專(zhuān)利名稱(chēng)：含腺伴隨病毒介導(dǎo)的抗血管生成因子的組合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療癌癥的構(gòu)建體或組合物，特別涉及腺伴隨病毒載體或腺病毒載體介導(dǎo)的表達(dá)抗血管生成因子HGFK1的構(gòu)建體AAV-HGFK1或Adv-HGFK1，以及含有構(gòu)建體AAV-HGFK1與腺病毒載體或表達(dá)抗癌基因、抑癌基因或細(xì)胞因子基因的腺病毒載體的構(gòu)建體的組合物。
背景技術(shù)：
在實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中，持續(xù)的血管生成是影響該進(jìn)程的關(guān)鍵因素之一，因?yàn)樾律転槟[瘤細(xì)胞提供增殖所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、氧氣及各種生長(zhǎng)因子。
據(jù)此，F(xiàn)olkman在1971年首次提出抑制腫瘤的血管形成可作為治療腫瘤的一種手段(Folkman J.et al.，J Exp Med，1971，133275-88.)。臨床前期研究顯示系統(tǒng)地全身應(yīng)用純化的重組抗血管生成因子，如angiostatin和endostatin，能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移(Hoffmann S.etal.，JCell Biochem，2006；98954-65./Kurup A et al.，Ann Oncol，2006；1797-103)。
HGFK1為人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的Kringle 1結(jié)構(gòu)域(Kringle 1domain ofHGF，簡(jiǎn)稱(chēng)HGFK1)，包含HGF第127至214位氨基酸序列。HGFK1是最近發(fā)現(xiàn)的一種新的抗血管生成因子，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)重組HGFK1蛋白的抗血管生成的作用明顯強(qiáng)于angiostatin(Xin L.et al.，Biochem Biophys Res Commun，2000；277186-190)。
然而，重組抗血管生成因子在臨床應(yīng)用上存在一定的限制，例如靜脈給藥后，抗血管生成因子在體內(nèi)的穩(wěn)定時(shí)間只有數(shù)小時(shí)，而要達(dá)到抗腫瘤作用則需要在體內(nèi)長(zhǎng)期地保持有效濃度的抗血管生成因子。因此，如何長(zhǎng)期保持抗血管生成因子在體內(nèi)的有效濃度是其進(jìn)入臨床應(yīng)用前亟待解決的問(wèn)題。
基因治療是解決這一問(wèn)題的有效方法。自1990年首次進(jìn)行對(duì)于人類(lèi)疾病的基因治療試驗(yàn)以來(lái)，基因療法作為一種全新的醫(yī)療手段日益引起人們的重視，特別是那些不能用傳統(tǒng)醫(yī)療手段徹底治愈的疾病，如糖尿病、癌癥和艾滋病等。目前使用的基因治療載體主要包括病毒和非病毒兩類(lèi)載體。一般來(lái)說(shuō)，病毒類(lèi)載體在表達(dá)強(qiáng)度和時(shí)空性方面比非病毒類(lèi)載體更優(yōu)越。
目前，在基因治療中最常用的病毒載體為腺病毒載體。腺病毒(Adv)是一種DNA雙鏈無(wú)包膜病毒，基因組DNA約長(zhǎng)36kb，可編碼14種蛋白。腺病毒載體也是一種理想的病毒類(lèi)載體，初期使用的病毒株存在較強(qiáng)的免疫原性，有引起強(qiáng)烈的過(guò)敏反應(yīng)的可能。令人鼓舞的是，近來(lái)Adv經(jīng)過(guò)改良，其免疫原性已經(jīng)大大降低。一般來(lái)說(shuō)，目前的腺病毒載體的主要優(yōu)點(diǎn)有(1)性質(zhì)穩(wěn)定，能高效表達(dá)，對(duì)人類(lèi)相對(duì)安全；(2)感染的宿主細(xì)胞范圍廣，可感染分裂期及靜止期細(xì)胞；(3)腺病毒感染細(xì)胞時(shí)無(wú)需整合到宿主細(xì)胞基因組中，不存在激活致癌基因或插入突變等風(fēng)險(xiǎn)；(4)是缺陷型病毒，不能自主復(fù)制；(5)容易制備，重組病毒可通過(guò)靜脈注射、噴霧、氣管內(nèi)滴注或制備成膠囊口服經(jīng)腸道吸收等方法進(jìn)入體內(nèi)，可獲得高效價(jià)病毒載體。
最近，也有人利用腺伴隨病毒(adeno associated virus，AAV)作為表達(dá)載體來(lái)進(jìn)行癌癥、白血病和艾滋病的治療研究，并取得了滿意的結(jié)果(Buning H et al.，Curr Opin Mol Ther，2003；5367-75)。但是，AAV存在產(chǎn)量低、輔助病毒污染及野生型AAV污染等缺陷。雖然目前對(duì)其上述缺陷進(jìn)行了改進(jìn)，但是同Adv比較，仍存在AAV對(duì)外源基因的傳輸與表達(dá)的效率不理想等問(wèn)題。
面對(duì)如此之多的表達(dá)載體，選擇出能夠成功地與HGFK1基因重組形成構(gòu)建體，其能夠穩(wěn)定高效表達(dá)，有效介導(dǎo)HGFK1在腫瘤組織中發(fā)揮抗血管生成作用，從而實(shí)現(xiàn)預(yù)防或治療原發(fā)性癌癥、轉(zhuǎn)移性癌癥和復(fù)發(fā)性癌癥的目的，亟需進(jìn)行深入的研究與探索。
此外，目前已知的抑癌基因、抗癌基因和細(xì)胞因子眾多，在癌癥的基因治療中哪些基因或因子能夠與抗血管生成因子聯(lián)合應(yīng)用，以及選擇何種載體來(lái)表達(dá)這些因子，使它們能夠發(fā)揮協(xié)同的預(yù)防或治療癌癥的作用，目前還沒(méi)有相關(guān)的報(bào)道。
p53是一種抑癌基因表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，具有抑制細(xì)胞分裂、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、上調(diào)多種抑癌基因和下調(diào)多種癌基因的活性，并有抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)基因和多藥抗藥性(MDR)基因表達(dá)的作用(Sherr CJ，Cell，2004；116235-46.)。Adv介導(dǎo)的p53(Adv-p53)已經(jīng)應(yīng)用于大量的臨床病例，其安全性和有效性已經(jīng)得到檢驗(yàn)(Peng Z，HumGene Ther，2005，16(9)1016-27)。
hTERTC27是我們研究組發(fā)現(xiàn)的一種抗癌基因，編碼人端粒酶C端的一段分子量為27kDa的氨基酸序列，能夠在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性地表達(dá)，具有腫瘤細(xì)胞特異性的細(xì)胞毒作用。它能引起腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制和細(xì)胞凋亡，而對(duì)正常細(xì)胞則沒(méi)有抑制和凋亡作用。體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)hTERTC27能抑制腫瘤的形成和生長(zhǎng)(Huang J.et al.，BiochemBiophys Res Commun，2003Feb 14；301627-32./Huang J.et al.，CancerRes，2002Jun 1；623226-32.)。hTERTC27的研究成果已經(jīng)申請(qǐng)美國(guó)專(zhuān)利(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朜o.10/449,565filed 30May 2003)。
細(xì)胞因子IL-2能夠顯著地增強(qiáng)T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞的免疫功能，又能誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞LAK細(xì)胞和激活腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(TIL)。IL-2與其它多種細(xì)胞因子之間有協(xié)同增強(qiáng)免疫功能的作用，因此IL-2具有顯著的免疫增強(qiáng)及抗腫瘤作用(Waldmann TA，AnnuRev Med，2006；5765-81)。
本發(fā)明人通過(guò)創(chuàng)造性的勞動(dòng)，選擇出能夠與HGFK1聯(lián)合應(yīng)用的抑癌、抗癌或細(xì)胞因子，并利用不同的表達(dá)載體使其能夠充分發(fā)揮協(xié)同的預(yù)防或治療癌癥作用。

發(fā)明內(nèi)容
為了更有效地預(yù)防或治療癌癥，克服現(xiàn)有技術(shù)中腫瘤血管生長(zhǎng)抑制劑作用時(shí)間短，效果不理想的缺陷，本發(fā)明提供了一種不僅能夠抑制腫瘤血管生長(zhǎng)而且能夠抑制癌癥細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的重組構(gòu)建體。尤其是，發(fā)明人通過(guò)創(chuàng)造性勞動(dòng)，選擇了表達(dá)如p53的抑癌基因，如hTERT C27的抗癌基因或者如IL-2的細(xì)胞因子基因的構(gòu)建體，與表達(dá)抗血管生成因子的構(gòu)建體組成組合物，來(lái)發(fā)揮協(xié)同預(yù)防或治療癌癥作用。本發(fā)明的構(gòu)建體與組合物不易降解，作用時(shí)間長(zhǎng)，效果穩(wěn)定，從而能夠有效預(yù)防和/或治療癌癥的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)。
本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供一種預(yù)防或治療癌癥的構(gòu)建體，其包含抗血管生成因子HGFK1的核酸序列與腺伴隨病毒表達(dá)載體或腺病毒表達(dá)載體，并稱(chēng)為AAV-HGFK1或Adv-HGFK1，該HGFK1的核酸序列為SEQ ID NO1或其同源序列。
本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供預(yù)防或治療癌癥的組合物，其中包括有效劑量的第一構(gòu)建體，其包含抗血管生成因子基因與腺伴隨病毒表達(dá)載體；腺病毒表達(dá)載體或第二構(gòu)建體，所述第二構(gòu)建體包括選自抑癌基因、抗癌基因和細(xì)胞因子或其組合和腺病毒表達(dá)載體。
本發(fā)明的第三方面，提供本發(fā)明的構(gòu)建體或組合物在制備預(yù)防或治療癌癥藥物中的用途，其中所述藥物中包括預(yù)防或治療有效劑量的所述構(gòu)建體或組合物。
本發(fā)明的第四方面，提供HGFK1蛋白的特異性抗體。此抗體可以用于HGFK1蛋白的免疫組化染色和Western Blot檢測(cè)。因此，所述抗體也可用于相關(guān)試劑盒的制備中。
本發(fā)明的第五方面，提供檢測(cè)HGFK1蛋白或基因的試劑盒，所述試劑盒包括本發(fā)明所述的HGFK1蛋白的特異性抗體，或檢測(cè)HGFK1基因的探針或引物。
本發(fā)明的再一方面提供預(yù)防或治療個(gè)體癌癥的方法，包括對(duì)所述個(gè)體以預(yù)防或治療有效劑量的本發(fā)明的構(gòu)建體或組合物給藥。
本發(fā)明中所使用的抗血管生成因子基因可選自angiostatin(血管他丁)、endostatin(內(nèi)皮他丁)和人HGFK1基因。所述的抗血管生成因子基因優(yōu)選為包含人HGFK1基因，其編碼包含HGF第127至214位氨基酸序列，核酸序列為SEQ ID NO1。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗血管生成因子HGFK1基因優(yōu)選編碼SEQ ID NO5或其同源序列的氨基酸序列。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述抗血管生成因子HGFK1的氨基酸序列，除SEQ ID NO5外，還含有6個(gè)組氨酸序列，即為SEQ IDNO6的氨基酸序列。
本發(fā)明中所使用的抑癌基因優(yōu)選為p53；抗癌基因優(yōu)選hTERTC27；細(xì)胞因子則優(yōu)選為IL-2的編碼基因。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物可以含任意的藥物學(xué)上可接受的載體。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述的癌癥為實(shí)體腫瘤，優(yōu)選肝細(xì)胞癌、直腸結(jié)腸癌和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，優(yōu)選原發(fā)性及轉(zhuǎn)移性肝癌。
本發(fā)明的構(gòu)建體或組合物可用于預(yù)防或治療原發(fā)性癌癥、轉(zhuǎn)移性癌癥。優(yōu)選治療轉(zhuǎn)移性癌癥。
在本發(fā)明中，利用腺病毒或腺伴隨病毒載體構(gòu)建的表達(dá)HGFK1的構(gòu)建體，與現(xiàn)有技術(shù)中采用普通載體的表達(dá)效果比較，能在體內(nèi)持續(xù)、穩(wěn)定表達(dá)抗血管生成基因HGFK1蛋白。尤其是，本發(fā)明的組合物中的含有抗血管生成的構(gòu)建體與腺病毒表達(dá)載體或含抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)基因的腺病毒載體的構(gòu)建體能夠發(fā)揮協(xié)同作用，比單獨(dú)使用含有抗血管生成的構(gòu)建體的能夠顯著增強(qiáng)抑制腫瘤的效果。


圖1A所示為含有HGFK1基因的腺伴隨病毒載體的構(gòu)建體AAV-HGFK1。
圖1B所示為包含p53，hTERTC27，HGFK1或IL-2基因的腺病毒載體(Adv)的構(gòu)建體pAd-X的示意圖，其中X為p53，hTERTC27，HGFK1或IL-2基因中的任何一個(gè)。
圖2所示為腺病毒載體Adv顯著增強(qiáng)腺伴隨病毒AAV載體的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染效率的柱狀圖。腺病毒Adv顯著增強(qiáng)腺伴隨病毒AAV重組載體的轉(zhuǎn)染效率達(dá)到10倍以上。圖中所用簡(jiǎn)寫(xiě)Adv為腺病毒(Adenovirus)；LD-AAV-EGFP為低劑量(low dose)AAV-EGFP(MOI為1×103)；HD-AAV-EGFP為高劑量(high dose)AAV-EGFP(MOI為1×104)；EGFP為增強(qiáng)綠色熒光蛋白。
圖3所示為AAV-HGFK1顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、引起腫瘤細(xì)胞凋亡以及顯著延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生存時(shí)間的基因治療結(jié)果。圖中縮寫(xiě)PBS為PBS緩沖液；EGFP為增強(qiáng)綠色熒光蛋白。圖3A所示為治療后不同的時(shí)間點(diǎn)各組肝細(xì)胞癌動(dòng)物模型的腫瘤體積。圖3B所示為各組肝細(xì)胞癌模型動(dòng)物死亡時(shí)腹水、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移、腹腔轉(zhuǎn)移和原發(fā)腫瘤體積的病理解剖特點(diǎn)。圖3C所示為治療后21天時(shí)TUNEL染色分析各組肝細(xì)胞癌模型的腫瘤細(xì)胞凋亡情況，箭頭所示為凋亡細(xì)胞。圖3D所示為各組肝細(xì)胞癌模型的生存情況。**表示與對(duì)照組相比較P值＜0.01。
圖4所示為皮下種植人惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的裸鼠模型的基因治療的生存曲線。分成七組Adv-hTERTC27、Adv-HGFK1或者AAV-HGFK1單獨(dú)治療組；AAV-HGFK1+Adv-hTERT C27的組合物或者AAV-HGFK1+Adv-IL-2的組合物治療組；對(duì)照組為PBS或AAV-EGFP注射組。圖中顯示治療后不同時(shí)間(天)，動(dòng)物存活百分比的變化。*表示Adv-hTERTC27、Adv-HGFK1或者AAV-HGFK1單獨(dú)治療組的生存時(shí)間比對(duì)照組顯著延長(zhǎng)，P值＜0.01；**表示AAV-HGFK1+Adv-hTERTC27或者AAV-HGFK 1+Adv-IL-2的組合物治療組的生存時(shí)間比Adv-hTERTC27、Adv-HGFK1或者AAV-HGFK1單獨(dú)治療組的生存時(shí)間顯著延長(zhǎng)，P值＜0.01。圖中縮寫(xiě)PBS為PBS緩沖液；Adv-C27為Adv-hTERTC27。
圖5所示為大腸癌肝轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型的基因治療組合物的治療結(jié)果。圖5A所示為，AAV-HGFK1組、AAV-EGFP組、AAV-EGFP+Adv-p53組和AAV-HGFK1+Adv-p53組在不同時(shí)間的生存百分比；圖5B所示為AAV-HGFK1組、AAV-EGFP組、AAV-EGFP+Adv-p53組和AAV-HGFK1+Adv-p53組的生存時(shí)間、平均生存時(shí)間、以及肝轉(zhuǎn)移和原發(fā)腫瘤發(fā)生的動(dòng)物數(shù)量。**表示AAV-HGFK1+Adv-p53治療組比AAV-EGFP對(duì)照組的生存時(shí)間顯著延長(zhǎng)，P值＜0.01。圖中縮寫(xiě)EGFP為增強(qiáng)綠色熒光蛋白。
圖6所示為Buffalo大鼠原發(fā)性肝細(xì)胞癌的基因治療組合物的生存曲線治療結(jié)果。圖中顯示治療后不同時(shí)間(天)，動(dòng)物存活百分比的變化。圖中縮寫(xiě)PBS為PBS緩沖液；HD-AAV-HGFK1為高劑量AAV-HGFK1。
圖7所示為毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖中縮寫(xiě)ALT為谷丙轉(zhuǎn)氨酶；AST為谷草轉(zhuǎn)氨酶；TB為總膽紅素；LDH為乳酸脫氫酶；CK為肌酸激酶；PBS為PBS緩沖液。
發(fā)明詳述定義本發(fā)明所以用術(shù)語(yǔ)“人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子Kringle 1結(jié)構(gòu)域(HGFK1)”包括不改變其抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和血管生成功能的其保守氨基酸的替代變體。
本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格雜交條件”指基因的雜交和洗滌條件，與該基因具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的核苷酸序列互補(bǔ)性時(shí)，仍能夠與該基因雜交。該雜交條件是本領(lǐng)域公知，例如參見(jiàn)Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6；Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(1982)，pp.387-389。
本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)基因的“同源序列”指與該基因具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的核苷酸序列一致性，而且基本上不影響所編碼蛋白的功能。基因的同源序列也可以是該基因的片段，只要其編碼的蛋白功能基本沒(méi)有改變。
本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)氨基酸序列的“同源序列”指與該序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸序列一致性，而且基本上不影響具有該氨基酸序列的蛋白的功能。
本發(fā)明所述術(shù)語(yǔ)“預(yù)防或治療癌癥”指所用構(gòu)建體或組合物可以預(yù)防癌癥的轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)，減輕、緩解、控制、改善或治愈原發(fā)性癌癥或轉(zhuǎn)移性癌癥或其相關(guān)的癥狀；也可以延長(zhǎng)癌癥患者的壽命或活存時(shí)間，降低死亡率。
本發(fā)明所述術(shù)語(yǔ)“對(duì)照組”指由綠色熒光蛋白(EGFP)與腺伴隨病毒載體(AAV)組成的構(gòu)建體的給藥組和/或施用PBS緩沖液組。
1.含有抗血管生成因子基因與腺伴隨病毒載體的第一構(gòu)建體多種抗血管生成因子基因，例如，angiostatin和endostatin(Hoffmann S.et al.，J CellBiochem.2006；98954-65；Kurup A et al.，Ann Oncol，2006；1797-103)，以及HGFK1(Xin L.et al.，BiochemBiophys Res Commun，2000；277186-190)基因的核酸序列，可用于本發(fā)明的構(gòu)建體中。本發(fā)明優(yōu)選的核酸序列為SEQ ID NO1的HGFK1基因及其同源序列。該SEQ ID NO1核酸序列編碼HGF的第127至214位的氨基酸序列(SEQ ID NO5)。所述HGFK1的核酸序列還包括在嚴(yán)格雜交條件下，與SEQ ID NO1雜交的核酸序列或其同源序列。本發(fā)明所用的腺伴隨病毒載體(adeno associated virus，AAV)，包括所有類(lèi)型的AAV，例如AAV1，AAV2，AAV5，AAV8，AAV11，優(yōu)選AAV2(Choi VW et al.Curr.Gene Ther.2005；5299-310.)。本發(fā)明選擇的AAV能夠有效傳輸HGFK1基因的并提高表達(dá)效率。同時(shí)，由所述AAV，尤其是AAV2構(gòu)建的表達(dá)本發(fā)明的HGFK1基因的構(gòu)建體，能夠在本發(fā)明的組合物中，與由腺病毒表達(dá)載體構(gòu)建的構(gòu)建體，發(fā)揮協(xié)同作用，顯著提高治療或預(yù)防癌癥的效果。
根據(jù)分子生物學(xué)常規(guī)方法以及DNA重組技術(shù)，可獲得抗血管生成因子基因序列，并與腺伴隨病毒載體重組構(gòu)成本發(fā)明的構(gòu)建體。相關(guān)的文獻(xiàn)與方法例如參見(jiàn)Sambrook et al(1989)Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory，NY；Marston，F(xiàn)(1987)DNA Cloning TechniquesA Practical Approach Vol III IRL Press，Oxford UK；DNA CloningF M Ausubelet al，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.(1994)。
2.HGFK1基因的核酸序列與腺病毒載體的構(gòu)建體除用腺病毒載體替換腺伴隨病毒載體外，根據(jù)本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法和第一構(gòu)建體的方法來(lái)構(gòu)建含HGFK1基因與腺病毒載體的構(gòu)建體。
用于構(gòu)建的腺病毒載體包裝系統(tǒng)包括，Adeno-XTM包裝系統(tǒng)、AdEasyTM包裝系統(tǒng)、AdMaxTM包裝系統(tǒng)、Ad5/F35MaxTM包裝系統(tǒng)、pAd/CMV/V5-DESTTM包裝系統(tǒng)等，優(yōu)選pAd/CMV/V5-DESTTM包裝系統(tǒng)。本發(fā)明所選擇的腺病毒表達(dá)載體，特別是pAd/CMV/V5-DESTTM包裝系統(tǒng)可有效傳輸HGFK1因子，并在單獨(dú)與聯(lián)合使用時(shí)均具有預(yù)防和治療癌癥的作用。例如，參見(jiàn)本發(fā)明的實(shí)施例所述。
3.含有抑癌基因、抗癌基因或細(xì)胞因子的核酸序列與腺病毒載體的第二構(gòu)建體能夠用于構(gòu)建第二構(gòu)建體的外源基因，包括如p53的抑癌基因，如hTERT C27的抗癌基因或如IL-2的細(xì)胞因子基因的核酸序列?？蓪⑦@些因子的基因與腺病毒載體組成第二構(gòu)建體。在基因治療中，這些含抑癌基因、抗癌基因或細(xì)胞因子與腺病毒載體的第二構(gòu)建體與含有抗血管生成因子基因和腺伴隨病毒載體的第一構(gòu)建體聯(lián)合應(yīng)用，產(chǎn)生意想不到的預(yù)防或治療癌癥的效果。本發(fā)明用于第二構(gòu)建體的外源基因優(yōu)選p53、hTERT C27或IL-2的核酸序列。編碼p53、hTERT C27和IL-2的基因分別具有SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4的核酸序列。
用于構(gòu)建的腺病毒載體包裝系統(tǒng)包括，Adeno-XTM包裝系統(tǒng)、AdEasyTM包裝系統(tǒng)、AdMaxTM包裝系統(tǒng)、Ad5/F35MaxTM包裝系統(tǒng)、pAd/CMV/V5-DESTTM包裝系統(tǒng)等，優(yōu)選pAd/CMV/V5-DESTTM包裝系統(tǒng)?？赏ㄟ^(guò)上述2中的方法來(lái)構(gòu)建含有抑癌基因、抗癌基因或細(xì)胞因子基因與腺病毒載體的構(gòu)建體。
構(gòu)建含外源基因與腺病毒載體的構(gòu)建體的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，例如參見(jiàn)上述HGFK1基因與腺病毒載體的構(gòu)建體的構(gòu)建方法。
4.預(yù)防與治療癌癥的組合物本發(fā)明的用于預(yù)防與治療癌癥的組合物包括預(yù)防或治療有效劑量的含有抗血管生成因子基因與腺伴隨病毒載體的第一構(gòu)建體；腺病毒載體，或含有抑癌基因、抗癌基因或細(xì)胞因子與腺病毒載體的第二構(gòu)建體；及任意地，藥學(xué)上可接受的載體。
可使用常規(guī)的制藥方法來(lái)制備適合的制劑從而對(duì)癌癥患者進(jìn)行本發(fā)明所述構(gòu)建體或組合物的給藥?？梢圆捎萌我膺m合的、例如非腸道的、靜脈的、皮下的、肌肉的、顱內(nèi)的、眶內(nèi)的、眼的、心室內(nèi)的、囊內(nèi)的、脊柱內(nèi)、腦池內(nèi)、腹膜內(nèi)的、鼻內(nèi)的、氣霧劑或口服給藥方法。給藥劑型可以是液體溶液或懸液；片劑或膠囊；粉末，滴鼻劑或氣霧劑形式。
適合腸道外給藥的組合物中包括無(wú)菌水性或非水性的本發(fā)明的組合物制劑，其優(yōu)選與受者的血液等張。根據(jù)公知的方法使用適合的分散劑或潤(rùn)濕劑及懸浮劑作為藥物載體來(lái)制備制劑。無(wú)菌的注射用制劑還可以是在非毒性腸道外可接受稀釋劑或溶劑中的無(wú)菌注射溶液或懸浮液，例如在1，3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受的載體和溶劑包括水、林格氏(Ringer′s)溶液及等張氯化鈉溶液。此外，無(wú)菌不易揮發(fā)的油類(lèi)可作為溶劑或懸浮介質(zhì)常規(guī)使用。為實(shí)現(xiàn)此目的，可使用任何溫和的非揮發(fā)油，包括合成的單或二甘油脂。此外，諸如油酸的脂肪酸可用于注射制劑中。
也可以采用生物匹配的、生物可降解的交酯聚合物、交酯/乙交酯聚合物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物來(lái)控制所述化合物的釋放。其它潛在的用于調(diào)節(jié)本發(fā)明構(gòu)建體或組合物的非腸道傳遞的系統(tǒng)包括乙烯-醋酸乙烯酯共聚物顆粒、滲透泵、可植入的灌注系統(tǒng)以及脂質(zhì)體。適于吸入的配方可包括藥物載體，例如乳糖，或可以是含有例如聚氧乙烯-9-月桂酸酯、甘膽酸鹽和脫氧膽酸鹽的水溶液，或可以是以滴鼻劑形式給藥的油狀溶液或作為凝膠。
適合口服、皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)等等給藥的組方可參見(jiàn)Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，PA。
基于本發(fā)明構(gòu)建體或組合物的“有效劑量”包括治療有效劑量或預(yù)防有效劑量?！爸委熡行┝俊笔侵冈趧┝可系挠行┝?，并且在必需的時(shí)間階段內(nèi)，達(dá)到所需要的治療結(jié)果，例如癌癥細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制、病灶縮小、復(fù)發(fā)率降低、存活時(shí)間延長(zhǎng)等等。根據(jù)諸如患者疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重的因素以及所述構(gòu)建體或組合物在患者體內(nèi)引起所需要反應(yīng)的能力不同，所述構(gòu)建體或組合物的治療有效劑量也會(huì)發(fā)生變化。可對(duì)劑量方案進(jìn)行調(diào)節(jié)從而提供最適的治療反應(yīng)。治療有效劑量也可以是所述治療有效效果超過(guò)了所述化合物的任意毒性或有害效果的量?！邦A(yù)防有效劑量”是指在劑量上的有效劑量，并且在必需的時(shí)間階段內(nèi)，達(dá)到所需要的預(yù)防結(jié)果，例如預(yù)防癌癥的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)。構(gòu)建體或組合物的優(yōu)選治療或預(yù)防有效劑量范圍可以是從MOI(感染復(fù)數(shù))為1×103至1×106中的任意整數(shù)，例如，本發(fā)明的第一構(gòu)建體的預(yù)防或治療的有效劑量為4×1011v.g/kg至1×1014v.g/kg；第二構(gòu)建體的預(yù)防與治療的有效劑量為；1×1010v.p/kg至1×1011v.p/kg；Adv-HGFK1構(gòu)建體的預(yù)防與治療的有效劑量亦為；1×1010v.p/kg至1×1011v.p/kg。本發(fā)明組合物的優(yōu)選的有效劑量為AAV-HGFK14×1011v.g/kg至1×1013v.g/kg；Adv-X1×1010v.p/kg至1×1011v.p/kg。
需要注意的是所述劑量可隨欲被預(yù)防或治療的癌癥的的嚴(yán)重程度不同而變化。對(duì)任意具體的患者而言，可根據(jù)個(gè)體的需要對(duì)具體的劑量進(jìn)行配置，并根據(jù)給藥或監(jiān)督給藥的職業(yè)人員判斷進(jìn)行調(diào)節(jié)。在此設(shè)定的劑量范圍僅僅是示例性的，而并非對(duì)醫(yī)療人員選定的劑量范圍進(jìn)行限制。根據(jù)諸如所述個(gè)體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和重量的因素，在所述組合物中的構(gòu)建體的量可以改變。可對(duì)劑型進(jìn)行調(diào)節(jié)從而提供最適的治療效果。
5.本發(fā)明構(gòu)建體或組合物效用發(fā)明人通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，Adv載體系統(tǒng)與AAV載體系統(tǒng)同時(shí)應(yīng)用能夠顯著增強(qiáng)AAV載體系統(tǒng)的效用達(dá)十倍以上(圖2、圖4)。為此，發(fā)明人設(shè)計(jì)了AAV-HGFK1和Adv(如Adv-p53、Adv-hTERTC27、Adv-IL-2或Adv本身)的組合物，并且將所述的組合物施用于原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性癌癥模型，取得了令人鼓舞的效果。所述的組合物的治療效果顯著優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用AAV-HGFK1，Adv-p53，Adv-hTERTC27或Adv-IL-2中任何一種的治療效果。
在大鼠的原位肝細(xì)胞癌中，通過(guò)包括門(mén)靜脈和腫瘤內(nèi)注射的注射途徑，用AAV-HGFK1進(jìn)行預(yù)防與治療。結(jié)果顯示，AAV-HGFK1能引起腫瘤細(xì)胞的凋亡、壞死，明顯延長(zhǎng)肝細(xì)胞癌動(dòng)物模型的生存時(shí)間(從對(duì)照組的平均30天到治療組的49天)，以及完全抑制癌癥的轉(zhuǎn)移(圖3)。
在大腸癌肝轉(zhuǎn)移中，AAV-HGFK1以及AAV-EGFP+Adv-p53的治療效果顯著優(yōu)于對(duì)照治療組；而AAV-HGFK1+Adv-p53的組合物治療組的平均生存時(shí)間顯著長(zhǎng)于AAV-HGFK1組以及AAV-EGFP+Adv-p53組，P值小于0.001；AAV-HGFK1+Adv-p53組合物的治療甚至達(dá)到了完全治愈，使得實(shí)驗(yàn)動(dòng)物長(zhǎng)期無(wú)瘤生存的效果(圖5)。
在人的惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤裸鼠模型中，通過(guò)包括腫瘤旁注射以及尾靜脈注射的給藥途徑實(shí)施預(yù)防與治療。Adv-hTERTC27，Adv-HGFK1和AAV-HGFK1單獨(dú)施用將平均生存時(shí)間從28.3天分別延長(zhǎng)至42.8、47.5和60.6天；而AAV-HGFK1+Adv-hTERTC27的組合物和AAV-HGFK1+Adv-IL-2的組合物的療效更加顯著到治療后80天時(shí)，施用AAV-HGFK1+Adv-hTERTC27的組合物的治療組無(wú)一死亡，施用AAV-HGFK1+Adv-IL-2的組合物的治療組僅有一列死亡(圖4)。
鑒于以上的研究結(jié)果，可知本發(fā)明可涵蓋其它的癌癥。其依據(jù)如下1、所選用的幾種原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性癌癥模型是癌癥中的比較常見(jiàn)的類(lèi)型，具有一定的代表性；2、所有的癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移都有賴于血管生成，而本發(fā)明能夠提供持久的、高水平的抗血管生成的預(yù)防與治療；3、本發(fā)明中所選用的抑癌基因具有廣譜抗癌性；4、本發(fā)明的組合物可以預(yù)防癌癥的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。
因此，本發(fā)明的構(gòu)建體或組合物可用于預(yù)防或治療實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)中。
6.毒性研究本發(fā)明提供了檢測(cè)AAV-HGFK1重組表達(dá)構(gòu)建體以及Adv-p53和/或Adv-hTERTC27表達(dá)構(gòu)建體組成的組合物對(duì)于機(jī)體的毒性的評(píng)價(jià)。我們施用高劑量的所述的組合物于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，然后檢測(cè)其血清中反映肝功能的指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶以及總膽紅素；反映心肌有無(wú)損害的指標(biāo)乳酸脫氫酶、肌酸激酶以及Tn-T，未檢測(cè)出肝功能和心肌受損害的跡象。另外，心肌組織的H&E染色也未發(fā)現(xiàn)明顯損害。
7.HGFK1蛋白抗體的制備使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備方法(Harlow，E.，和Lane，D.(1988)Antiodiesa laboratory manual(抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)).Cold Spring Harbor，NYColdSpring Harbor Laboratory)或本領(lǐng)域公知的方法，可將本發(fā)明的構(gòu)建體或其表達(dá)的蛋白用來(lái)制備針對(duì)本發(fā)明蛋白的抗體。
例如，可將本發(fā)明的構(gòu)建體純化至免疫動(dòng)物例如兔子的必須程度。為了防止抗血清的低親和性或低特異性的潛在問(wèn)題，可對(duì)抗血管生成因子制備2或3種構(gòu)建體，并將每種構(gòu)建體注射到至少2只動(dòng)物中。可通過(guò)一系列，優(yōu)選為包括至少三次加強(qiáng)注射的注射來(lái)產(chǎn)生抗血清?？刹捎酶ナ贤耆魟┻M(jìn)行初次免疫，然后采用弗氏不完全佐劑進(jìn)行加強(qiáng)免疫?？刹捎肳estern Blot和使用所述純化蛋白的免疫沉淀分析對(duì)抗體滴度進(jìn)行監(jiān)測(cè)。可使用CNBr-葡聚糖偶聯(lián)蛋白對(duì)免疫血清進(jìn)行親和純化?？墒褂貌幌嚓P(guān)的蛋白板測(cè)定抗血清的特異性?？蛇x擇地，或除此之外，可以產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于本發(fā)明抗血管生成因子相對(duì)唯一的免疫原性區(qū)域的多肽，并通過(guò)引入的C-末端賴氨酸與鑰孔戚血藍(lán)素(KLH)偶聯(lián)。對(duì)這些多肽中每一種的抗血清都可通過(guò)軛合于BSA的多肽進(jìn)行親和純化，使用多肽軛合物在ELISA和Western Blot并通過(guò)Western Blot和免疫沉淀測(cè)定特異性。
可選擇地，可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤方法制備與本發(fā)明的抗血管生成因子特異性結(jié)合的單克隆抗體。一旦產(chǎn)生出來(lái)，可通過(guò)Western雜交或免疫沉淀對(duì)單克隆抗體的特異性識(shí)別進(jìn)行測(cè)定?？烧J(rèn)為那些與本發(fā)明所述因子結(jié)合的抗體是有用的；這樣的抗體可用作，例如，免疫分析。
在一些實(shí)施方案中，可使用具有免疫原性的多肽片段，制備抗體。例如，使用從羧基末端至氨基末端方向的至少75％、至少50％、至少25％或至少5％的本發(fā)明的SEQ ID NO5氨基酸序列作為免疫原性多肽片段進(jìn)行免疫以產(chǎn)生抗體。本發(fā)明優(yōu)選氨基酸序列RSY KGT VSI TKS GIKC(SEQ ID NO7)作為HGFK1的免疫原。
8.試劑盒本發(fā)明還涉及用于檢測(cè)抗血管生成因子HGFK1蛋白或其基因的試劑盒，所述試劑盒包括本發(fā)明所述的抗血管生成因子HGFK1蛋白的抗體，或根據(jù)抗血管生成因子HGFK1基因序列、優(yōu)選根據(jù)SEQ ID NO1或其同源序列設(shè)計(jì)的引物或探針。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒用于ELISA、West blot、免疫共沉淀等等的檢測(cè)分析。在另一實(shí)施方案中，所述試劑盒用于Northern Blot、Southern Blot、PCR等等的檢測(cè)分析。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒還包括指導(dǎo)檢測(cè)的說(shuō)明書(shū)和其它用于所述檢測(cè)的常用試劑，例如標(biāo)記試劑。
據(jù)此，本發(fā)明還涉及所述的抗血管生成因子HGFK1蛋白的抗體在制備所述試劑盒中的用途。
實(shí)施例實(shí)施例1編碼人HGFK1多肽的AAV表達(dá)載體的構(gòu)建體將人的HGFK1的cDNA(SEQ ID NO1核酸序列)，插入已經(jīng)預(yù)先用相同的內(nèi)切酶消化過(guò)的pAM/CAG/EGR-1-pL-WPRE-BGH-polyA的AAV包裝載體，構(gòu)成AAV-HGFK1重組載體。再采用三載體輔助病毒缺陷包裝系統(tǒng)(AAV、H22和pFD6)進(jìn)行包裝，即采用碳酸鈣法將重組載體AAV-HGFK1和輔助質(zhì)粒H22和pFD6共同轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染60-72小時(shí)后，收獲細(xì)胞，分離出的重組病毒顆粒經(jīng)HiTrap Heparin親和層析純化后，以實(shí)時(shí)(real-time)PCR確定其最終滴度。
體外以AAV-HGFK1感染小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞及大鼠肝細(xì)胞癌細(xì)胞后，用免疫組化方法對(duì)感染的細(xì)胞進(jìn)行染色。結(jié)果顯示，HGFK1能在細(xì)胞漿內(nèi)高表達(dá)。將培養(yǎng)感染后細(xì)胞的培養(yǎng)液濃縮后，用WesternBlot方法對(duì)濃縮物的檢測(cè)結(jié)果顯示，該培養(yǎng)液中存在HGFK1，表明HGFK1能被分泌到細(xì)胞外。
經(jīng)Balb/C小鼠的尾靜脈注射AAV-HGFK1重組病毒后，收集該小鼠的血清并濃縮。以Western Blot方法對(duì)濃縮血清進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了HGFK1在血清中的存在，表明HGFK1被表達(dá)并分泌入血。在Buffalo大鼠門(mén)靜脈注射AAV-HGFK1重組病毒后，以Western Blot方法同樣在該大鼠的濃縮血清中檢測(cè)到HGFK1的表達(dá)。利用免疫組化方法也檢測(cè)到大鼠肝細(xì)胞內(nèi)有HGFK1高表達(dá)。
實(shí)施例2編碼p53，hTERTC27、IL-2或HGFK1基因的腺病毒載體(Adv)的構(gòu)建體pAd-X本發(fā)明提供編碼人p53，hTERTC27、IL-2或HGFK1基因的重組缺陷型腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建體的制備、包裝方法，包括以下步驟將人p53基因，hTERTC27基因、IL-2基因或HGFK1基因分別連接到穿梭質(zhì)粒pENTRTM2B中，然后將重組的穿梭質(zhì)粒pENTR-p53，pENTR-hTERTC27、pENTR-IL-2或pENTR-HGFK 1以及pAd/CMV/V5-DEST通過(guò)同源重組得到表達(dá)載體pAd-p53，pAd-hTERTC27、pAd-IL-2或pAD-HGFK1，將所得表達(dá)載體用LipofectamineTM2000Reagent(Invitrogen)分別轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，裂解細(xì)胞、過(guò)氯化銫柱濃縮、純化。將純化的攜帶人p53，hTERTC27、IL-2或HGFK1基因的重組腺病毒(Adv-p53，Adv-hTERTC27、Adv-IL-2或Adv-HGFK1)轉(zhuǎn)染兔頸動(dòng)脈，并用攜帶LacZ報(bào)告基因的重組腺病毒(Adv-LacZ)作為對(duì)照，3天后RT-PCR、ELISA法檢測(cè)人p53，hTERTC27或IL-2基因mRNA、蛋白的表達(dá)。結(jié)果得到了滴度高于3×1010pfu/ml的分別攜帶人p53基因，hTERTC27基因和IL-2基因的重組腺病毒Adv-p53，Adv-hTERTC27和Adv-IL-2(圖1B)。
實(shí)施例3試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?1)肝細(xì)胞癌動(dòng)物模型用大鼠的肝細(xì)胞癌細(xì)胞株McA-RH-7777細(xì)胞通過(guò)手術(shù)注射于Buffalo大鼠的肝左葉包膜下(1×106個(gè)細(xì)胞/只，一次性注射)。7天以后通過(guò)手術(shù)打開(kāi)大鼠腹腔觀察，可見(jiàn)肝左葉表面有一個(gè)3×3mm2的腫瘤組織，即確認(rèn)模型建立。
(2)大腸癌肝轉(zhuǎn)移模型采用小鼠的大腸癌細(xì)胞株CT26細(xì)胞注射于BALB/c小鼠的脾臟內(nèi)(5×105/只，一次性注射)。十天后取12只小鼠，通過(guò)手術(shù)發(fā)現(xiàn)每只鼠的肝臟均有多個(gè)大小不一的腫瘤灶，即確認(rèn)出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移。因此可以說(shuō)明此方法建立肝轉(zhuǎn)移模型的成功率為100％。
(3)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤動(dòng)物模型采用人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87細(xì)胞(5×106/只，一次性注射)種植于裸鼠皮下。7天后可見(jiàn)注射部位有一約5×5mm2的隆起，即確認(rèn)成瘤。
實(shí)施例4對(duì)原發(fā)性肝細(xì)胞癌的治療作用按照實(shí)施例3中所述建立原發(fā)性肝細(xì)胞癌模型。
大鼠的肝細(xì)胞癌模型建立以后，即確認(rèn)成瘤后，立即開(kāi)始治療，隨機(jī)分為三組，每組六只1、PBS緩沖液組；2、AAV-EGFP組(1.2×1012v.g./只)；3、AAV-HGFK1組(1.2×1012v.g./只)。其中PBS組和AAV-EGFP組作為對(duì)照組，AAV-HGFK1作為治療組。注射途徑包括門(mén)靜脈和腫瘤內(nèi)注射兩種，其中腫瘤內(nèi)的注射劑量為0.2×1012v.g./只，門(mén)靜脈內(nèi)的注射劑量為1×1012v.g./只，均為確認(rèn)腫瘤模型建立以后即時(shí)一次性注射。
試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。
圖3A示出了治療后不同的時(shí)間點(diǎn)各組肝細(xì)胞癌動(dòng)物模型的腫瘤體積。第7天以及第14天時(shí)治療組(AAV-HGFK1注射)和對(duì)照組(PBS或AAV-EGFP注射)的腫瘤體積無(wú)明顯差別(P＞0.05)，而治療后第21天時(shí)治療組的腫瘤體積明顯小于對(duì)照組(P＜0.01)。
圖3B顯示了各組肝細(xì)胞癌模型動(dòng)物死亡時(shí)的病理解剖特點(diǎn)其中對(duì)腹水、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移、腹腔轉(zhuǎn)移以及原發(fā)性腫瘤體積進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示，腹水兩個(gè)對(duì)照組的各6只動(dòng)物都有腹水(100％)，而治療組只有2只有腹水(33％)；肝內(nèi)轉(zhuǎn)移兩個(gè)對(duì)照組的各6只動(dòng)物都有肝內(nèi)轉(zhuǎn)移(100％)，而治療組所有動(dòng)物都未見(jiàn)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移；肺轉(zhuǎn)移PBS對(duì)照組有5只有肺轉(zhuǎn)移(83.3％)，AAV-EGFP對(duì)照組6只都有肺轉(zhuǎn)移(100％)，而治療組所有動(dòng)物未見(jiàn)肺轉(zhuǎn)移；腹腔轉(zhuǎn)移兩個(gè)對(duì)照組的各6只動(dòng)物都有腹腔轉(zhuǎn)移(100％)，而治療組所有動(dòng)物都未見(jiàn)腹腔轉(zhuǎn)移。原發(fā)腫瘤體積治療組明顯小于對(duì)照組(P＜0.05)。
圖3C示出了治療后21天時(shí)TUNEL染色分析各組肝細(xì)胞癌模型的腫瘤細(xì)胞凋亡情況。箭頭所示為凋亡細(xì)胞。治療組的腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著低于兩個(gè)對(duì)照組(P＜0.01)。
圖3D則示出了各組肝細(xì)胞癌模型的生存情況。AAV-HGFK1治療組的平均生存時(shí)間(49天)顯著長(zhǎng)于兩對(duì)照組的平均生存時(shí)間(均為30天)。
上述結(jié)果顯示，用AAV-HGFK1治療能引起腫瘤細(xì)胞的凋亡、壞死，明顯延長(zhǎng)肝細(xì)胞癌動(dòng)物模型的生存時(shí)間(從對(duì)照組的平均30天到治療組的49天)，以及完全抑制癌癥的轉(zhuǎn)移。這說(shuō)明AAV-HGFK1顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、引起腫瘤細(xì)胞凋亡以及顯著延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生存時(shí)間。
實(shí)施例5對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤的預(yù)防或治療作用按照實(shí)施例3中所述建立人的惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤裸鼠模型。
模型建立后，隨機(jī)分成七組，每組六只1、PBS緩沖液組；2、AAV-EGFP組(1.5×1011vg/只)；3、AAV-HGFK1組(1.5×1011vg/只)；4、Adv-HGFK1組(2.5×109vp/只)；5、Adv-IL-2+AAV-HGFK1組(1.5×1011vg/只+2.5×109vp/只)；6、Adv-hTERTC27組(2.5×109vp/只)；7、Adv-hTERTC27+AAV-HGFK1組(1.5×1011vg/只+2.5×109vp/只)。
確認(rèn)成瘤后立即給藥，給藥途徑為腫瘤旁注射以及尾靜脈注射，均為一次性注射。
試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。Adv-hTERTC27，Adv-HGFK1，AAV-HGFK1單獨(dú)施用將平均生存時(shí)間從28.3天分別延長(zhǎng)至42.8，47.5和60.6天(*表示與AAV-EGFP對(duì)照組相比Adv-hTERTC27，Adv-HGFK1，AAV-HGFK1三個(gè)治療組的生存時(shí)間顯著延長(zhǎng)，P＜0.01)；而AAV-HGFK1+Adv-hTERTC27的組合物和AAV-HGFK1+Adv-IL-2的組合物的療效更加顯著(**表示AAV-HGFK1+Adv-hTERTC27和AAV-HGFK1+Adv-IL-2的組合物治療組的生成時(shí)間比Adv-hTERTC27，Adv-HGFK1，AAV-HGFK1單獨(dú)施用的治療組的生存時(shí)間顯著延長(zhǎng)，P＜0.01)，到治療后80天時(shí)，施用AAV-HGFK1+Adv-hTERTC27的組合物的治療組無(wú)一死亡，施用AAV-HGFK1+Adv-IL-2的組合物的治療組僅有一列死亡。
實(shí)施例6對(duì)大腸癌肝轉(zhuǎn)移的預(yù)防或治療作用按照實(shí)施例3中所述建立大腸癌肝轉(zhuǎn)移模型。
小鼠出現(xiàn)大腸癌肝轉(zhuǎn)移后，隨機(jī)分為四組，每組六只1、AAV-EGFP組(1.5×1011vg/只)；2、AAV-HGFK1組(1.5×1011vg/只)；3、AAV-EGFP+Ad-P53(1.5×1011vg/只+2.5×109vp/只)；4、AAV-HGFK1+Ad-P53(1.5×1011vg/只+2.5×109vp/只)。
立即給于治療，動(dòng)物的給藥方法為尾靜脈內(nèi)一次性注射。試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。
圖5A顯示，大腸癌肝轉(zhuǎn)移的動(dòng)物模型中，AAV-HGFK1組以及AAV-EGFP+Adv-p53組的治療效果顯著優(yōu)于AAV-EGFP治療組；而AAV-HGFK1+Adv-p53的組合物治療組的平均生存時(shí)間又顯著長(zhǎng)于AAV-HGFK1組和AAV-EGFP+Adv-p53組，P值小于0.001。圖5B示顯示，AAV-HGFK1+Adv-p53治療組的平均生存時(shí)間超過(guò)61天，而其它各組的平均生存時(shí)間為AAV-EGFP組21天、AAV-HGFK1組30天、AAV-EGFP+Adv-p53組30天。此動(dòng)物模型中，AAV-HGFK1+Adv-p53的組合物治療組的六只動(dòng)物中有一只達(dá)到長(zhǎng)期無(wú)瘤生存；而且肝轉(zhuǎn)移腫瘤全部消除，部分原發(fā)腫瘤消除。
上述結(jié)果表明，AAV-HGFK1組以及AAV-EGFP+Adv-p53組的治療效果顯著優(yōu)于AAV-EGFP治療組；而AAV-HGFK1+Adv-p53的組合物治療組的平均生存時(shí)間顯著長(zhǎng)于AAV-HGFK1組以及AAV-EGFP+Adv-p53組，P值小于0.001；AAV-HGFK1+Adv-p53組合物的治療甚至達(dá)到了完全治愈，使得實(shí)驗(yàn)動(dòng)物長(zhǎng)期無(wú)瘤生存的效果。
實(shí)施例7組合物對(duì)原發(fā)性肝細(xì)胞癌的治療效果在Buffalo大鼠的肝臟上建立原位的肝細(xì)胞癌模型，同實(shí)施例3中的肝細(xì)胞癌動(dòng)物模型。模型建立以后，隨機(jī)分為五組1、PBS緩沖液作為對(duì)照組；2、Adv-p53(2.5×109vp/只)；3、AAV-HGFK1(3×1011vg/只)；4、高劑量AAV-HGFK1(3×1012vg/只)；5、AAV-HGFK1+Adv-p53的組合物(AAV-HGFK1為3×1011vg/只；Adv-p53為2.5×109vp/只)。
確認(rèn)成瘤后立即給藥。給藥途徑包括門(mén)靜脈和腫瘤內(nèi)注射兩種，均為一次性注射。試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。
結(jié)果表明，與對(duì)照組相比較，AAV-HGFK1+Adv-p53的組合物能夠?qū)⑵骄鏁r(shí)間從30天延長(zhǎng)到61天，甚至超過(guò)用10倍的高劑量AAV-HGFK1(3×1012vg/只)來(lái)治療的53天。單用Adv-p53治療組的平均生存時(shí)間為37天。AAV-HGFK1(3×1011vg/只)治療組的平均生存時(shí)間為39天。
實(shí)施例8毒性試驗(yàn)本發(fā)明提供了檢測(cè)AAV-HGFK1重組表達(dá)構(gòu)建體以及Adv-p53、Adv-hTERTC27組成的組合物對(duì)于機(jī)體的毒性的評(píng)價(jià)試驗(yàn)。對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物施用高劑量的所述的組合物。
取成年雄性Buffalo大鼠12只，隨機(jī)分為四組，每組3只1.PBS緩沖液注射組，作為對(duì)照；2.AAV-HGFK1(4.8×1012Vg/只)注射組；3.AAV-HGFK1+Adv-p53(4.8×1012vg/只+1×1010vp/只)注射組；4.AAV-HGFK1+Adv-hTERTC27(4.8×1012vg/只+1×1010vp/只)注射組。
給藥方法為門(mén)靜脈注射以及肝臟內(nèi)注射，均為一次性注射，肝臟內(nèi)注射劑量為門(mén)靜脈注射劑量的三分之一。試驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。
在給藥后第7天和第60天分別檢測(cè)其血清中反映肝功能的指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶以及總膽紅素，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)有肝功能受損害的跡象(圖7A)。
近來(lái)有報(bào)道稱(chēng)腫瘤的抗血管生成治療能造成心肌損害，因此我們還通過(guò)常規(guī)方法檢測(cè)了反映心肌有無(wú)損害的指標(biāo)乳酸脫氫酶、肌酸激酶以及Tn-T。前兩項(xiàng)在正常范圍內(nèi)，TnT也屬正常(痕量，測(cè)不出)。這些都表明心肌無(wú)受損害的跡象(圖7B)。給藥后120天取心肌組織，做H&E染色也未發(fā)現(xiàn)明顯損害(圖7C)。
并且，所有受試的動(dòng)物模型中都未見(jiàn)因?yàn)槊庖叻磻?yīng)而死亡的現(xiàn)象。
實(shí)施例9HGFK1蛋白抗體的制備材料與試劑1).合成多肽RSY KGT VSI TKS GIKC，其序列與HGFK1羧基末端的氨基酸序列一致2).弗氏完全佐劑3).青霉素和鏈霉素4).實(shí)驗(yàn)動(dòng)物兔5).其它材料及試劑操作方法1).免疫方法采用淋巴結(jié)注射法①在兔的兩后足跖部皮下(或皮內(nèi))注射活卡介苗50mg(每側(cè)約0.30ml)。7～10天后，兔跖及腘肌淋巴結(jié)腫大；②于腫大的兩側(cè)淋巴結(jié)內(nèi)各注射加有完全佐劑的所述的合成多肽乳化液0.50ml(含合成多肽5mg/ml、青霉素1000U/ml、鏈霉素1000μg/ml)；③必要時(shí)，14天后，重復(fù)步驟②一次；④再過(guò)7天后，于兩側(cè)淋巴結(jié)內(nèi)各注射加有完全佐劑的所述的合成多肽乳化液0.50ml(含合成多肽5mg/ml、青霉素1000U/ml、鏈霉素1000μg/ml)；⑤5～7天后，耳靜脈采血。測(cè)定血清效價(jià)。
2).效價(jià)測(cè)定 采用瓊脂擴(kuò)散法。
(1)將血清倍比稀釋?zhuān)尤胪庵芸住?br> (2)中間孔加所述的合成多肽。
(3)37℃濕盒瓊擴(kuò)24小時(shí)，觀察結(jié)果。
結(jié)果判定抗HGFK1抗體的效價(jià)測(cè)定瓊脂擴(kuò)散效價(jià)達(dá)1∶16或1∶32者為合格。
雖然本發(fā)明已通過(guò)上述詳細(xì)描述和具體實(shí)施方式
進(jìn)行了說(shuō)明，但本發(fā)明并不受此限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本申請(qǐng)的公開(kāi)結(jié)合公知常識(shí)對(duì)本發(fā)明的方案進(jìn)行等同修飾和變換，它們都應(yīng)屬于本發(fā)明的范圍。
SEQUENCE LISTING<110>林李家宓<120>含腺伴隨病毒介導(dǎo)的抗血管生成因子的組合物及其應(yīng)用<130>06F1109-HXN<160>7<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>270<212>DNA<213>HGFK1 cDNA<400>1atgaactgca tcattggtaa aggacgcagc tacaagggaa cagtatctat cactaagagt60ggcatcaaat gtcagccctg gagttccatg ataccacacg aacacagctt tttgccttcg120agctatcggg gtaaagacct acaggaaaac tactgtcgaa atcctcgagg ggaagaaggg180ggaccctggt gtttcacaag caatccagag gtacgctacg aagtctgtga cattcctcag240tgttcagaag ttgaatgcat gacctgctaa 270<210>2<211>2508<212>DNA<213>p53 cDNA<400>2ccagggagca ggtagctgct gggctccggg gacactttgc gttcgggctg ggagcgtgct60ttccacgacg gtgacacgct tccctggatt ggcagccaga ctgccttccg ggtcactgcc120atggaggagc cgcagtcaga tcctagcgtc gagccccctc tgagtcagga aacattttca180gacctatgga aactacttcc tgaaaacaac gttctgtccc ccttgccgtc ccaagcaatg240gatgatttga tgctgtcccc ggacgatatt gaacaatggt tcactgaaga cccaggtcca300gatgaagctc ccagaatgcc agaggctgct ccccgcgtgg cccctgcacc agcagctcct360acaccggcgg cccctgcacc agccccctcc tggcccctgt catcttctgt cccttcccag420
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<212>DNA<213>IL-2cDNA<400>4atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt60gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat120ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc180acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa240gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta300agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa360acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga420tggattacct tttgtcaaag catcatctca acactgactt ga 462<210>5<211>88<212>PRT<213>HGFK1 protein<400>5Asn Cys Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile1 5 10 15Thr Lys Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His20 25 30Glu His Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn35 40 45Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu50 55 60Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu Val Glu Cys65 70 75 80Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr85
<210>6<211>94<212>PRT<213>HGFK1 protein containing 6 histidines<400>6Asn Cys Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile1 5 10 15Thr Lys Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His20 25 30Glu His Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn35 40 45Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu50 55 60Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu Val Glu Cys65 70 75 80Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr His His His His His His85 90<210>7<211>16<212>PRT<213>HGFK1 polypeptide fragment<400>7Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys Ser Gly Ile Lys Cys1 5 10 1權(quán)利要求
1.用于預(yù)防或治療癌癥的構(gòu)建體，所述構(gòu)建體含有編碼人抗血管生成因子HGFK1的基因與腺病毒表達(dá)載體，其中所述抗血管生成因子HGFK1基因的核酸序列為SEQ ID NO1的核酸序列或其同源序列。
2.用于預(yù)防或治療癌癥的構(gòu)建體，所述構(gòu)建體含有編碼抗血管生成因子HGFK1基因與腺伴隨病毒表達(dá)載體，其中所述抗血管生成因子HGFK1基因的核酸序列為SEQ ID NO1的核酸序列及其同源序列。
3.用于預(yù)防或治療癌癥的組合物，所述組合物包括有效劑量的第一構(gòu)建體，其含有編碼抗血管生成因子的基因與腺伴隨病毒表達(dá)載體；以及腺病毒表達(dá)載體或第二構(gòu)建體，所述第二構(gòu)建體包含選自抑癌基因、抗癌基因和細(xì)胞因子的基因或其組合的基因與腺病毒表達(dá)載體。
4.如權(quán)利要求3所述的組合物，其中所述抗血管生成因子基因選自具有SEQ ID NO1核酸序列的人抗血管生成因子HGFK1核酸序列或其同源序列。
5.如權(quán)利要求3或4所述的組合物，其中所述抗血管生成因子基因編碼選自具有SEQ ID NO5、SEQ ID NO6及其同源序列的氨基酸序列的人抗血管生成因子HGFK1。
6.如權(quán)利要求3-5中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述腺伴隨病毒表達(dá)載體為AAV。
7.如權(quán)利要求3-6中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述抑癌基因選自核酸序列為SEQ ID NO2的p53基因及其同源序列。
8.如權(quán)利要求3-7中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述抗癌基因選自核酸序列為SEQ ID NO3的hTERT C27基因及其同源序列。
9.如權(quán)利要求3-8中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述細(xì)胞因子基因選自核酸序列為SEQ ID NO4的IL-2基因及其同源序列。
10.權(quán)利要求3-9中任一權(quán)利要求所述組合物在制備用于預(yù)防或治療癌癥藥物中的用途，所述癌癥為實(shí)體腫瘤。
11.如權(quán)利要求10所述用途，其中所述癌癥選自肝細(xì)胞癌、直腸結(jié)腸癌和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞癌。
12.如權(quán)利要求10或11所述的用途，其中所述癌癥為原發(fā)性癌癥或轉(zhuǎn)移性癌癥。
13.權(quán)利要求1中所述的構(gòu)建體Adv-HGFK1在制備用于治療癌癥以及預(yù)防癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的藥物中的用途。
14.權(quán)利要求2中所述的構(gòu)建體AAV-HGFK1在制備用于治療癌癥以及預(yù)防癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的藥物中的用途。
15.如權(quán)利要求13和14所述用途，其中所述癌癥選自肝細(xì)胞癌、直腸結(jié)腸癌和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞癌。
16.由選自抗血管生成因子HGFK1及其免疫原性片段的多肽產(chǎn)生的抗所述抗血管生成因子HGFK1的抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供腺伴隨病毒載體以及腺病毒載體介導(dǎo)的表達(dá)抗血管生成因子HGFK1的構(gòu)建體AAV－HGFK1及Adv－HGFK1，本發(fā)明還提供含有構(gòu)建體AAV－HGFK1與腺病毒載體介導(dǎo)表達(dá)抗癌基因、抑癌基因或細(xì)胞因子的構(gòu)建體的組合物。本發(fā)明的構(gòu)建體或組合物可用來(lái)治療、控制或預(yù)防原發(fā)性癌癥與轉(zhuǎn)移性癌癥。本發(fā)明還涉及所述的構(gòu)建體或組合物在制備用于預(yù)防或治療癌癥的藥物中用途。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1958075SQ20061014034
公開(kāi)日2007年5月9日 申請(qǐng)日期2006年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月27日
發(fā)明者林李家宓, 沈贊, 孔祥復(fù) 申請(qǐng)人:林李家宓