專利名稱：蛋白質(zhì)輸送系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及非基因物質(zhì)到細(xì)胞的輸送，尤其涉及蛋白質(zhì)物質(zhì)到細(xì)胞的輸送。
技術(shù)背景目前，遺傳性或后天性疾病，比如囊性纖維化或癌癥的基因療法普遍涉及 兩種治療序列的輸送方法之一。第一種方法使用裸核酸或非病毒載體，其通常 是膠囊化的脂質(zhì)體或脂質(zhì)體復(fù)合物。第二種方法使用病毒載體。病毒載體可以是非結(jié)合的，如腺病毒(Ad)或皰疹病毒(HSV);病毒載體也可以是結(jié)合的， 如腺伴隨病毒(AAV)與變性病毒(例如MLV)。在Ad與HSV的情況下，治 療基因的表達(dá)只是瞬時(shí)的。在結(jié)合載體的情況下，如變性病毒或AAV，表達(dá)是 長(zhǎng)期的(理論上細(xì)胞壽命期限)。這些基因治療方法具有幾個(gè)缺點(diǎn)。裸核酸或與脂質(zhì)體復(fù)合的核酸到細(xì)胞的 傳輸效率是極低的。逆轉(zhuǎn)錄載體可以結(jié)合進(jìn)受體基因組的致瘤區(qū)域，這種結(jié)合 可能導(dǎo)致白血病及或癌癥。非結(jié)合載體的致癌風(fēng)險(xiǎn)低，然而其只能保證治療基 因的瞬時(shí)表達(dá)，因此僅具有短暫的治療價(jià)值。病毒載體必然引起抗體中和或遭 遇其受體中原有抗體，這限制基因轉(zhuǎn)移的效率和轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞生命期限。所有病毒 載體，即使是有復(fù)制缺陷的，在理論上都具有恢復(fù)復(fù)制型，和/或與同時(shí)存在 于相同受體中的同樣或相關(guān)族系的另一病毒重組的可能性。盡管這種情況發(fā)生 的可能性較小，它還是可能產(chǎn)生具有未知復(fù)制能力、致病性與繁殖潛力的新病 毒種類。最終，所有這些技術(shù)都涉及一般意義上的遺傳物質(zhì)，尤其是DNA到受 體細(xì)胞的傳輸。這種物質(zhì)的傳輸涉及生物學(xué)風(fēng)險(xiǎn)，因此要求對(duì)生物安全性的慎 重考慮。為了解決這些問題，正在開發(fā)更安全更有效的核酸傳輸?shù)暮铣奢d體。對(duì)病 毒載體的修飾工作也正在進(jìn)行，以減少其免疫影響，并控制其在宿主細(xì)胞中的 聚集位點(diǎn)。與體外基因治療相結(jié)合的干細(xì)胞技術(shù)也正在開發(fā)。有許多具體的情況，例如，在細(xì)胞分化或組織發(fā)育中，只需要某個(gè)特定的 基因的瞬時(shí)表達(dá)。舉例來說，人體中肺腺泡的形成是產(chǎn)后的現(xiàn)象，其可以被在
此期間發(fā)生的幾種類型的攻擊所改變。這種攻擊包括高壓氧治療，機(jī)械通氣，細(xì)菌或病毒感染。支氣管一肺發(fā)育不良(BPD)是肺泡發(fā)展的病變，這是在早產(chǎn)新生兒中出現(xiàn)的主要的呼吸困難并發(fā)癥。肺泡上皮細(xì)胞的異常增生與肺部微脈管化的發(fā)育異常在BPD生理病理學(xué)中起了至關(guān)重要的作用。刺激肺泡上皮細(xì) 胞增生并控制細(xì)胞凋亡的角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因素(KGF)和控制微脈管化過程的血 管內(nèi)皮生產(chǎn)因子(VEGF)是涉及正常肺泡發(fā)育的兩個(gè)主要因子，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)BPD 發(fā)生時(shí)，這些因子的表達(dá)減少。因此，這些因子是基因治療的潛在靶點(diǎn)。肺泡 發(fā)育的瞬時(shí)性導(dǎo)致短暫的治療時(shí)間，這特別適合于通過非結(jié)合載體，例如腺病 毒，進(jìn)行的瞬時(shí)轉(zhuǎn)基因表達(dá)。其它瞬時(shí)基因表達(dá)的實(shí)例在組織分化與增生的過程中是常見的，細(xì)胞基因 或生長(zhǎng)因子受體在細(xì)胞周期的某些時(shí)期活化與去活化，這兩種情況引起了事件 順序的微調(diào)。在許多存在單一遺傳性缺陷的單一瞬時(shí)表達(dá)的蛋白質(zhì)中，突變基因的野生 型等位基因的瞬時(shí)表達(dá)可以充分修正這種遺傳缺陷引起的整個(gè)病理。一種替代方法是非缺陷的生物活性基因產(chǎn)物，肽和/或天然構(gòu)象的蛋白質(zhì) 的直接傳輸(Ford等.Gene Ther. 2001 ， 8:1-4; Dalkara等，Mol. Ther. 2004 ， 9: 964-969)。雖然傳輸?shù)乃巹┎粫?huì)與基于載體的核酸持續(xù)到同樣程度，但是其應(yīng)該 能夠持續(xù)足夠長(zhǎng)時(shí)間，從而在短暫的治療時(shí)間內(nèi)具有效力。治療蛋白質(zhì)到細(xì)胞的輸送具有核酸輸送所不具有的某些優(yōu)點(diǎn)。由于這些蛋 白質(zhì)可以被選中以在翻譯后修飾(例如糖化，磷酸化)存在的情況下正確地?cái)y 帶它們，并具有與受體相同的起源，其將很好地與受體相容并且不會(huì)引起任何 免疫原反應(yīng)。這將允許反復(fù)的給藥。如上所述，基于基因治療的病毒的主要缺 點(diǎn)是載體的免疫原性不但載體可以促使對(duì)其本身的即時(shí)有害反應(yīng)，而且免疫 防護(hù)可以發(fā)展到超過一定程度，而致使病毒載體的反復(fù)給藥變得無效。治療蛋 白質(zhì)的致癌結(jié)合也是不可能的，對(duì)所有病毒載體都沒有這種情況。而且，治療 蛋白的輸送意味著轉(zhuǎn)錄，翻譯與翻譯后修飾以及胞內(nèi)輸送/靶向?qū)?zhǔn)到具體的 細(xì)胞區(qū)室(例如受體與細(xì)胞表面分子的質(zhì)膜，或核轉(zhuǎn)錄因子的原子核)的細(xì)胞運(yùn)轉(zhuǎn) 的被跳過?？梢灶A(yù)測(cè)這將減少對(duì)細(xì)胞的壓力。雖然希望如此，但是運(yùn)送足夠數(shù)量的蛋白質(zhì)到細(xì)胞卻難以實(shí)現(xiàn)。已經(jīng)嘗試 過脂質(zhì)體調(diào)節(jié)技術(shù)Owais等(Eur. J. Biochem， 2000， Vol 267: 3946-3956)已經(jīng)用脂質(zhì)體中的促融合脂類促進(jìn)與受體細(xì)胞的融合并導(dǎo)致膠囊化的蛋白質(zhì)的輸 送。在專利US 5631237中，仙臺(tái)病毒(Sendaivims)蛋白質(zhì)被用于促進(jìn)脂質(zhì)體 與受體細(xì)胞的融合。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明采取一種替換方法來解決非遺傳物質(zhì)到細(xì)胞的輸送問題。尤其是利 用類病毒粒子(VLPs)作為膜結(jié)合蛋白與非膜結(jié)合蛋白的運(yùn)載工具。VLPs的結(jié)構(gòu)類似病毒粒子，但是沒有病毒基因組。因此，其不能復(fù)制，沒 有致病性。該粒子通常包含至少一種類型的來自病毒的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。在大多數(shù) 情況下，這種蛋白質(zhì)會(huì)形成蛋白質(zhì)衣殼(例如VLPs包含變性病毒，腺病毒或 噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì))。在某些情況下，該衣殼也被包裹在源自細(xì)胞的脂質(zhì)雙分子 層里，其中組裝VLP已經(jīng)被釋放(例如，VLPs包括人類免疫缺乏病毒結(jié)構(gòu)蛋白 質(zhì)，諸如Gag)。當(dāng)編碼某種病毒結(jié)構(gòu)蛋白的基因在未受到其它病毒基因感染的宿主細(xì)胞中 過度表達(dá)時(shí)，通常形成VLPs。在胞質(zhì)液中，按照類似于^m^/ &病毒粒子的組 裝過程，結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組裝進(jìn)入VLP中。當(dāng)然，沒有其它病毒基因在場(chǎng)，真正的 病毒粒子不能形成。VLPs的形成導(dǎo)致其從宿主細(xì)胞中釋放。這可能是通過細(xì)胞 溶解作用進(jìn)行的。在VLPs來自包膜病毒的情況時(shí)，這個(gè)過程是通過從宿主細(xì)胞 出芽，這造成VLP被脂質(zhì)雙分子層包裹。現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)包膜的類病毒粒子可以被設(shè)計(jì)成促融合的，并因此能將膜結(jié) 合與非膜結(jié)合的蛋白質(zhì)都輸送到細(xì)胞。因此， 一方面，本發(fā)明提供一種具有質(zhì)膜衍生的脂質(zhì)雙分子層包膜的類病 毒粒子(VLP)，該VLP進(jìn)一步的包括a) 能形成包膜VLP的病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，或其片段或衍生物；b) 促融合蛋白質(zhì)；c) 重組靶蛋白。術(shù)語"質(zhì)膜衍生的脂質(zhì)雙分子層包膜"是指從VLP已經(jīng)被釋放的宿主細(xì)胞的 質(zhì)膜衍生的脂質(zhì)雙分子層。該包膜部分或全部地包裹VLP。 VLP最好完全地(或 幾乎完全地)包裹在包膜內(nèi)。脂質(zhì)雙分子層將具有相當(dāng)于宿主細(xì)胞質(zhì)膜組合物
的高分子組成。雙分子層中同樣的脂類、蛋白質(zhì)與碳水化合物的比例將很相似。 這樣的大分子包括跨膜受體和通道(比如受體激酶和離子通道)，細(xì)胞骨架蛋白 質(zhì)(比如肌動(dòng)蛋白)，脂質(zhì)或連接碳水化合物的蛋白質(zhì)，磷脂(比如磷脂酰膽堿， 絲氨酸磷脂和腦磷酯)及膽固醇。該組合物將是復(fù)雜的并有別于諸如脂質(zhì)體的 人工雙分子層制劑的典型成分。脂質(zhì)體通常包括少量不同類型的脂類。這是在 這些脂類的水懸浮液經(jīng)超聲后自發(fā)形成。脂質(zhì)體將包裹一部分水溶液，因此脂 質(zhì)體可以通過包裹水溶液中的酶作用物而在內(nèi)部充填那些物質(zhì)。脂質(zhì)體也可以 用植入雙分子層的跨膜蛋白質(zhì)制造，然而技術(shù)限制表明，可以被歸入脂質(zhì)體的 蛋白質(zhì)的數(shù)量與多樣性被嚴(yán)重縮減。因此，考慮到其復(fù)雜性，技術(shù)人員會(huì)認(rèn)為它與本發(fā)明的VLPs的質(zhì)膜衍生的脂質(zhì)雙分子層具有明顯差異。而且，脂質(zhì)體形成的自發(fā)性導(dǎo)致組分(即脂類與蛋白質(zhì))大量無序的與均勻的排列。相反，由于是從本身具有有序性的質(zhì)膜衍生得到，本發(fā)明的VLPs 的脂質(zhì)雙分子層組分將合理地排序。在優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的VLP的質(zhì)膜衍生的脂質(zhì)雙分子層包含至少四種， 更優(yōu)選至少六種，最優(yōu)選至少八種不同類型的脂類。其中優(yōu)選的脂類類型是絲 氨酸磷脂。本發(fā)明VLPs的脂質(zhì)雙分子層包含20%到60%絲氨酸磷脂，更優(yōu)選 為30%到50%，最優(yōu)選為大約40%.在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的VLP的質(zhì)膜衍生的脂類雙分子層包含至 少四種，更優(yōu)選至少六種，最優(yōu)選至少八種不同類型的蛋白質(zhì)。"類病毒粒子"，其意思是類似病毒粒子的結(jié)構(gòu)，但是缺少病毒基因組，不 能復(fù)制并且沒有致病性。該粒子通常包含至少一種類型的來自病毒的結(jié)構(gòu)蛋白 質(zhì)。優(yōu)選僅一種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)存在。最優(yōu)選沒有其它的病毒的非結(jié)構(gòu)組分存在。 本發(fā)明的VLPs包括質(zhì)膜衍生的脂類雙分子層包膜。 、"病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)"是一種蛋白質(zhì)，其有助于衣殼蛋白或病毒的蛋白質(zhì)核 心的整體結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)可以從能形成包膜VLPs的任何病毒獲 得。這些通常是來自天然包膜病毒的蛋白質(zhì)。這種病毒包括，但是不局限于， 逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如fflV， Moloney小鼠白血病病毒，貓白血病病毒，Rous肉瘤 病毒)，冠狀病毒，皰疹病毒，嗜肝DNA病毒及正黏液病毒(例如流感病毒)。 然而，天然的非包膜的病毒也可以形成包膜VLPs，這些也包括在本發(fā)明中。天然非包膜病毒包括小核糧核酸病毒，呼腸孤病毒，腺病毒，乳頭瘤病毒和細(xì)小病毒o優(yōu)選結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)是逆轉(zhuǎn)錄病毒Gag蛋白質(zhì)。特別優(yōu)選的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的是對(duì) 應(yīng)于HIV-1 Gag基因的蛋白質(zhì)。這是因?yàn)镚agVLPs的制造與組裝是很高效的， 并且這些VLPs具有低的細(xì)胞毒性。慢病毒屬fflV-l的Gag基因?yàn)槎嗟鞍譖r 55Gag解碼，該多蛋白Pr 55Gag是結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)p17載體(MA)， p24衣殼(CA)， p7殼包核酸(NC)與p6的前體。Gag在成熟時(shí)被切為獨(dú)立蛋白質(zhì)，fflV-l的 傳染性病毒體，然而，在Gag VLPs中Gag保持為單一的蛋白質(zhì)，因?yàn)闆]有要 求的病毒蛋白酶。機(jī)理依據(jù)及Gag VLP形成中涉及的蛋白質(zhì)在先有技術(shù)中進(jìn)行 了廣泛的論述。(見Carridre等，1995， Virol.75: 2366-2377; Wilk等，2001， 3. Virol. 75:759-77130 ; US 2002/0052040 ; Chazal與Gerlier ， 2003 Microbiol .Molec .Biol. Rev. 67:226-237 ; Hong 與 Boulanger ， 1993 J.Virol.67:2787-2798; Royer等，1992 J,Virol.66:3230-3235; Spearman等,1994 J. Virol.68:3232-3242及其引用的參考資料)因此，在優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種具有質(zhì)膜衍生的脂質(zhì)雙分子層包 膜的VLP，該VLP進(jìn)一步包括a) 能形成包膜VLP的fflV-lGag，或其片段或衍生物；b) 促融合蛋白質(zhì)；c) 重組耙蛋白。如同HIV-lGag的情況，術(shù)語"結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)"包含的是親結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，其中 結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)是經(jīng)親蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)多蛋白翻譯后分裂制造的，其中多結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì) 源自于單一縮多氨酸。這些蛋白質(zhì)可能不需要被切開就能形成VLP。在本發(fā)明中包括的這些天然結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的片段與衍生物保持形成VLPs的 能力。技術(shù)人員會(huì)知道如何確定具體的片段或衍生物是否保持形成VLPs的能 力。例如見Carr^re等，1995 J. Virol,69:2366-2377與Wilk等，2001 J.Virol.75:759-77130及其引用的參考資料(例如Facke等， 1993,J.Viro1 .67,4972-4980)提供的關(guān)于識(shí)別保持形成VLPs能力的Gag區(qū)域與 片段的指導(dǎo)。這種技術(shù)可以很容易地應(yīng)用于其他病毒結(jié)構(gòu)蛋白。這些天然序列 的衍生物，通常具有至少40%，優(yōu)選50%或60%或以上，尤其是70%或80%或
以上的與天然序列的序列同源性。為了實(shí)施本發(fā)明，按照對(duì)該技術(shù)通常理解，"序 列同源性"并不是用來僅指序列一致性，而且是指氨基酸的使用，在相似的物理 特性，諸如電荷與極性的基礎(chǔ)上，這些氨基酸是可互換的。用來自相同物理組 的氨基酸在一個(gè)信號(hào)序列之內(nèi)的氨基酸的取代被認(rèn)為是保守性置換，預(yù)計(jì)不會(huì) 改變信號(hào)肽的活性。因此只用異亮氨酸完全替換亮氨酸將被認(rèn)為具有起動(dòng)程序 的100%"序列同源性"。合適的基團(tuán)是，甘氨酸與丙氨酸；絲氨酸，蘇氨酸，天 門冬酰胺，谷氨酰胺與半胱氨酸；賴氨酸精氨酸與組氨酸；谷氨酸與天冬氨酸； 纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，甲硫氨酸，纈氨酸與異亮氨酸；苯基丙氨酸，色氨酸 與酪氨酸；甲硫氨酸與亮氨酸。序列同源性可以計(jì)算為以下論述的"序列一致性"， 但是允許以上討論的保守性置換。優(yōu)選地，天然的病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的衍生物或其活化片段顯示與天然結(jié)構(gòu)蛋 白質(zhì)或其部分至少50%，優(yōu)選地至少60%或70%，比如選至少80%序列一致性 (例如用SWISS-PROT蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫，用具有可變Pam因子的FASTA pep國(guó)cmp，并且gap creation penalty設(shè)為12.0， gap extension penalty設(shè)為4.0，時(shí) 段具有2氨基酸測(cè)定的那樣)。天然的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，或其片段或衍生物,可以用作融合蛋白，它具有屬于不 同種類，子群族或病毒亞科的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一種或更多的結(jié)構(gòu)域的(例如慢病 毒屬與spumavirus;見Carridre等，supra)，或具有非病毒蛋白質(zhì)序列。VLP通常包括病毒結(jié)構(gòu)蛋白的多重拷貝(Briggs,J.A.,等，2004.Nat StructMol. Biol. 11:672-675)。優(yōu)選地，VLP將包括病毒結(jié)構(gòu)蛋白的至少2000次拷貝，更優(yōu) 選為至少3000次拷貝，最優(yōu)選為至少4000次拷貝。術(shù)語"促融合蛋白"是指一種病毒蛋白質(zhì)，其可以促使VLP的質(zhì)膜衍生的 包膜與受體細(xì)胞膜融合。正是這個(gè)機(jī)理導(dǎo)致VLP的蛋白質(zhì)組分進(jìn)入到胞質(zhì)液。 眾所周知，核糖核酸病毒與變性病毒的包膜糖蛋白結(jié)合到細(xì)胞受體，并引發(fā)融 合。因此這些蛋白質(zhì)是這些病毒的傳染性的原因。促融合蛋白質(zhì)的其它實(shí)例包 括，但是不局限于，流行性感冒血球凝集素(HA)，呼吸道合胞病毒融合蛋白標(biāo) 記物(RSVFP)，蜱傳腦炎病毒(IBEV)的E蛋白與登革熱病毒，Semliki Forest virus 的El蛋白(SFV)，狂犬病病毒與水泡性口膜炎病毒(VSV)的G蛋白與baculovims gp 64(Guibinga GHFriedmann T., 2004,Mol. Ther.l 1:645-651)。這些蛋白質(zhì)的功能
等效片段或衍生物也可以使用。功能等效片段或衍生物應(yīng)當(dāng)保留野生型蛋白質(zhì)的至少50%，更優(yōu)選至少75%，最優(yōu)選為至少90%的促融合活性。特別優(yōu)選的是水泡性口膜炎病毒的包膜糖蛋白(VSV-G)。VSV-G具有高度促 融合活性，并且實(shí)際上所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以通過其質(zhì)膜糖蛋白的碳水化物部 分結(jié)合VSV-G。沒有希望按照理論被結(jié)合，VSV-G-細(xì)胞表面交互作用的分子機(jī) 制由附件組成，其跟隨細(xì)胞膜與病毒包膜之間的膜融合步驟。這種方法已經(jīng)被 流感病毒血球凝集素與宿主細(xì)胞質(zhì)膜很好地證明(Hunter， E. 1997.Viral entry and receptors (病毒進(jìn)入與受體)，in Retroviruses (在逆轉(zhuǎn)錄病毒中)，Cold Spring Harbor Laboratory Press (冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版)，New York (紐約)。)。因此，在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明提供具有質(zhì)膜衍生的脂質(zhì)雙分子層包 膜的VLP，該VLP進(jìn)一步的包括a) 能夠形成包膜VLP的病毒結(jié)構(gòu)蛋白，或其片段或衍生物；b) 能夠促進(jìn)包膜與受體細(xì)胞膜的融合的水泡性口膜炎病毒的包膜糖蛋白 (VSV-G)，或其片段或衍生物；c) 重組靶蛋白。優(yōu)選的促融合蛋白是與病毒結(jié)構(gòu)蛋白異種的。術(shù)語"異種的"是指正被討 論的蛋白質(zhì)的生物學(xué)來源與具有不同的生物學(xué)來源的每一蛋白質(zhì)來源的事實(shí)。 例如，如果結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)是HIVl結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，那么促融合蛋白質(zhì)不是fflVl促融 合蛋白質(zhì)。在具體的優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種具有質(zhì)膜衍生的脂質(zhì)雙分子層包 膜的VLP，該VLP進(jìn)一步的包括a) 能夠形成包膜VLP的HIV 1 Gag，或其片段或衍生物；b) 能夠促進(jìn)包膜與受體細(xì)胞膜的融合的水泡性口膜炎病毒的包膜糖蛋白 (VSV-G)，或其片段或衍生物；c) 重組靶蛋白。促融合蛋白質(zhì)可以是上述天然蛋白質(zhì)之一的片段或衍生物。這些天然序列 的衍生物將具有至少40%，優(yōu)選為50或60%或以上，特別是70或80%或以上 天然序列的序列同源性。優(yōu)選地，天然的病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的衍生物或其活化片段顯示與天然結(jié)構(gòu)蛋 白質(zhì)或其部分至少50%，優(yōu)選地至少60%或70%，比如至少80%序列一致性(例 如用SWISS-PROT蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫，用具有可變Pam因子的FASTApep-cmp， 并且gap creation penalty設(shè)為12.0， gap extension penalty設(shè)為4.0， 時(shí)段具有2 氨基酸)。通過重組體，這意味著靶蛋白是通過重組體編碼序列編碼的，而不是天然 的存在于釋放VLPs的受體的質(zhì)膜衍生的脂質(zhì)雙分子層中。術(shù)語"靶蛋白"是指輸送到受體細(xì)胞的蛋白質(zhì)。這種蛋白質(zhì)可能包括受體 細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，受體細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的不同種類或克隆版本的蛋白質(zhì)。本 發(fā)明優(yōu)選的靶蛋白與受體細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)狀態(tài)相同，其表達(dá)方式是翻譯后 修飾，這與受體細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的相同。這種修飾包括糖化或添加輔酶基或形成四 級(jí)結(jié)構(gòu)的脂類修飾。最優(yōu)選的將是野生型蛋白質(zhì),其相當(dāng)于在變異形式中發(fā)現(xiàn)的 或受體細(xì)胞缺乏的蛋白質(zhì)。重組靶蛋白可能是膜蛋白或非膜蛋白。膜蛋白的非限制性的例子，包括離 子通道，諸如囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(CFTR)，具有酪氨酸激酶活性的受 體諸如PDGF-受體與SCF-R受體(干細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體，或c-kit或CD117)， G-蛋白聯(lián)接受體，諸如腎上腺素能受體。非膜蛋白的非限制性實(shí)例包括胞質(zhì)蛋白， 諸如肌動(dòng)蛋白,Ras， BRKl/2與核內(nèi)蛋白，諸如類固醇受體與組蛋白。優(yōu)選并入 本發(fā)明的VLPs的膜蛋白是具有單一跨膜結(jié)構(gòu)域(又名類型1膜蛋白)的蛋白和具 有短的胞質(zhì)尾區(qū)的蛋白。類型1膜蛋白的特別優(yōu)選實(shí)例是SCF-R受體。雖然不 是類型1膜蛋白，CFTR蛋白也是膜蛋白特別優(yōu)選的實(shí)例，其結(jié)合進(jìn)本發(fā)明的 VLPs。因此，在最優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種具有質(zhì)膜衍生的脂質(zhì)雙分子層 包膜的VLP，該VLP進(jìn)一步的包括a) 能夠形成包膜VLP的HIV 1 Gag，或其片段或衍生物，；b) 能夠促進(jìn)包膜與受體細(xì)胞膜融合的水皰性口腔炎病毒的包膜糖蛋白 (VSV-G)或其片段或衍生物；c) 重組CFTR。如上所述，VSV-G是廣譜促融合蛋白質(zhì)。那么應(yīng)當(dāng)根據(jù)組織/細(xì)胞專一性要 求選擇更具體的促融合蛋白。
另外，VSV-G可以修飾，以達(dá)到要求的專一性程度。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以 設(shè)計(jì)VSV使其具有所期待的專一性。下面用舉例的方式，對(duì)二個(gè)方法進(jìn)行描述。第一，至少一個(gè)具體細(xì)胞配基可以用遺傳學(xué)方法插入至少一個(gè)易受影響的 VSV-G的回路。細(xì)胞特異性配體(S)將從靶細(xì)胞或組織的現(xiàn)有文獻(xiàn)資料，或噬菌 體對(duì)理想靶細(xì)胞生物淘洗的直接實(shí)驗(yàn)測(cè)定來獲得。這種技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員 所熟知的(gaden等,J. virol. 2004,78:7227-7247)。第二，在細(xì)胞特異性配體的插入會(huì)對(duì)VSV-G的膜融合功能有害的情況下， 細(xì)胞特異性配體可以用遺傳學(xué)方法插入fflV-l EnvGp 160的可變形的回路，與 VSV-G在VLP表面上共表達(dá)?？梢允褂弥亟M體腺病毒，Ad-EnvGpl60-L。預(yù)計(jì) EnvGp 160將容易地結(jié)合進(jìn)Gag VLPs (Wyma等，2000 J. Virol, 74:9381-9387 and Yu等，1992 J. Virol. 66:4966-4971)。在另一方面，本發(fā)明提供一種將重組體靶蛋白傳輸?shù)绞荏w細(xì)胞的方法，該方法包括a) 提供上文所定義的一種VLP;b) 將受體細(xì)胞暴露到上述的VLP。如上所述，重組體靶蛋白可以是膜結(jié)合蛋白。質(zhì)膜衍生的脂質(zhì)雙分子層包 膜病毒類粒子通過質(zhì)膜的出芽與摘除從產(chǎn)品細(xì)胞中釋放。這是文獻(xiàn)記錄的方法 (Chazal禾卩Gerlier， supra, Spearman等，supra; Sakalian禾口 Hunter, 1998 Adv. Exp. Med. Biol. 440:329-33 9).經(jīng)出芽，VLPs被一些宿主細(xì)胞的質(zhì)膜包裹。因此， 包膜包括宿主細(xì)胞衍生的質(zhì)膜蛋白質(zhì)。如果設(shè)計(jì)宿主細(xì)胞表達(dá)質(zhì)膜中的重組體 膜蛋白，那么重組蛋白質(zhì)將結(jié)合進(jìn)質(zhì)膜衍生的脂質(zhì)雙分子層包膜病毒類粒子。 于是重組體靶膜蛋白到受體細(xì)胞的輸送將通過促融合蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)的膜融合發(fā) 生。為獲得這種VLP傳送，重組體膜蛋白可以簡(jiǎn)單地用受體細(xì)胞培養(yǎng)。為了優(yōu) 化靶蛋白進(jìn)入VLP的結(jié)合，可以修飾重組體耙膜蛋白(特別是用多重跨膜結(jié)構(gòu)域 或長(zhǎng)胞質(zhì)尾區(qū)的那些蛋白)。例如，當(dāng)其序列被插入膜蛋白的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中時(shí)， fflV-1 gp 41中的縮氨酸序列可以幫助膜蛋白進(jìn)入基于VLPs的HIV-lGag的結(jié)合 (Wyma， D.J.等，2000， J. Virol. 74: 938 1-9387; Lee S.F.等，2000， J. Biol. Chem. 275: 15809-15819).為優(yōu)化膜蛋白進(jìn)入VLPs的結(jié)合的而做的進(jìn)一步的修飾實(shí)例 是，將符合活化T-細(xì)胞(LAT)蛋白縮氨酸序列的縮氨酸序列插入膜蛋白的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中(AlexanderM等，2004， J. Virol, 78: 1685-1696).因此，在優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的重組體靶蛋白是已經(jīng)在細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中 用至少一個(gè)幫助膜蛋白結(jié)合進(jìn)VLPs的縮氨酸序列修飾的膜蛋白。在進(jìn)一步的優(yōu) 選實(shí)施例中，重組體靶蛋白是已經(jīng)在細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中用至少一個(gè)來自幫助膜蛋 白結(jié)合進(jìn)VLPs的fflV-l gp 41或LAT的縮氨酸序列修飾的膜蛋白。VLP膜("供體膜")與受體細(xì)胞膜("受體膜")的融合是通過促融合蛋白引起 的，并導(dǎo)致重組體膜蛋白到受體細(xì)胞膜的傳輸。重組體膜蛋白到受體細(xì)胞膜的 直接膜到膜傳輸應(yīng)該維護(hù)其最適宜生物活性與功能性所需的局部濃度(例如質(zhì)膜 生物化學(xué)微環(huán)境，公認(rèn)的伴侶蛋白質(zhì)等等)。如果膜蛋白不是通常出現(xiàn)在質(zhì)膜中(例如出現(xiàn)在細(xì)胞器膜中的蛋白質(zhì))，技術(shù) 人員應(yīng)具有能力設(shè)計(jì)這種蛋白質(zhì)，促進(jìn)其瞄準(zhǔn)質(zhì)膜而不是其在細(xì)胞中天然存在 的場(chǎng)所。諸如上述的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移法優(yōu)點(diǎn)超過基因傳輸。膜蛋白經(jīng)常是復(fù)合蛋白質(zhì)。 CFTR蛋白是這種蛋白質(zhì)的指示物。作為Cl-通道，CFTR蛋白是橫跨膜糖蛋白， 并與疾病囊性纖維化(CF)有關(guān)。CFTR具有多重跨膜結(jié)構(gòu)域，二個(gè)傳送調(diào)節(jié)區(qū)域 的胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域(胞內(nèi)域)，其相當(dāng)于N-與C-端，以及胞外或胞外域。胞外域 與胞內(nèi)域兩者都是分別通過糖化與磷酸化翻譯后修飾的。CFTR的生物活性要求 不同類型翻譯后修飾與質(zhì)膜尋址，兩個(gè)特點(diǎn)接著要求嚴(yán)格的胞內(nèi)折疊與三維結(jié) 構(gòu)修正，以及意義明確的胞內(nèi)通道。而且，編碼序列(超過1，400氨基酸殘基) 的長(zhǎng)度使其不可能與所有其調(diào)控的上游與下游元素一起克隆。考慮到CFTR蛋 白質(zhì)分子的復(fù)雜性，可以預(yù)言，使用病毒或非病毒載體的人類CFTR基因的可 調(diào)型表達(dá)將遇到某些困難。通過在設(shè)計(jì)制造本發(fā)明的VLPs的適合宿主細(xì)胞中 表達(dá)這種蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)在其修正的膜范圍內(nèi)作為適當(dāng)?shù)乇磉_(dá)與修正的 CFTR，結(jié)合進(jìn)VLP。因此該蛋白質(zhì)以可能達(dá)到的最好的構(gòu)形給藥。為了能輸送非膜結(jié)合蛋白質(zhì)，通過用能夠結(jié)合到病毒結(jié)構(gòu)蛋白的蛋白質(zhì)作 為融合蛋白標(biāo)記物，表達(dá)靶蛋白。例如，如果病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)是fflV-lGag，那 么fflV-l的Vpr蛋白質(zhì)的N-或C-端能被使用。Vpr己經(jīng)顯示與Gag的p6結(jié)構(gòu) 域C-端的相互作用，Gag與Vpr-X(Vpr的融合蛋白標(biāo)記物與公認(rèn)的耙蛋白)的化 學(xué)計(jì)量比已經(jīng)被認(rèn)為是殼體化的。(Zhu等，2004 Retrovirology 1:26-31.). Vpr-X 將作為p6結(jié)合的內(nèi)部蛋白在Gag粒子的核心內(nèi)被輸送。經(jīng)過VLP的包膜與受體細(xì)胞膜之間的融合，VLP的內(nèi)部核心將在胞質(zhì)液中 分離。這接著使結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)與融合蛋白(例如Gag的p6結(jié)構(gòu)域與Vpr-X融合蛋 白的Vpr半族)之間蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用不穩(wěn)定，釋放融合蛋白?？梢岳玫?白質(zhì)融合到靶蛋白的自然特性。例如，Vpr載有核定位信號(hào)，自然運(yùn)送至細(xì)胞核。 因此,vpr標(biāo)記的蛋白質(zhì)將被運(yùn)送到細(xì)胞核。技術(shù)人員將會(huì)知道這些融合蛋白及其 性質(zhì)的潛在候選者。例如，Vif， FIIV-1病毒粒子的一種輔助蛋白質(zhì)，也與Gag相 互作用，并可以與Gag有效地共殼體化。(Bardy等，2001 J. Gen. Virol. 82:2719-2733.; Bouyac等，1997 J. Virol. 71:9358-9365; Huvent等，1998 J. Gen. Virol. 79:1069-1081). Vif不具有核定位信號(hào)。因此被輸送的重組蛋白質(zhì)可以融合 到Vif，導(dǎo)致與主要通過Vpr瞄準(zhǔn)的核區(qū)室不同的到細(xì)胞區(qū)室的輸送?？梢暂斔偷郊?xì)胞活體內(nèi)、活體外或體外。細(xì)胞可以是隔離的，或與其它的 細(xì)胞一起培養(yǎng)的，或正在組織中。另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種蛋白質(zhì)治療的方法，上述方法包括a) 提供上文所定義的一種VLP;b) 將細(xì)胞暴露到上述VLP中，VLP的劑量應(yīng)當(dāng)足以誘導(dǎo)出與治療蛋白質(zhì)相 關(guān)的治療效果。通常，蛋白質(zhì)治療包括蛋白質(zhì)輸送到細(xì)胞，以獲得治療效果。細(xì)胞中這些 蛋白質(zhì)往往是不足的。不足意味著細(xì)胞沒有足夠數(shù)量的功能正常的蛋白。這表 明細(xì)胞有可能完全不表達(dá)蛋白質(zhì)，但是也表明細(xì)胞表達(dá)蛋白質(zhì)的突變版本。通 過輸送治療數(shù)量的蛋白質(zhì)到缺乏該蛋白質(zhì)的細(xì)胞，這種缺乏引起通的疾病狀態(tài) 可能反轉(zhuǎn)。這種方法的候選者包括CFTR蛋白質(zhì)。因此在優(yōu)選實(shí)施例中，發(fā)明提供一種治療囊性纖維化的蛋白質(zhì)治療方法。另外，治療蛋白質(zhì)可以是蛋白質(zhì)藥物，雖然向不缺乏治療蛋白質(zhì)的細(xì)胞給 藥，但是細(xì)胞仍然將受益于暴露到治療蛋白中。在蛋白質(zhì)治療方法中VLP的給藥方式將根據(jù)治療的疾病而改變，因?yàn)椴煌?的疾病要求VLP在身體內(nèi)不同的位點(diǎn)給藥。例如囊性纖維化的治療可能涉及呼 吸道的氣道上皮的給藥。這將在CF-病人,嬰兒與幼童的壽命中及早有益地規(guī)定， 以免肺與呼吸道發(fā)展中的畸形，而且避免這種疾病中常見的機(jī)會(huì)感染的內(nèi)在并 發(fā)癥的出現(xiàn)。通常，VLP以藥用可接受的組合物形式給藥。因此本發(fā)明也提供藥物組合物，其包括上述定義的VLP和至少一種藥用可接受的載體，稀釋劑或賦形劑。在這種組合物中VLP可以由配方按重量計(jì)算從0.05%到99%組成，更優(yōu)選 的是0.1°/。到10%。"藥用可接受的"意思是該成分必須與組合物的其它成分兼容，而且承受 者生理上可接受。藥物組合物可以按照本領(lǐng)域熟知的與在文獻(xiàn)中廣泛描述的任 何常規(guī)方法配制。因此，活性成分可以與任選的其它的活性物質(zhì)結(jié)合，具有一 種或更多的傳統(tǒng)的載體，稀釋劑及或賦形劑,制造傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)制劑，諸如藥片，藥 丸，粉末，錠劑，香袋，扁囊劑，酏劑，懸浮液，乳液，溶液栓劑，無菌可注 射的溶液，無菌包裝粉末，等等。優(yōu)選方式是調(diào)整該組合物使其適合通過注射 或噴霧給藥。適合的載體，賦形劑與稀釋劑的實(shí)例是乳糖，右旋糖，蔗糖，山梨糖醇， 甘露糖醇，淀粉，阿拉伯膠，磷酸鈣，藻酸，黃芪膠，明膠，硅酸鈣，微晶纖 維素，聚乙烯吡咯烷酮，纖維素，水糖漿，水，水/乙醇，水/乙二醇，羥基苯酸 鹽，滑石，硬脂酸鎂，礦物油或脂肪物質(zhì)諸如硬脂或其適合的混合物。另外組 合物可以包括脫模劑，潤(rùn)濕劑，乳化劑，懸浮劑，防腐劑，脫硫劑，調(diào)味劑等 等。也可以采用本領(lǐng)域一些公知技術(shù)進(jìn)行配制以便在向病人給藥后，可以實(shí)現(xiàn) 活性成分的快速，持續(xù)或延緩釋放。另外，在植入或重新植入之前，VLP(或組合物)可以細(xì)胞體外給藥。例如， 一種應(yīng)用是，在對(duì)從其身體獲取干細(xì)胞的病人身上重新給藥前，將生長(zhǎng)因子受 體傳輸?shù)礁杉?xì)胞，給與其放大和體外擴(kuò)增的能力。干細(xì)胞體外生長(zhǎng)是困難的過 程，培養(yǎng)通常穩(wěn)定在3><109細(xì)胞的高峰水平，在該水平干細(xì)胞停止分裂。用本發(fā) 明的蛋白質(zhì)的傳輸方法，通過將生長(zhǎng)因子受體輸送到高峰水平的千細(xì)胞，可以 引起這些細(xì)胞的進(jìn)一步增殖。SCF-R受體(干細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體，或c-kit，或CD117)是公認(rèn)的候選者。 干細(xì)胞預(yù)先暴露于攜帶具有特定配基(SCF )的SCF-R的本發(fā)明所述的VLPs， 這種干細(xì)胞的治療將重新刺激那些干細(xì)胞的生長(zhǎng)。這個(gè)過程可以重復(fù)若干次， 獲得10U干細(xì)胞水平，這對(duì)肝癌的活體內(nèi)治療是必要的。除了SCFR，膜受體也
發(fā)揮功能，刺激干細(xì)胞的增殖，例如EGFR。另夕卜，Hox 4或端粒末端轉(zhuǎn)移酶可 以通過Vpr或Vif標(biāo)記胞內(nèi)輸送，通過干細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄激活獲得相同的目標(biāo)。另一種應(yīng)用是，使用本發(fā)明的胞內(nèi)蛋白質(zhì)的輸送方法，傳輸特定的免疫原 的蛋白(例如腫瘤抗原)到體外樹突狀細(xì)胞(DC)，因此將這些抗原處理成免疫原的 肽，并用MHC級(jí)-II分子在細(xì)胞表面表達(dá)。當(dāng)治療-DC在活體內(nèi)再給藥時(shí)，這 些免疫原的肽的MHC-級(jí)II的代表將引起或再?gòu)?qiáng)化到腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)。還 有一個(gè)體外應(yīng)用包括，將特定組織的細(xì)胞表面分子輸送到從病人身體分離出的 干細(xì)胞，確保將干細(xì)胞重新瞄準(zhǔn)系統(tǒng)給藥的特定器官。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供治療中使用的上述定義的VLP。上面描述的組合 物也可以用于治療。優(yōu)選用于治療以蛋白質(zhì)缺乏為特征的疾病，最優(yōu)選的是囊 性纖維化的治療。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供上述定義的VLP在制造治療囊性纖維化的藥物 中的應(yīng)用。本發(fā)明的VLP也可以用作疫苗或在免疫療法使用。在這種情況下，結(jié)合進(jìn) VLP包膜的重組蛋白質(zhì)將由于其具有免疫原的潛力而被選擇。在疫苗或免疫療 法中，使用本發(fā)明的VLPs的優(yōu)點(diǎn)是，重組體膜蛋白處于膜磷脂與相鄰蛋白質(zhì)的 天然范圍內(nèi)，其具有修正的翻譯后修飾(例如其糖化狀態(tài))，并且其處于天然構(gòu) 象。當(dāng)向要求的受體給藥時(shí)，這些是在場(chǎng)的免疫原抗原表位和生成的高度反應(yīng) 并特異性抗體的近似完美的參數(shù)。使用本發(fā)明的VLPs的典型免疫規(guī)程將包括后續(xù)使用VLP結(jié)合蛋白質(zhì)的促 進(jìn)劑的可溶解蛋白質(zhì)初次給藥，然后是使用代表免疫原的抗原表位的合成肽的 第二促進(jìn)劑。本規(guī)程中，步驟被顛倒或重復(fù)，這些改變也是預(yù)期的。這種策略 可以被用于人類病人(免疫療法，種痘)，以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，肯定會(huì)制造實(shí)驗(yàn)室活 體外使用的或用于人類或獸醫(yī)學(xué)的診斷試劑盒的制造的高度反應(yīng)的抗體。除了藥用可接受的載體、稀釋劑與前述的賦形劑，疫苗組合物將進(jìn)一步的 包括佐劑。非限制性實(shí)例包括免疫刺激核酸，肽葡聚糖，脂多糖，lipoteichonic 酸,咪唑喹啉化合物，鞭毛蛋白，脂蛋白，免疫刺激有機(jī)分子，未加甲醇的含CpG 低聚核苷酸或其混合物。本發(fā)明的VLPs也可以用于消耗溶液中不良的可溶性因子?？梢栽O(shè)計(jì)VLPs
表達(dá)被消耗的可溶性因子的受體。然后通過受體與可溶性因子之間復(fù)合物的形 成，VLP將可溶性因子從溶液中分離。應(yīng)用前景是抗血管生成的癌癥生物制劑療法。通常組織的脈管化，尤其是具有腫塊是通過幾個(gè)可溶性因子，例如VEGF (血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子)或其它的血管生成因子，強(qiáng)制控制的。VEGF與其特 定受體(VEGF-R)在內(nèi)皮細(xì)胞表面的相互作用的任何阻礙，將引起腫瘤脈管化 的低水平以及由于產(chǎn)生的缺氧癥造成的腫瘤退化。傳輸膜插入及表面暴露的 VEGF-R (或任何其它血管生成因子的受體)的VLPs將與內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)的 相同受體競(jìng)爭(zhēng)。這種VLPs的瘤體注射將消耗循環(huán)VEGF (或其它的血管生成因 子)的胞外載體，并阻礙新生血管的發(fā)生及由此的腫瘤擴(kuò)散。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解這些治療技術(shù)可以怎樣用于活體外情況，因此 作為研究具有實(shí)驗(yàn)體系價(jià)值的蛋白質(zhì)輸送的體外研究工具，本發(fā)明具有重大的 實(shí)用性。如上所述，當(dāng)過量表達(dá)的病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組裝并從宿主細(xì)胞出芽時(shí)，本發(fā) 明的VLPs形成。因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供如上定義的VLP的制造方法，上述的方 法包括將能形成包膜VLP的病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，或其片段或衍生物與促融合蛋白 及重組靶蛋白在一個(gè)體外培養(yǎng)的細(xì)胞株中共表達(dá)，并將VLP從培養(yǎng)基中分離。宿主細(xì)胞可以是任何細(xì)胞，優(yōu)選真核生物的，尤其是哺乳動(dòng)物的。最優(yōu)選 的細(xì)胞是和將與VLP融合的細(xì)胞同源或兼容的細(xì)胞。優(yōu)選處于培養(yǎng)期的細(xì)胞。 在某些情況，編碼(i)能夠形成包膜VLP的病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)或其片段或衍生物； (ii)促融合蛋白質(zhì)，和/或(iii)重組體靶蛋白的核酸可以分別穩(wěn)定整合，成對(duì)或一 起進(jìn)入細(xì)胞的基因組，該細(xì)胞應(yīng)是能夠活體外連續(xù)生長(zhǎng)的穩(wěn)固的細(xì)胞株。這種 細(xì)胞株將更適宜不受干擾地表達(dá)VLP或其中組分。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一株體外宿主細(xì)胞株，其包括a) 編碼能夠形成包膜VLP的病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，或其片段或衍生物的核酸；b) 編碼促融合蛋白質(zhì)的核酸；c) 編碼重組體靶蛋白的核酸。本發(fā)明的另一個(gè)方面的內(nèi)容是一種核酸載體，其包括a)編碼能夠形成包膜VLP的病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，或其片段或衍生物的序列；b)編碼的促融合蛋白質(zhì)的序列；C)可以插入靶蛋白的編碼序列的克隆位點(diǎn)。結(jié)合編碼靶蛋白的序列，這種載體是本發(fā)明的進(jìn)一步的方面；上述載體的 表達(dá)產(chǎn)物能夠形成如上所述的VLP。這種載體可以從任何熟知的病毒載體(例 如腺病毒，AAV, HSV，牛痘病毒或桿狀病毒載體)或非病毒載體(例如質(zhì)粒 或酵母人工染色體)獲得。在優(yōu)選實(shí)施例中，載體進(jìn)一步包含至少一種選自下列允許序列真實(shí)功能的 位置；復(fù)制起點(diǎn)，選擇性標(biāo)記，轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子,轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)劑，轉(zhuǎn)錄控制元件， 3'未翻譯的控制序列，5'未翻譯的控制序列以及允許耙蛋白產(chǎn)物檢測(cè)及或提純的 序列。具體附加序列的選擇將依賴宿主細(xì)胞類型。進(jìn)一步，本發(fā)明提供成套元件，包括上述定義的載體與(設(shè)計(jì)的)宿主細(xì) 胞株。另外，該成套元件可以包括a) —個(gè)穩(wěn)定的宿主細(xì)胞株，該細(xì)胞株包含編碼能夠形成包膜VLP的病毒結(jié) 構(gòu)蛋白或其片段或衍生物的核酸以及編碼促融合蛋白的核酸；b) 適于宿主細(xì)胞株的最終轉(zhuǎn)染的載體，該宿主細(xì)胞株包含編碼靶蛋白的序列。為特定的方面，對(duì)所敘述的優(yōu)選實(shí)施例可以做細(xì)節(jié)上的必要的修改。 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供具有質(zhì)膜衍生的脂質(zhì)雙分子層的VLP，上述的 VLP進(jìn)一步包括至少一種病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)或其片段或衍生物，能夠形成包膜病 毒類粒子與重組體膜結(jié)合的靶蛋白，其中靶蛋白位于病毒類粒子的包膜中。任何諸如此類優(yōu)選的病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)與以上論述的膜結(jié)合靶蛋白應(yīng)用于本 發(fā)明的這個(gè)方面。組合物，宿主細(xì)胞,制造方法,醫(yī)學(xué)應(yīng)用,裝備與載體的前述討論運(yùn)用必要的改 變到本發(fā)明的這個(gè)方面。本發(fā)明的這個(gè)方面的VLPs特別適用于種痘或免疫療法規(guī)程,疫苗組合物與 設(shè)計(jì)用于消耗不良的可溶性因子的溶液的規(guī)程。因此，本發(fā)明關(guān)于促融合VLPs 的這些方面的前述討論同樣適用于本發(fā)明的這個(gè)方面的VLPs。


圖1:(a)控制Sf9細(xì)胞的電子顯微鏡(EM)分析；(b-d)桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞，通過用重組體桿狀A(yù)cMNP V-Gag活體外 感染的昆蟲細(xì)胞顯示出芽的高效率與Gag載體的大量生產(chǎn)。(a,b)細(xì)胞表面掃描電鏡照片，顯示不受感染的細(xì)胞(a)的質(zhì)膜的比較的光滑 外側(cè)面，與Gag表達(dá)的細(xì)胞(b)表面上看得見的囊泡或(芽)在數(shù)量上對(duì)比。如同 在超薄切片(c,d)上觀測(cè)到的那樣，這些芽相當(dāng)于Gag VLP。(c, d)AcMNP V-Gag感染的細(xì)胞的超薄切片的透射式電子顯微鏡分析，在二 個(gè)不同的放大倍數(shù)顯示。雙層膜下的物質(zhì)的高密度電子區(qū)由Pr55 Gag多蛋白分 子構(gòu)成，其構(gòu)成Gag粒子的內(nèi)部核心。棒在(a)與(b)中代表500nm，在(c)中100nm，在(d)中l(wèi)mm。圖2:感染重組體，Gag表達(dá)的人類腺病毒，Ad 5-Gag的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的部 分的透射式電子顯微鏡分析。注意Gag粒子在胞外介質(zhì)中釋放。棒代表200nm。圖3:具有病毒糖蛋白VSV-G的Gag載體假模標(biāo)本。Gag粒子(VLP)的 SDS-PAGE與免疫印跡分析。純化的Gag粒子用SDS變性，在變性的聚丙烯酰 胺凝膠(PAGE)中做電泳，蛋白質(zhì)傳輸?shù)较趸w維膜，用單克隆抗體(mAb)抗-Gag 或抗-VSV-G檢測(cè)，在VSV-G-假模標(biāo)本Gag載體的蔗糖-D20中超速離心法分析。 缺陷同時(shí)與抗-Gag與抗-VSV-GmAbs起反應(yīng)。注意Pr55Gag與VSV-G62-kDa信 號(hào)的共沉降。(B),在(A)中使用抗-Gag(路線l)或抗，VSV-G(路線2)mAb獲得的Gag粒子的峰值的免疫印跡分析；MM,預(yù)染分子量標(biāo)準(zhǔn)。路線1右邊的虛線指示Gag 自發(fā)分裂產(chǎn)物。圖4:具有VSV-G的Gag載體假模標(biāo)本的EM分析。(a) 從Sf9細(xì)胞共表達(dá)的Pr 55Gag與VSV-G出芽的Gag粒子。(b) 控制，從Sf9細(xì)胞單一表達(dá)的Pr55Gag出芽的Gag粒子。注意(b)顯示 的"光滑"Gag粒子與(a)顯示的"絨毛狀的"Gag粒子之間在膜包裹粒子形態(tài)上的
差異；"絨毛狀的"方面很可能符合插入膜的VSV-G分子，這體現(xiàn)在圖3蛋白質(zhì) 印跡中。圖5:非基因膜到膜蛋白輸送的原理示意圖。在畫面的左上角用圖解法地代表的是生產(chǎn)者細(xì)胞，表達(dá)Pr 55Gag ,VSV -G 糖蛋白(作為促膜融合的假模標(biāo)本藥劑)，被傳輸?shù)陌业鞍?即C1通道/CFTR分子, 用GFP標(biāo)記(GFP-CFTR》。在組裝與出芽以及胞外釋放之后，輸送膜插入的 GFP-CFTR分子的VSV-G-假模標(biāo)本Gag粒子將與耙細(xì)胞活體外培養(yǎng)，這在畫面 右下角描述。VSV-G將促使準(zhǔn)病毒膜"供體膜"與受體細(xì)胞的質(zhì)膜("受體膜") 的融一種嵌合基因被結(jié)合進(jìn)VLPs，該基因?yàn)樵贑FTR蛋白質(zhì)的N-端融合到具有 GFP結(jié)構(gòu)域CFTR的綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)編碼。GFP半族標(biāo)記的CFTR能夠 迅速識(shí)別，并使標(biāo)記的蛋白質(zhì)能夠迅速建立。融合基因GFP-CFTR在兩個(gè)不同 的表達(dá)系統(tǒng)中克隆,(i)桿狀病毒AcMNPV，形成重組體桿狀病毒 AcMNPV-GFPCFTR，(ii)在腺病毒類型5(Ad 5)中產(chǎn)生重組病毒Ad 5-GFP-CFTR。 該蛋白質(zhì)被觀測(cè)到定位在細(xì)胞質(zhì)膜。通過表達(dá)質(zhì)粒攜帶的相似GFP標(biāo)記的結(jié)構(gòu) 已經(jīng)報(bào)道具有與非標(biāo)記蛋白質(zhì)CFTR相同的功能GFP-CFTR，作為任何其它的 細(xì)胞表面分子或受體，于是將直接地可用，沒有進(jìn)一步的細(xì)胞代謝過程就可以 獲得其可溶性配位體。圖6:非基因Gag-Vpr調(diào)節(jié)的胞內(nèi)蛋白質(zhì)的輸送原理示意圖。 畫面的左上角，用圖示法代表的是生產(chǎn)者細(xì)胞表達(dá)的Pr55Gag ， VSV-G糖 蛋白(作為促膜融的假模標(biāo)本藥劑)，被傳輸?shù)腣pr融合的靶蛋白(Vpr-X)。在Gag -Gag與Gag Vpr-X(經(jīng)過Pr 55Gag的p6結(jié)構(gòu)域)交互作用及粒子組裝后，胞外 出芽釋放的VSV-G假模標(biāo)本Gag粒子將與耙細(xì)胞活體外培養(yǎng)，如同畫面右下角 描述。VSV-G將促使準(zhǔn)病毒膜"供體膜"與靶細(xì)胞的質(zhì)膜("受體膜")之間的融合。 在膜融合之后，Gag粒子將在耙細(xì)胞的胞質(zhì)液內(nèi)分離,Vpr-X融合蛋白標(biāo)記物將 通過Vpr-NLS調(diào)節(jié)通道被傳輸?shù)郊?xì)胞核。 并在膜包膜類病毒粒子中被共殼體化，通過二者的共表達(dá)誘發(fā)昆蟲細(xì)胞合胞體。 其中，(a) 相差顯微技術(shù),注意在細(xì)胞-細(xì)胞融合前的瓣?duì)铙w方面。(b) 電子顯微鏡檢查，注意在左邊的巨大多核細(xì)胞，在右邊的正常單核細(xì)胞。圖8: GFP-CFTR到人類A549細(xì)胞的傳輸，通過包括VSV-G糖蛋白的Gag VLPs調(diào)節(jié)。在質(zhì)膜及與VSV-G共本地化時(shí)，GFP標(biāo)志被看作通過RITC標(biāo)記的 抗VSV-G抗體的形象化。細(xì)胞核的DAPI染色顯示在畫面的左邊底部。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明將根據(jù)下列非限制實(shí)例進(jìn)一步描述 實(shí)施例1: CFTR-GFPVLPs的制造一種嵌合基因被結(jié)合進(jìn)VLPs，該基因?yàn)樵贑FTR蛋白質(zhì)的N-端融合到具有 GFP結(jié)構(gòu)域CFTR的綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)編碼。GFP半族標(biāo)記的CFTR能夠 迅速識(shí)別，并使標(biāo)記的蛋白質(zhì)能夠迅速建立。融合基因GFP-CFTR在兩個(gè)不同 的表達(dá)系統(tǒng)中克隆，(i)桿狀病毒AcMNPV，形成重組體桿狀病毒 AcMNPV-GFPCFTR，(ii)在腺病毒類型5(Ad 5)中產(chǎn)生重組病毒Ad 5-GFP-CFTR。 該蛋白質(zhì)被觀測(cè)到定位在細(xì)胞質(zhì)膜。通過表達(dá)質(zhì)粒攜帶的相似GFP標(biāo)記的結(jié)構(gòu) 已經(jīng)報(bào)道具有與非標(biāo)記蛋白質(zhì)CFTR相同的功能(Haggie等.，2002， J. Biol. Chem. 277:16419-16425和Loffing-Cueni等，2001， Am. J. Physiol. Cell Physiol. 281 :C 1889-1897.20). GFP-CFTR克隆被證明是活化的與有功能的(Robert等，2004， J. Biol. Chem. 279:21160-21168.)，如同Ad 5-GFP-CFTR克隆修復(fù)有CFTR缺陷 的細(xì)胞Cl-通道的活性。作為陰性對(duì)照，CFTR的生物學(xué)非活性突變株，CFTRAF 508被使用。Sf9細(xì)胞被三種重組體桿狀病毒AcMNPV Gag ,AcMNPV-VSV-G與 AcMNPV-GFP-CFTR共感染。經(jīng)過出芽,攜帶VSV-G的Gag病毒類粒子可以在 蔗糖-D20梯度中用超速離心方法從培養(yǎng)上清液中分離出來(Huvent等,1998 J. Gen. Virol. 79:1069-1081.)這已經(jīng)被本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。簡(jiǎn)要地說，在感染后 60-72小時(shí)之間收集培養(yǎng)基。收獲的培養(yǎng)基在4以2,500轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘， 收集包含VLPs的上清液，拋棄細(xì)胞團(tuán)塊。
然后，上清液(大約llml)是在適合SW 41貝克曼(Beckman)轉(zhuǎn)子的超速 離心機(jī)離心管里用lml PBS中20%蔗糖緩沖液分層。接著，離心管在4'C以30,000 轉(zhuǎn)/分鐘離心1小時(shí)。這個(gè)離心步驟從大量的培養(yǎng)基(大約60ml)中，濃縮VLPs。 棄去上清液，細(xì)胞團(tuán)塊再次懸浮在PBS (20(Hil/塊)，再懸浮的細(xì)胞團(tuán)塊在4。C放 置過夜。然后匯集再懸浮的細(xì)胞團(tuán)塊，通過30-50蔗糖-D20梯度進(jìn)行第二次離 心作用。蔗糖梯度(30-50% w/v)是用NaOH緩沖到pH 7.2的氘水(D20)的50%蔗糖溶 液與10mMTris-HCl， pH7.2， 150mMNaCl， 5.7mMNa2EDTA的30%蔗糖溶液 制造。設(shè)計(jì)適合貝克曼(Beckman) SW41轉(zhuǎn)子的超速離心機(jī)離心管中，用梯度 混合器制造梯度。VLPs(大約1.5ml)在蔗糖梯度上分層，離心管在4'C以28，000 轉(zhuǎn)/分鐘離心18小時(shí)。在離心操作的結(jié)尾，觀察到寬的乳白色條帶與模糊條帶。 寬條帶對(duì)應(yīng)Gag粒子，而模糊條帶主要由桿狀病毒組成。VLPs的采集是，用注 射器刺穿離心管，針恰好在寬條帶的下面，提取大約50(Hil的寬條帶。匯集提取的全部VLP條帶，在PBS中稀釋5倍。然后，稀釋液在4以30,000 轉(zhuǎn)/分鐘2小時(shí)，使VLPs團(tuán)聚下沉。棄去上清液，VLPs再次懸浮在PBS(200pl) 中。在4t過夜后，棄去團(tuán)i央。然后對(duì)VLP制造進(jìn)行定量(按照mg蛋白質(zhì))。實(shí)施例2:透射電子顯微鏡用圖例說明所示的病毒感染細(xì)胞，感染復(fù)數(shù)(M01)為25。在感染48小時(shí)后 通過離心沉降結(jié)塊，收集用于電子顯微鏡(EM)檢查的細(xì)胞。然后細(xì)胞團(tuán)塊用O.lm pH7.5磷酸鹽緩沖液的2.5%戊二醛固定，用osmium tetroxicle后固定，用鞣酸(在 H20中0.5% )處理。脫水后，樣品是嵌入環(huán)氧樹脂(Epon )中 (Epon-812，F(xiàn)ulham,Latham,紐約)。提取剖面，用2.6%堿性檸檬酸鉛-0.5%部分 Sections乙酸雙氧鈾在50%乙醇中染色，在Jeoll200-EX電子顯微鏡下檢驗(yàn)。實(shí)施例3:掃描電子顯微鏡細(xì)胞在載玻片上生長(zhǎng)，用圖例說明的病毒感染，感染復(fù)數(shù)(MOI)為25。固定 和后固定與透射EM描述的相同。然后細(xì)胞用液體C02臨界點(diǎn)干燥，涂蓋黃金， 用Zeiss DSM 950電子顯微鏡檢驗(yàn)。
實(shí)施例4: Gag VIP分析一超速離心分析回收從Sf 9細(xì)胞質(zhì)膜釋放的Gag VLPs，通過蔗糖D20梯度用超速離心法 分析(Huvent I.等，1998， J. Gen. Virol .79:1069-1081)。線性梯度(總體積 10ml,30-50% w/v)在Beckman SW 41轉(zhuǎn)子中，以28,000轉(zhuǎn)/分鐘離心18小時(shí)， 在NaOH將pH值調(diào)到7.2的D20中制造50%蔗糖溶液，用pH 7.2， 150mM NaCl， 5.7mM Na2EDTA的10mM Tris-HCl制造30%蔗糖溶液。從離心管頂部收集0.5ml 部分，使用不連續(xù)的緩沖系統(tǒng)在10%丙烯酰胺凝膠中用SDS-PAGE分析該蛋白 質(zhì)。(Laemmli，1970,Nature ,227:680-685)。GagVLP分析-免疫印跡分析對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行上述電泳，電子傳輸?shù)较趸w維膜(Hybond-ECL，Amersham)。 在室溫下在包含0.05%吐溫20(TBS-T)的Tris緩沖鹽水(20mM Tris-HCl,pH 7.5，150mMNaCl)中用5%脫脂乳阻滯后，通過與抗-Gag(實(shí)驗(yàn)室制造的兔多克隆 抗體)或抗-VSVg(單克隆抗-VSVg,Sigma)反應(yīng)，檢測(cè)Gag與VSVg蛋白質(zhì)，隨后 堿性磷酸酶標(biāo)記的抗-IgG共軛。用5-溴-4-氯代-3-氮茚基磷酸鹽toluidinium與 氮藍(lán)四唑(Euromedex)進(jìn)行缺陷的顯色。實(shí)施例5: VLPs調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)傳輸與免疫熒光顯微術(shù)分析從上述蔗糖-D20梯度純化Gag VLPs。然后純化的Gag VLPs在DMEM培 養(yǎng)基(Invitrogen)中稀釋，并加入到蓋玻片上生長(zhǎng)的A549細(xì)胞中。細(xì)胞在37i:用 VLPs培養(yǎng)1小時(shí)，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)清洗三次。然后細(xì)胞在室溫下用PBS 的2%多聚甲醛固定10分鐘。接著，在室溫下用PBS中1%牛血清清蛋白阻滯 細(xì)胞，用抗-VSVg(l:1000稀釋)培養(yǎng)l小時(shí)。在室溫下細(xì)胞用堿性蕊香紅標(biāo)記的 二抗-鼠抗體(Sigma)培養(yǎng)1小時(shí)。然后在固定在滑片上用裝備有AxioCam數(shù)字 式攝象機(jī)的Axiovert135倒置顯微鏡觀測(cè)之前，細(xì)胞用DAPI(4'，6-二脒基-2-苯基 B引哚；Sigma)培養(yǎng)。
權(quán)利要求
1. 一種類病毒粒子(VLP)，其具有質(zhì)膜衍生的脂質(zhì)雙分子層包膜，該VLP進(jìn)一步的包括a) 能形成包膜VLP的病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，或其片段或衍生物；b) —種促融合蛋白質(zhì)；c) 一種重組體靶蛋白。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，其特征在于所述的質(zhì)膜衍生的脂質(zhì)雙分子 層包膜包含至少四種，更優(yōu)選至少六種，更優(yōu)選至少八種不同的脂類類型。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的VLP，其特征在于所述的質(zhì)膜衍生的脂質(zhì)雙 分子層包膜包含絲氨酸磷脂。
4. 根據(jù)上述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的VLP，其特征在于所述的質(zhì)膜 質(zhì)膜衍生的脂質(zhì)雙分子層包膜包括至少四種，更優(yōu)選至少六種，最優(yōu)選至少八 種不同類型的蛋白質(zhì)。
5. 根據(jù)上述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的VLP，其特征在于所述的病毒 結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)來自一種病毒，該病毒來自一種病毒族，該病毒族選自逆轉(zhuǎn)錄病毒， Coronaviriclae，皰疹病毒，嗜肝DNA病毒和正黏液病毒。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的VLP，其特征在于所述的病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)是來自 fflV-l的一種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的VLP，其特征在于所述的病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)是 HIV誦lPr 55Gag。
8. 根據(jù)上述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的VLP，其特征在于所述的VLP 包括至少病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的2000個(gè)拷貝，更優(yōu)選至少3000個(gè)拷貝，最優(yōu)選至 少4000個(gè)拷貝。
9. 根據(jù)上述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的VLP，其特征在于所述的促融 合蛋白選自血球凝集素，呼吸道合胞病毒融合蛋白，蜱傳腦炎病毒與登革熱病 毒的B蛋白，Semliki Forest vims病毒的E1蛋白，狂犬病病毒與水皰性口腔炎 病毒的G蛋白，桿狀病毒gp64，或上述蛋白的功能等效片段或衍生物。
10. 根據(jù)權(quán)要求9所述的VLP，其特征在于所述的促融合蛋白質(zhì)是水皰性口 腔炎病毒的G蛋白。
11. 根據(jù)上述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的VLP，其特征在于所述的促融 合蛋白質(zhì)是與病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)異種的。
12. 根據(jù)上述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的VLP，其特征在于所述的重組 體靶蛋白是一種膜蛋白。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的VLP，其特征在于所述的膜蛋白是一種具有單一 跨膜結(jié)構(gòu)域的膜蛋白。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1到11中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的VLP ，其特征在于所述 的重組體耙蛋白選自CFTR， SCF-R， EGFR與Hox4。
15. —種將重組體靶蛋白遞送到受體細(xì)胞的方法，該方法包括a) 提供上述任一權(quán)利要求所定義的VLP;b) 將受體細(xì)胞暴露到上述的VLP。
16. —種蛋白質(zhì)治療方法，該方法包括a) 提供上述任一權(quán)利要求所定義的VLP;b) 將細(xì)胞暴露到上述VLP中，VLP的劑量應(yīng)當(dāng)足以誘導(dǎo)出與治療蛋白質(zhì)相 關(guān)的治療效果。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的蛋白質(zhì)治療方法，其特征在于所述的蛋白質(zhì)治療 方法適用于囊性纖維化的治療。
18. —種藥物組合物，其包括任何上述權(quán)利要求定義的VLP和至少一種藥用 可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
19. 按照上述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求定義的VLP在治療上的用途。
20. 按照權(quán)利要求14所定義的VLP在制造用于治療囊性纖維化的藥物中的 應(yīng)用。
21. —種用于制造按照上述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求定義的VLP的方法，該 方法包括將能形成包膜VLP的病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，或其片段或衍生物與促融合蛋 白及重組靶蛋白在一個(gè)體外培養(yǎng)的細(xì)胞株中共表達(dá)，并將VLP從培養(yǎng)基中分離。
22. —株體外宿主細(xì)胞株，其包括a) 編碼能夠形成包膜VLP的病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，或其片段或衍生物的核酸；b) 編碼促融合蛋白質(zhì)的核酸；c) 編碼重組體靶蛋白的核酸。
23. —種核酸載體，其包括a) 編碼能夠形成包膜VLP的病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，或其片段或衍生物的序列；b) 編碼的促融合蛋白質(zhì)的序列；c) 可以插入靶蛋白的編碼序列的克隆位點(diǎn)。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的核酸載體，其特征在于該載體進(jìn)一步包括下列項(xiàng)目中的至少一種復(fù)制起點(diǎn)，選擇性標(biāo)記，轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)劑，轉(zhuǎn)錄控制元件，3'端未翻譯的控制序列，5'端未翻譯的控制序列與允許 檢測(cè)和/或把蛋白產(chǎn)物提純的序列。
25. —套元件，包括權(quán)利要求21或22定義的一種載體與一種宿主細(xì)胞株。
26. —套元件，其包括a) —個(gè)穩(wěn)定的宿主細(xì)胞株，該細(xì)胞株包含編碼能夠形成包膜VLP的病毒結(jié) 構(gòu)蛋白或其片段或衍生物的核酸以及編碼促融合蛋白的核酸；b) 適于宿主細(xì)胞株的最終轉(zhuǎn)染的載體，該宿主細(xì)胞株包含編碼靶蛋白的序列。
27. —種VLP，其具有質(zhì)膜衍生的脂質(zhì)雙分子層包膜，該VLP進(jìn)一步包括 至少一個(gè)能夠形成包膜VLP的病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)或其片段或衍生物，以及一個(gè)與 重組體膜結(jié)合的靶蛋白，其中所述的靶蛋白位于該病毒類粒子的包膜里。
全文摘要
本發(fā)明提供一種類病毒粒子(VLP)，其具有質(zhì)膜衍生的脂質(zhì)雙分子層包膜，該VLP進(jìn)一步包括能夠形成包膜VLP的病毒結(jié)構(gòu)蛋白，或其片段或衍生物，促融合蛋白及重組靶蛋白。本發(fā)明還描述了使用上述VLP將重組靶蛋白輸送到細(xì)胞的方法，上述VLP、包含VLP的組合物及成套元件的醫(yī)療用途以及上述VLP的制造方法，同時(shí)還公開了用于上述VLP制造方法的載體和寄主細(xì)胞。
文檔編號(hào)A61K9/50GK101146522SQ200580041312
公開日2008年3月19日 申請(qǐng)日期2005年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月3日
發(fā)明者斯帝恩·林德卡爾·詹森 申請(qǐng)人:生物活性蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)醫(yī)療公司