專利名稱：用于由靶細胞表達因子viii的腺伴隨病毒載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及適于血友病基因治療的腺伴隨病毒載體(AAV)載體。特別是，這些AAV載體適于將編碼因子VIII的核酸遞送到患血友病A的受治療者受體中，這樣受治療者的血液能夠形成凝塊。
背景血友病是一種特征為血液凝固缺陷的遺傳病。在血友病A(經(jīng)典的血友病，因子VIII缺陷)中，X-染色體連鎖的遺傳缺陷破壞了編碼因子VIII(一種血漿糖蛋白質(zhì)，是血液凝固級聯(lián)中的一種關(guān)鍵組分)的基因。人因子VIII以單鏈多肽合成，推定的分子量為265kDa。因子VIII基因編碼2351個氨基酸，該蛋白質(zhì)有6個結(jié)構(gòu)域(從氨基端到羧基端指定為A1-A2-B-A3-C1-C2)(Wood等人.自然(Nature)，312；330，1984；Vehar等人.自然，312；337，1984；Toole等人。自然，312；342，1984)。人因子VIII于細胞內(nèi)經(jīng)加工產(chǎn)生主要由含結(jié)構(gòu)域A1、A2和B的200KDA的重鏈和含結(jié)構(gòu)域A3、C1和C2的80kDa的輕鏈組成的雜二聚體(Kaufman等人.生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，263；6352-6362，1988)。單鏈多肽和雜二聚體均作為無活性前體循環(huán)于血漿中(Ganz等人.歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem.)，170；521-528，1988)。血漿中的因子VIII的活化始于凝血酶在結(jié)構(gòu)域A2和B之間的切割，從而釋放結(jié)構(gòu)域B并產(chǎn)生包含結(jié)構(gòu)域A1和A2的重鏈。在該蛋白質(zhì)的激活的前凝血劑形式中，980個氨基酸的結(jié)構(gòu)域B被刪除。另外，在天然蛋白質(zhì)中，位于結(jié)構(gòu)域B兩側(cè)的兩個多肽鏈(“a”和“b”)與二價鈣陽離子結(jié)合。血友病可能產(chǎn)生于點突變、缺失或?qū)е陆K止密碼的突變(見，Antonarakis等人.分子生物醫(yī)學(xué)(Mol.Biol.Med.)，4；81，1987)。
本病相當(dāng)罕見，每10000個男性中大約有一個受此折磨。盡管在患病父親和攜帶者母親所生的女孩以及X-染色體異常(例如Turner綜合癥、X鑲嵌現(xiàn)象，等等)的女性中可能會發(fā)生此病，但在女性中血友病極為罕見。根據(jù)患者癥狀的嚴(yán)重程度及循環(huán)的因子VIII水平，可以將每個患者的疾病程度概括性地劃分為輕度、中度、重度三類。因子VIII的正常水平在50-200ng/ml血漿之間變動，而輕度患者為此值的6-60％，中度患者為此值的1-5％。重度血友病患者的因子VIII水平低于正常值的1％。
雖然血友病患者在外科手術(shù)或嚴(yán)重創(chuàng)傷后顯然需要凝固因子，但是每日都可能出現(xiàn)的自發(fā)性內(nèi)出血更值得關(guān)注。血友病患者會經(jīng)歷早期嬰兒的自發(fā)性出血，以及經(jīng)常性的自發(fā)性關(guān)節(jié)積血和其他需要凝固因子替換的出血。沒有有效的治療，慢性血友病型關(guān)節(jié)病會在成年初期發(fā)生。嚴(yán)重患病者易于嚴(yán)重的出血，可以分散地穿過組織面，最終由于危及重要器官而致死。
在中度和重度血友病患者中常常會觀察到血腫。在這些患者中，血腫具有漸進性地擴大和向各個方向擴散的傾向。部分這些血腫局部性地擴大而導(dǎo)致相鄰器官、血管和神經(jīng)的局部壓迫。腹部血腫的一個罕見但卻常常致命的并發(fā)癥是血腫穿孔和引流進入結(jié)腸，導(dǎo)致感染和敗血癥。顱內(nèi)和/或顱外出血也代表非常危險的出血形勢。皮下血腫會分散地進入肌肉，而咽和咽后血腫(例如并發(fā)細菌或病毒性的咽炎)會擴大并阻塞氣道，有時導(dǎo)致危及生命的情形，需要施用足夠劑量的因子VIII濃縮物，以使因子VIII水平正常。
除血腫外，在血友病患者中常常觀察到關(guān)節(jié)積血，其中出血進入關(guān)節(jié)大約占血友病型出血的75％。反復(fù)性地出血進入關(guān)節(jié)最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的廣泛破壞、滑液增生以及其他鄰近組織和骨骼中的反應(yīng)性改變。反復(fù)性地關(guān)節(jié)積血的主要并發(fā)癥是關(guān)節(jié)變形，還常常伴隨著肌肉萎縮和軟組織攣縮；伴隨著關(guān)節(jié)空間漸進性地喪失，也會形成骨質(zhì)疏松癥和位于軟骨下的骨骼中的囊腫區(qū)。
在血友病患者中常常觀察到其他癥狀，包括血尿和粘膜出血。幾乎所有的重度血友病患者在其一生的某些時候會經(jīng)歷血尿，并且粘膜出血在血友病患者中很常見。骨骼囊腫(假腫瘤)是血友病型出血的罕見但危險的并發(fā)癥。對許多這些病例需要立即治療。
在二十世紀(jì)80年代早期，許多重度血友病患者用因子VIII濃縮物治療，每周大約三次。不幸的是，這些濃縮物傳播病毒諸如乙型肝炎和/或丙型肝炎以及人免疫缺陷病毒(HIV)。在美國和西歐，據(jù)報道至少75％的因子VIII濃縮物接受者具有抗HIV抗體(見，Schrier和Leung.同上)。某些這些患者還逐步出現(xiàn)了HIV相關(guān)的免疫性血小板減少(血友病患者中非常嚴(yán)重的并發(fā)癥)。盡管抗病毒療法(例如，用疊氮胸苷和戊脒預(yù)防)的目的是想減緩疾病進展，但是成熟的AIDS(獲得性免疫缺陷綜合癥)以毫不寬容的速度在感染了HIV的血友病患者中發(fā)生。確實，這使血友病患者的預(yù)期存活期(在20世紀(jì)70年代間達到頂峰時的66歲)的改善被逆轉(zhuǎn)，降至49歲(見，Schrier和Leung.同上)。無病毒制品和重組因子VIII的開發(fā)對控制傳染性病毒的污染起到了幫助。
然而，血友病患者獲得無病毒濃縮物和重組因子VIII雖然重要，但只是解決了部分問題。為了預(yù)防自發(fā)性內(nèi)出血事件，患有血友病A的患者必須經(jīng)常具有大約1％，優(yōu)選地5％的血清因子VIII水平。目前，無病毒制品和重組因子VIII的花費太高，無法預(yù)防性地或維持性地施用凝固因子。確實，在美國大多數(shù)血友病患者沒有基于維持目的接受重組因子VIII療法，而只在可能引起出血(如外科手術(shù))的活動或事件前或者作為對自發(fā)性出血的治療接受它。
而且，即使可以得到花費合理的重組的或無病毒的因子VIII制品，也無法通過每日施用而使因子VIII的水平達到穩(wěn)態(tài)水平。充其量，患者接受變化很大的多種因子VIII的水平。緊隨施用后的水平為超生理性的，而在施用前的水平是亞生理性的。因而仍然需要相對經(jīng)濟但卻有效的治療和預(yù)防血友病患者的出血(尤其是自發(fā)性出血)的方法和組合物。此外，在本領(lǐng)域需要能夠更加接近地模擬在正常個體中所觀察到的穩(wěn)態(tài)生理水平的方法和組合物，以用于凝血因子(例如因子VIII)的長期遞送。
發(fā)明概述本發(fā)明提供適于基因治療治療血友病的改善的病毒載體。尤其是，本發(fā)明提供通過遞送編碼凝固蛋白質(zhì)因子VIII的核酸用于治療血友病A的AAV載體和方法。本發(fā)明還提供包含這種AAV載體的藥物組合物，以及制造和使用該載體的方法。
本發(fā)明尤其適用于血友病A的基因治療。因而，在本發(fā)明的一個實施方案中，至少將一種包含編碼因子VIII核酸分子的載體與指導(dǎo)因子VIII在合適的受體細胞中表達的控制序列有效地連接。接著將AAV載體在導(dǎo)致因子VIII表達的條件下，引入到受治療者的受體細胞中。因而，該受治療者獲得了因子VIII的連續(xù)供給，以便在出血事件期使血液凝結(jié)。
通過使用本發(fā)明的方法，實現(xiàn)了在體內(nèi)長期表達治療水平的因子VIII。在一個實施方案中，通過門靜脈注射給予動物兩種AAV載體一種攜帶有編碼因子VIII的重鏈DNA序列，另一種攜帶有編碼因子VIII的輕鏈DNA序列。定期收集血液樣品并測定因子VIII活性?？芍貜?fù)地，動物表達有生物學(xué)活性的、600-900ng/ml的因子VIII，其水平遠高于大約200ng/ml的正常生理水平。而且，這些水平持續(xù)了13個月以上，因子VIII的水平或活性沒有下降。在另一相關(guān)的實施方案中，將刪除結(jié)構(gòu)域B形式的因子VIII克隆到單AAV載體中，顯示表達有生物學(xué)活性的因子VIII。
然而，并不旨在將本發(fā)明限制在特別的實施方案。通過使用多種不同的控制和調(diào)節(jié)序列，既在體內(nèi)又在體外已制造并試驗了許多不同形式的重組因子VIII。通過使用AAV載體和本發(fā)明中講授的方法能夠表達編碼有生物學(xué)活性的因子VIII的任何DNA序列。所以，本發(fā)明涵蓋含有能夠在體外或體內(nèi)產(chǎn)生有生物學(xué)活性的因子VIII蛋白質(zhì)的任一AAV載體或多種載體。
例如在某些實施方案中，AAV載體含有因子VIII重鏈的前57個堿基對(編碼10個氨基酸信號序列和人生長激素(hGH)多聚腺苷酸化序列)。在某些替代實施方案中，載體也含有結(jié)構(gòu)域A1和A2，以及結(jié)構(gòu)域B的N端的5個氨基酸，和/或結(jié)構(gòu)域B的C端的85個氨基酸，以及結(jié)構(gòu)域A3，C1和C2。而在其他實施方案中，將編碼因子VIII重鏈和輕鏈的核酸克隆到單一載體中，其被編碼結(jié)構(gòu)域B的14個氨基酸的42個核苷酸分隔開。
本發(fā)明還提供施用上述載體的方法。例如，本發(fā)明旨在涵蓋適于將AAV載體遞送到患者受體或試驗動物的肝臟中的方法。并不旨在將本發(fā)明限制在任何特定的施用途徑。然而，在優(yōu)選的實施方案中，通過門或動脈血管系統(tǒng)成功地施用了本發(fā)明的AAV載體。
鑒于本文所公開的內(nèi)容，對本領(lǐng)域的那些普通技術(shù)人員而言實施本發(fā)明的這些和其他實施方案是容易的。
附圖簡述

圖1提供表示因子VIII蛋白質(zhì)的簡圖。
圖2提供表示缺失結(jié)構(gòu)域B形式的因子VIII蛋白質(zhì)的簡圖。
圖3提供表示從內(nèi)部末端重復(fù)(ITR到ITR)開始的、缺失結(jié)構(gòu)域B形式的因子VIII構(gòu)建體(AAV-F8-1)的筒圖，包括控制序列。
圖4提供表示從內(nèi)部末端重復(fù)(ITR到ITR)開始的、缺失結(jié)構(gòu)域B形式的因子VIII構(gòu)建體(PVM4.1c-F8AB)的簡圖，包括控制序列。
圖5提供pAAV-F8-1的序列(ITR到ITR)，其中質(zhì)粒的骨架略去。
圖6提供pVm4.1cF8ΔB的序列(ITR到ITR)，其中質(zhì)粒的骨架略去。
圖7提供載體rAAV-hFVIII-HC和rAAV-hFVIII-LC的圖譜。
圖8提供證明多種人FVIII的構(gòu)建體在大鼠血漿中表達的曲線圖。
圖9提供使用對(A)hFVIII輕鏈和(B)hFVIII重鏈特異性的探針之肝DNA的Southern印跡分析。
圖10提供使用對(A)hFVIII輕鏈和(B)hFVIII重鏈特異性的探針之來自不同組織DNA的Southern印跡分析。
圖11提供使用對(A)hFVIII輕鏈和(B)hFVIII重鏈特異性的探針之肝RNA的Northern印跡分析。
本發(fā)明涉及用于在人細胞中高水平表達基因產(chǎn)品的改善的病毒載體。尤其是，本發(fā)明提供適用于基因治療的AAV載體。這些載體具有遞送含核酸構(gòu)建體的能力，導(dǎo)致在宿主中產(chǎn)生因子VIII蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供包含這種AAV載體的藥物組合物，以及制造和使用這些構(gòu)建體的方法。
可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生本發(fā)明的AAV載體和rAAV病毒粒。這些方法一般包括步驟(1)將AAV載體引入到宿主細胞；(2)將AAV輔助構(gòu)建體引入到宿主細胞，其中輔助構(gòu)建體包含能夠在宿主細胞中表達以互補從AAV載體中缺失的AAV輔助功能的AAV編碼區(qū)；(3)將一種或更多的輔助病毒和/或附屬功能載體引入到宿主細胞，其中輔助病毒和/或附屬功能載體提供能夠支持重組AAV(“rAAV”)病毒體在宿主細胞中有效地產(chǎn)生的附加功能；(4)培養(yǎng)宿主細胞以產(chǎn)生rAAV病毒體。通過使用標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)染技術(shù)可以將AAV載體、AAV輔助構(gòu)建體和輔助病毒或一種或多種附屬功能載體，同時地或者依次地引入到宿主細胞中。
除非特別指出，本發(fā)明的實施采用了本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的病毒學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)和重組DNA技術(shù)的常規(guī)方法，包括那些在諸如Sambrook等人編著.分子克隆實驗手冊(Molecular CloningALaboratory Mannual)，Glover編著.DNA克隆實用方法(DNACloningA Practical Approach)第I和II卷，Gait編著。寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)，Hames和Higgins編著。核酸雜交(Nucleic Acid Hybridization)，Hames和Higgins編著。轉(zhuǎn)錄和翻譯(Transcription and Translation)，Tijessen編著。CRC細小病毒手冊(CRC Handbook of Parvoviruses)第I和II卷，F(xiàn)ields和Knipe編著?；A(chǔ)病毒學(xué)(Fundamental Virology)第二版第I和II卷中的參考文獻中描述的方法。定義在描述本發(fā)明中將使用下列術(shù)語，并將其定義如下。
如本文所用，術(shù)語“基因轉(zhuǎn)移”和“基因遞送”指將特定的核苷酸序列(例如DNA)可靠地插入到靶細胞中的方法或系統(tǒng)。在特別優(yōu)選的實施方案中，該核苷酸序列包含至少一部分因子VIII。
如本文所用，術(shù)語“載體”和“基因轉(zhuǎn)移載體”指任何遺傳元件，諸如質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、粘粒、染色體、病毒、病毒體等，當(dāng)其與恰當(dāng)?shù)目刂菩蛄邢嗦?lián)系時具有復(fù)制能力和/或在細胞之間可以轉(zhuǎn)移核酸序列。因而，該術(shù)語包括克隆和表達載體以及病毒載體。
基因轉(zhuǎn)移載體可以包含轉(zhuǎn)錄序列，諸如多聚腺苷酸化位點、選擇性標(biāo)記或報告基因、增強子序列和其他能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的控制序列。在下面對這些控制序列予以更加全面的描述。
術(shù)語“表達載體”如本文所用指重組的DNA分子，其含有在特定的宿主生物體中為表達有效地連接的編碼序列所必需的希望的編碼序列和適當(dāng)?shù)暮怂嵝蛄?。為了在原核生物中表達而必需的核酸序列常常包含有啟動子、操縱子(任選)和核糖體結(jié)合位點以及其他序列。通常所知，真核細胞使用啟動子(組成型的、誘導(dǎo)型的或組織特異型的)、增強子、終止信號和多聚腺苷酸化信號，盡管可以刪除某些元件和添加其他元件而不犧牲必需的表達。
如本文所用，術(shù)語“宿主”和“表達宿主”指包含外源DNA序列(例如通過轉(zhuǎn)染)、表達載體或媒介物的生物體和/或細胞，以及適用于表達重組的基因或蛋白質(zhì)的生物體和/或細胞。并不旨在將本發(fā)明限制在任何特殊類型的細胞或生物體。確實，期望將任何合適的生物體和/或細胞作為宿主用于本發(fā)明。
如本文所用，術(shù)語“病毒復(fù)制子”和“病毒的復(fù)制起點”指病毒DNA序列，其允許位于表達適當(dāng)?shù)膹?fù)制因子的宿主細胞中的載體以染色體外方式復(fù)制。在某些實施方案中，含有SV40或者多瘤病毒復(fù)制起點的載體復(fù)制至高拷貝數(shù)，而含有來自牛乳頭瘤病毒或EB病毒的復(fù)制子的載體，以染色體外方式復(fù)制至低拷貝數(shù)，其可使用于其他實施方案中。
如本文所用，術(shù)語“AAV載體”指具有功能性的或部分功能性的ITR序列。ITR序列可以來自腺伴隨病毒血清型，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7等。然而，ITR并不需要是野生型的核苷酸序列，其可被改變(例如通過核苷酸插入、刪除或替換)，只要序列保留提供有功能的搶救、復(fù)制和包裝的功能?？梢詫AV載體上的一個或多個AAV野生型基因(優(yōu)選地rep和/或cap基因)全部或部分刪除，但保留有功能的側(cè)翼ITR序列。具有功能的ITR序列對AAV病毒體的搶救、復(fù)制和包裝是必需的。因而，在此將“AAV載體”定義為至少包含在病毒的復(fù)制和包裝中以順式方式必需的那些序列(例如具有功能的ITR)。
如本文所用，術(shù)語“ITR”指反向末端重復(fù)。術(shù)語“腺伴隨病毒反向末端重復(fù)”或“AAV ITR”指本領(lǐng)域周知的回文區(qū)，見于AAV基因組的每個末端，作為DNA復(fù)制起點和病毒的包裝信號以順式方式共同起作用。為用于本發(fā)明中的某些實施方案，將AAV側(cè)翼ITR置于所選的一個或多個異源核苷酸序列的5’和3’位。任選地，ITR與rep的編碼區(qū)或者Rep表達產(chǎn)物一起用于所選的序列整個進入靶細胞的基因組中。
如本文所用，術(shù)語“AAV rep編碼區(qū)”指AAV基因組的本領(lǐng)域周知的區(qū)域，其編碼復(fù)制蛋白質(zhì)Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。這些Rep表達產(chǎn)物已證明具有許多功能，包括對AAV的DNA復(fù)制起點的識別、結(jié)合和產(chǎn)生缺刻，DNA螺旋酶活性和AAV(或其他異源)啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)制。為復(fù)制AAV基因組，共同地需要Rep表達產(chǎn)物。Muzyczka(Muzyczka.Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158；97-129，1992)和Kotin(Kotin和Hum.基因治療(Gene Ther.)，5；793-801，1994)提供了對AAV的rep編碼區(qū)以及cap編碼區(qū)的另外描述(如下)。AAV的rep編碼區(qū)的適合的同源物包括人皰疹病毒6(HHV-6)的rep基因，據(jù)知其也介導(dǎo)AAV-2DNA復(fù)制(Thompson等人。病毒學(xué)(Viroi.)，204；304-311，1994)。
如本文所用，術(shù)語“AAV cap編碼區(qū)”指AAV基因組的本領(lǐng)域周知的區(qū)域，其編碼衣殼蛋白質(zhì)VP1、VP2和VP3或其功能性同源物。這些cap表達產(chǎn)物提供包裝功能，共同地需要這樣的表達產(chǎn)物以包裝病毒基因組。
如本文所用，術(shù)語“AAV輔助功能”指AAV這樣的編碼區(qū)，其能夠在宿主細胞中表達以互補AAV載體中缺失的AAV病毒功能。一般地，AAV輔助功能包括AAV rep編碼區(qū)和AAV cap編碼區(qū)。“AAV輔助構(gòu)建體”為含有這樣的AAV編碼區(qū)的載體，所述編碼區(qū)為互補從AAV載體中缺失的AAV病毒功能所需要的(例如AAV的rep編碼區(qū)和AAV的cap編碼區(qū))。
如本文所用，術(shù)語“附屬功能”和“附屬因子”指AAV復(fù)制需要但并不是由AAV病毒體(或rAAV病毒體)本身提供的功能和因子。因而，這些附屬功能和因子必須由宿主細胞、病毒(例如腺病毒或單純皰疹病毒)或處于相同細胞中的另一個被共表達的表達載體提供。通常情況下，將腺病毒的E1、E2A、E4和VA的編碼區(qū)用于提供為AAV復(fù)制和包裝所需要的必需的附屬功能(Matsushita等人.基因治療，5；938，1998)。
如本文所用，術(shù)語“野生型”(“wt”)指基因或基因產(chǎn)物，其具有將其從天然存在的來源中分離出來的時候該基因或基因產(chǎn)物所具有的特性。野生型基因就是在群體中最常觀察到的基因，因而主觀地將其指定為基因的“正?！被颉耙吧汀毙问健Ｅc此形成對照，術(shù)語被修飾的”或“突變體”指這樣的基因或基因產(chǎn)物，其在與野生型的基因或基因產(chǎn)物比較時在序列和/或功能性質(zhì)上顯示出修飾(即，改變了的性質(zhì))。要指出的是，可以分離到天然發(fā)生的突變體；這些突變體通過這樣的事實而得以鑒定即當(dāng)它們與野生型基因或基因產(chǎn)物相比較時具有改變了的性質(zhì)。
如本文所用，術(shù)語“AAV病毒體”指完整的病毒顆粒，諸如野生型”(wt)AAV病毒顆粒(包含與AAV衣殼蛋白質(zhì)外殼相結(jié)合的線性、單鏈AAV核酸基因組)。在這一點上，可以將任一互補的有義(“正義”或“反義”鏈)的單鏈AAV核酸分子包裝入任一AAV病毒體，并且所有兩條鏈具有相等的感染性。
如本文所用，術(shù)語“重組AAV病毒體”和“rAAV病毒體”指含有異源目的DNA分子(例如因子VIII序列)的感染性病毒顆粒，而目的DNA分子的兩側(cè)均為AAV ITR。在本發(fā)明的某些實施方案中，在其中含有AAV載體、AAV輔助功能及附屬功能的適合的宿主細胞中產(chǎn)生rAAV病毒體。這樣就賦予宿主細胞編碼AAV多肽的能力，在將含有重組目的核苷酸序列的AAV載體(諸如至少一部分因子VIII或因子VIII結(jié)構(gòu)域的部分)包裝入重組的病毒顆粒中用于隨后的基因遞送時需要這些多肽。
如本文所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)染”指細胞吸收外來的DNA，當(dāng)將外源的DNA引入到細胞膜內(nèi)時，細胞就被“轉(zhuǎn)染”了。在本領(lǐng)域中有許多普遍公知的轉(zhuǎn)染技術(shù)(見例如，Graham等人。病毒學(xué)，52；456，1973；Sambrook等人編著。分子克隆實驗手冊(Molecular CloningALaboratory Mannual)，冷泉港實驗室，紐約，1989；Davis等人。分子生物學(xué)基本方法(Basic Methods in Molecular Biology)，Elsevier，1986；Chun等人。基因(Gene)，13；197，1981)?？梢圆捎眠@些技術(shù)將一種或多種外源的DNA成分，諸如基因轉(zhuǎn)移載體和其他核酸分子，引入到適合的受體細胞中。
如本文所用，術(shù)語“穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染”和“穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染的”指將外來的DNA引入和整合到被轉(zhuǎn)染細胞的基因組中。術(shù)語“穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子”指具有穩(wěn)定地整合入基因組DNA中的外來DNA的細胞。
如本文所用，術(shù)語“瞬時轉(zhuǎn)染”或“瞬時地轉(zhuǎn)染的”指將外來的DNA引入到細胞中，其中外來的DNA不能整合入被轉(zhuǎn)染細胞的基因組中。外來的DNA在被轉(zhuǎn)染細胞的細胞核中存在數(shù)天。在這一段時間里，外來的DNA受到指導(dǎo)位于染色體上的內(nèi)源基因表達的調(diào)節(jié)控制。術(shù)語“瞬時轉(zhuǎn)染子”指已吸收了外來的DNA但是不能將該DNA整合的細胞。
如本文所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)導(dǎo)”表示通過復(fù)制缺陷型病毒載體(諸如通過重組的AAV病毒體)將DNA分子體內(nèi)或體外遞送到受體細胞中。
如本文所用，術(shù)語“受體細胞”指已被核酸構(gòu)建體或含有所選目的核苷酸序列(即因子VIII)的載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞，或者具有被核酸構(gòu)建體或含有所選目的核苷酸序列(即因子VIII)的載體所轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力的細胞。本術(shù)語包括親代細胞的后代，不管后代在形態(tài)或遺傳組成上是否與原始的親代完全一致，只要存在所選的序列。
術(shù)語“異源”當(dāng)其指核酸序列(諸如編碼序列和控制序列)時，表示在正常情況下沒有連接在一起和/或在正常情況下不與特定的細胞相聯(lián)系的序列。因而，核酸構(gòu)建體或載體的“異源”區(qū)即為一核酸片段，其在另一個核酸分子內(nèi)或附加于該核酸分子上，而在自然界中沒有發(fā)現(xiàn)其與上述的另一個核酸分子相聯(lián)系。例如，核酸構(gòu)建體的異源區(qū)可以包含這樣的編碼序列，在自然界中沒有發(fā)現(xiàn)該編碼序列兩側(cè)的序列與其有聯(lián)系。異源編碼序列的另一個例子是這樣的構(gòu)建體，其中的編碼序列本身在自然界中沒有發(fā)現(xiàn)(例如具有不同于天然基因的密碼子的合成序列)。相似地，為了本發(fā)明的意圖，被正常情況下在細胞中不存在的構(gòu)建體所轉(zhuǎn)染的細胞將被認為是異源的。如本文所用，等位基因的變異或天然發(fā)生的突變事件并不產(chǎn)生異源的DNA。
如本文所用，“編碼序列”或“編碼”特定抗原的序列是當(dāng)將其置于適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列的控制之下時，在體內(nèi)或體外被轉(zhuǎn)錄(DNA情況下)和翻譯(mRNA情況下)為多肽的核酸序列。編碼序列的邊界由位于5’(氨基)端的起始密碼子和位于3’(羧基)端的翻譯終止密碼子決定。編碼序列可以包括但不限于來自原核生物或真核生物的mRNA的cDNA、來自原核生物或真核生物DNA的基因組DNA序列，甚至合成的DNA序列。通常轉(zhuǎn)錄終止序列位于編碼序列的3’位。
如本文所用，術(shù)語“核酸序列”指DNA或RNA序列。該術(shù)語將含有DNA和RNA的任何已知的堿基類似物均包括在內(nèi)，諸如但不限于4-乙酰胞嘧啶核苷、8-羥基-N6-甲基腺嘌呤核苷、氮雜環(huán)丙烯基胞嘧啶核苷、假異胞嘧啶核苷、5-(羧羥甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、肌苷、N6-異戊烯腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶核苷、5-甲基胞嘧啶核苷、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨甲尿嘧啶、5-甲氧氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-mannosylqueosine、5’-甲氧羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧尿嘧啶、2-甲基硫-N6-異戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-羥乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羥乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶核苷、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-羥乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羥乙酸、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶核苷和2，6-二氨基嘌呤。
如本文所用，術(shù)語“重組DNA分子”如本文所用，指含有通過分子生物學(xué)的技術(shù)手段連接到一起的DNA區(qū)段的DNA分子。
如本文所用，術(shù)語“調(diào)節(jié)元件”指控制核酸序列表達的某些方面的遺傳元件。例如啟動子是促進有效地連接的編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)節(jié)元件。其他調(diào)節(jié)元件為剪接信號、多聚腺苷酸化信號、終止信號等等(定義見下)。
術(shù)語DNA“控制序列”共同地指調(diào)節(jié)元件，諸如啟動子序列、多聚腺苷酸化信號、轉(zhuǎn)錄終止序列、上游調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域、復(fù)制起點、內(nèi)部核糖體進入位點(“IRES”)、增強子等等，它們共同地為受體細胞中的編碼序列提供復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。只要所選編碼序列能夠在適當(dāng)?shù)氖荏w細胞中被復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯就并不需要所有這些控制序列永遠存在。
真核生物中的轉(zhuǎn)錄控制信號一般包括“啟動子”和“增強子”元件。啟動子和增強子由與參與轉(zhuǎn)錄的細胞蛋白質(zhì)特異性地相作用的短列DNA序列組成(Maniatis等人?？茖W(xué)(Science)，236；1237，1987)。已從多種真核生物來源包括酵母、昆蟲和哺乳動物細胞和病毒的基因中分離出啟動子和增強子元件(類似的控制序列即啟動子也在原核生物中發(fā)現(xiàn))。對特定的啟動子和增強子的選擇依賴于將使用什么類型的細胞來表達目的蛋白質(zhì)(即因子VIII)。某些真核生物的啟動子和增強子具有寬宿主范圍，而其他則在有限的細胞類型的亞類中具有功能(見例如，Voss等人。Trends.Biochem.Sci.，11；287，1986；和Maniatis等人。同上，綜述)。例如，SV40早期基因的增強子在來自許多哺乳動物種類的廣泛的多種細胞類型中活性非常高，并且廣泛地用于在哺乳動物細胞中表達蛋白質(zhì)(Dijkema等人。EMBO J.，4；761，1985)。在寬范圍的哺乳動物細胞類型中具有活性的另外兩個啟動子和增強子元件的例子是人延伸因子1α基因(Uetsuki等人.生物化學(xué)雜志，264；5791，1989；Kim等人.基因，91；217，1990；和Mizushima和Nagata.核酸研究(Nucl.Acids.Res.)，18；5322，1990)和勞氏肉瘤病毒的長末端重復(fù)(Gorman等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79；6777，1982)和人巨細胞病毒(Boshart等人.細胞(Cell)，41；521，1985)的啟動子和增強子。發(fā)現(xiàn)啟動子和增強子在天然狀態(tài)下可以單獨或一起存在。例如逆轉(zhuǎn)錄病毒的長末端重復(fù)既含有啟動子功能又含有增強子功能。而且，通常地啟動子和增強子獨立地作用于被轉(zhuǎn)錄或翻譯的基因。因而，增強子和啟動子可以是“內(nèi)源的”或“外源的”或“異源的”。“內(nèi)源的”增強子/啟動子為基因組中與給定的基因天然地連接的增強子/啟動子?！巴庠吹摹被颉爱愒吹摹眴幼雍驮鰪娮訛橥ㄟ^遺傳操作手段(即分子生物學(xué)技術(shù))將其置于基因的并列位以使該基因的轉(zhuǎn)錄受所連接的增強子/啟動子指導(dǎo)。
如本文所用，術(shù)語“組織特異的”指諸如啟動子、增強子等這樣的調(diào)節(jié)序列或控制序列，其中核酸序列在特異的一種或多種細胞類型或組織中的表達要明顯地更高。在特別優(yōu)選的實施方案中，白蛋白啟動子和運甲狀腺素蛋白啟動子在肝細胞中比在其他細胞類型中顯示因子VIII的表達增加。然而并不旨在將本發(fā)明限制在白蛋白或運甲狀腺素蛋白啟動子或者限制在肝特異性表達，因為也構(gòu)思了其他的組織特異性調(diào)節(jié)元件或顯示改變了的基因表達模式的調(diào)節(jié)元件。
在表達載體上，“剪接信號”的存在常常導(dǎo)致重組轉(zhuǎn)錄本的較高水平表達。剪接信號介導(dǎo)從原始RNA轉(zhuǎn)錄本上切除內(nèi)含子，它包括剪接供體和受體位點(Sambrook等人編著。分子克隆實驗手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，紐約，1989，16.7-16.8)。常使用的剪接供體和受體位點是來自SV40的16SRNA的剪接接點。
在真核生物的細胞中高效地表達重組的DNA序列需要指導(dǎo)所得轉(zhuǎn)錄本高效地終止和多聚腺苷酸化的信號表達。轉(zhuǎn)錄終止信號一般見于多聚腺苷酸化信號的下游并且長度為幾百個核苷酸。術(shù)語“poly A位點”或“poly A序列”，如本文所用，表示指導(dǎo)新生的RNA轉(zhuǎn)錄本終止及多聚腺苷酸化的DNA序列。重組的轉(zhuǎn)錄本高效地多聚腺苷酸化是期望的，因為缺少了poly A尾巴的轉(zhuǎn)錄本不穩(wěn)定，并且很快地被降解了。在表達載體中使用的poly A信號可以是“異源的”或“內(nèi)源的”。內(nèi)源的poly A信號為天然地見于基因組中給定基因的編碼區(qū)3’末端的poly A信號。異源的poly A信號為分離自一個基因并置于另一個基因的3’位的poly A信號。常用的異源poly A信號為SV40的poly A信號。SV40的poly A信號包含在237bp的BamHI/Bcl I限制性片段上，指導(dǎo)終止和多聚腺苷酸化(Sambrook等人。同上，在16.6-16.7)。
“有效地連接”指元件的排列，其中將所述組分構(gòu)型為能使它們發(fā)揮通常的功能。因而，與編碼序列有效地連接的控制序列具有實現(xiàn)編碼序列表達的能力。控制序列并不需要與編碼序列相鄰，只要它們有指導(dǎo)其表達的功能。因而，舉例來講，不翻譯但轉(zhuǎn)錄的間隔序列可以存在于啟動子序列和編碼序列之間，而仍可以認為啟動子序列與編碼序列有效地連接”。
術(shù)語“經(jīng)分離的”當(dāng)用于核酸方面時，如在“經(jīng)分離的寡核苷酸”或“經(jīng)分離的多核苷酸”中指這樣的核酸序列，其被鑒定并從至少一種在其天然的來源物中通常與其相聯(lián)系之污染物核酸中分離出來。經(jīng)分離的核酸所存在的形式或背景與其在自然界中被發(fā)現(xiàn)時的不同。與此相對照，未經(jīng)分離的核酸為諸如DNA和RNA的核酸，呈它們在自然界中存在的狀態(tài)。例如，給定的DNA序列(例如，一種基因)見于宿主細胞的染色體上，與相鄰的基因接近；RNA序列(諸如編碼特定蛋白質(zhì)的特定mRNA序列)以與許多其他編碼各種蛋白質(zhì)的多個mRNA的混合物形式見于細胞中。經(jīng)分離的核酸、寡核苷酸或多核苷酸可以單鏈或雙鏈的形式存在。當(dāng)將經(jīng)分離的核酸、寡核苷酸或多核苷酸用于表達蛋白質(zhì)時，寡核苷酸或多核苷酸將最少含有有義鏈或編碼鏈(即寡核苷酸或多核苷酸可以是單鏈)，但是可以同時含有有義鏈和反義鏈(即寡核苷酸或多核苷酸可以是雙鏈)。
如本文所用，術(shù)語“純化的”或“純化”指從樣品中去除污染物。例如，可以通過去除污染性的非免疫球蛋白蛋白質(zhì)將抗體純化；也可以通過去除不與目的抗原(例如，至少一部分因子VIII)相結(jié)合的免疫球蛋白將其純化。去除非免疫球蛋白蛋白質(zhì)和/或去除不與目的抗原(例如，至少一部分因子VIII)相結(jié)合的免疫球蛋白將使樣品中所需要的抗原反應(yīng)性的免疫球蛋白之百分比提高。在另一個例子中，將重組因子VIII多肽在細菌宿主細胞中表達，并且通過去除宿主細胞的蛋白質(zhì)將該多肽純化；由此提高了樣品中重組的多肽的百分比。
如本文所用，術(shù)語“嵌合蛋白質(zhì)”指從不同的基因中獲得的兩個或多個編碼序列，已將其克隆在一起，而且在翻譯后其以單一多肽序列起作用。嵌合蛋白質(zhì)也稱為“雜合蛋白質(zhì)”。如本文所用，術(shù)語“嵌合蛋白質(zhì)”指從不同的生物體種類中獲得的編碼序列，以及從相同的生物體種類中獲得的編碼序列。
“包含給定的多核苷酸序列的組合物”，如本文所用，廣泛地指含有給定的多核苷酸序列的任何組合物。該組合物可以包含水性溶液。
如本文所用，術(shù)語“風(fēng)險”用于指經(jīng)歷出血事件風(fēng)險的個體。在特別優(yōu)選的實施方案中，這些個體為有輕度、中度或重度血友病的血友病患者。
如本文所用，術(shù)語“受治療者”指任何動物(即脊椎動物類和無脊椎動物類)；而術(shù)語“脊椎動物受治療者”指脊索動物亞門中的任一員。本術(shù)語旨在涵蓋該亞門中的任一成員，包括但不限于人類和其他靈長類、嚙齒類(例如小鼠、大鼠和豚鼠)、兔形類(例如兔)、牛類(例如家畜牛)、綿羊類(例如綿羊)、公山羊類(例如山羊)、豬類(例如豬)、馬類(例如馬)、犬類(例如狗)、貓類(例如貓)、馴養(yǎng)家禽(例如雞、火雞、鴨、鵝、其他鶉雞類鳥等)，以及野生的或野生動物類，包括但不限于諸如有蹄動物類(例如鹿)、熊、魚、兔形類、嚙齒類、鳥類等動物。并不旨在將本術(shù)語限制在特定的年齡或性別。所以，成年及新生的受治療者以及胎兒，不管是雄性還是雌性，均涵蓋于本術(shù)語中。
如本文所用，術(shù)語“治療有效量”或“治療有效劑量”為AAV載體或病毒體的量或劑量，該量或劑量的AAV載體或病毒體能產(chǎn)生足夠量的因子VIII，以減小受治療者的血液凝集所需的時間。一般地，具有不到因子VIII正常水平的1％的重度血友病患者的血液凝集時間大于60分鐘，與此相比，非血友病患者為大約10分鐘。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及適于血友病A的基因治療的AAV載體。尤其是，這些AAV載體適于將編碼因子VIII的核酸遞送到懷疑患有血液凝固障礙的受體宿主中。通過使用核酸作為模板，使宿主產(chǎn)生因子VIII，這樣受治療者的血液能夠凝集。本發(fā)明也提供包含這種AAV載體的藥物組合物以及制造和使用這些構(gòu)建體的方法。I AAV載體腺伴隨病毒(AAV)是非致病性的、復(fù)制缺陷的、輔助依賴的細小病毒(或“依賴病毒”或“腺衛(wèi)星病毒”)。至少有6個已識別的血清型，指定為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV-X7等。培養(yǎng)和血清學(xué)的證據(jù)顯示AAV2和AAV3使人發(fā)生感染。盡管人群的85％為AAV2血清陽性，卻從未將該病毒與人類的疾病相聯(lián)系。由于其廣泛的宿主范圍、出色的安全性和在感染宿主中轉(zhuǎn)基因表達的持續(xù)性，有意將重組的AAV(rAAV)病毒體作為基因治療的載體。重組的AAV(rAAV)病毒體的一個顯著的特性是體內(nèi)施用后獲得延長的表達。
通過使用已知的技術(shù)可以構(gòu)建本發(fā)明的AAV載體，以在轉(zhuǎn)錄方向上有效地連接的成分提供(a)控制序列，包括轉(zhuǎn)錄起始和終止區(qū)，和(b)編碼至少一部分因子VIII的核苷酸序列。所選控制序列在靶受體細胞中具有功能。所得的含有有效地連接的組分之構(gòu)建體與功能性的AAV ITR序列結(jié)合(5’和3’位)。
AAV ITR區(qū)的核苷酸序列已知(見例如，Kotin和Hum.基因治療，5；793-801，1994；在Fields和Knipe編著病毒學(xué)基礎(chǔ)(Fundamental Virology)第二版中，Berns.“細小病毒屬及其復(fù)制(Parvoviridae and Their replication)”有AAV-2的序列)。用于本發(fā)明載體中的AAV ITR并不需要為野生型的核苷酸序列，并且可以將其改變(例如，通過核苷酸插入、缺失或替換)。另外，AAV ITR可以從幾個AAV血清型，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV-X7等中的任何一個衍生而來。而且，在AAV載體中，位于所選核苷酸序列側(cè)翼的5’和3’位的ITR只要它們發(fā)揮預(yù)想的功能，并不一定需要與相同的AAV血清型或分離物完全相同或由其衍生。A控制序列在本發(fā)明的某些實施方案中，在載體中使用了異源控制序列。一般地，使用的異源控制序列包括那些來自編碼哺乳動物或病毒基因的控制序列。例如，包括但不限于SV40早期啟動子、小鼠乳癌病毒LTR啟動子、腺病毒主要晚期啟動子(Ad MLP)、單純皰疹病毒(HSV)啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子(諸如CMV立即早期啟動子區(qū)(CMVIE))、勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動子、合成的啟動子、雜合啟動子等等。另外，來自非病毒基因(諸如鼠金屬硫蛋白基因)的序列也在此使用。這些啟動子序列已有商業(yè)供應(yīng)(例如從Stratagene)。
在某些實施方案中，期望可以獲得組織特異性的表達(例如由肝細胞表達有生物學(xué)活性的因子VIII)。并不旨在將本發(fā)明限制在由任一特定的細胞或細胞類型表達有生物學(xué)活性的因子VIII。然而由于肝細胞(即肝臟細胞)是正常情況下合成因子VIII的細胞(見，Kaufman.Ann.Rev.Med.，43；325，1992)，所以在某些特別優(yōu)選的實施方案中，期望將本發(fā)明的組合物施用于肝臟。
在優(yōu)選的實施方案中，通過將因子VIII的編碼序列與異源控制序列(來自在所選的組織類型中專一性地被轉(zhuǎn)錄的基因)偶聯(lián)獲得表達。前面已經(jīng)對許多組織特異性的啟動子予以描述，它們能夠在所選組織類型中實現(xiàn)指導(dǎo)性表達。然而用于本AAV載體的控制序列也可以包括正常情況下與所選核酸序列相聯(lián)系的控制序列。B AAV因子VIII載體的構(gòu)建通過將所選序列直接插入到已切除主要的AAV開放閱讀框架(“ORF”)的AAV基因組中，可以構(gòu)建結(jié)合AAV ITR的含有控制序列和目的核苷酸序列(即至少一部分編碼因子VIII的序列)的AAV載體(即AAV載體)。只要保留了足夠的ITR部分以發(fā)揮復(fù)制和包裝功能，也可以刪除AAV基因組的其他部分。通過使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)(見例如，美國專利5173414和5139941(所有這些于此處引用作為參考)；國際專利出版物WO92/01070和WO93/03769；Lebkowski等人.分子細胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)，8；3988-3996，1988；Vincent等人。疫苗90(Vaccines 90)，冷泉港實驗室出版社，1990；Carter.Curr.Opin.Biotechnol.，3；533-539，1992；Muzyczka.Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158；97-129，1992；Kotin和Hum.基因治療，5；793-801，1994；Shelling和Smith.基因治療，1；165-169，1994；和Zhou等人。實驗醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)，179；1867-1875，1994)可以設(shè)計這些構(gòu)建體。
或者，可將AAV ITR從病毒基因組中或者從含有AAV ITR的AAV載體中切割下來，通過使用標(biāo)準(zhǔn)的連接技術(shù)(諸如那些在Sambrook等人。同上，中所描述)將其融合于位于另一個載體上的所選核酸構(gòu)建體的5’和3’。例如可在20mM Tris-HCl pH7.5，10mMMgCl2，10mM DTT，33μg/ml BSA，10mM-50mM NaCl和40μM ATP，0.01-0.02(Weiss)單位的T4 DNA連接酶中于0℃(對于“粘性末端”連接)或1mM ATP，0.3-0.6(Weiss)單位的T4 DNA連接酶中于14℃(對于“平端”連接)連接，可得以完成連接。分子間的“粘性末端”連接通常在總DNA濃度為30-100μg/ml(總末端濃度5-100nM)下進行。含有ITR的幾種AAV載體已在例如美國專利5139941(此處引用作為參考)中描述過。尤其是其中描述了幾個可以從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(收藏號為53222、53223、53224、53225和53226)得到的AAV載體。
另外，可以通過合成方式產(chǎn)生包含AAV ITR序列(置于所選核酸序列的5’和3’位)的嵌合基因。從按標(biāo)準(zhǔn)方法(見例如，Edge.自然，292；756，1981；Nambair等人?？茖W(xué)，223；1299，1984；Jay等人。生物化學(xué)雜志，259；6311，1984)制備的重疊寡核苷酸裝配完整的嵌合序列。
而且，并不旨在將本發(fā)明限制在任何特定因子VIII序列。通過使用多種不同的調(diào)節(jié)元件和控制元件，在體外和體內(nèi)已分離和測定了許多天然的和重組形式的因子VIII。因而，通過使用AAV載體和本發(fā)明中講授的方法可以表達任何已知的或以后發(fā)現(xiàn)的編碼有生物學(xué)活性的因子VIII的DNA序列(單獨地或與至少一種另外的載體聯(lián)合)。天然發(fā)生的或重組形式的因子VIII的例子可見于專利和科學(xué)文獻，包括美國專利5563045、美國專利5451521、美國專利5422260、美國專利5004803、美國專利4757006、美國專利5661008、美國專利5789203、美國專利5681746、美國專利5595886、美國專利5045455、美國專利5668108、美國專利5633150、美國專利5693499、美國專利5587310、美國專利5171844、美國專利5149637、美國專利5112950、美國專利4886876、國際專利94/11503、國際專利87/07144、國際專利92/16557、國際專利91/09122、國際專利97/03195、國際專利96/21035、國際專利91/07490、歐洲專利0672138、歐洲專利0270618、歐洲專利0182448、歐洲專利0162067、歐洲專利0786474、歐洲專利0533862、歐洲專利0506757、歐洲專利0874057、歐洲專利0795021、歐洲專利0670332、歐洲專利0500734、歐洲專利0232112、歐洲專利0160457、Sanberg等人.第二十屆血友病世界聯(lián)盟國際大會(1992年)(XXth Int.Congress of the World Fed.Of Hemophilia(1992))、Lind等人。歐洲生物化學(xué)雜志，232；19，1995。
使用重組方法，諸如通過篩選表達因子VIII的細胞之cDNA和基因組文庫或通過從已知包含因子VIII的序列之載體得到序列，能夠獲得編碼上述因子VIII的核酸序列。此外，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，諸如苯酚抽提和cDNA或基因組DNA的PCR(見Sambrook等人.，同上，對獲取和分離DNA技術(shù)的描述)，能夠從含有因子VIII序列的細胞或組織中直接分離出所需序列。也可以通過合成而不是克隆產(chǎn)生編碼目的抗原(即因子VIII序列)的核苷酸序列。能夠從按標(biāo)準(zhǔn)方法制備的重疊的寡核苷酸裝配完整的序列，并裝配成為完整的編碼序列(見，例如Edge.自然，292；756，1981；Nambair等人?？茖W(xué)，223；1299，1984；Jay等人。生物化學(xué)雜志，259；6311，1984)。
盡管并不旨在將本發(fā)明限制于評價生產(chǎn)生物學(xué)活性的因子VIII的任何特定的方法，但是構(gòu)思了諸如免疫測定(例如ELISA)和生物學(xué)活性測定方法(例如凝固活性測定)。
此外，在特別優(yōu)選的實施方案中，人因子VIII涵蓋于本發(fā)明，并不旨在將本發(fā)明限制于人因子VIII。確實，本發(fā)明旨在涵蓋來自除人類以外的動物，包括但不限于陪伴動物類(例如犬類、貓類和馬類)、家畜(例如牛類、公山羊類和綿羊類)、實驗室動物類(例如嚙齒類諸如鼠類以及兔形類)和“奇異的”動物(例如海洋哺乳動物、巨型的貓等)的因子VIII。II病毒體的產(chǎn)生產(chǎn)生本發(fā)明的AAV因子VIII載體和rAAV因子VIII病毒體一般涉及步驟(1)將含有因子VIII基因的AAV載體引入到宿主細胞；(2)將AAV輔助構(gòu)建體引入到宿主細胞，其中輔助構(gòu)建體含有能夠在細胞中表達以互補從AAV載體中失去的AAV輔助功能的AAV編碼區(qū)；(3)將一個或多個輔助病毒和/或附屬功能載體引入到宿主細胞中，其中輔助病毒和/或附屬功能載體提供能夠支持重組的AAV(“rAAV”)病毒體在宿主細胞中高效產(chǎn)生的附屬功能；(4)培養(yǎng)宿主細胞以產(chǎn)生rAAV病毒體。
使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)方法(例如轉(zhuǎn)染)可以將上述的載體和構(gòu)建體引入到宿主細胞中。在本領(lǐng)域中已公知許多轉(zhuǎn)染技術(shù)(見例如，Graham等人。病毒學(xué)，52；456，1973；Sambrook等人。同上，Davis等人。同上，Chu等人?；?，13；197，1981)。特別適合的轉(zhuǎn)染方法包括磷酸鈣共沉淀(Graham等人。病毒學(xué)，52；456-467，1973)、直接顯微注射進入培養(yǎng)細胞(Capecchi.細胞，22；479-488，1980)、電穿孔(Shigekawa等人。生物技術(shù)(BioTechn)，6；742-751，1988)、脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(Mannino等人。生物技術(shù)(BioTechn)，6；682-690，1988)、脂肪介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)(Felgner等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84；7413-7417，1987)和使用高壓微粒轟擊的核酸遞送(Klein等人。自然，327；70-73，1987)。
為了本發(fā)明的目的，產(chǎn)生rAAV病毒體的適合的宿主細胞包括可以用作或已經(jīng)用作異源DNA分子受體的微生物、酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。術(shù)語包括已經(jīng)被轉(zhuǎn)染的原始細胞的后代。因而，如上所示，縮主細胞”如本文所用，一般地指已被外源的DNA序列轉(zhuǎn)染的細胞。在實施本發(fā)明中，優(yōu)選來自人的穩(wěn)定的細胞系293(ATCC收藏號CRL1573)。尤其是，人細胞系293是已被腺病毒-5的DNA片段轉(zhuǎn)化的人胚胎腎細胞系(Graham等人.普通病毒學(xué)雜志(J.Gen.Virol.)，36；59，1977)，并且表達腺病毒的E1a和E1b基因(Aiello等人。病毒學(xué)，94；460，1979)。該293細胞系很容易被轉(zhuǎn)染，并為在其中產(chǎn)生rAAV病毒體提供特別方便的平臺。
為了產(chǎn)生rAAV病毒體，含有上述AAV載體的宿主細胞必需具有能夠提供AAV輔助功能以復(fù)制和加衣殼于兩側(cè)為AAV ITR的核苷酸序列的能力。AAV輔助功能一般為來自AAV的可以被表達以提供AAV基因產(chǎn)物的編碼序列，反過來，其為大量復(fù)制AAV以反式方式起作用。如本文所用，AAV輔助功能為互補從AAV載體中失去的必需的AAV功能。因而AAV輔助功能包括一個或所有兩個主要的AAV ORF，即rep和cap編碼區(qū)，或其功能性同源物。
通過用AAV輔助構(gòu)建體轉(zhuǎn)染宿主細胞(在用AAV載體轉(zhuǎn)染之前或與AAV載體同時轉(zhuǎn)染)將AAV輔助功能引入到宿主細胞中。如此使用的AAV輔助構(gòu)建體至少提供AAV rep和/或cap基因的瞬時表達，以互補大量AAV感染所必需的失去的AAV功能。AAV輔助構(gòu)建體缺少AAV ITR并且既不能復(fù)制又不能包裝它們本身。
在優(yōu)選的實施方案中，這些構(gòu)建體以載體形式存在，載體包括但不限于質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、粘粒、病毒或病毒體。已描述過許多AAV輔助構(gòu)建體，諸如常用的既編碼Rep又編碼Cap表達產(chǎn)物的質(zhì)粒pAAV/Ad和pIM2929+45(見例如，Samulski等人。病毒學(xué)雜志(J.Virol.)，63；3822-3828，1989；和McCarty等人。病毒學(xué)雜志，65；2936-2945，1991)。已描述過許多編碼Rep和/或Cap表達產(chǎn)物的其他載體(見例如，美國專利5139941，此處引用作為參考)。
可以將AAV載體和AAV輔助構(gòu)建體均構(gòu)建為含有一個或多個任選的選擇性標(biāo)記。適合的標(biāo)記包括賦予那些轉(zhuǎn)染有含有選擇性標(biāo)記的構(gòu)建體的細胞(當(dāng)轉(zhuǎn)染細胞生長于適當(dāng)?shù)倪x擇培養(yǎng)基時)以抗生素抗性或敏感性、產(chǎn)生顏色、或改變抗原特性的基因。用于實施本發(fā)明的幾個可選擇的標(biāo)記基因包括編碼氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)的基因，其通過賦予對G418的抗性允許在哺乳動物細胞中選擇。其他適合的標(biāo)記已為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。
為了產(chǎn)生rAAV病毒體，必須使宿主細胞(或包裝細胞)具有提供來自非AAV功能或“附屬功能”的能力。附屬功能為來自非AAV病毒的和/或細胞的功能(AAV依賴此功能復(fù)制其本身)。因而，附屬功能至少包括在AAV復(fù)制中需要的那些非AAV蛋白質(zhì)和RNA，包括那些參與了AAV基因轉(zhuǎn)錄的激活、階段特異性的AAV mRNA剪接、AAV DNA復(fù)制、rep和cap表達產(chǎn)物的合成和AAV衣殼裝配的物質(zhì)。以病毒為基礎(chǔ)的附屬功能可以來自任何已知的輔助病毒。
尤其是，通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，將附屬功能引入到宿主細胞中，然后在其中表達。通常，附屬功能由感染了無關(guān)輔助病毒的宿主細胞提供。已知許多適合的輔助病毒，包括腺病毒、諸如單純皰疹病毒1型和2型的皰疹病毒和痘病毒。非病毒的附屬功能也將在本文中使用，諸如那些通過使用任何已知的多種試劑進行細胞同步化提供的物質(zhì)(見例如，Buller等人。病毒學(xué)雜志，40；241-247，1981；McPherson等人。病毒學(xué)，147；217-222，1985；Schlehofer等人.病毒學(xué)，152；110-117，1986)。
或者，可以通過使用附屬功能載體提供附屬功能。附屬功能載體包含提供一種或多種附屬功能的核苷酸序列。附屬功能載體能夠被引入到適合的宿主細胞中以支持AAV病毒體在宿主細胞中高效產(chǎn)生。附屬功能載體可以質(zhì)粒、噬菌體、病毒、轉(zhuǎn)座子或粘粒的形式存在。附屬功能載體也可以一個或多個線性化的DNA或RNA片段存在，當(dāng)其與適當(dāng)?shù)目刂菩蛄泻兔赶嗦?lián)系時，可以在宿主細胞中被轉(zhuǎn)錄和翻譯以提供附屬功能。
提供附屬功能的核酸序列可以從天然來源物諸如從腺病毒基因組中獲得，或者采用本領(lǐng)域已知的重組或合成的方法構(gòu)建。在這一點上，對來自腺病毒的附屬功能進行了廣泛的研究，已對涉及附屬功能的許多腺病毒基因進行了鑒定和部分表征(見例如，Carter.“腺伴隨病毒輔助功能”，CRC細小病毒手冊(CRC Handbook of Parvoviruses)，第I卷(P.Tijssen編輯)，1990；和Muzyczka.Curr.Top.Microbiol.Immun.，158；97-129，1992)。特別是，據(jù)認為腺病毒的早期基因區(qū)E1a、E2a、E4、VAI RNA和(很可能的)E1b參與輔助過程(Janik等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78；1925-1929，1981)。對來自皰疹病毒的附屬功能已予以描述(Young等人.Prog.Med.Virol.，25；113，1979)。對來自痘病毒的附屬功能也予以了描述(見例如，Carter.同上，和Schlehofer等人。病毒學(xué)，152；110-117，1986)。
作為用輔助病毒感染宿主細胞或者用附屬功能載體轉(zhuǎn)染宿主細胞的結(jié)果，附屬功能得以表達，其反式激活A(yù)AV輔助構(gòu)建體以產(chǎn)生AAVRep和/或Cap蛋白質(zhì)。Rep表達產(chǎn)物指導(dǎo)從AAV載體中切除重組的DNA(包括編碼至少一部分因子VIII的目的DNA)。Rep蛋白質(zhì)也為復(fù)制AAV基因組服務(wù)。所表達的Cap蛋白質(zhì)裝配入衣殼，并且將重組的AAV基因組包裝入衣殼中。這樣，大量的AAV復(fù)制接著是DNA被包裝入rAAV病毒體。
在重組的AAV復(fù)制之后，通過使用多種常規(guī)的純化方法(諸如CsCl梯度)可以從宿主細胞中純化rAAV病毒體。此外，如果采用輔助病毒感染來表達附屬功能，可以使用已知方法將殘留的輔助病毒滅活。例如通過加熱至約60℃的溫度保持約20分鐘或更長(如果適當(dāng)?shù)脑?，可以將腺病毒滅活。該處理選擇性地滅活不耐熱的輔助腺病毒，而保存耐熱的rAAV。III藥物組合物此時，所得到的rAAV病毒體就可用于藥物組合物了，該藥物組合物可遞送至受治療者以產(chǎn)生有生物學(xué)活性的因子VIII。藥物組合物包含足夠的遺傳物質(zhì)以使受體產(chǎn)生治療有效量的因子VIII，以減少、停止和/或預(yù)防出血?？梢詫⒔M合物單獨地或與至少一種其他試劑(諸如穩(wěn)定化合物)聯(lián)合施用，所施用的組合物可處于任一無菌的生物相容的藥學(xué)載體中，包括但不限于鹽水、緩沖的鹽水、右旋糖和水?？梢詫⒔M合物單獨地或者與其他試劑、凝固因子或因子前體、藥物或激素聯(lián)合地向患者施用。在優(yōu)選的實施方案中，藥物組合物中也含有藥學(xué)可接受的賦形劑。這些賦形劑包括其本身不會誘導(dǎo)接受組合物的個體產(chǎn)生有害的免疫反應(yīng)并且施用也沒有不適當(dāng)?shù)亩拘灾我凰帉W(xué)試劑。藥學(xué)可接受的賦形劑包括但不限于液體，諸如水、鹽水、甘油、糖類和乙醇。藥學(xué)可接受的鹽類可以包括在其中，例如無機酸鹽類，諸如鹽酸鹽類、氫溴酸鹽類、磷酸鹽類、硫酸鹽類等等；和有機酸鹽類，諸如乙酸鹽類、丙酸鹽類、丙二酸鹽類、苯甲酸鹽類等等；另外，輔助性的物質(zhì)諸如保濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等等，也可以存在于該載體中。在Remington’s藥物科學(xué)(Mack出版公司，新澤西州，1991)中提供了藥學(xué)可接受的賦形劑的詳盡討論。
適用于非腸道施用的藥物配方可以在水性溶液中配制，優(yōu)選地在生理相容的緩沖液諸如Hank’s溶液、Ringer’s溶液或生理緩沖鹽水中。水性注射懸浮液可以含有增加懸浮液粘性的物質(zhì)，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或葡聚糖。另外，可以將活性化合物的懸浮液配制為適當(dāng)?shù)挠托宰⑸鋺腋∫?。適合的親脂性溶劑或賦形劑包括脂肪油(諸如芝麻油)或合成的脂肪酸酯類(諸如油酸乙酯或甘油三酯)或脂質(zhì)體。任選地，懸浮液也可以含有提高化合物溶解度以便配制高濃縮溶液的適合的穩(wěn)定劑或試劑。
對于局部或鼻部施用，在配方中使用針對待滲透的特定障礙層的滲透劑。這樣的滲透劑為本領(lǐng)域公知。
可以采用本領(lǐng)域公知的方式(例如通過常規(guī)的混合、溶解、顆?；?、糖衣化、研磨、乳化、膠囊化、包封或凍干法)制造本發(fā)明的藥物組合物。
可以鹽的形式提供藥物組合物，并可通過與許多酸類形式，包括但不限于鹽酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸等。與其相應(yīng)的游離堿形式相比，鹽類在水性或其他質(zhì)子溶劑中更加易溶。在其他情況下，優(yōu)選的制備物可以為凍干粉末，其中可以含有下列的任一種或者全部1-50mM組氨酸、0.1％-2％蔗糖和2％-7％甘露醇，pH范圍4.5-5.5，在使用前將其與緩沖液混合。
在制備好藥物組合物后，將其置于適當(dāng)?shù)娜萜鲀?nèi)。并貼上治療用標(biāo)簽。在施用含因子VIII的載體時，該標(biāo)簽應(yīng)包括施用的量、頻次和方法。
適用于本發(fā)明的藥物組合物包括組合物，其中包含有效量的活性成分以達到預(yù)期目的。通過使用本發(fā)明中所講授的技術(shù)，諸如ELISA和Chrom Z FVIII凝固活性測定法和其他本領(lǐng)域公知的技術(shù)，確定治療有效劑量對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言根本不是難事。除其他因素外，治療劑量還將依賴于受治療者的年齡和一般情況、血友病的程度以及控制序列的強度。因而，在人類中的治療有效劑量將落在一個相對寬的范圍內(nèi)，通過臨床試驗可將其確定。
旨在用于本發(fā)明的劑量治療和方案將根據(jù)受治療者和待用的制劑的變化而變化。因而，劑量治療可以是單劑方案或多劑方案。而且，可以向受治療者施用適當(dāng)?shù)亩鄤┮赃_到或維持所需的血液凝集時間。
盡管對其他遞送方法諸如增強的常規(guī)遞送進行了展望(見，例如美國專利5720720，此處引用作為參考)，但是一般地通過使用常規(guī)注射器注射可完成體內(nèi)藥物組合物的直接遞送。在這一點上，組合物可以皮下地、表皮地、皮內(nèi)地、鞘內(nèi)地、眼框內(nèi)地、粘膜內(nèi)地(例如，鼻地、直腸地、陰道地)、腹膜內(nèi)地、靜脈內(nèi)地、動脈內(nèi)地、口服地或肌肉地遞送，其他施用模式包括口和肺施用、栓劑和透皮敷用，在特別優(yōu)選的實施方案中，藥物組合物通過靜脈內(nèi)施用于門血管系統(tǒng)或肺動脈。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到上述方法和組合物也適用于其他本領(lǐng)域公知的治療方案。例如，本發(fā)明的方法和組合物與離體療法(例如，將細胞從身體移出，與AAV載體溫育并將處理后的細胞返回身體)相容。IV施用可以將AAV載體施用于任何適于表達因子VIII的組織。在優(yōu)選的實施方案中，通過門血管系統(tǒng)或肝動脈成功地施用本發(fā)明的AAV載體，不受理論的束縛，據(jù)認為在那里載體轉(zhuǎn)導(dǎo)肝細胞。將基因靶向肝臟的流行方法聚焦在離體基因治療上。肝臟導(dǎo)向的離體基因治療涉及肝臟細胞的手術(shù)移出、體外肝臟細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如用重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染移出的細胞)，接著是將遺傳性地修飾的肝臟細胞注射入患者的肝臟或脾臟。肝臟離體基因治療的嚴(yán)重缺點是這樣的事實，即在培養(yǎng)基中無法維持和擴增肝細胞。因而，肝臟導(dǎo)向的離體基因治療的成功依賴于能夠?qū)⑦z傳修飾的(即轉(zhuǎn)導(dǎo)了的)肝細胞及其后代高效穩(wěn)定地移植。據(jù)報道，即使在最適條件下，注射入肝臟或脾臟(移植的)的修飾的自體肝臟細胞僅占肝臟中總細胞數(shù)的小百分比(少于10％)。為了解決肝臟中的移植問題，已嘗試將轉(zhuǎn)導(dǎo)的原發(fā)肝細胞異位嫁接于腹膜腔。
由于肝臟導(dǎo)向的離體基因治療存在問題，所以為將基因轉(zhuǎn)入肝臟細胞而研究了體內(nèi)方法，包括使用重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒、重組的腺病毒、脂質(zhì)體和分子偶聯(lián)物。盡管這些體內(nèi)方法不再有與肝臟導(dǎo)向的離體基因治療相伴的缺點，但是它們并不提供特異性地靶向肝細胞的方法。另外，為了實現(xiàn)體內(nèi)轉(zhuǎn)基因的表達延長，這些方法中的幾個需要進行部分肝切除術(shù)。腺病毒和以分子偶聯(lián)物為基礎(chǔ)的遞送方法也導(dǎo)致肝毒性和炎癥，這是因子VIII基因治療的不期望的特性。本發(fā)明提供用于長期表達有生物學(xué)活性的因子VIII的組合物和方法。期望本發(fā)明會克服部分肝切除術(shù)，而同時允許因子VIII在體內(nèi)以治療濃度水平表達。本發(fā)明進一步提供使接受治療的個體產(chǎn)生因子VIII靶向肝細胞的基因治療組合物和方法。
然而，即使在正常情況下并不合成蛋白質(zhì)的其他組織也可能適于因子VIII的表達。例如，已經(jīng)證明肌細胞表達有生物學(xué)活性的血液凝固因子IX，盡管在正常情況下其在肝臟中合成。
最后，AAV載體可以含有任何編碼有生物學(xué)活性的因子VIII的核酸序列。另外，AAV載體可以含有編碼因子VIII的片段的核酸，所述片段本身沒有生物學(xué)活性，但是當(dāng)向受治療者施用時改善或恢復(fù)血液凝固時間。例如，正如上面所討論，因子VIII蛋白質(zhì)包含兩個多肽鏈重鏈和輕鏈，由在加工過程中被切割的結(jié)構(gòu)域B將其分隔。如本發(fā)明所證明，用因子VIII重鏈和輕鏈共轉(zhuǎn)導(dǎo)受體細胞導(dǎo)致有生物學(xué)活性的因子VIII的表達。然而，由于大部分血友病患者僅在其中一條鏈(例如輕鏈或重鏈)上含有突變或缺失，所以有可能僅僅施用患者缺陷的那條鏈，而讓患者提供另一條鏈。在這種情況下，AAV載體將落入本發(fā)明的范圍，即使單鏈(即重鏈或輕鏈)并沒有生物學(xué)活性，但是向能夠提供第二條鏈的受治療者施用單鏈后，就形成了具有生物學(xué)活性的因子VIII。V因子VIII測定正如下面的實驗所述，測定因子VIII的表達和活性的方法有多種。盡管本發(fā)明并不限于免疫測定方法，但是本發(fā)明也提供了檢測因子VIII表達的方法，包括步驟a)提供懷疑含有因子VIII的樣品和含有已知量的已知因子VIII的對照品；和b)將測試樣品與已知對照品比較以確定樣品中因子VIII的相對濃度。因而這些方法可以鑒定樣品(例如患者樣品)中是否含有足夠量的因子VIII。另外，通過使用任何適合的手段實施這些方法，可以確定測試及對照樣品中因子VIII的相對濃度，所述手段包括但不限于Western印跡分析、Northern印跡分析、Southern印跡分析、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(例如SDS-PAGE)、逆轉(zhuǎn)錄酶偶聯(lián)的聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、放射性免疫分析(RIA)和熒光免疫分析(IFA)。因而實施這些方法可以確定動物來源的測試樣品的基因組中存在正常的因子VIII序列，或者因子VIII(mRNA或蛋白質(zhì))的表達，以及探測測試樣品中存在異?；蛲蛔兊囊蜃覸III。
在一個優(yōu)選的實施方案中，通過免疫化學(xué)分析檢測因子VIII的存在。例如免疫化學(xué)分析可以包含檢測對因子VIII抗原決定簇特異的抗體的結(jié)合。在另一個優(yōu)選的實施方案的方法中，抗體包括多克隆抗體，而在另一個優(yōu)選的實施方案中抗體包括單克隆抗體。
進一步地期望將針對至少一部分因子VIII的抗體用于與因子VIII的定域與結(jié)構(gòu)、測定其在適當(dāng)?shù)纳飿悠分械乃降扔嘘P(guān)的本領(lǐng)域公知的方法(如，Western印跡)?？蓪⒖贵w用于檢測來自個體(例如，用本發(fā)明的方法和/或組合物治療的個體)的生物樣品中的因子VIII。生物樣品可以是生物液體，包括但不限于血液、血清、血漿、間隙液、尿、腦脊液、滑液等等。尤其是，可以從包括但不限于肝細胞的細胞來源中檢測抗原。例如可以從個體獲得細胞并將其裂解(例如，通過凍融循環(huán)或用溫和的細胞裂解劑包括但不限于TRITON-X100、毛地黃皂甙、NONIDET P(NP)-40、皂甙等或其組合，見例如，國際專利出版物WO92/08981)。
接著，通過使用適當(dāng)?shù)牟呗?例如ELISA或RIA)和形式(例如微孔板、浸漬片(例如，正如國際專利出版物WO93/03367)等)，能夠直接測試生物樣品中因子VIII的存在?；蛘呖梢詫悠分械牡鞍踪|(zhì)按大小分離(例如通過加或不加十二烷基硫酸鈉(SDS)的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，通過免疫印跡(例如Western印跡)檢測因子VIII的存在)。一般地，使用所生成的針對相當(dāng)于蛋白質(zhì)抗原決定簇的多肽之抗體的免疫印跡法更有效，并且因此而特別地適于本發(fā)明。在另一個優(yōu)選的實施方案中，采用本領(lǐng)域公知的技術(shù)(Herzog等人。Nature Medicine，5；56，1999)，利用受治療者的全血凝固時間和受試者血液之活化的部分促凝血酶原激酶時間(aPTT)，測定因子VIII的水平。
在本文中，前面對特定的測定系統(tǒng)給出解釋只是為了闡明，以滿足對發(fā)明內(nèi)容充分公開的要求。應(yīng)當(dāng)明白本發(fā)明構(gòu)思了多種免疫化學(xué)測定方法處于其精神和范圍之內(nèi)。確實，其他方法諸如確定因子VIII存在與活性的生物測定法也涵蓋于本發(fā)明。
因而，除了上述的免疫測定系統(tǒng)外，其他測定系統(tǒng)諸如那些設(shè)計目的為測量和/或檢測因子VIII和/或受治療者血液的凝固能力的方法也涵蓋于本發(fā)明(例如，ChromZ FVIII凝固活性(FVIII-c)測定法(Helena Labs))。
實驗部分以下是為了實現(xiàn)本發(fā)明的具體實施方案的實施例。提供實施例只是為了說明的目的，并不旨在以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
在所使用的數(shù)字(例如數(shù)量、溫度等)方面，為了確保準(zhǔn)確已經(jīng)作了努力，但是某些實驗性的錯誤和偏差當(dāng)然應(yīng)該是允許的。
在隨后的實驗內(nèi)容公開部分，應(yīng)用以下縮寫N(正常的)；M(摩爾)；mM(毫摩爾)；μM(微摩爾)；g(克)；mg(毫克)；μg(微克)；ng(納克)；l或L(升)；ml(毫升)；μl(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(納米)；mU(毫單位)；51Cr(鉻51)；μCi(微居)；EC(攝氏溫度)；hFVIII(人因子VIII)；FVIII(因子VIII)；pH(氫離子濃度)；JRH級；NaCl(氯化鈉)；HCl(鹽酸)；OD(光密度)；bp(堿基對)；ATP(腺苷5’-三磷酸)；PCR(聚合酶鏈反應(yīng))；DNA(脫氧核糖核酸)；cDNA(互補DNA)；AAV(腺伴隨病毒)；rAAV(重組的腺伴隨病毒)；ITR(反向末端重復(fù))；FCS或FBS(胎小牛血清；胎牛血清)；CFA(完全福氏佐劑)；BSA(牛血清白蛋白)；ATCC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心)；Sigma(SigmaAldrich，St.Louis，MO)；Biodesign International(BiodesignInternational，Kennebunk，MI)；Baxter Hyland(Baxter HealthcareCorp.，Biotech Group—Hyland Division)；Helena Labs(Helena Labs，Beaumont，TX)；American Diagnostica(American Diagnostica，Greenwich，CT)；Accurate Chemical(Accurate Chemical andScientific公司)；Molecular Probes(Molecular Probes，Eugene，OR)；Vysis(Vysis，Downer Grove，IL)；Tel-Test(Tel-Test公司，F(xiàn)riendswood，TX)；Molecualr Dynamics(Molecualr Dynamics，Sunnyvale，CA)；NUNC(Naperville，IL)；和Stratagene(Stratagene克隆系統(tǒng)，La Jolla，CA)；和Biodesign(Biodesign International，Kennebunkport，ME)。
實施例1雙載體質(zhì)粒構(gòu)建根據(jù)Yonemura等人(Yonemura等人.蛋白質(zhì)工程(Pro.Engineer.)，6；669-674，1993)的報道，裝配人因子VIII(hFVIII)的重鏈和輕鏈，并以表達盒的形式克隆到AAV載體中。兩個載體都含有啟動子和來自人延伸因子1α(EF1α)基因(Uetsuki等人。生物化學(xué)雜志，264；5791-5798；Kim等人?；颍?；217-223，1990)的第一個非編碼內(nèi)含子(從-573到+985)。每個載體還包含因子VIII重鏈的編碼19個氨基酸信號序列的前57個堿基對。重鏈構(gòu)建體編碼結(jié)構(gòu)域A1和A2以及結(jié)構(gòu)域B N端的5個氨基酸。輕鏈載體除結(jié)構(gòu)域A3、C1和C2外還編碼結(jié)構(gòu)域B的羧基端的85個氨基酸。兩個載體均利用人生長激素(hGH)多聚腺苷酸化信號。將表達盒插入到AAVITR之間。開始的克隆步驟涉及刪除pVm4.1e-hFIX(Nakai等人。血液(Blood)，91；1-9，1998)的SphI和XcmI位點之間的EF1α序列的854bp，并再連接以得到pVm4.1eδD-hFIX。
接著用EcoRI消化該構(gòu)建體釋放出hFIX cDNA，并與一個含有MfeI末端(EcoRI相容的)和一個內(nèi)部ClaI限制性位點的寡核苷酸連接，得到pVm4.1eδD-接頭。分別從pVm4.1cFVIII-HC和pVm4.1cFVIII-LC中以ClaI-BstEII片段的形式分離出包括hGH多聚腺苷酸化序列的重鏈和輕鏈片段。將這些片段克隆到pVm4.1eδD-接頭中相應(yīng)的位點之間，得到質(zhì)粒pVm4.1eδD-FVIII-HC(也叫rAAV-hFVIII-HC)和pVm4.1eδD-FVIII-LC(也叫rAAV-hFVIII-LC)。
圖7提供了構(gòu)建體的圖譜。在該圖中，每幅圖的上部線條代表載體的基因結(jié)構(gòu)，下部線條代表由載體編碼的hFVIII蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)(ITR，反向末端重復(fù)；EF1α/內(nèi)含子1，人多肽延伸因子1α基因啟動子和第一個內(nèi)含子；hFVIII-HC，人FVIII cDNA；hFVIII-LC，人FVIII cDNA；hGH PA，人生長激素多聚腺苷酸化信號；SS，人FVIII信號序列；A1、A2、“B”、A3、C1、C2，完整的和不完整的(“”)hFVIII蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域)。
實施例2 單載體質(zhì)粒的構(gòu)建含有因子VIII輕和重兩鏈的質(zhì)粒pAAV-F8-1構(gòu)建體之構(gòu)建如下。使用寡核苷酸Z8 S和Z8A生成含有克隆位點、基于EF1α和免疫球蛋白G(IgG)內(nèi)含子序列的合成內(nèi)含子的5’-剪接供體位點、Kozak序列和人血液凝固因子VIII(FVIII)編碼序列的前16個核苷酸的PCR片段Z8。核酸序列如下所示寡核苷酸Z8S5′cccaagcttgcggccgcccgggtgccgcccctaggcaggtaagtgccgtgtgtggttcc 3′(SEQ ID NO1)寡核苷酸Z8A5′ccgctcgagcagagctctatttgcatggtggaatcgatgccgcgggaaccacacacggc 3′(SEQ ID NO2)PCR片段Z85′cccaagcttgcggccgcccgggtgccgcccctaggcaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcggcatcgattccaccatgcaaatagagctctgctcgagcgg 3′(SEQ ID NO3)將核酸Z8插入到pZREO-2(Invitrogen)中HindIII和XhoI位點之間，產(chǎn)生pZ8。使用寡核苷酸INT3S和INT3A(其序列如下)生成含有分支點、多聚嘧啶區(qū)和合成內(nèi)含子的3剪接受體位點的PCR片段INT3。寡核苷酸INT3S5′ttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattactga 3′(SEQ ID NO4)寡核苷酸INT3A5′gaatcgatacctgtggagaaaaagaaaaagtggatgtcagtgtcagtaattcaaggc 3′(SEQ ID NO5)PCR片段INT35′ttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattactgacactgacatccactttttctttttctccacaggtatcgattc 3′(SEQ ID NO6)
將INT3插入到pZ8的SacII和ClaI位點之間，產(chǎn)生pZ8.I。所以，Z8.I在AvrII和ClaI位點之間含有完整的合成內(nèi)含子。將帶有SacI和XhoI限制性位點的hFVIII cDNA片段插入到pZ8.I的SacI和XhoI位點之間，產(chǎn)生pZ8.I.dB。所以，pZ8.I.dB含有合成的內(nèi)含子和完整的hFVIII編碼序列。
使用經(jīng)過修飾以消除接頭序列的寡核苷酸EG3S和EG3A，產(chǎn)生含有三個HNF-3結(jié)合位點和小鼠白蛋白基因的-54到+8序列的PCR片段EG3。EG3S和EG3A的序列如下寡核苷酸EG3S5′agggaatgtttgttcttaaataccatccagggaatgtttgttcttaaataccatccagggaatgtttgttcttaaataccatctacagttattggttaaa 3′(SEQ ID NO7)寡核苷酸EG3A5′ggaaaggtgatctgtgtgcagaaagactcgctctaatatacttctttaaccaataactg 3′(SEQ ID NO8)PCR片段EG35′agggaatgtttgttcttaaataccatccagggaatgtttgttcttaaataccatccagggaatgtttgttcttaaataccatctacagttattggttaaagaagtatattagagcgagtctttctgcacacagatcacctttcc 3′(SEQ ID NO9)接著使用T4多核苷酸激酶將EG3磷酸化并將其插入到pZ8.I.dB的SmaI位點，產(chǎn)生pZ8.I.dB.egg。通過將兩個寡核苷酸SPA.S和SPA.A雜交，生成含有基于兔β-珠蛋白序列(基因和發(fā)育(Genes andDevelop.)，3；1091)的高效合成多聚腺苷酸化信號的DNA片段SPA。寡核苷酸SPA.S5′tcgagaataaaagatcagagctctagagatctgtgtgttggttttttgtgtgcggccgc 3′(SEQ ID NO10)寡核苷酸SPA.A5′tcgagcggccgcacacaaaaaaccaacacacagatctctagagctctgatcttttattc 3′(SEQ ID NO11)PCR片段SPA5′tcgagaataaaagatcagagctctagagatetgtgtgttggttttttgtgtgcggccgctcga 3′(SEQ ID NO12)將SPA插入到pZero-2的XhoI位點，產(chǎn)生pZero-2.SPA。將SPA從pZero-2.SPA克隆中切除并插入到pZ8.I.dB.egg的XhoI位點，產(chǎn)生pZ8.I.dB.egg.A。將pAAV-CMV-FIX9用ClaI消化，用T4聚合酶補平和再連接以產(chǎn)生pAAV(Cla-)-CMV-FIX9。
使用NotI將含有HNF-3白蛋白啟動子-合成的內(nèi)含子-hFVIII-合成的poly A信號的完整表達盒從pZ8.I.dB.egg.A中切除，并連接到質(zhì)粒主鏈和來自pAAV(Cla-)-CMV-FIX9的AAV ITR上以造出pAAV-F8-1。從ITR到ITR的載體核苷酸序列(即排除質(zhì)粒主鏈在外)列于SEQ ID NO3。
實施例3 病毒體產(chǎn)生正如在美國專利5858351、美國專利5846528、美國專利5622865及Matsushita等人?；蛑委?，5；938，1998(所有這些在此處引用作為參考)中所描述，通過使用無Ad系統(tǒng)，從這些質(zhì)粒中產(chǎn)生AAV載體。簡言之，將293細胞(ATCC目錄號CRL-1573)以3.6×106個細胞/平皿的密度接種在10cm的平皿(每平皿含10ml培養(yǎng)基)中，并在CO2和濕潤的條件下于37℃溫育。溫育過夜后，大約70％-80％的細胞匯合。
接著通過磷酸鈣法(正如本領(lǐng)域所公知)用DNA轉(zhuǎn)染細胞。簡言之，用無菌移液吸頭將含有因子VIII編碼區(qū)的AAV載體7μg、提供輔助功能的Pladeno5 7μg和1909AAV輔助病毒7μg加入到帶扣蓋的3ml聚苯乙烯無菌管中。接著每管加入300mM的CaCl2(JRH級)1.0ml并通過吸液器上下吹吸混合。用2ml的移液管加入等體積的2×HBS(274mM NaCl、10mM KCl、42mM HEPES、1.4mMNa2PO4、12mM葡萄糖、pH7.05，JRH級)，將溶液上下吹吸三次。將該DNA混合液立即逐滴地加入到細胞中，均勻地分布在10cm平皿中。接著將細胞在CO2和濕潤條件下于37℃溫育6小時。在轉(zhuǎn)染的細胞培養(yǎng)物中可見顆粒狀沉淀。6小時后從細胞中移出DNA混合物，提供新鮮的培養(yǎng)基并溫育72小時。
72小時后，收集、沉淀、再懸浮細胞于1ml TBS/1％BSA中，通過重復(fù)地(三次)在干冰上冷凍懸浮液和在37℃融化以制備凍/融提取物。將病毒制備物于-80℃保存并在第一輪感染前通過斑點印跡測定法測定滴度。
實施例4 體外細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)將來自穩(wěn)定的人細胞系293(ATCC號CRL1573)的細胞接種在6孔板(即有6個供細胞生長的孔的板)，密度為5×105個細胞/孔。當(dāng)單層達到80％-90％匯合時，將其用rAAV病毒體AAV-eδD-FVIII-HC、AAV-eδD-FVIII-LC(AAV-eδD-FVIII-HC與AAV-eδD-FVIII-LC的比例相同)或者AAV-eδD-FIX以MOI為3×103和3×104感染。在感染后18小時用DMEM/10％加熱滅活的FBS置換培養(yǎng)基。后來收集培養(yǎng)基以通過ELISA(描述如下)分析其FVIII輕鏈抗體水平，以及通過ChromZ FVIII作為凝固活性(FVIIIc)測定法(Helena Labs)分析其生物活性，使用了制造商的說明書及如實施例6中所描述。
實施例5單鏈因子VIII感染性測定在本實施例中，研究探討了單鏈因子VIII的感染性。為了測定rAAV-hF8-1的感染性，用rAAV-hF8-1和對照載體rAAV-hF8L以MOI為1×104個病毒顆粒/細胞感染HepG2、293和H2.35細胞。通過Hirt提取法從感染細胞中分離重組的AAV DNA，并在堿性瓊脂糖凝膠上進行電泳。用人F8作探針的Southern印跡分析表明，從感染細胞未包被的病毒中分離到相似量的rAAV-hF8-1和rAAV-hF8L。為了進一步闡明rAAV-hF8-1的感染性，使用了本領(lǐng)域公知的感染中心測定法(ICA)(見例如，Snyder.Current Protocols in Genetics，第十二章，John Wiley & Sons，1997)。在該測定中，確定了感染性顆粒與rAAV-F8-1總顆粒的比例，以及感染性顆粒與對照rAAV載體(基因組大小為4645個核苷酸)的總顆粒的比例。結(jié)果顯示，在感染性顆粒與總顆粒的比例上rAAV-hF8-1與對照載體具有可比性，為大約1∶1000?？偲饋?，這些結(jié)果顯示rAAV-hF8-1具有的感染性與具有野生型基因組大小的rAAV載體相似。
實施例6因子VIII蛋白質(zhì)表達測定使用特異于FVIII輕鏈的ELISA確定293細胞中以及注射動物中FVIII輕鏈抗原水平(描述如下)。用50μl按1∶500在包被緩沖液中稀釋的輕鏈特異性抗體N77110(Biodesign International)4℃過夜包被NUNC Maxisorb 96孔板。用沖洗緩沖液(PBS，0.05％Tween20)沖洗板三次，再用200μl封閉緩沖液(PBS，10％馬血清，0.05％Tween)在室溫下封閉1小時。洗板三次后加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣品。用Bioclate重組的人FVIII(Baxter Hyland)作標(biāo)準(zhǔn)品并在封閉緩沖液中稀釋至濃度為320ng/ml-10ng/ml范圍內(nèi)。
為分析轉(zhuǎn)導(dǎo)培養(yǎng)物上清液，標(biāo)準(zhǔn)品中含有50％培養(yǎng)基，為分析小鼠血漿，將標(biāo)準(zhǔn)品在合并的正常小鼠血漿(Sigma)中稀釋至10％。在測定中還包含標(biāo)準(zhǔn)品測定參考血漿(SARP，Helena Labs)。隨標(biāo)準(zhǔn)品和樣品(96μl/孔)上樣后，將板在室溫下溫育2小時并用沖洗緩沖液(200μl/孔)沖洗五次。加入1∶200稀釋的偶聯(lián)有辣根過氧化物酶的輕鏈特異性抗體ESH 8-HRP(American diagnostica)(100μl/孔)，接著將板在室溫下溫育1小時。板子用沖洗緩沖液沖洗四次，然后依制造商的說明書使用ABTS過氧化物酶底物試劑盒(BioRad)探測抗原。結(jié)果見下面的實施例7中的表1。
實施例7 因子VIII生物活性測定用Chrom Z FVIII凝固活性(FVIII-c)測定法(Helena Labs，Beaumount，TX)探測按實施例4中所描述的被感染的293細胞中有生物學(xué)活性的FVIII。使用Bioclate重組的人因子VIII(Baxter Hyland)作為標(biāo)準(zhǔn)品分析轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)物上清液。將標(biāo)準(zhǔn)品在血漿稀釋緩沖液(由試劑盒提供)中稀釋為10ng/ml-0.313ng/ml范圍，并使其在培養(yǎng)基中的含量為2.5％。由于該測定法既可以探測人的又可以探測鼠的FVIII活性，所以將其修改以耗盡小鼠血漿中的有生物學(xué)活性的人因子VIII。在進行測定之前，將小鼠血漿用人因子VIII特異性的抗體預(yù)溫育。在未處理過的血漿樣品和抗體處理過的樣品中因子VIII活性的差別代表了血漿中有生物學(xué)活性的人因子VIII的量。本測定法所使用的標(biāo)準(zhǔn)品為合并的正常人血漿(FACT；獲得自George King Biomedical)。將FACT在FVIII缺乏的血漿中進行系列稀釋，從未稀釋的200ng/ml到稀釋后的6.25ng/ml。在加或不加2μl抗體N77110下，將標(biāo)準(zhǔn)品(10μl)在37℃溫育15分鐘。類似地，將小鼠血漿樣品在FVIII缺乏的血漿中稀釋，然后在加或不加2μl抗體N77110下，將10μl這些稀釋的樣品在37℃溫育15分鐘，之后馬上置于冰上。這樣，所有加抗體的溫育是在100％的血漿背景下進行的。將吸附的抗體和沒有吸附的FACT標(biāo)準(zhǔn)品以及小鼠血漿樣品在由Chrom Z試劑盒提供的血漿探測緩沖液中按1∶20稀釋。因而，用于測定的FACT標(biāo)準(zhǔn)品的最終濃度范圍為10ng/ml-0.313ng/ml。
將25μl這些稀釋液加入到預(yù)冷的96孔板中。板置于冰上，加入25μl F1Xa試劑和50μl FX，并將板于37℃溫育15分鐘。加入底物(50μl)并將板在37℃下再溫育3分鐘。通過加入25μl 50％的乙酸終止反應(yīng)并測量405nm的光密度。
如下面的表1所示，用AAV-eδD-FVIII-HC感染的293細胞沒有導(dǎo)致抗原產(chǎn)生，也沒有有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)。感染有AAV-eδD-FVIII-LC的細胞產(chǎn)生FVIII輕鏈，但沒有有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)。然而用所有兩種載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞以劑量依賴方式產(chǎn)生FVIII輕鏈和有生物學(xué)活性的FVIII。用陰性對照載體AAV-eδD-FIX轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞，既沒有產(chǎn)生抗原也沒有產(chǎn)生任何有生物學(xué)活性的FVIII。假設(shè)在轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞中產(chǎn)生了等量的重鏈和輕鏈。采用定義1個單位等于1毫升正常人的混合血漿中因子VIII的量或200ng，將活性單位數(shù)轉(zhuǎn)換為納克。
表1從兩種rAAV載體體外產(chǎn)生有生物學(xué)活性的人因子VIII
實施例8 FVIII重鏈和輕鏈的免疫熒光染色在這些實驗中，采用免疫熒光染色分析按如上所述轉(zhuǎn)導(dǎo)的293細胞。將293細胞以4×105個細胞/孔的密度鋪于包被有大鼠尾膠原的雙孔培養(yǎng)玻片。48小時后，將細胞以3×104個顆粒/細胞的MOI用rAAV-hFVIII-HC和rAAV-hFVIII-LC轉(zhuǎn)導(dǎo)。轉(zhuǎn)導(dǎo)48小時后，用丙酮將細胞在原位固定，用2％BSA封閉，并用熒光標(biāo)記的抗hFVIII輕鏈抗體和熒光標(biāo)記的抗hFVIII重鏈抗體染色。所用的抗hFVIII輕鏈抗體為ESH-4單克隆抗體(American Diagnostica)，依制造商說明書用alexa-488(Molecular Probes)熒光標(biāo)記。所用的抗hFVIII重鏈抗體為MAS530P單克隆抗體(Accurate Chemical)，依制造商說明書用alexa-594(M0lecular Probes)熒光標(biāo)記。細胞用DAPI復(fù)染。用裝備有獨立的濾鏡(用于DAPI、FITC和羅丹明信號)和CCD照相機的Zeiss Axioskop熒光顯微鏡收集影像。用Quips影像軟件(Vysis)進行影像分析。
如上所示，用rAAV-eδD-FVIII-HC或者AAV-eδD-FVIII-LC感染細胞，接著用針對所有二條鏈的抗體染色，導(dǎo)致人FVIII的單個鏈的產(chǎn)生。共感染有所有兩種載體的細胞之免疫熒光染色證實，許多細胞共表達人FVIII的所有兩條鏈，盡管某些細胞只表達hFVIII的重鏈或輕鏈。
實施例9 采用單構(gòu)建體體外表達因子VIII表2說明含有由不同的啟動子驅(qū)動的因子VIII重鏈和輕鏈的兩種單載體構(gòu)建體表達有生物學(xué)活性的因子VIII。將構(gòu)建體pAAV-hF8-1(SEQ ID NO13)和pVm4.1cF8ΔB(SEQ ID NO14)轉(zhuǎn)染到293細胞。轉(zhuǎn)染后，讓細胞表達因子VIII 48-72小時。依制造商的說明書通過Chrom Z FVIII凝固活性(FVIII-c)測定法測定培養(yǎng)液中的因子VIII表2體外產(chǎn)生有生物學(xué)活性的FVIII
實施例10 用組織特異性啟動子表達因子VIII在這些實驗中使用了不同的啟動子和增強子元件以驅(qū)動因子VIII編碼序列的表達。使用不同啟動子，比較了因子VIII在293細胞和HepG2細胞中的表達。pAAVeF8ΔB含有帶hGH內(nèi)含子的EF-1α啟動子、缺失結(jié)構(gòu)域B的因子VIII(F8ΔB)和poly A。如前所述，pAAV-hF8-1使用帶最小的內(nèi)含子的HNF-3白蛋白啟動子，其后為F8ΔB和最小的poly A。構(gòu)建體pAAV-c8使用CMV增強子-啟動子和F8ΔB。pAAV8b1含有HNF-3白蛋白啟動子，其后為帶F8ΔB的CMV/B-珠蛋白內(nèi)含子和最小的多聚腺苷酸位點。表3描述了相對于對照質(zhì)粒pV4.1eF8ΔB而言利用白蛋白啟動子的因子VIII在Hep G2和293細胞中的表達。這些數(shù)據(jù)說明在Hep G2肝細胞中帶有白蛋白啟動子的因子VIII的表達比在293細胞中因子VIII的表達提高了。
表3啟動子的相對組織特異性
接下來，將衍生自運甲狀腺蛋白(TTR)基因啟動子的幾個啟動子轉(zhuǎn)染到Hep G2細胞。TTR是含量豐富的血清蛋白質(zhì)，并且其基因的增強子-啟動子含有公知的肝臟特異性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(Samadani等人?；虮磉_(Gene Expression)，6；23，1996；Yan等人。EMBO，9；869，1990；Costa和Grayson.核酸研究(Nuc.Acids Res.)，19；4139，1991；Costa等人。分子細胞生物學(xué)(Mol.Cell.Bio.)，6；4697，1986)。通過將pAAV-hF8-1上的HNF-3白蛋白啟動子置換為多種長度的TTR啟動子-增強子，制造構(gòu)建體。通過把弱親和力結(jié)合位點置換為強親和力結(jié)合位點而修飾TTR增強子-啟動子，以產(chǎn)生pAAV-hF8-2。pAAV-hF8-TTR-E-L-P202構(gòu)建體含有全長TTR啟動子并在增強子和啟動子之間有一個接頭。其余構(gòu)建體為5’端缺失的pAAV-hF8-TTR-E-P202在啟動子和增強子之間沒有接頭；pAAV-hF8-TTR-E-P197從啟動子中刪除5個堿基對；pAAV-hF8-TTR-E-P151有50個堿基對的缺失；pAAV-hF8-TTR-P202缺少TTR增強子，pAAV-hF8-TTR(X)在增強子中有65個堿基對的缺失。對照質(zhì)粒pAAV-hF8-1表達大約4.6mU/ml。表4表明，使用TTR啟動子系列使因子VIII活性相對于對照質(zhì)粒成倍提高。
表4用來自TTR的啟動子表達因子VIII
實施例11 體內(nèi)因子VIII的表達為了測試本發(fā)明的AAV載體方法在體內(nèi)的可行性，通過門靜脈對三組(每組5只)C57BL/6小鼠注射3×1011個AAV-eδD-FVIII-HC顆粒，3×1011個AAV-eδD-FVIII-LC顆粒，或者AAV-eδD-FVIII-HC和AAV-eδD-FVIII-LC兩種均3×1011個顆粒。另外，對一組(4只)動物用3×1011個AAV-eδD-FIX顆粒注射。已經(jīng)表明當(dāng)將基因通過腺病毒載體遞送到門靜脈時，該品系小鼠不誘發(fā)對人FVIII的免疫應(yīng)答(Connelly等人。血液，87；4671-4677，1996)。正如如下的結(jié)果所提示，在這些實驗中所獲得的數(shù)據(jù)證實了通過使用兩種AAV載體獨立地遞送FVIII的重鏈和輕鏈產(chǎn)生有生物學(xué)活性的FVIII的可行性。
通過后眼眶血管叢收集血液樣品(前兩個月每兩周一次，其后六個月每月一次以及在第十一個月)于檸檬酸鈉中。在用AAV-eδD-FVIII-LC單獨注射或兩種載體均注射的動物中，F(xiàn)VIII輕鏈的表達水平很高(如圖8所示)。
為了評價動物中產(chǎn)生的有生物學(xué)活性的人FVIII的量，使用了修改的Chrom Z測定法。由于該測定法既檢測人的又檢測小鼠的FVIII，所以在吸附到人特異性的FVIII抗體之前或之后對血漿中FVIII存在的量進行了確定。吸附后留在血漿中的FVIII的量代表有活性的小鼠FVIII的量，并且二者之差代表了有活性的人FVIII的量。對照實驗證實當(dāng)向小鼠血漿樣品中加入高達32ng的人FVIII時，抗體可以從該樣品中移出80％-90％的人FVIII。如表5所示，修改的Chrom Z測定法表明只有那些用兩種載體均注射的動物產(chǎn)生有生物學(xué)活性的FVIII。盡管在注射后10周和5個月得到了相似的結(jié)果，表5顯示的結(jié)果來自注射后8周時收集的血漿的結(jié)果。用重鏈和輕鏈兩種載體共注射的5只動物中有一只沒有表達VIII(推測是由于無效注射)，因而將其從分析中剔除。如ELISA所測量，兩種載體均注射的動物產(chǎn)生超過2μg/ml的FVIII輕鏈。Chrom Z測定法表明在血漿中探測到總共600-900ng/ml有活性的hFVIII。來自小鼠因子VIII的占大約400-500ng/ml，表明在血漿中存在有大約230-430ng/ml有活性的人hFVIII。盡管發(fā)現(xiàn)只有一部分總蛋白質(zhì)具有活性，但是動物產(chǎn)生了生理水平的活性蛋白質(zhì)(即200ng/ml)。發(fā)現(xiàn)這些動物維持了超過11個月而不衰減的生理水平的活性蛋白質(zhì)。對單獨用輕鏈載體、單獨用重鏈載體或者hFIX載體注射動物所進行的類似分析證實，在這些動物的血漿中沒有有生物學(xué)活性的FVIII。
表5體內(nèi)人因子VIII的生物學(xué)活性
*＝三只動物的平均值)
實施例12 基因轉(zhuǎn)移和載體在組織中的表達在這些實驗中，每組實驗動物中的一只在注射后8周處死(即，如在實施例11中所述)，從其中分離出DNA，接著通過Southern印跡分析獲得基因轉(zhuǎn)移到肝臟的證據(jù)。另外，為了確定載體在除肝臟外的其他器官中的表達程度，從其他組織中獲得DNA。
20微克DNA用BglII消化，用1％瓊脂糖凝膠分離，并與32P標(biāo)記的編碼hFVIII的結(jié)構(gòu)域A1和A2的1126 bp AlwNI片段(重鏈探針)或者32P標(biāo)記的編碼hFVIII的結(jié)構(gòu)域A3、C1和C2的1456bpNdeI-EcoRI片段(輕鏈探針)雜交。通過將BglII消化的重鏈或輕鏈質(zhì)粒DNA(分別為pVm4.1eδD-hFVIII-HC和pVm4.1eδD-hFVIII-LC)插入到BglII消化的天然小鼠肝臟DNA(比例為每二倍體基因組10、5、1、0.1、0.01個拷貝)中，生成拷貝數(shù)對照。用Storm860 Phosphoimager(Molecular Dynamics)分析了雜交后的膜，并且用ImageQua NT軟件(Molecular Dynamics)對載體拷貝數(shù)的定量進行了評估。對雜交后的膜也進行了放射自顯影。使用RNA Stat提取試劑盒(Tel-Test)從肝臟中分離出總RNA。正如如下簡述，通過使用本領(lǐng)域公知的方法，連同32P標(biāo)記的上述對因子VIII的重鏈和輕鏈特異的探針，對10μg RNA也進行了Northern印跡分析，并且在雜交后的膜上進行放射自顯影。
使用本領(lǐng)域公知的方法將肝臟DNA用BglII消化并與下述的FVIII輕鏈探針雜交之后，在用rAAV-hFVIII-LC或重鏈和輕鏈兩種載體均注射的動物中探測到所預(yù)計的3015bp的條帶。在單獨用重鏈載體或者用hFIX載體注射的動物中沒有觀察到該條帶，如圖9A所示(rAAV-hFVIII-LC，道1；rAAV-hFIX，道2；rAAV-hFVIII-HC，道3；rAAV-hFVIII-LC和rAAV-hFVIII-HC兩種，道4；通過將相應(yīng)的質(zhì)粒以每二倍體基因組10、5、1、0.1、0.01個拷貝數(shù)的比例插入到BglII消化的天然小鼠肝臟DNA中產(chǎn)生拷貝數(shù)對照，道5-9)。Phosphoimage分析發(fā)現(xiàn)輕鏈載體以每二倍體基因組大約2.4和1.5個拷貝數(shù)分別存在于單獨用輕鏈載體或用兩種載體注射的動物中。如圖9B所示，當(dāng)用hFVIII重鏈探針與BglII消化的DNA雜交時，在單獨用重鏈載體或者用兩種載體均注射的動物中觀察到預(yù)期的2318bp的條帶，但在單獨用輕鏈載體或者用hFIX載體注射的動物中沒有觀察到。在單獨用重鏈載體和用兩種載體均注射的動物中載體的拷貝數(shù)分別為每二倍體基因組1.1和1.7個。
正如圖10A和10B所示，從脾、腎和心臟組織中提取的DNA與hFVIII的輕鏈探針或者重鏈探針的雜交結(jié)果提示，這些組織每10個二倍體基因組中含有少于1個拷貝數(shù)的載體序列，證實了在門靜脈內(nèi)注射后載體主要分布到肝臟。
通過對來自注射后8周處死的動物的RNA的Northern印跡分析(如上所述)還評價了人FVIII基因在小鼠肝臟中的表達。正如圖11A所示，在單獨用輕鏈載體或者用兩種載體均注射的動物中觀察到預(yù)計大小(2.7kb)的hFVIII輕鏈轉(zhuǎn)錄本。類似地，正如圖11 B所示，在單獨用重鏈載體或者用兩種載體均注射的動物中探測到預(yù)期的hFVIII重鏈轉(zhuǎn)錄本(2.7kb)。由于Southern印跡分析證明在用兩種載體均注射的動物中，重鏈和輕鏈的DNA序列以大約相同的拷貝數(shù)存在(每二倍體基因組分別為1.7和1.5個拷貝數(shù))，所以這些結(jié)果證實hFVIII的重鏈和輕鏈均以大約相等的量在肝臟中表達。
序列表<110>Couto.Linda B.
Colosi.peter C.<120>用于由靶細胞表達因子VIII的腺伴隨病毒<130>AVIGEN-03743<140>待分配<141>1999-07-30<150>60/125，974<151>1999-03-24<150>60/104，994<151>1998-10-20<160>14<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>59<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成的<400>1cccaagcttg cggccgcccg ggtgccgccc ctaggcaggt aagtgccgtg tgtggttcc59<210>2<211>59<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成的<400>2ccgctcgagc agagctctat ttgcatggtg gaatcgatgc cgcgggaacc acacacggc 59<210>3<211>103<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成的<400>3cccaagcttg cggccgcccg ggtgccgccc ctaggcaggt aagtgccgtg tgtggttccc 60gcggcatcga ttccaccatg caaatagagc tctgctcgag cgg 103<210>4<211>57<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成的<400>4ttcccgcggg cctggcctct ttacgggtta tggcccttgc gtgccttgaa ttactga57<210>5<211>57<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成的<400>5gaatcgatac ctgtggagaa aaagaaaaag tggatgtcag tgtcagtaat tcaaggc57<210>6<211>99<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成的<400>6ttcccgcggg cctggcctct ttacgggtta tggcccttgc gtgccttgaa ttactgacac 60tgacatccac tttttctttt tctccacagg 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acaaaaaagt ccgatttatg gcatacacag atgaaacctt taagactcgt 1800gaagctattc agcatgaatc aggaatcttg ggacctttac tttatgggga agttggagac 1860acactgttga ttatatttaa gaatcaagca agcagaccat ataacatcta ccctcacgga 1920atcactgatg tccgtccttt gtattcaagg agattaccaa aaggtgtaaa acatttgaag 1980gattttccaa ttctgccagg agaaatattc aaatataaat ggacagtgac tgtagaagat 2040gggccaacta aatcagatcc tcggtgcctg acccgctatt actctagttt cgttaatatg 2100gagagagatc tagcttcagg actcattggc cctctcctca tctgctacaa agaatctgta 2160gatcaaagag gaaaccagat aatgtcagac aagaggaatg tcatcctgtt ttctgtattt 2220gatgagaacc gaagctggta cctcacagag aatatacaac gctttctccc caatccagct 2280ggagtgcagc ttgaggatcc agagttccaa gcctccaaca tcatgcacag catcaatggc 2340tatgtttttg atagtttgca gttgtcagtt tgtttgcatg aggtggcata ctggtacatt 2400ctaagcattg gagcacagac tgacttcctt tctgtcttct tctctggata taccttcaaa 2460cacaaaatgg tctatgaaga cacactcacc ctattcccat tctcaggaga aactgtcttc 2520atgtcgatgg aaaacccagg tctatggatt ctggggtgcc acaactcaga ctttcggaac 2580agaggcatga ccgccttact gaaggtttct agttgtgaca agaacactgg tgattattac 2640gaggacagtt atgaagatat ttcagcatac ttgctgagta aaaacaatgc cattgaacca 2700agaagcttcg aaataactcg tactactctt cagtcagatc aagaggaaat tgactatgat 2760gataccatat cagttgaaat gaagaaggaa gattttgaca tttatgatga ggatgaaaat 2820cagagccccc gcagctttca aaagaaaaca cgacactatt ttattgctgc agtggagagg 2880ctctgggatt atgggatgag tagctcccca catgttctaa gaaacagggc tcagagtggc 2940agtgtccctc agttcaagaa agttgttttc caggaattta ctgatggctc ctttactcag 3000cccttatacc gtggagaact aaatgaacat ttgggactcc tggggccata tataagagca 3060gaagttgaag ataatatcat ggtaactttc agaaatcagg cctctcgtcc ctattccttc 3120tattctagcc ttatttctta tgaggaagat cagaggcaag gagcagaacc tagaaaaaac 3180tttgtcaagc ctaatgaaac caaaacttac ttttggaaag tgcaacatca tatggcaccc 3240actaaagatg agtttgactg caaagcctgg gcttatttct ctgatgttga cctggaaaaa 3300gatgtgcact caggcctgat tggacccctt ctggtctgcc acactaacac actgaaccct 3360gctcatggga gacaagtgac agtacaggaa tttgctctgt ttttcaccat ctttgatgag 3420accaaaagct ggtacttcac tgaaaatatg 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權(quán)利要求
1.一種治療人血友病的方法，包括a)提供至少一種包含編碼因子VIII的核苷酸序列的重組腺伴隨病毒載體；和b)在使所述因子VIII核苷酸序列在所述受治療者中以提供有效治療量的水平表達的條件下，將所述至少一種重組腺伴隨病毒載體施用于所述受治療者。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述因子VIII核苷酸序列在所述受治療者的肝臟中表達。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述血液凝固障礙得到改善。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述血液凝固障礙是血友病A。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述受治療者是人。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述重組腺伴隨病毒載體編碼所述因子VIII的輕鏈。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述重組腺伴隨病毒載體編碼所述因子VIII的重鏈。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述因子VIII核苷酸序列編碼選自A1、A2、A3、B、C1和C2中的至少一個因子VIII結(jié)構(gòu)域。
9.權(quán)利要求1的方法，其中將所述重組腺伴隨病毒載體靜脈內(nèi)施用。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述靜脈內(nèi)施用是通過門靜脈。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述重組腺伴隨病毒載體進一步地包含編碼人生長激素多聚腺苷酸化序列的核苷酸。
12.一種治療受治療者的方法，包括a)提供i)患有血液凝固障礙的受治療者，ii)第一種包含編碼因子VIII輕鏈之核苷酸序列的重組腺伴隨病毒載體；和iii)第二種包含編碼因子VIII重鏈之核苷酸序列的重組腺伴隨病毒載體；和b)在使所述因子VIII重鏈和輕鏈核苷酸序列在所述受治療者中以提供治療有效量的水平表達的條件下，將所述第一種和第二種重組腺伴隨病毒載體施用于所述受治療者。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述因子VIII重鏈和輕鏈核苷酸序列在所述受治療者的肝臟中表達。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述因子VIII核苷酸序列編碼選自A1、A2、A3、B、C1和C2中的至少一個因子VIII結(jié)構(gòu)域。
15.權(quán)利要求12的方法，其中所述血液凝固障礙得到改善。
16.權(quán)利要求12的方法，其中所述血液凝固障礙是血友病A。
17.權(quán)利要求12的方法，其中所述受治療者是人。
18.權(quán)利要求12的方法，其中所述將重組腺伴隨病毒載體靜脈內(nèi)施用。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述靜脈內(nèi)施用是通過門靜脈。
20.權(quán)利要求12的方法，其中所述重組腺伴隨病毒載體進一步地包含編碼人生長激素多聚腺苷酸化序列的核苷酸。
21.一種重組腺伴隨病毒載體以及藥學(xué)可接受的賦形劑，其中所述載體包含與控制序列有效地連接的編碼至少一部分因子VIII的核酸，其中所述控制序列指導(dǎo)所述因子VIII部分的翻譯的轉(zhuǎn)錄。
22.權(quán)利要求21的載體，其中所述編碼因子VIII的核酸包含編碼因子VIII重鏈的核苷酸。
23.權(quán)利要求21的載體，其中所述編碼因子VIII的核酸包含編碼因子VIII輕鏈的核苷酸。
24.權(quán)利要求21的載體，其中所述編碼至少一部分因子VIII的核酸編碼選自A1、A2、A3、B、C1和C2中的至少一個因子VIII結(jié)構(gòu)域。
25.權(quán)利要求21的載體，其中所述載體進一步包含編碼人生長激素多聚腺苷酸化序列的核苷酸。
26.一種含有至少一種重組腺伴隨病毒載體的宿主細胞，其中所述宿主細胞能表達因子VIII。
27.權(quán)利要求26的宿主細胞，其中所述細胞是肝臟細胞。
28.權(quán)利要求26的宿主細胞，其中所述因子VIII以處于或者高于生理水平表達。
29.權(quán)利要求26的宿主細胞，其中所述宿主細胞以大于約200ng/ml的水平表達所述因子VIII。
30.權(quán)利要求29的宿主細胞，其中所述宿主細胞存在于動物中。
全文摘要
本發(fā)明提供了適于在人細胞中高水平地表達基因的改善的病毒載體。尤其是,本發(fā)明提供適于基因治療的腺伴隨病毒載體(AAV)。這些載體具有遞送含核酸構(gòu)建體的能力,導(dǎo)致在受體個體體內(nèi)產(chǎn)生治療水平的有生物學(xué)活性的全長因子Ⅷ。本發(fā)明還提供包含這種AAV載體的藥物組合物以及制造和使用這些構(gòu)建體的方法。
文檔編號A61K48/00GK1329509SQ99814128
公開日2002年1月2日 申請日期1999年10月19日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月20日
發(fā)明者L·B·科特, P·C·克洛斯 申請人:阿維根公司