的正?；?，如腺苷脫氨酶、dystrophin、低密度脂蛋白受體、α-1抗胰蛋白酶、凝血因子VIII或凝血因子IX和α或β-半乳糖苷酶；細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素1到12，干擾素α、β或γ，腫瘤壞死因子α或β，粒細(xì)胞集落剌激因子，粒巨細(xì)胞集落剌激因子，紅細(xì)胞生成素，生長激素，胰島素和類胰島素生長激素；神經(jīng)營養(yǎng)因子；非自身抗原基因如allo-HLA(HLA-B7)；編碼病毒抗原的核苷酸序列；抗癌基因如p53、RB、WT-1、NM23和NF-1；反義癌基因如Ras序列；和自殺基因如胸苷激酶和胞苷脫氨酶。
復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、外源基因和poly(A)序列都插入在腺病毒載體中兩個(gè)重組酶識別序列之間，一般按此順序位于兩個(gè)重組酶識別序列之一的上游。
但也可以按外源基因、poly(A)序列、復(fù)制起點(diǎn)和啟動(dòng)子的順序位于兩個(gè)重組酶識別序列之一的上游。一旦用重組酶形成環(huán)狀DNA分子將它們包含于其中時(shí)，以上兩種順序相互沒有區(qū)別。
當(dāng)將本發(fā)明應(yīng)用于基因治療時(shí)，動(dòng)物細(xì)胞被兩種重組腺病毒載體共轉(zhuǎn)染，一種表達(dá)重組酶，另一種帶有兩個(gè)重組酶識別序列，還帶有位于兩個(gè)重組酶識別序列之間的啟動(dòng)子、外源基因和poly(A)序列。兩種載體的轉(zhuǎn)染可以同時(shí)進(jìn)行或相繼進(jìn)行，因?yàn)檗D(zhuǎn)移到動(dòng)物細(xì)胞中的DNA載體保持穩(wěn)定一個(gè)月以上。
共同轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中以后，表達(dá)重組酶的重組腺病毒載體持續(xù)表達(dá)重組酶一段時(shí)間，從而持續(xù)產(chǎn)生重組酶。所產(chǎn)生的重組酶作用于另一共轉(zhuǎn)染的帶有兩個(gè)重組酶識別序列的重組腺病毒載體，切下位于兩個(gè)重組酶識別序列之間的DNA片段，形成環(huán)狀DNA分子。此環(huán)狀DNA分子具有在動(dòng)物細(xì)胞中可操作的復(fù)制起點(diǎn)，因此在共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中自主復(fù)制，連續(xù)表達(dá)外源基因。因此，這兩種腺病毒載體的僅一次共轉(zhuǎn)染可以幾乎永恒地持續(xù)顯示預(yù)期的治療效果。因而相信本發(fā)明的重組腺病毒載體在基因治療中極其有效。
本發(fā)明的基因治療可應(yīng)用于廣泛的人和動(dòng)物細(xì)胞，如高度分化的人和哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞、肌肉系統(tǒng)細(xì)胞、肝細(xì)胞、未分化的的上皮細(xì)胞和成纖細(xì)胞。
以下解釋構(gòu)建本發(fā)明腺病毒的方法1.首先解釋帶有啟動(dòng)子、重組酶基因和poly(A)序列的重組腺病毒載體的構(gòu)建方法。
構(gòu)建本發(fā)明的重組腺病毒載體特別困難，因?yàn)槿缟纤?，腺病毒基因組在其兩端帶有共價(jià)連結(jié)的蛋白質(zhì)。
因此，本發(fā)明中優(yōu)選使用下列步驟，其中就重組酶Cre基因作為重組酶基因而論。這些步驟也可以相似方式用于其它重組酶基因。
(1)用PCR方法擴(kuò)增后的重組酶Cre基因和質(zhì)粒pUC19(Takara Shuzo Co.Ltd.，Japan)同時(shí)用限制酶PstI和XbaI(Takara Shuzo Co.Ltd，Japan)消化。將形成的產(chǎn)物混合并連接，得到其中引入了重組酶Cre基因的質(zhì)粒pUCCre。
(2)按照SAIBO KOGAKU(Cell Engineering，13，760-763(1994))描述的方法制備的，帶有CAG啟動(dòng)子的盒式粘性質(zhì)粒pAdexl CAwt用限制酶Swa I(Boehringer，Germany)消化。將消化產(chǎn)物與質(zhì)粒pUCCre用限制酶PstI和XbI(Takara Shuzo Co.Ltd.，Japan)消化的產(chǎn)物混合，然后用Klenow酶(Takara shuzoCo.Ltd.，Japan)補(bǔ)平。然后，沉淀DNA片段，用T4 DNA連接酶連接，得到其中引入了重組酶Cre基因的盒式粘性質(zhì)粒。
當(dāng)使用CAG啟動(dòng)子以外的啟動(dòng)子時(shí)，首先從全長腺病毒基因組(36kb)制備帶有缺失E3區(qū)(1.9kb)(對復(fù)制不是必需的)和E1A·E1B區(qū)(2.9kb)的約31kb的基因組DNA。另一方面，制備含啟動(dòng)子、重組酶Cre基因和poly(A)序列的質(zhì)粒，用適當(dāng)?shù)南拗泼赶速|(zhì)粒，得到重組酶Cre基因表達(dá)單元。將此單元插入在腺病毒基因組的E1A·E1B缺失位點(diǎn)，得到盒式粘性質(zhì)粒。
(3)這樣得到的盒式粘性質(zhì)粒用λ體外裝試劑盒Gigapack XL(Stratagene Co.Ltd.，USA)進(jìn)行體外包裝。
(4)另外，制備腺病毒DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物(Ad5dlX DNA-TPC)。使用載體Ad5dlX(I.Saito等，J.Virology，vol.54，711-719(1985))作為腺病毒DNA。以10Roux管的量用載體Ad5dlX感染HeLa細(xì)胞，然后培養(yǎng)?；厥詹《绢w粒，用鹽酸胍處理，進(jìn)行超速離心，分離回收DNA-TPC復(fù)合物。
這樣得到的Ad5dlX DNA-TPC復(fù)合物用足量的EcoT22I處理，按以下步驟制備重組腺病毒。
(5)最后一步，將其中引入了重組酶Cre基因的盒式粘性質(zhì)粒與事先用EcoT22I處理過的Ad5dlX DNA-TPC復(fù)合物混合，形成的混合物按磷酸鈣法用Celfect Kit(Pharmacia)轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中。從因所轉(zhuǎn)染的病毒繁殖而死之的細(xì)胞中回收病毒溶液，得到帶有啟動(dòng)子、重組酶基因和poly(A)序列的重組腺病毒載體。
2.下面描述另一重組腺病毒載體的構(gòu)建方法，它帶有兩個(gè)重組酶識別序列，以及位于兩個(gè)重組酶識別序列之間的復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、外源基因和poly(A)序列。為方便起見，下面描述使用SV40的復(fù)制起點(diǎn)的情況。
(a)首先構(gòu)建表達(dá)目標(biāo)外源基因的盒式粘性質(zhì)粒。
(1)在克隆位點(diǎn)向帶有CAG啟動(dòng)子的質(zhì)粒pCAGGS(Niwa等，Gene，108，193-200，1990)中插入SwaI接頭，制備質(zhì)粒pCAWG。該質(zhì)粒用SwaI消化，然后用堿性磷酸酯酶處理。然后將目標(biāo)外源基因與生成的pCAWG混合，用連接酶處理。用此產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.Coli DHI菌株(ATCC 33849)，得到一質(zhì)粒，其中外源基因在CAG啟動(dòng)子控制下表達(dá)。
(2)制備帶有外源基因表達(dá)單元(其中外源基因在CAG啟動(dòng)子控制下表達(dá))以及SV40復(fù)制起點(diǎn)的DNA片段。上述(1)中得到的質(zhì)粒用限制酶SapI和SalI消化，用Klenow酶補(bǔ)平，然后進(jìn)行電泳得到目標(biāo)DNA片段。將回收的DNA片段與預(yù)先用限制酶SmaI消化的質(zhì)粒pUC18(Takara Shuzo Co.Ltd.，Japan)混合，然后用堿性磷酸酯酶處理。形成的產(chǎn)物用連接酶處理，得到具有外源基因表達(dá)單元和SV40的復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒。
(3)為了向含有表達(dá)單位和SV40的復(fù)制起點(diǎn)的DNA片段的兩端增加loxP序列，進(jìn)行下列步驟。
質(zhì)粒pUC119(Takara Shuzo Co.Ltd.，Japan)用限制酶Ec1136II消化。用堿性磷酸酯酶處理后，消化的質(zhì)粒與帶有l(wèi)ox P序列的合成DNA片段(SEQ ID No3)連接，后者在末端具有MluI位點(diǎn)和XhoI位點(diǎn)，設(shè)計(jì)這些位點(diǎn)是為了連接后從每個(gè)MluI和XhoI位點(diǎn)形成NruI位點(diǎn)。這樣，得到了含有插入的兩個(gè)合成DNA片段的質(zhì)粒。
此質(zhì)粒用限制酶NruI消化并用堿性磷酸酯酶處理后，處理過的質(zhì)粒與以上(2)中構(gòu)建的質(zhì)粒用限制酶SalI和Ec1136II消化所得DNA片段連接，然后補(bǔ)平。這樣，得到了一質(zhì)粒，它帶有含外源基因表達(dá)單元和SV40的復(fù)制起點(diǎn)還在兩端含有l(wèi)oxP位點(diǎn)的DNA片段。
(4)然后進(jìn)行下列步驟，以得到含下述DNA片段的重組粘性質(zhì)粒，該DNA片段含有外源基因表達(dá)單元和SV40的復(fù)制起點(diǎn)及在兩端還含有l(wèi)oxP位點(diǎn)。
首先，用限制酶SmaI和EcoRI消化上述(3)中所得質(zhì)粒，并用Klenow酶補(bǔ)平。產(chǎn)物在電泳上純化，以制備含外源基因表達(dá)單元和SV40的復(fù)制起點(diǎn)且在兩未端含有l(wèi)oxP位點(diǎn)的DNA片段。另一方面，載體pAdexlcw〔SAIBO KOGAKU(Cedl Engineering)，13，760-763，1994〕用限制酶SwaI消化。將上述制備的片段和盒式粘性質(zhì)?；旌喜⒊恋?。此DNA混合物用T4 DNA連接酶的連接，得到含有下述DNA片段的盒式粘性質(zhì)粒，此DNA片段含有外源基因表達(dá)單元和SV40的復(fù)制起點(diǎn)，在兩端還含有l(wèi)oxP位點(diǎn)。
(b)構(gòu)建具有下述片段的重組腺病毒載體，所述片段含有兩個(gè)loxP序列，還含有位于兩個(gè)loxP序列之間的復(fù)制起點(diǎn)、CAG啟動(dòng)子和外源基因。
本發(fā)明的重組腺病毒載體可用上述1.(3)到(5)中的相同方法制備。
帶有啟動(dòng)子、重組酶基因和poly(A)序列的重組腺病毒載體和帶有SV40的復(fù)制起點(diǎn)、外源基因表達(dá)單元和兩個(gè)未端的loxP序列的另一重組腺病毒載體可有效地用于治療各種疾病，包括遺傳疾病。更詳細(xì)地講，將含有本發(fā)明的兩種重組腺病毒載體的高滴度病毒溶液適當(dāng)?shù)叵♂專♂屓芤航?jīng)適當(dāng)途徑給藥，例如，局部(中樞神經(jīng)系統(tǒng)、門靜脈)、口服(用腸衣)、吸入、皮下等。
下列將參照實(shí)施例和參考實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明，但無意去限制它。
除非另有說明，實(shí)施例中進(jìn)行的操作噬菌體、質(zhì)粒、DNA、各種酶、E、Coli、培養(yǎng)細(xì)胞等等的各種步驟都是根據(jù)Molecular Cloning，A Laboratory Manual(T.Maniatis等編，第二版(1989)，ColdSpring Harbor Laboratory)中描述的方法的改進(jìn)。DNA限制酶和修飾酶購自Takara Shuzo Co.Ltd.，New England Biolabs(NEB)，Stratagene或Boebringer，并按照它們的說明使用。
實(shí)施例1構(gòu)建帶有重組酶Cre基因和CAG啟動(dòng)子的重組腺病毒載體(1)構(gòu)建表達(dá)重組酶Cre基因的盒式粘性質(zhì)粒1)用含重組酶Cre基因的E.Coli噬菌體P1 DNA(ATCC11303-B23)作為模板，下述寡核苷酸(SEQ ID No1)作為5’-引物，下述寡核苷酸(SEQ ID No2)作為3’-引物，VentR(NEB)作為聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)的詳細(xì)條件將在下文描述。將產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，從瓊脂糖凝膠上切下顯示約1kb的帶，得到含重組酶Cre基因的約1kb的DNA片段。
5 ′-引物5′-CGT CTGCAG TGCA TCATGA GTAATTTACTGACCGTACACCAAAATTTGCCTGC-3′PstIBspHI3′-引物3′-GACCTTCTACCGCTAATCGGTAAT TCGCGAGATCT CGG-5′Aor51HI；XbaI劃線部分指限制酶的識別位點(diǎn)。PCR的條件緩沖液10mM KCl，20mMTris-HCl(pH8.8)，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％Triton.X-100
(使用NEB提供的緩沖液)聚合酶2單位dNTP400μM引物1μMP1噬菌體DNA1ng雙鏈解旋溫度1.5分鐘退火溫度1.5分鐘鏈延伸反應(yīng)溫度2.0分鐘反應(yīng)循環(huán)20次這樣得到的DNA片段和pUC19(Takara Shuzo Co.Ltd.，Japan)分別都用限制酶RstI(Takara Shuzo Co.Ltd.，Japan)和XbaI(Takara Shuzo Co.Ltd.，Japan)消化，回收消化產(chǎn)物，將DNA片段產(chǎn)物與pUC19產(chǎn)物以摩爾比約3∶1相互混合。然后混合物用T4 DNA連接酶(Takara Shuzo Co.Ltd.，Japan)連接。反應(yīng)混合物用于轉(zhuǎn)化E.Coli JM109株(ATCC 53323)。處理后的E.Coli細(xì)胞接種在用100μg/ml氨芐青霉素補(bǔ)充的LB瓊脂板上，選擇在此瓊脂上生長的轉(zhuǎn)化子，得到帶有重組酶Cre基因的質(zhì)粒pUCCre。
然后，已按SAIBO KOGAKU(Cell Engineering)，13，760-763(1994)描述的方法制備的含CAG啟動(dòng)子的盒式粘性質(zhì)粒pAdexl-cAwt用SwaI消化。再將1μg消化產(chǎn)物與0.1μg的約1kb DNA片段混合，此DNA片段是通過質(zhì)粒pUCCre用PstI和XbaI消化并用Klenow酶(Takara Shuzo Co.Ltd.，Japan)補(bǔ)平后得到。
這里所用的CAG啟動(dòng)子是日本專利申請公開No.3(1991)-168087中公開的一種高度表達(dá)載體。從上述公開說明書第13頁20行到20頁14行及第22頁1行到25頁16行中描述的質(zhì)粒pCAGGS用限制酶SalI和HindIII酶切，可制備CAG啟動(dòng)子。這樣制得的CAG啟動(dòng)子可用于本發(fā)明。
2)向上步得到的混合物中加入乙醇沉淀粘性質(zhì)粒。離心回收沉淀，溶于5倍稀釋的TE溶液(10mM Tris-HCl(pH7.5)，1mMEDTA)。
3)所得含粘性質(zhì)粒的溶液用緩沖溶液中的ATP和T4 DNA連接酶在終體積7μl內(nèi)進(jìn)行連接反應(yīng)過夜。向其中加入無菌水和Swal反應(yīng)的緩沖液，使體積達(dá)48μl。然后于70℃加熱10分鐘使連接酶失活。
不像質(zhì)粒，粘性質(zhì)?？梢杂行У匕b相互以線性銜接形式而不是環(huán)形連接而成的大分子DNA。
4)加入2μl Swal(Boehringer，Germany)后，于25℃將粘性質(zhì)粒消化1小時(shí)。下面給出用Swal消化粘性質(zhì)粒的原因。
如果其中不包含表達(dá)單元的盒式粘性質(zhì)粒再連接，將再生Sw-al識別位點(diǎn)。因此，用Swal消化可以再裂解不包括表達(dá)單元的粘性質(zhì)粒，結(jié)果沒有菌落形成。這是僅選擇含有插入序列的盒式粘性質(zhì)粒的有效方法。
5)按照Molecular Cloning，vol，3，E.34中描述的常規(guī)方法，將盒式粘性質(zhì)粒進(jìn)行苯酚萃取、離心和凝膠過濾。
6)再用Swal消化。即向緩沖液中加入5μl Swal，進(jìn)行Swal反應(yīng)，于25℃裂解粘性質(zhì)粒2小時(shí)。進(jìn)行裂解的原因如上所述。
7)將形成的粘粒(1μl)進(jìn)行體外包裝。
即使用1/4量的λ體外包裝試劑盒Gigapack XL(StratageneCo.Ltd.，USA)，平衡鹽溶液于-80℃冷凍。因?yàn)镚igapack XL對42kb或及小的粘性質(zhì)粒提供的包裝效率低，該試劑盒在一定程度上選擇因包含插入序列而變大的粘性質(zhì)粒。在此實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)挑出10個(gè)菌落時(shí)，其中大部分含有插入序列。因此，可以方便地得到具有預(yù)期定向(即，左側(cè)方向，指從E3基因區(qū)到E1基因區(qū)的方向)的克隆。
按照Izumu Saito等在JIKKEN IGAKU(ExperimentalMedicinc)，vol.7，183-187(1989)中描述的常規(guī)方法操作粘性質(zhì)粒。
8)將包裝的粘性質(zhì)粒感染到E.Coli DH1菌株(ATCC 33849)中。
即，將粘性質(zhì)粒以1/200，1/20，1/2的量及平衡鹽溶液接種到三個(gè)(Ap+)補(bǔ)以氨芐青霉素瓊脂板上和5ml Ap+LB(管)中，然后培養(yǎng)過夜。
由試管LB培養(yǎng)中，用miniprep試劑盒中提取并制備了少量純化的(miniprep)DNA。用全酶消化法測定含插入序列的粘性質(zhì)粒。結(jié)合瓊脂板挑出菌落，在1.5ml Ap+LB中培養(yǎng)過夜，用miniprep試劑盒制備少量純化的DNA。
9)用限制酶消化證實(shí)了包含在粘性質(zhì)粒中的表達(dá)單元的定向和結(jié)構(gòu)。
即，用NruI和連接酶制備了含表達(dá)單元但缺失大部分腺病毒DNA的質(zhì)粒，從該質(zhì)粒制備了DNA片段，以最終用cDNA克隆證實(shí)。
(2)制備腺病毒DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物(Ad5 dlX DNA-TPC)1)作為腺病毒DNA，使用載體Ad5 dlX(I、Saito等，J.Virol-ogy，vol.54，711-719(1985)).將載體Ad5 dlX DNA以10 Roux管的量感染到HeLa細(xì)胞中，然后孵育。
即，Ad5-dlX的病毒溶液(～109PFU/ml/)以0.2ml/Roux管的量感染。三天后，于1500rpm離心5分鐘收集脫膜細(xì)胞。大部分腺病毒顆粒不存在于培養(yǎng)基中，而在細(xì)胞核中，因此可有利地從感染細(xì)胞中純化病毒。
無菌條件下進(jìn)行下列步驟。
2)將這樣得到的細(xì)胞懸浮在20ml 10mM Tris-HCl(pH8.0)中，用密封型超聲儀于200W超聲處理2分鐘(30秒×4)，以破壞細(xì)胞從而釋放病毒。
為了從細(xì)胞中釋放病毒，當(dāng)細(xì)胞懸液體積為5ml或更少時(shí)，5次冷凍—熔化即可。但是當(dāng)體積較大時(shí)，用超聲儀釋放病毒是有利的。此時(shí)必須使用帶有專用杯的密封型超聲儀。普通的投入型是危險(xiǎn)的，既使在安全箱中進(jìn)行操作也是如此。
3)10Krpm離心10分鐘除去細(xì)胞碎片以后，將上清液置于裝在離心機(jī)(SW28管)中的15ml氯化銫溶液(比重為1.43)上，然后離心濃縮(25Krpm，1小時(shí)，4℃)。
4)將界面上的病毒帶轉(zhuǎn)入SW50.1管中。肉眼觀察緊在界面下的病毒層，收集了5ml病毒帶。同時(shí)，另一管中充滿氯化銫溶液(比重1.34)。
將這些管于4℃ 35Krpm離心過夜。然后，收集形成的病毒帶，轉(zhuǎn)移到預(yù)先形成梯度的管中。再將此管進(jìn)行4℃35Krpm超速離心4小時(shí)。
5)收集病毒帶，與等量的8M鹽酸胍混合。再向混合物中加入4M鹽酸胍飽和的氯化銫。將形成的混合物裝入VTi65管中。顆粒蛋白用4M鹽酸胍變性使解離，從而釋放DNA-TPC復(fù)合物。在此實(shí)驗(yàn)中不能用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓，因?yàn)檫€沒有建立起除去該物質(zhì)的方法。
6)上述管于15℃55Krpm進(jìn)行超速離心過夜，然后每0.2ml分部分離。從每場中吸出1μl，與1μg/ml溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶翁水溶液混合，以用熒光染色證實(shí)DNA存在與否。收集含DNA的2/3流份。
7)將這些流份對500mlTE透析過夜兩次，然后于-80℃貯存。用常規(guī)方法以O(shè)D260值為基礎(chǔ)測定所得Ad5 dlX DNA-TPC的量。
8)形成的Ad5 dlX DNA-TPC復(fù)合物用足量的EcoT22I消化2小時(shí)，然后于-80℃保存用于下面第(3)步中構(gòu)建重組腺病毒載體。
同時(shí)，DNA-TPC復(fù)合物可進(jìn)行限制酶消化、透析和凝膠過濾，但未能進(jìn)行電泳、苯酚處理和乙醇沉淀。氯化銫平衡離心僅作為一種濃縮方法。因此，DNA-TPC復(fù)合物系統(tǒng)保持在盡可能高的濃度。從10Roux管的染感細(xì)胞中得到的300μg DNA-TPC復(fù)合物。
9)收集1份DNA-TPC復(fù)合物溶液，加入10ml電泳BPB緩沖液。然后，向此混合物中加入1μl蛋白酶K(10mg/ml)。形成的混合物于37℃孵育10分鐘，將DNA-TPC復(fù)合物中的末端蛋白消化。苯酚萃取后，在瓊脂糖凝膠上電泳分離上清液，以證實(shí)完全消化。
離心凝膠過濾除去EcoT22I消化的DNA-TPC中的限制酶緩沖液，形成的產(chǎn)物分開放入幾個(gè)管中，于-80℃貯存。
(3)分離重組病毒，制備高滴度病毒溶液1)向直徑6cm和10cm的Petri皿中加入在補(bǔ)以10％FCS的DME中培養(yǎng)的293細(xì)胞系。
2)將8μg(3-9μg為宜)其中引入了表達(dá)單元的pAdexlw DNA與1μg先用EcoT22I消化過的Ad5dlX DNA-TPC復(fù)合物混合，按常規(guī)磷酸鈣法用Celfeet Kit(Phamacia)將形成的混合物轉(zhuǎn)染到6cm Petri皿中的293細(xì)胞系。即，將混合物滴入6cm Petri皿中的培養(yǎng)基上，并繼續(xù)培養(yǎng)。
培養(yǎng)過夜(約16小時(shí))后，第二天早上更換培養(yǎng)基。然后在晚上將含細(xì)胞的培養(yǎng)基以0.1ml/孔的量與含5％FCS的DME一起注入三個(gè)96孔膠原包被的板的孔中(不稀釋，稀釋10倍，稀釋100倍)。為了避免每個(gè)板之間細(xì)胞計(jì)數(shù)的明顯差異，將從10cm Petri皿收獲的293細(xì)胞的三分之一加入到兩個(gè)稀釋溶液的板上。
3)3-4天后及8-10天后，再向每個(gè)孔中加入50μl含10％FCS的DME。當(dāng)293細(xì)胞系變稀時(shí)，盡早向孔中加入含10％FCS的DME。
在7-15天觀察其中病毒繁殖細(xì)胞死亡的孔。從每個(gè)其中細(xì)胞完全死亡的孔中，用無菌巴斯德移液管將含死細(xì)胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到1.5ml無菌管中。迅速冷凍此管，于-80℃保存。
4)在15-18天內(nèi)觀察結(jié)束。從裝有含有較晚期死亡之細(xì)胞的培養(yǎng)基的管中選出約10個(gè)管。重復(fù)6次冷凍—熔化后，于5Krpm進(jìn)行離心10分鐘。形成的上清液作為第一批種子于-80℃保存。
其中病毒在早期開始繁殖的孔表示多個(gè)病毒株混合感染的可能性大。
5)將293細(xì)胞系置于-24孔板中，向孔中加入雙份的5％FCS-DME(0.4ml/孔)和10μl第一批病毒種子。
6)當(dāng)在約3天內(nèi)細(xì)胞完全死亡時(shí)，從雙孔之一得到上清液，即按照與上述制備第一批病毒種子的方法相似的方法，經(jīng)6次冷凍—熔化并離心而得。將如此得到的上清液用作第二批種子于-80℃保存。第二病毒溶液的滴度為約107-108PFU/ml。將雙孔的另一孔中之死細(xì)胞5Krpm離心5分鐘，棄去上清液。將細(xì)胞單獨(dú)于-80℃保存(細(xì)胞團(tuán)塊)。收集了10個(gè)病毒株的細(xì)胞團(tuán)塊，按以下步驟從感染細(xì)胞中提取總DNA。向每個(gè)細(xì)胞團(tuán)中加入400μg TNE(50mMTris-HCl，pH7.5，100mM NaCl，10mM EDTA)，4μl蛋白酶K(10mg/ml)和4μl 10％SDS。
7)在50℃處理一小時(shí)后，用苯酚—氯仿萃取2次，然后進(jìn)行乙醇沉淀。將乙醇沉淀回收的核酸溶于50μl含20μg/ml核糖核酸酶的TE中。
15μl溶液用XhoI(它識別含CG的位點(diǎn))消化，消化產(chǎn)物與表達(dá)粘粒盒的XhoI消化產(chǎn)物一起在長約15cm的瓊脂糖凝膠上電泳過夜。比較所得圖譜。選擇這樣的克隆，它具有精確指示從表達(dá)單元中的酶切位點(diǎn)到腺病毒基因組中左側(cè)末端的DNA序列的譜帶。棄去產(chǎn)生許多指示未確定DNA序列之譜帶的克隆，因?yàn)榇嬖诖丝寺”挥腥笔У牟《疚廴镜目赡苄浴?br> 腺病毒DNA的繁殖水平一般為10,000拷貝/細(xì)胞。因此，甚至提取的總DNA包含細(xì)胞本身DNA和腺病毒DNA，用限制酶消化然后進(jìn)行電泳，也從而觀察到指示來自腺病毒DNA的DNA片段的譜帶。諸如在識別位點(diǎn)含CG的限制酶XhoI不消化細(xì)胞DNA。結(jié)果，當(dāng)進(jìn)行電泳時(shí)易于觀察和區(qū)別圖譜。當(dāng)使用其它酶時(shí)，要求以未感染的293細(xì)胞系DNA作為對照，因?yàn)闀a(chǎn)生人細(xì)胞重復(fù)序列。將消化的未感染293細(xì)胞系DNA進(jìn)行電泳觀察譜帶，它們將指示人細(xì)胞重復(fù)序列。
8)通過XhoI消化證實(shí)的第二種子溶液以0.1ml的量轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞系中，該細(xì)胞系已被放入含25ml培養(yǎng)基的150cm2膠原包被的瓶中。
當(dāng)在三天內(nèi)細(xì)胞死亡后，含死細(xì)胞的培養(yǎng)基用密封型超聲儀于最大輸出功率200W無菌處理2分鐘(30秒×4)以釋放病毒。
以3Krpm于4℃離心10分鐘除去沉淀，將所得上清液以2ml/管的量裝在13個(gè)5ml冷凍管中。這些管用干冰迅速冷卻，于-80℃保存，制得第三批種子溶液。含本發(fā)明的重組腺病毒載體的第三種子溶液顯示滴度高達(dá)109PFU/ml。
將5μl第三種子溶液轉(zhuǎn)染到24-孔板中含293細(xì)胞系的一個(gè)孔中后，繁殖后的病毒DNA用限制酶消化，然后進(jìn)行電泳。通過上文描述的步驟證實(shí)了形成的圖譜。當(dāng)存在此病毒可能與缺失病毒或親本病毒混合的任何懷疑時(shí)，棄去所有的第三種子。因?yàn)橛幸言诘诙《救芤褐幸汛嬖诘娜笔Р《驹诳蓽y水平迅速繁殖的可能性。所以用另一第二種子溶液再進(jìn)行以上步驟?；蛘?，將第一種子溶液進(jìn)行限制稀釋方法純化病毒溶液。
參考實(shí)例對本發(fā)明的重組腺病毒載體滴度的簡單測定根據(jù)下列步驟可以簡單測定本發(fā)明重組腺病毒載體的滴度。
(1)準(zhǔn)備一個(gè)直徑10cm的Petri皿裝入293細(xì)胞。
用補(bǔ)有5％FCS的DME連續(xù)稀釋重組腺病毒載體溶液(即第三種子溶液)至10-1到10-4。例如，用0.9ml DME和0.1ml病毒溶液制備此溶液。更換所有微量吸移管頭。
(2)在一膠原包被的96-孔板的每一孔中加入50μlDME。
在第一排的8個(gè)孔中，每個(gè)加入25μl稀釋至10-4的重組腺病毒載體溶液。
用8-孔板的多道吸液管將25μl載體溶液轉(zhuǎn)移到第二排的孔中。然后重復(fù)相同操作，直到第11排，將最后的25μl載體溶液棄去。結(jié)果制備了3″系列稀釋溶液直到3″×10-4。第12排中的溶液是作為對照的未感染細(xì)胞。
在此實(shí)驗(yàn)中每次使用都更換吸頭。
實(shí)施例2帶有兩個(gè)loxP序列還在兩個(gè)loxP序列之間含有SV40的復(fù)制起點(diǎn)、CAG啟動(dòng)子和乙型肝炎病毒表面抗原(HBs)的重組腺病毒載體的構(gòu)建。
(1)構(gòu)建表達(dá)乙型肝炎病毒表面抗原(HBs)的盒式粘性質(zhì)粒1)具有HBs cDNA的質(zhì)粒pHBVadr4(Fujiyama等，NucleicAcids Res.，11，4601-4610，1983)用限制酶Pspl 406I和XhoI消化，然后用Klenow酶補(bǔ)平。形成的消化質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，回收710bp的DNA片段。
2)進(jìn)行下列步驟以得到在CAG啟動(dòng)子控制下表達(dá)HBs cDNA的表達(dá)單元將SwaI接頭插入在含有CAG啟動(dòng)子的質(zhì)粒pCAGGS(Niwa等，Gene，108，193-200，1990)的克隆位點(diǎn)中，形成質(zhì)粒pCAWG.質(zhì)粒pCAWG用SwaI消化，然后用堿性磷酸酯酶處理。然后，形成的產(chǎn)物與以上1)中得到的710bp DNA片段以約1∶3的摩爾比混合?；旌衔镉肨4 DNA連接酶連接。用此反應(yīng)混合物的染E.Coli DHI株(ATCC 33849)。從補(bǔ)有氨芐青霉素的LB瓊脂板上挑出轉(zhuǎn)化子。得到質(zhì)粒pCAG·HBs，其中已正確插入了710bp DNA片段，使HBs cDNA在CAG啟動(dòng)子控制下表達(dá)。
3)進(jìn)行下列步驟以得到含HBs表達(dá)單元和SV40的復(fù)制起點(diǎn)的DNA片段。
質(zhì)粒pCAG·HBs用SspI和SalI消化，然后用Klenow酶補(bǔ)平。然后，生成的產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳回收3.6kp DNA片段。質(zhì)粒PUC18(Takara Shuzo Co.Ltd.，Japan)用限制酶SmaI消化，用堿性磷酸酯酶處理，并與3.6kb DNA片段以約1∶3的摩爾比混合。連接此混合物得到目標(biāo)質(zhì)粒pUC18CAHBsS。
4)然后進(jìn)行下列步驟以向含HBs表達(dá)單元和SV40的復(fù)制起點(diǎn)的DNA片段的兩端加入loxP位點(diǎn)。
質(zhì)粒pUC119(Takara Shuzo Co.Ltd.，Japan)用限制酶Ec1136II消化，用堿性磷酸酯酶處理。生成的產(chǎn)物與下述合成DNA片段(SEQ ID No3)連接，后者帶有l(wèi)oxP序列，在末端具有MluI位點(diǎn)和XhoI位點(diǎn)，設(shè)計(jì)此片段使得連接后從每個(gè)MluI和XhoI位點(diǎn)形成NruI位點(diǎn)。這樣得到其中插入了兩個(gè)合成DNA片段的質(zhì)粒pULL2r。
合成DNA片段5′-CGAACGCGTATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCTCGAGTCG-3′3′-GCTTGCGCATATTGAAGCATATCGTATGTAATATGCTTCAATAGAGCTCAGC-5′劃線的序列指loxP位點(diǎn)、。
上述3)中得到的pUC18CAHBsS用限制酶SalI和Ec1136II消化。消化產(chǎn)物用Klenow酶補(bǔ)平后，形成的產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，回收3.6kb的DNA片段。質(zhì)粒pULL2r用限制酶Nurl消化，用堿性磷酸酯酶處理。處理后的質(zhì)粒與3.6kb DNA片段連接，得到目標(biāo)質(zhì)粒pULCA·HBsS。
5)制備以下兩個(gè)DNA，以得到帶有兩端含loxP位點(diǎn)的DNA片段的重組粘性質(zhì)粒，該片段含有HBs表達(dá)單元和SV40的復(fù)制起點(diǎn)。
(a)質(zhì)粒pULCA·HBsS用限制酶SmaI和EcoRI消化，然后用Klanow酶將兩端補(bǔ)平。然后，產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，回收0.3μg的3.7kb DNA片段。
(b)質(zhì)粒pAdexlcw〔SAIBO KOGAKU(Cell Engineering)，13，760-763，1994〕用限制酶SwaI消化，得到1μg消化產(chǎn)物。
將上述(a)和(b)中所得兩個(gè)DNA產(chǎn)物混合，混合物用與實(shí)施例1，(1)，2)到9)的步驟相同的方法處理，得到目標(biāo)重組粘粒。
按與實(shí)施例1，(2)和(3)相似的步驟，得到了帶有兩個(gè)loxP序列，在兩個(gè)loxP序列之間還含有SV40復(fù)制起點(diǎn)、CAG啟動(dòng)子和乙型肝炎病毒表面抗原(HBs)的目標(biāo)重組腺病毒載體AdexlLCAHB-sSL。
實(shí)施例3感染實(shí)驗(yàn)COS-1細(xì)胞或CV-1細(xì)胞在一直徑6cm的Petri皿中培養(yǎng)，直到此皿的整個(gè)底表面布滿細(xì)胞。
按下列實(shí)驗(yàn)步驟將實(shí)施例1和2中制得的腺病毒載體以m.o.i＝5吸收1小時(shí)。三天后，收獲細(xì)胞，以進(jìn)行Southern印跡分析。
即，重組腺病毒載體AdexlLCAHBsSL帶有HindIII位點(diǎn)，約6.0kb，在loxP位點(diǎn)用重組酶Cre裂解后形成3.5kb的環(huán)狀DNA分子。因?yàn)樵摥h(huán)形DNA分子有一個(gè)HindIII位點(diǎn)，用HindIII處理后回收的DNA用Southern印跡分析。710bp的HBs片段用作探針。
結(jié)果示于圖1中。
從圖1中可以清楚地看出，在第4和8道觀察到了環(huán)形DNA分子用HindIII消化產(chǎn)生的3.5kb線性DNA，即只有實(shí)施例1和2中得到的兩種腺病毒載體共同轉(zhuǎn)染時(shí)才如此。
當(dāng)用實(shí)施例2中所得腺病毒載體和不含重組酶Cre基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染時(shí)，沒有觀察到3.5kb的帶，而只在第3和7道觀察到6.0kb的帶，它是從AdexlLCAHBsSL用HindIII酶切而產(chǎn)生的。
再者，比較第7和8道間的帶密度表明，環(huán)狀DNA分子在轉(zhuǎn)染的COS-1細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制40倍。另一方面，第3道與第4道的密度幾乎相同，這一事實(shí)表明環(huán)形DNA分子在CV-1細(xì)胞中不復(fù)制。這與來自SV40的復(fù)制起點(diǎn)在CV-1細(xì)胞中不起作用這一事實(shí)相符。
上述結(jié)果明顯表明，當(dāng)動(dòng)物細(xì)胞用實(shí)施例1和2中所得本發(fā)明的兩種腺病毒載體共同轉(zhuǎn)染時(shí)，位于載體中兩個(gè)重組酶識序列之間的DNA片段被切下并形成一環(huán)形DNA分子，此環(huán)形DNA分子在被轉(zhuǎn)染細(xì)胞中自主復(fù)制。
上述感染實(shí)驗(yàn)如下方便地進(jìn)行。
當(dāng)培養(yǎng)基中血清不是FCS(如為CS時(shí))，培養(yǎng)的細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基洗兩次。
在此步驟中以一定量加入病毒溶液(用無血清或FCS補(bǔ)充的培養(yǎng)基稀釋)，使細(xì)胞表面不干。對96-孔板的量約為30-40μl，對24-孔板為50-70μl，對直徑為10cm的Petri皿為100-200μl。在與病毒溶液補(bǔ)充前有意保留少量的培養(yǎng)基是切實(shí)有利的，然后再向保留的培養(yǎng)基中加入病毒溶液達(dá)到上述體積。象蹺蹺板一樣以幾秒的間隔搖動(dòng)培養(yǎng)板幾次，病毒溶液均勻分布在細(xì)胞上。此操作每20分鐘進(jìn)行3次，在此操作過程中細(xì)胞應(yīng)放在CO2孵箱中。
完成第三次操作后(轉(zhuǎn)染后一小時(shí))，加入常規(guī)量的培養(yǎng)液進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染時(shí)間一般為1小時(shí)，(最多)2小時(shí)對此是足夠的。
本發(fā)明提供了可以轉(zhuǎn)染各種動(dòng)物細(xì)胞的重組DNA病毒載體，并且外源基因能夠在被轉(zhuǎn)染的動(dòng)物細(xì)胞中自主復(fù)制。本發(fā)明還提供一種產(chǎn)生重組DNA病毒載體的簡單方法。本發(fā)明的重組DNA病毒載體對治療遺傳性疾病特別有用。
序列表SEQ ID No1長度53個(gè)堿基對類型核酸鏈型單鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型其它核酸(含部分基因組DNA的任選DNA)假設(shè)是反義否來源E.Coli噬菌體P1 DNA特性鑒定方法S序列描述SEQ ID No1CGTCTGCAGT GCATCATGAG TAATTTACTG ACCGTACACC AAAATTTGCC TGC53SEQ ID No2長度38個(gè)堿基對類型核酸鏈型單鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型其它核酸(含部分基因組DNA的任選DNA)假設(shè)是反義否來源E.Coli噬菌體P1 DNA特性鑒定方法S序列描述SEQ ID No2GGCTCTAGAG CGCTTAATGG CTAATCGCCA TCTTCCAG 38
SEQ ID No3長度52個(gè)堿基對類型核酸鏈型雙鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型其它核酸(含部分基因組DNA的任選DNA)假設(shè)是反義否來源E.Coli噬菌體P1 DNA特性鑒定方法S序列描述SEQ ID No3CGAACGCGTA TAACTTCGTA TAGCATACAT TATACGAAGT TATCTCGAGT CG 5權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞的重組DNA病毒載體，它包括啟動(dòng)子、重組酶基因和poly(A)序列。
2.按照權(quán)利要求1的重組DNA病毒載體，其中所述DNA病毒載體為腺病毒載體。
3.按照權(quán)利要求2的重組DNA病毒載體，其中所述重組酶基因是得自E.Coli P1噬菌體的重組酶Cre基因。
4.一種轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞的重組DNA病毒載體，它包括兩個(gè)重組酶識別序列、在所述動(dòng)物細(xì)胞中可操作的復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、外源基因和poly(A)序列，所述復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、外源基因和poly(A)序列都位于兩個(gè)重組酶識別序列之間。
5.按照權(quán)利要求4的重組DNA病毒載體，其中所述DNA病毒載體為腺病毒載體。
6.按照權(quán)利要求5的重組DNA病毒載體，其中所述復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、外源基因和poly(A)序列依此順序位于兩個(gè)重組酶識別序列之一的上游。
7.按照權(quán)利要求5的重組DNA病毒載體，其中所述外源基因、poly(A)序列、復(fù)制起點(diǎn)、和啟動(dòng)子依此順序位于兩個(gè)重組酶識別序列之一的上游。
8.按照權(quán)利要求4-7之任一的重組DNA病毒載體，其中所述重組酶識別序列是編碼loxP的DNA序列，它是重組酶Cre的底物。
9.按照權(quán)利要求4-8之任一的重組DNA病毒載體，其中所述復(fù)制起點(diǎn)來自病毒或動(dòng)物細(xì)胞。
10.按照權(quán)利要求9的重組DNA病毒載體，其中所述復(fù)制起點(diǎn)選自乳多空病毒、皰疹病毒、腺病毒、痘病毒和細(xì)小病毒的復(fù)制起點(diǎn)。
11.按照權(quán)利要求1-10之任一的重組DNA病毒載體，其中所述啟動(dòng)子和poly(A)包含在一雜合啟動(dòng)子CAG中，后者包括巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子、雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、和兔β-株蛋白縫接受體和poly(A)序列。
12.一種向動(dòng)物細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因的方法，其包括下列步驟用含啟動(dòng)子、重組酶基因和poly(A)序列的重組DNA病毒載體，和含有兩個(gè)重組酶識別序列、在所述動(dòng)物細(xì)胞中可操作的復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、外源基因和poly(A)序列的重組DNA病毒載體共轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞，所述復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、外源基因和poly(A)序列位于兩個(gè)重組酶識別序列之間；切下含有所述復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、外源基因和poly(A)序列的DNA片段，形成環(huán)形DNA分子；及所述環(huán)形DNA分子在共轉(zhuǎn)染的動(dòng)物細(xì)胞中自主復(fù)制。
13.按照權(quán)利要求12向動(dòng)物細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因的方法，其中兩個(gè)DNA病毒載體均為腺病毒載體。
14.一種向細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)人基因的方法，其包括在基因治療中使用權(quán)利要求12或13的方法。
全文摘要
用兩種重組DNA病毒載體共同轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞，一種帶有啟動(dòng)子、重組酶基因和poly(A)序列，另一種含有兩個(gè)重組酶識別序列和位于它們之間的復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、外源基因和poly(A)序列。然后一個(gè)載體中表達(dá)的重組酶作用下切下另一載體中的含復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、外源基因和poly(A)序列的DNA片段，形成一環(huán)狀DNA分子，并在共轉(zhuǎn)染細(xì)胞中自主復(fù)制，從而連續(xù)表達(dá)外源基因。這兩個(gè)DNA病毒載體對治療遺傳性疾病特別有用。
文檔編號A61K48/00GK1132791SQ9511629
公開日1996年10月9日 申請日期1995年9月18日 優(yōu)先權(quán)日1994年9月19日
發(fā)明者齋藤泉, 鍾江裕美 申請人:住友制藥株式會社