經(jīng)修飾的腺伴隨病毒載體組合物的制作方法
【專利說明】經(jīng)修飾的腺伴隨病毒載體組合物
[0001] 相關(guān)申請 本專利申請要求享有于2012年7月6日提交的美國申請系列號61/668, 839的優(yōu)先權(quán) 權(quán)益，所述申請通過引用并入本文。
[0002] 序列表 本申請包含序列表，所述序列表已通過EFS-Web以ASCII格式遞交，并且以其整體通過 引用并入本文。所述ASCII副本，于2013年3月14日生成，命名為17023. 126W01_SL.txt， 并且大小為39, 125字節(jié)。
[0003] 背景 腺伴隨病毒（AAV)是細小病毒科(parvoviridae family)的小的非致病病毒。AAV通 過其依靠輔助病毒進行復(fù)制而與該科其他成員區(qū)別。AAV的約5kb基因組由一段正或負極 性的單鏈DNA組成。基因組的末端是短的反向末端重復(fù)，其可以折疊為發(fā)夾結(jié)構(gòu)并且作為 病毒DNA復(fù)制起點。在物質(zhì)上（Physically)，細小病毒病毒體是無包膜的并且其二十面的 衣殼直徑約20nm。
[0004] 迄今為止，已經(jīng)鑒定很多種血清學(xué)上不同的AAV，并且已經(jīng)從人或靈長類 中分離。Govindasamy 等，"Structurally Mapping the Diverse Phenotype of Adeno-Associated Virus Serotype 4，，' J 80 (23):11556-11570 (2006)。例如， AAV2的基因組長度為4680個核苷酸并且包含兩個可讀框（ORF)。左側(cè)的ORF編碼非結(jié)構(gòu)性 的R印蛋白，R印40、R印52、R印68和R印78,它們除了涉及單鏈的后代基因組的產(chǎn)生， 還涉及復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)。R印68/78同樣顯示出具有NTP結(jié)合活性和DNA和RNA解旋酶活 性。Rep蛋白具有核定位信號和幾個潛在的磷酸化位點。這些激酶位點之一的突變，導(dǎo)致復(fù) 制活性的丟失。
[0005] 基因組的末端是短的反向末端重復(fù)（ITR)，所述反向末端重復(fù)具有潛力以折疊為 作為病毒DNA復(fù)制起點的T形發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在ITR區(qū)中已描述對于ITR功能重要的兩個元件， GAGC重復(fù)基序和末端解離位點（trs)。重復(fù)基序已顯示出當(dāng)ITR為線性或發(fā)夾構(gòu)象時均結(jié) 合R印。該結(jié)合作用于位置R印68/78用于在trs切割，其以位點和鏈特異性的方式發(fā)生。
[0006] AAV的以下特征使得其成為用于基因轉(zhuǎn)移的有吸引力的載體。AAV載體具有廣 泛的宿主范圍；在體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂的和不分裂的細胞，并且維持轉(zhuǎn)導(dǎo)基因高水平的表 達。病毒顆粒是熱穩(wěn)定的、耐溶劑的、耐去污劑的、耐PH變化的、耐溫度變化的，并且可以在 CsCl梯度中濃縮。AAV不與任何致病事件有關(guān)，并且使用AAV載體轉(zhuǎn)導(dǎo)沒有發(fā)現(xiàn)對細胞生 長或分化誘導(dǎo)任何持續(xù)的負面影響。ITR已顯示為是允許完全去除病毒基因以產(chǎn)生載體系 統(tǒng)的包裝所需的唯一順式（cis)元件。
[0007] 目前需要具有改進的包裝特征的AAV載體。
[0008] 概沭 在某些實施方案中，本發(fā)明提供腺伴隨病毒（AAV)填充物（filler)組分(也稱為"填充 片段（stuffer)序列")，其包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有至少90%同一性的長 度為3300-4200個核苷酸的核酸。
[0009] 在某些實施方案中，本發(fā)明提供腺伴隨病毒（AAV)填充物組分，其由與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:2具有至少90%同一性的長度為3300-4200個核苷酸的核酸組成。
[0010] 在某些實施方案中，本發(fā)明提供AAV載體，其包含上述填充物組分。
[0011] 附圖和表格簡述 圖1是5pFBAAVmU6miHDSl填充片段（9110bp)的質(zhì)粒圖譜。
[0012] 圖2是5pFBAAVmU6miHDSl填充片段(填充片段#1) (SEQ ID N0:3)的序列。
[0013] 圖3提供5pFBAAVmU6miHDSl填充片段（SEQ ID NO: 1，4-11)的各種單獨組分的 序列。
[0014] 圖4是顯不相對Htt表達的圖。
[0015] 圖5是5pFBAAVmU6miHDSl-填充片段的質(zhì)粒圖譜。
[0016] 圖 6 是 5pFBAAVmU6miHDSl-填充片段（SEQ ID NO: 12)的質(zhì)粒序列。
[0017] 圖7提供填充片段序列(填充片段#2) (SEQ ID NO: 2)。
[0018] 圖8.完整病毒體相對于空病毒體的EM評估。兩個空病毒體的實例通過箭頭突出 顯示。該制備物只具有~4%的空病毒體，這是非常低的。
[0019] 圖9.銀染色以檢測純化的病毒體的衣殼完整性。幾種不同的miRNA-表達構(gòu)建體 與內(nèi)含子Ι/Π 填充片段一同工程化入穿梭載體以生成接近野生型基因組大小。純化的病 毒顯示出最佳的VPI、VP2和VP3蛋白比例。
[0020] 表I. miR-內(nèi)含子1/II病毒體的包裝效率％和污染物％。
[0021] 詳沭 AAV載體和表汰盒 本發(fā)明的病毒載體利用AAV載體。"AAV"載體指腺伴隨病毒，并且可以用來指天然存在 的野生型病毒本身或其衍生物。除非另有要求，該術(shù)語涵蓋全部亞型、血清型和假型，以及 天然存在和重組形式。如本文使用的，術(shù)語"血清型"指這樣的AAV，所述AAV通過基于衣殼 蛋白與確定的抗血清(例如，存在8種已知的靈長類AAV血清型，AAV-I至AAV-8)的反應(yīng)性 進行鑒定并區(qū)別于其他AAV。例如，血清型AAV-2用于指這樣的AAV，所述AAV包含從AAV-2 的cap基因編碼的衣殼蛋白和含有來自相同AAV-2血清型的5'和3' ITR序列的基因組。
[0022] 假型AAV指包含來自一種血清型的衣殼蛋白和包括第二種血清型的5'-3' ITR的 病毒基因組的AAV。假型rAAV期望具有衣殼血清型的細胞表面結(jié)合特性和與ITR血清型一 致的遺傳特性。假型rAAV使用本領(lǐng)域描述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)生產(chǎn)。如本文所用的，例如，rAAVl可 以用于指具來自相同血清型的衣殼蛋白和5' -3' ITR的AAV，或其可以指具有來自血清型1 的衣殼蛋白和來自不同AAV血清型(例如AAV血清型2)的5' -3' ITR的AAV。
[0023] 縮寫"rAAV"指重組腺伴隨病毒，同樣指重組AAV載體(或"rAAV載體")。在一個 實施方案中，AAV表達載體使用已知技術(shù)構(gòu)建，以至少提供在轉(zhuǎn)錄方向上的可操作地連接的 組分，包括轉(zhuǎn)錄起始區(qū)、目標(biāo)DNA和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的控制元件。選擇在哺乳動物細胞中有功能 的控制元件。產(chǎn)生的包含可操作地連接的組分的構(gòu)建體側(cè)接（5'和3'）有功能的AAV ITR 序列。
[0024] "腺伴隨病毒反向末端重復(fù)"或"AAV ITR"意指在AAV基因組每一端發(fā)現(xiàn)的本領(lǐng)域 公知的區(qū)域，其以順式一同作為DNA復(fù)制起點并且作為病毒的包裝信號。
[0025] 已知AAV ITR區(qū)的核苷酸序列。如本文使用的，"AAV ITR"不需要具有描述的野 生型核苷酸序列，但是可以被改變，例如，通過核苷酸的插入、刪除或取代。此外，AAV ITR 可以來自幾種AAV血清型中的任一種，包括但不限于，AAV-I、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、 AAV7等。此外，在AAV載體中側(cè)接所選擇的核苷酸序列的5'和3' ITR不需要一定相同或 源自相同的AAV血清型或分離物，只要它們的功能如預(yù)期的，S卩，允許刪除和拯救來自宿主 細胞基因組或載體的目的序列。
[0026] AAV ITR可以從包含其的AAV載體質(zhì)粒中切除，并使用標(biāo)準(zhǔn)連接技術(shù)融合存在 于另一個載體中的所選核酸構(gòu)建體的5'和3' ，例如Sambrook和Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor, NY (2001)中描述的那些。例如，連接可以在20 mM Tris-Cl pH 7. 5、10 mM MgC12、 10 mM DTT、33 Pg/ml BSA、10 mM-50 mM NaCl 中與 40 μΜ ΑΤΡ、0·01-0·02 (Weiss)單位 T4 DNA連接酶在(TC (用于"粘性末端"連接）或與I mM ΑΤΡ、0·3-0·6 (Weiss)單位T4 DNA連接酶在14°C (用于"平末端"連接）完成。分子間的"粘性末端"連接通常在總DNA 濃度30-100 Pg/ml (總終濃度5-100 nM)實施。包含ITR的AAV載體在例如美國專利號 5, 139, 941中描述。特別地，在其中描述了幾種可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心("ATCC"）在 檢索號 53222、53223、53224、53225 和 53226 下得到的 AAV 載體。
[0027] 腺伴隨病毒優(yōu)選地包裝全長基因組，即近似天然基因組相同大小并且不太大或太 小的基因組。很多靶核酸序列或編碼靶核酸序列的表達盒非常小。為避免包裝片段化的基 因組，本發(fā)明人設(shè)計并測試了當(dāng)連接至表達盒時在ITR之間產(chǎn)生長度上大小接近于正常的 基因組的核酸序列。起始序列是哺乳動物起點，但是顯著地修飾以確保該"填充物組分"(也 稱為"填充片段序列"）除其他之外缺乏增強子、啟動子、剪接調(diào)節(jié)子、非編碼RNAs或反義序 列。也就是說，填充片段序列是"沉默的"并且對表達盒不賦予活性。
[0028] 在本發(fā)明中，用于AAV載體的合適的DNA分子將包括，例如，填充片段序列和編 碼本發(fā)明siRNA分子的表達盒。很多表達盒非常小，例如那些表達抑制RNAs (siRNAs和 shRNAs)的表達盒。因此，有必要添加序列至盒，從而構(gòu)成全長或接近全長的AAV基因組。 如果只有小基因組用于AAV生產(chǎn)，則重組病毒體會是異質(zhì)的并且包含各種大小基因組。這 是因為病毒喜歡包裝全長基因組，所以它會挑取其他DNA片段以填充空間。填充片段不能 太大，因為高于野生型基因組大小的105%的AAV基因組將通常不能包裝。
[0029] 在某些實施方案中，本發(fā)明提供腺伴隨病毒（AAV)填充物組分(也稱為"填充片段 序列")，其包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2具有至少90%同一性的長度為3300-4200 個核苷酸的核酸。 {SEQ10 ΝΟ?) GAAlirriGGCTAirCCAGGlTOCCIlWirrCATCGCAAATGGGACGTIAAGAGeCiCAGACiAGAAl' Λ??1ΛΛ〔ΑαΑΛΑΟ?ΤΤ€ΤΑΑ;ΓΑΠ?01Χ、Α.Τ-Π-ΑΛ?ΟΤ?ΤΑΜ:; 丁 AntiWCTTTBT AAACtCTCC ATWTTTrfCCAGGAATTGCTGCiACM^riTGGCTTCX)TG 丁 GTCnrTGAGGACf'GTAGGCCATG CTAG〇nOTG〇TTiTAGGT€icAciGTGCirrrrcTriC)(nTiiT：iccrrric：Trc^rrrcc:CA'rc,TCCTCTT CTTlXJTITCCAGCCATrrCIXrCrTATGClTAAGTTrOGTGCAGCACiCIGTTTGGCIOCTCTC^AGATT CCTOCTTCCTCAOATGCTOTArilTClTrAGGCCCAGCCiGGCTGGCAGCOGGA