專利名稱：：用于治療心力衰竭的rna干擾的制作方法用于治療心力衰竭的RNA干擾發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總體涉及治療心臟疾病的方法，并且更具體地，涉及使用RNAi降低受磷蛋白(PLB)以治療慢性心力衰竭的方法，包括通過(guò)靶向AAV9載體腺伴隨病毒(AAV)遞送，和診斷對(duì)慢性心力衰竭的RNAi治療的易感性的方法。背景信息心力衰竭目前影響超過(guò)兩百萬(wàn)美國(guó)人，并且其經(jīng)濟(jì)和人員損失將隨著人口的老齡化而繼續(xù)增加。對(duì)于65歲和以上的患者，充血性心力衰竭是最常見(jiàn)的住院患者診斷，每年報(bào)道超過(guò)400，000新病例。預(yù)后差，5年內(nèi)死亡率60%，并且23-52%的死亡可歸因于致死性心律失常(心源性猝死；S⑶)。心力衰竭是心輸出量不能滿足生理需求。因此心力衰竭不是特殊病，而是代表大多數(shù)心臟疾病的終點(diǎn)的綜合征，所述心臟疾病包括缺血性心臟病、心肌疾病(舒張性、限制性、或肥大性)、瓣膜性心臟病以及慢性高血壓和糖尿病。另外，在如急性心肌梗死、心臟手術(shù)后(心肌頓抑、心肌冬眠(hybernation))或再血管化治療后(即再灌注損傷、溶栓后、經(jīng)皮穿刺冠狀動(dòng)脈成形術(shù)或冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù))的情形中，心力衰竭的癥狀也可急性呈現(xiàn)(即急性心力衰竭、或心源性休克)。降低的收縮性是充血性心力衰竭的關(guān)鍵特征，而儲(chǔ)存心肌細(xì)胞中的鈣的肌質(zhì)網(wǎng)(SR)在心臟收縮性以及興奮和收縮的偶聯(lián)中起關(guān)鍵作用。收縮性力的形成依賴于SR中積累的Ca2+的量。肌質(zhì)網(wǎng)鈣ATP酶(SERCAa)豐度的增加或受磷蛋白(PLB)磷酸化的增加和/或PLB豐度的降低可促進(jìn)SR的Ca2+攝取的增加，由此增強(qiáng)心肌細(xì)胞的收縮性。PLB是53氨基酸、肌肉特異性磷蛋白。去磷酸化的PLB與SERCA2a結(jié)合并調(diào)節(jié)進(jìn)入心臟組織的SR中的鈣的量。當(dāng)被蛋白激酶A磷酸化時(shí)，SERCA2a的PLB抑制被復(fù)活，增加進(jìn)入SR的鈣流量和增強(qiáng)肌肉的收縮性。心肌基因治療可用于許多心血管疾病的治療，所述心血管疾病包括缺血性心肌疾病、充血性心力衰竭和惡性心律失常。用于心肌基因遞送的有用載體將允許在直接心肌內(nèi)注射或輸注到冠狀動(dòng)脈或竇中之后有效和穩(wěn)定地向心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)許多轉(zhuǎn)基因。例如，直接注射到左心室心肌的質(zhì)粒DNA載體已被鄰近注射區(qū)域的心肌細(xì)胞表達(dá)6個(gè)月。然而，此方法的治療有用性受到心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低(注射區(qū)域中0.1%至1.0%的心肌細(xì)胞)的限制。復(fù)制缺陷型腺病毒(RDAd)載體的心肌內(nèi)注射和冠狀動(dòng)脈內(nèi)輸注兩種方法已被用于在體內(nèi)有效轉(zhuǎn)導(dǎo)嚙齒動(dòng)物、兔和豬中的心肌細(xì)胞。然而，腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的可行性受到對(duì)病毒和外源轉(zhuǎn)基因蛋白的免疫應(yīng)答的限制，所述免疫應(yīng)答引起嚴(yán)重的心肌炎癥，感染30天內(nèi)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的消除，并由此造成在免疫活性宿主中短暫的重組基因表達(dá)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及通過(guò)調(diào)節(jié)缺陷的心臟Ca2+穩(wěn)態(tài)而治療嚴(yán)重心力衰竭的靶向RNAi，所述調(diào)節(jié)是經(jīng)由使用腺伴隨病毒(AAV)轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞來(lái)降低受磷蛋白(PLB)的表達(dá)。該方法還涉及使用所公開(kāi)的方法在受治療者中降低室性心律失常、以及全面改善心力衰竭的存活。此外，本發(fā)明提供可用于診斷對(duì)RNAi治療的易感性的方法，并包括基本上由降低PLB活性的RNAi組成的藥物組合物、試劑盒和載體同樣地，本發(fā)明提供用于治療受治療者的心力衰竭的方法。該方法包括向有相應(yīng)需要的受治療者施用包括RNAi表達(dá)盒的載體，其中所述盒包含其表達(dá)產(chǎn)物降低受磷蛋白(PLB)活性的RNAi序列，所述載體的施用是以與施用載體之前相比，有效治療所述受治療者的心力衰竭和改善所述受治療者的收縮功能的量。在一種實(shí)施方案中，所述載體是病毒體。在另一種實(shí)施方案中，所述載體是質(zhì)粒。在另一種實(shí)施方案中，所述病毒體是細(xì)小病毒。在另一種實(shí)施方案中，所述細(xì)小病毒是腺伴隨病毒(AAV)，包括AAV血清型9。在又一種實(shí)施方案中，所述RNAi表達(dá)盒包括SEQIDNO:1所列的核苷酸序列。在相關(guān)的實(shí)施方案中，SEQIDNO:1的側(cè)翼為AAV末端重復(fù)序列。在另一種實(shí)施方案中，PLB基因表達(dá)被抑制至少10%。在另一種實(shí)施方案中，所述RNAi序列包括SEQIDNO:2所列的靶序列。同樣地，所述RNAi表達(dá)盒編碼至少一個(gè)RNA，包括在嚴(yán)格條件下與PLB基因的核苷酸序列雜交的第一核苷酸序列，和為所述第一核苷酸序列的互補(bǔ)反向重復(fù)序列并與所述第一核苷酸序列雜交形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的第二核苷酸序列。在一種實(shí)施方案中，所述兩種核苷酸序列通過(guò)RNA環(huán)狀結(jié)構(gòu)連接。在另一種實(shí)施方案中，所述受治療者是哺乳動(dòng)物，諸如人類。本發(fā)明進(jìn)一步提供藥物組合物，該藥物組合物包括重組的腺伴隨病毒(AAV)載體和藥學(xué)可接受的載運(yùn)體，其中所述載體包含其RNA表達(dá)產(chǎn)物導(dǎo)致受磷蛋白(PLB)的表達(dá)和/或活性的降低的RNAi表達(dá)盒。在一種實(shí)施方案中，所述RNAi表達(dá)盒的RNA表達(dá)產(chǎn)物包括在嚴(yán)格條件下與PLB基因mRNA的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，其中嚴(yán)格條件包括但不限于，在42°C下在包含50%甲酰胺、5xSSC和SDS的溶液中雜交，并在65°C下在包含0.2xSSC和0.SDS的溶液中清洗。在另一種實(shí)施方案中，所述RNAi表達(dá)盒包括SEQIDNO:1所列的核苷酸序列。在另一種實(shí)施方案中，所述RNA表達(dá)產(chǎn)物包括SEQIDN0:2所列的靶序列。在另一種實(shí)施方案中，所述組合物適于靜脈內(nèi)施用、動(dòng)脈內(nèi)施用、心室內(nèi)施用、或心瓣膜灌注。本發(fā)明還提供一種腺病毒伴隨病毒(AAV)載體，該載體包括至少一個(gè)AAV末端重復(fù)序列，其中所述載體包含其RNAi表達(dá)產(chǎn)物導(dǎo)致受磷蛋白(PLB)mRNA的表達(dá)或PLB活性降低的RNAi表達(dá)盒。在實(shí)施方案中，所述RNAi表達(dá)盒的RNA表達(dá)產(chǎn)物包括在嚴(yán)格條件下與PLB基因mRNA的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。在另一種實(shí)施方案中，所述RNAi表達(dá)盒包括SEQIDNO:1所列的核苷酸序列。在另一種實(shí)施方案中，所述RNA表達(dá)產(chǎn)物包括SEQIDNO:2所列的靶序列。本發(fā)明還提供增加肌質(zhì)網(wǎng)(SR)的鈣攝取的方法。該方法包括使肌肉組織樣品與腺伴隨病毒(AAV)載體接觸，其中所述載體包括編碼RNAi表達(dá)產(chǎn)物的多核苷酸序列，由此增加SR中的鈣攝取，并與和載體接觸之前的收縮性相比增強(qiáng)心肌細(xì)胞的收縮性。在一種實(shí)施方案中，所述RNAi包括在嚴(yán)格條件下與PLB靶基因mRNA的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。在另一種實(shí)施方案中，所述載體包括SEQIDNO:1所列的核苷酸序列。在另一種實(shí)施方案中，所述RNAi包括SEQIDNO:2所列的靶序列。在另一種實(shí)施方案中，所述RNAi表達(dá)盒的RNA編碼區(qū)造成PLB基因的表達(dá)下調(diào)。在另一種實(shí)施方案中，所述RNAi載體包括與PLB靶基因的RNA編碼區(qū)具有至少約90%同一性的序列。本發(fā)明進(jìn)一步提供試劑盒，該試劑盒包括腺伴隨病毒(AAV)載體，其中所述載體包含編碼導(dǎo)致受磷蛋白(PLB)mRNA的表達(dá)或PLB活性降低的RNAi表達(dá)產(chǎn)物的多核苷酸序列，一種或多種緩沖液，使用這些組成部分的說(shuō)明，和包含這些組成部分的容器。在實(shí)施方案中，所述RNAi包括在嚴(yán)格條件下與PLB靶基因mRNA轉(zhuǎn)錄物的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明還提供診斷受治療者對(duì)所述受治療者中的胞內(nèi)鈣失調(diào)所致的慢性心力衰竭(HF)的RNAi治療的易感性的方法。該方法包括使受治療者的肌肉組織樣品與腺伴隨病毒(AAV)載體接觸，其中所述載體包括編碼導(dǎo)致受磷蛋白(PLB)mRNA的表達(dá)或活性降低的RNAi表達(dá)產(chǎn)物的多核苷酸序列，和確定所述肌肉組織樣品與AAV載體接觸之前和之后所述組織樣品中鈣ATP酶泵(SERCA)的活性，其中SERCA活性的增加與受治療者對(duì)HF的RNAi治療的易感性相關(guān)。本發(fā)明還提供改善具有慢性心力衰竭的受治療者的存活的方法。該方法包括施用腺伴隨病毒(AAV)載體，其中所述載體包括編碼導(dǎo)致受磷蛋白(PLB)mRNA的表達(dá)降低和細(xì)胞中的PLB蛋白的量減少的RNAi表達(dá)產(chǎn)物的多核苷酸序列，并且所述RNAi包括在嚴(yán)格條件下與PLB靶基因mRNA的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。在一種實(shí)施方案中，所述載體改善收縮功能，由此改善受治療者的存活。在另一種實(shí)施方案中，所述AAV是血清型9。本發(fā)明還提供降低受治療者的室性心律失常的方法。該方法包括施用包含編碼導(dǎo)致受磷蛋白(PLB)mRNA的表達(dá)或PLB活性降低的RNAi表達(dá)產(chǎn)物的多核苷酸序列的病毒體，改善心室功能，由此降低所述受治療者的室性心律失常。在一種實(shí)施方案中，所述病毒體是AAV9。附圖簡(jiǎn)述圖IA是顯示Northern印跡圖的圖像圖示，所述Northern印跡圖展示在開(kāi)發(fā)用于心力衰竭(HF)治療的RNA干擾(RNAi)載體中通過(guò)不同載體的靶向沉默。所示為原代月Jl^ffllfi(primaryneonatalratcardiomyocyte,PNCM)ψshRNA靶向沉默效力。分別在用在泳道上方給出的以顆粒/細(xì)胞(p/c)計(jì)的劑量的相應(yīng)載體治療后5天(上面部分)或10天(下面部分)收獲細(xì)胞。然后使用大鼠PLB-特異性探針進(jìn)行Northern印跡。為了確保等量的RNA上樣，剝離印跡并使其與β-肌動(dòng)蛋白-特異性探針重新雜交。泳道1至18顯示基于腺伴隨病毒(AAV)的載體AAV-shPLB(泳道1_6)、AAV-shPLB-CMV-β-內(nèi)含子(泳道7-12)和AAV-shPLB-CMV-GFP(泳道13-18)的RNAi-介導(dǎo)的PLB-mRNA下調(diào)的劑量依賴性。泳道19-24顯示引起用AAV_shGFP治療后的PLB-mRNA表達(dá)的非特異性shRNA的對(duì)照，其產(chǎn)生shRNA序列靶向的綠色熒光蛋白(GFP)(泳道19-24)。為了與AAV進(jìn)行比較，使用了腺病毒載體AdV-shPLB(泳道25-28)。至第10天，>98%的PLB-mRNA被4xl03p/c的最低劑量的rAAV_shPLB除去(泳道1，2)，類似于AdV-shPLB(泳道25-28)。在rAAV-shPLB載體中并入CMV-GFP表達(dá)盒(泳道7_12)以向此載體提供被體內(nèi)成像易于檢測(cè)的標(biāo)簽，導(dǎo)致感染細(xì)胞中的強(qiáng)GFP表達(dá)(未顯示)，但意外地消除了其PLB基因沉默效應(yīng)。并入CMV-β-內(nèi)含子盒(泳道12-18)具有相似但較不顯著的效應(yīng)。圖IB是顯示圖IA的載體產(chǎn)生的細(xì)胞shRNA水平的圖形圖示。在CMV-GFP盒存在下，shPLB產(chǎn)生被消除(泳道13-18)，而不具有其它序列的TO-shPLB載體顯示5天(泳道1-3)和10天(泳道4-6)的穩(wěn)定表達(dá)。在NRCM中，AdVshPLB在第5天產(chǎn)生非常高的shPLB水平，然后該水平相當(dāng)迅速地下降。圖IC是顯示腺病毒和AAV載體的詳細(xì)圖譜的圖像圖示。AAV-shPLB具有與AdV-shPLB和它們對(duì)應(yīng)的shGFP對(duì)照載體相同的TO_shRNA表達(dá)系統(tǒng)。此外，四種含有CMV的載體攜帶盒，CMV-GFP盒或CMV-β-內(nèi)含子盒與TO-shRNA序列處于頭接頭方向，并且它們被牛生長(zhǎng)激素(bgH)末端信號(hào)隔開(kāi)。圖ID是圖像和圖形圖示，左圖顯示治療NRCM過(guò)程中的PLB蛋白的Western印跡，而右圖顯示加入載體后第3、5和7天的PLB蛋白定量。在第7天，AdV-shPLB和rAAV6_shPLB造成細(xì)胞內(nèi)PLB分別下調(diào)至基線的9%和13%。圖IE是顯示以下的圖形圖示與具有與未治療細(xì)胞不可分辨的[&2+幾瞬變(transient)的AAV9_shGFP組相比，AAV9_shPLB治療過(guò)程中NRCM中的[Ca2Ii瞬變顯示顯著更高的振幅和加快的瞬變動(dòng)力學(xué)(縮短的TTP和τ)。AdV-shPLB治療還造成比AdV-shGFP對(duì)照顯著更高的振幅。與AAV9組相反，AdV-shPLB和AdV_shGFP組的TTP被延長(zhǎng)，該組未顯示τ的差異。圖IF是顯示圖IE中所示的[Ca2+]i瞬變的統(tǒng)計(jì)評(píng)估的圖形圖示。*表示ρ<0.05和**ρ<0.01。圖2Α是說(shuō)明體內(nèi)RNAi治療HF的方案的流程圖。最初將用于體內(nèi)RNAi治療的動(dòng)物分成兩組一組為大動(dòng)脈被綁扎(TAB)的56只動(dòng)物，第二組是12只進(jìn)行模擬手術(shù)的動(dòng)物。在TAB動(dòng)物中，在心臟RNAi載體轉(zhuǎn)移之前，經(jīng)過(guò)25-30周以允許它們形成左心室(LV)舒張和允許縮短分?jǐn)?shù)(FS)下降25%，如通過(guò)連續(xù)超聲波心動(dòng)描記術(shù)所評(píng)估的。在經(jīng)歷TAB的初始的56只動(dòng)物中，40只動(dòng)物存活，并進(jìn)一步分組以接受Ad-shGFP(η=10)或Ad-shPLB(η=10)，或?qū)φ蛰d體AAV9-shGFP(n=10)或AAV9_shPLB(η=10)。載體注射經(jīng)由含有200μ1腺病毒GxliTpfu)或AAV9(5X10"載體基因組)載體溶液的22G導(dǎo)管進(jìn)行。使導(dǎo)管從LV尖前進(jìn)至主動(dòng)脈根，在遠(yuǎn)離導(dǎo)管位點(diǎn)的一端將主動(dòng)脈和肺動(dòng)脈主干夾住40秒鐘并注射溶液。腺病毒載體組在一個(gè)月后、AAV載體治療組在三個(gè)月后通過(guò)超聲波心動(dòng)描記術(shù)、尖端導(dǎo)管(tipcatheter)、形態(tài)測(cè)定法和組織學(xué)進(jìn)行結(jié)果評(píng)估(參見(jiàn)，圖3A-3F)。在AdV組，8/10和9/10的動(dòng)物在1個(gè)月后存活。3個(gè)月后，rAAV-shPLB組中9/10的動(dòng)物存活，rAAV_shGFP組中6/10的動(dòng)物存活。同時(shí)對(duì)這些組中心臟表達(dá)的微RNA進(jìn)行了進(jìn)一步研究。圖2B是顯示i.v.注射表達(dá)綠色熒光蛋白的rAAV9_GFP載體(下)或鹽水(上)的大鼠心臟的圖像圖示。注射后一個(gè)月，摘除心臟并通過(guò)GFP成像顯現(xiàn)，GFP成像顯示在rAAV9-GFP組中有心臟橫截面大致均勻的信號(hào)，而在鹽水組中則沒(méi)有信號(hào)。圖2C是顯示rAAV9-GFP_治療的大鼠的心臟的GFP熒光在一個(gè)月時(shí)達(dá)到90%表面積的概況的圖像圖示。圖2D是顯示向大鼠i.v.注射rAAV9-GFP后一個(gè)月不同器官中的GFP免疫組織化學(xué)染色的圖像圖示。但在i.v.注射腺病毒載體(AdV-GFP)后，未在心臟中檢測(cè)到GFP(a)，!AAV9-GFP治療造成強(qiáng)烈的GFP表達(dá)(b)和(c)，該表達(dá)是大致均勻的。少數(shù)區(qū)域全無(wú)GFP免疫反應(yīng)性(已圈出)，其他區(qū)域顯示均勻的細(xì)胞質(zhì)染色(已圈出)。在一個(gè)月的高表達(dá)已明顯造成在細(xì)胞中穩(wěn)定的GFP的沉淀(箭頭)形成的部位，染色尤其致密，這與RNAi載體產(chǎn)生的shRNA相反。平均70%的心肌細(xì)胞是免疫組織化學(xué)陽(yáng)性的，而個(gè)體細(xì)胞之間的表達(dá)有差異。(e)顯示一部分細(xì)胞具有微弱的染色的骨骼肌，而肝顯示僅個(gè)別細(xì)胞的顯著信號(hào)(d)。肺中沒(méi)有可見(jiàn)的信號(hào)。關(guān)于AAV9分布的進(jìn)一步數(shù)據(jù)在圖2J中給出，其中GFP通過(guò)Western印跡分析定量，記錄心臟的rAAV9_GFP表達(dá)的最高親和性。肝和骨骼肌顯示低表達(dá)，而肺僅顯示非常微弱的表達(dá)。圖2E是顯示i.v.注射rAAV9_GFP后1周和4周的肝蘇木精-曙紅染色的圖像圖示，顯示無(wú)毒性證據(jù)。rAAV-shRNA載體也未造成肝毒性。圖2F是顯示Northern印跡圖的圖像圖示，所述Northern印跡圖展示，與shGFP對(duì)照組相比，AdV-shPLB治療后1個(gè)月和rAAV9-shPLB治療后3個(gè)月的心臟PLB蛋白顯著減少。NCX和GAPDH蛋白保持不變。與模擬(sham)組相比，處于心力衰竭的shGFP組中SERCA2a降低，而兩個(gè)shPLB組的SERCA2a均顯著增加。圖2G是顯示不同治療組的Western印跡的統(tǒng)計(jì)評(píng)估的圖形圖示。*表示與AdV-shGFP相比ρ<0.05，#表示與rAAV9-shGFP相比ρ<0.05。圖2Η是顯示靜脈內(nèi)rAAV9_GFP注射后一個(gè)月的心臟GFP表達(dá)的圖像圖示。左側(cè)的四個(gè)圖(rAAV9-GFP)顯示有初級(jí)GFP抗體，而右側(cè)的兩個(gè)圖(對(duì)照)顯示沒(méi)有。關(guān)于AAV9分布的進(jìn)一步數(shù)據(jù)證明心臟的rAAV9-GFP表達(dá)的最高親和性。肝和骨骼肌顯示低表達(dá)，而肺僅顯示非常微弱的表達(dá)。圖21是顯示靜脈內(nèi)rAAV9-GFP注射后1個(gè)月其他器官中的GFP表達(dá)的圖像圖示。左側(cè)的圖(RAAV9-GFP)顯示有初級(jí)GFP抗體，而右側(cè)圖(對(duì)照)顯示沒(méi)有。圖2J是顯示靜脈內(nèi)rAAV9_GFP注射后不同器官中通過(guò)免疫印跡的GFP定量的圖像和圖形圖示。圖3A是展示RNAi治療對(duì)HF的功能和形態(tài)效應(yīng)的系列圖形圖示。其中總結(jié)了RNAi治療對(duì)舒張期LV功能的血液動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響。與shGFP對(duì)照(泳道2，4)相比，TAB后大鼠中高LV充盈壓(LVEDP)被shPLB載體顯著降低(泳道3，5)。最大壓力下降速率(maximalrateofpressurefall)(-dP/dt)以及等容松弛時(shí)間常數(shù)(isovolumetricrelaxationtimeconstant)Tau被shPLB治療顯著增加。rAAV-shPLB治療(泳道5)后3個(gè)月值被恢復(fù)到正常范圍(泳道1)。圖3B是顯示與圖3A類似的對(duì)收縮期LV功能的治療效應(yīng)的圖形圖示。超聲波心動(dòng)描記術(shù)顯示rAAV-shPLB治療后3個(gè)月的標(biāo)準(zhǔn)化的縮短分?jǐn)?shù)(FS)，而AdV-shPLB的FS改善雖然是明顯的，但較不顯著。與對(duì)照相比，最大壓力上升速率(maximalrateofpressurerise)(+dP/dt)以及收縮期壓力(LVSP)得到改善。圖3C是顯示死后形態(tài)測(cè)定法的系列圖形圖示，顯示TAB誘導(dǎo)的顯著的LV肥大(泳道2，4)，1^重量和1^/體重(1^/81)比2/3三分之一高于基線(thirdsabovebaseline)(泳道1)。后者在用AdV-shPLB或rAAV9-shPLB(泳道3、5)治療1或3個(gè)月后被降低至正常的范圍內(nèi)。兩種載體類型均顯著減低心臟肥大。圖3D是總結(jié)心臟形態(tài)學(xué)的超聲波心動(dòng)描記術(shù)數(shù)據(jù)的系列圖形圖示，這與確證形態(tài)測(cè)定發(fā)現(xiàn)的圖3C相似。圖3E是顯示RNAi治療后的HF動(dòng)物中的心臟膠原蛋白含量的圖形圖示。3個(gè)月時(shí)，rAAV9-shRNA治療造成顯著降低的纖維化。對(duì)照載體則無(wú)效果。圖3F是顯示兩種治療模式均誘導(dǎo)心肌細(xì)胞直徑的顯著下降的圖形圖示。圖3G是顯示RNAi治療過(guò)程中心臟BNPmRNA水平的圖形圖示。.表示對(duì)于AAV9-shGFP比AAV9_shPLB，ρ<0.05；11表示對(duì)于AdV-shGFP比AdV-shPLB，ρ<0.05圖4Α是顯示RNAi治療過(guò)程中細(xì)胞微RNA的評(píng)估的系列圖形圖示。如所示的，在用稍后將用于體內(nèi)治療的載體(AAV-shPLB、AAV—shGFP、AdV-shPLB)進(jìn)行治療的過(guò)程中，與未治療的PNCM相比，五種心臟表達(dá)的微RNA(miR)的細(xì)胞水平未發(fā)生變化，而含有CMV啟動(dòng)子的載體改變了這些水平。圖4B是顯示以下的系列圖形圖示與在標(biāo)準(zhǔn)PNCM的培養(yǎng)條件下獲得的圖4A的數(shù)據(jù)相反，在肥大誘導(dǎo)藥物存在下，細(xì)胞miRNA水平發(fā)生顯著改變。圖4C是顯示RNAi治療過(guò)程中的心臟miRNA_l和miRNA_133水平的系列圖形圖示。J表示對(duì)于AAV9-shGFP比AAV9_shPLB，ρ<0.05；1表示對(duì)于AdV-shGFP比AdV-shPLB，ρ<0.05。圖5A是顯示CMV啟動(dòng)子對(duì)shRNA產(chǎn)生的干擾的圖形圖示。如所示的，除了圖IA和IB中分析的不同AAV載體之外，還直接比較了載體AAV-ShPLB-CMF-GFP(具有功能性GFP盒)與AAV-shPLB-GFP(無(wú)CMV啟動(dòng)子)，以及AAV-shPLB_CW-β-內(nèi)含子與AAV-shPLB-β-內(nèi)含子(無(wú)CMV)。圖5Β是顯示與AAV6shPLB-CMF-GFP標(biāo)記載體孵育后第5天培養(yǎng)的心肌細(xì)胞單層的圖像圖示，符合AAV6假型的非常高的轉(zhuǎn)導(dǎo)率。圖5C是表明在從MCV經(jīng)由終止信號(hào)通讀至極短的shRNA序列中U6-shPLB_bGH方向上擾亂的shRNA產(chǎn)生的可能原因的圖像圖示，隨后其影響了介導(dǎo)RNAi的短發(fā)夾的正確形成。圖5D是顯示RNAi治療過(guò)程中NRCM中的鈣穩(wěn)態(tài)變化的系列圖形圖示。圖5E是顯示RNAi治療過(guò)程中NRCM中的鈣穩(wěn)態(tài)變化的系列圖形圖示。圖6是顯示具有心力衰竭并用AAV9/PL_RNAi治療的大鼠中改善的存活的圖形圖示。其顯示與使用單獨(dú)的載體或具有GFP的載體的對(duì)照相比，通過(guò)使用AAV9/PL-RNAi的表達(dá)的RNAi基因轉(zhuǎn)移的受磷蛋白抑制對(duì)具有轉(zhuǎn)變?yōu)樾牧λソ叩膲毫^(guò)大性肥大的大鼠的存活的效應(yīng)。圖7是顯示豬缺血性再灌注模型中降低的室性心律失常結(jié)果的圖形圖示。與使用GFP的對(duì)照載體相比，該實(shí)驗(yàn)使用AAV9/PL-RNAi的表達(dá)。圖8是顯示豬缺血性再灌注模型中改善的心室功能結(jié)果的圖形圖示。與使用單獨(dú)的載體或具有GFP的載體的對(duì)照相比，該實(shí)驗(yàn)使用AAV9/PL-RNAi的表達(dá)。發(fā)明詳述在描述本發(fā)明組合物、方法和治療方法之前，應(yīng)理解，此發(fā)明不限于所述的特定組合物、方法和實(shí)驗(yàn)條件，因?yàn)榇祟惤M合物、方法和條件可進(jìn)行變化。還應(yīng)理解，本文所用的術(shù)語(yǔ)僅是為了描述特定實(shí)施方案的目的，而不意圖為限制，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍將僅在所附權(quán)利要求中限制。如本說(shuō)明書和所附權(quán)利要求中所用，除非上下文另外清楚地指明，否則單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“該”包括復(fù)數(shù)含義。因此，例如，“該方法”的含義包括在本領(lǐng)域技術(shù)人員閱讀本公開(kāi)等等之后將變得明顯的一種或多種方法和/或本文所述類型的步驟。除非另外指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與此發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義。雖然與本文描述的方法和材料相似或等價(jià)的任何方法和材料可用于本發(fā)明的實(shí)踐或檢驗(yàn)，但是現(xiàn)在描述非限制性方法和材料。除非另外說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)踐將利用本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的病毒學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)和重組DNA技術(shù)的常規(guī)方法。此類技術(shù)在文獻(xiàn)中有詳盡說(shuō)明，參見(jiàn)，如Sambrook等人MolecularCloning=ALaboratoryManual(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))(現(xiàn)行版)；DNACloning:APracticalApproach(DNA克隆實(shí)用方法)，第I&II卷(D.Glover,編輯)；OligonucleotideSynthesis(寡核苷酸合成)(N.Gait編輯，現(xiàn)行版)；NucleicAcidHybridization(核酸雜交)(B.Hames&S.Higgins編輯，現(xiàn)行版)！TranscriptionandTranslation(轉(zhuǎn)錄和翻譯)(B.Hames&S.Higgins編輯，現(xiàn)行版)；CRCHandbookofParvoviruses,(CRC細(xì)小病毒手冊(cè))，第I&II卷(P.Tijessen編輯)；FundamentalVirology(基礎(chǔ)病毒學(xué))，第2版，第I&II卷(B.N.Fields和D.M.Knipe編輯)。本發(fā)明成功展示了使用與心臟Ca2+穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物PLB互補(bǔ)的RNAi治療受治療者中的心力衰竭(HF)。合成的小干擾RNA介導(dǎo)RNAi，但是它們的體內(nèi)使用受到在血漿中不穩(wěn)定和進(jìn)入靶細(xì)胞的低轉(zhuǎn)移的限制。申請(qǐng)人已展示，腺病毒短發(fā)夾RNA載體(AdV-shRNA)沉默心肌細(xì)胞(PNCM)中的PLB，并在體內(nèi)改善HF動(dòng)物的血液動(dòng)力學(xué)。申請(qǐng)人還開(kāi)發(fā)了攜帶RNAi的向心臟的腺伴隨病毒(AAV)載體，其實(shí)現(xiàn)了心臟功能的恢復(fù)、心臟舒張和肥大的逆轉(zhuǎn)，并改善了存活。在PNCM中，苯腎上腺素誘導(dǎo)的肥大相關(guān)的微RNA失調(diào)被所述RNAi載體校正。除了它們對(duì)收縮功能的效應(yīng)外，RNAi靶向改變微RNA水平，由此在不存在血液動(dòng)力學(xué)因子或神經(jīng)體液活化下直接改變細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄程序。在一種實(shí)施方案中，公開(kāi)了治療心力衰竭的方法，包括向有相應(yīng)需要的受治療者施用治療有效量的RNAi表達(dá)盒，其中所述盒包括病毒體載體和其表達(dá)產(chǎn)物降低受磷蛋白(PLB)的表達(dá)和/或活性的RNAi序列，所述施用以有效轉(zhuǎn)導(dǎo)所述受治療者的心肌細(xì)胞的量進(jìn)行，由此造成所述RNAi表達(dá)盒的表達(dá)并治療所述受治療者中的心力衰竭。本發(fā)明公開(kāi)了通過(guò)局部誘導(dǎo)的RNAi治療心臟疾病的策略。HF仍是發(fā)達(dá)國(guó)家中死亡的主要因素。目前的藥物治療效力有限，而在晚期HF中，左心室輔助設(shè)備或心臟移植是最終的選擇。雖然HF可由多種病因?qū)W引起，但是缺陷的心臟Ca2+穩(wěn)態(tài)已被鑒定為重要的最終共同途徑。衰竭的心臟的機(jī)能失調(diào)部分是由于降低的SERCA2a表達(dá)和/或PLB磷酸化造成的PLB-控制的肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+ATP酶泵(SERCA2a)的功能不良(Schmidt等人，AmJPhysiol(1999)277:H474480)。未磷酸化的PLB保持SERCA2a的低Ca2+親和力，造成降低的SRCa2+攝取、緩慢的松弛和降低的SRCa2+負(fù)荷，而響應(yīng)于β-腎上腺素能刺激的PLB磷酸化解除這一抑制(MacLennan，D.H.&Kranias，Ε.G.Phospholambanacrucialregulatorofcardiaccontractility(受粦蛋白臟收縮個(gè)生的關(guān)鍵i周節(jié)物).NatureReviewsMolecularCellBiology4，566-77(2003))。PLB基因的種系切除(Luo等人，CircRes(1994)75:401-409)、和顯性陰性PLB突變體的體細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移(Hoshijima等人，MatureMedicine(2002)8:864_871；Iwanaga等人，JClinInvest(2004)113:727_736)、PLB-反義-RNA(Eizema等人，Circulation(2000)1012193-2199；He等人，Circulation(1999)100974-980)、或細(xì)胞內(nèi)抑制性PLB抗體被用于增加SERCA2a活性、收縮功能和拯救心力衰竭模型(Dieterle等人，CardiovascRes(2005)67:678_688；Meyer等人，F(xiàn)ASEBJ(2004)181312-1314；Minamisawa,S.等人，Chronicphospholamban-sarcoplasmicreticulumcalciumATPaseinteractionisthecriticalcalciumcyclingdefectindilatedcardiomyopathy(f曼t生蛋白—月JLM網(wǎng)鈣ATP酶相互作用是舒張性心肌病中的關(guān)鍵鈣循環(huán)缺陷.Cell99,313-22(1999))0心肌細(xì)胞中由化學(xué)合成的短干擾RNA(siRNA)介導(dǎo)的RNAi甚至在體外也顯示低效力和低穩(wěn)定性(Watanabe等人，JMolCellCardiol(2004)37:691_698)。合成siRNA的兩個(gè)基本限制是它們?cè)谘獫{和靶細(xì)胞中的快速降解，以及在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)足夠的轉(zhuǎn)移和靶向的問(wèn)題。病毒載體具有克服這些限制的潛能。在本發(fā)明中，其他心臟蛋白包括Ca2+調(diào)控蛋白(Ca2+handlingprotein)的表達(dá)未發(fā)生改變，表明高度的靶特異性。同樣地，功能表征一系列載體和它們的效力決定因素后，在嚴(yán)重HF的動(dòng)物模型中沿傳統(tǒng)的腺病毒載體確定了優(yōu)化的細(xì)小病毒(即AAV)，并確定了RNAi治療過(guò)程中的心肌細(xì)胞微RNA(miR)途徑。因此，本文呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)展示心臟功能的體內(nèi)恢復(fù)以及病理性肥大和擴(kuò)張的降低。本文使用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)小病毒”涵蓋細(xì)小病毒科(Parvoviridae)，包括自主復(fù)制的細(xì)小病毒和依賴病毒。自主細(xì)小病毒包括以下屬的成員細(xì)小病毒屬(Parvovirus)、紅細(xì)胞病毒屬(Erythrovirus)、濃核病毒屬(Densovirus)、重復(fù)病毒屬(Iteravirus)和康特拉病毒屬(Contravirus)。示例性自主細(xì)小病毒包括但不限于，小鼠細(xì)小病毒、牛細(xì)小病毒、犬細(xì)小病毒、雞細(xì)小病毒、貓全白細(xì)胞缺乏癥病毒、貓細(xì)小病毒、鵝細(xì)小病毒、Hl細(xì)小病毒、番鴨(muscovyduck)細(xì)小病毒、B19病毒和任何其他細(xì)小病毒。其他自主細(xì)小病毒是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。參見(jiàn)，如BERNARDN.FIELDS等人，VIROLOGY(病毒學(xué))，第2卷，第69章(第4版，Lippincott-RavenPublishers)。細(xì)小病毒科是小的單鏈無(wú)包膜DNA病毒科，基因組長(zhǎng)大約5000核苷酸。該科的成員包括腺病毒(Ad)和腺伴隨病毒(AAV)。腺病毒代表感染呼吸道、眼睛、腸和泌尿道的膜的一組病毒。腺病毒代表最大的無(wú)包膜病毒，因?yàn)樗鼈兪悄軌蛲ㄟ^(guò)核內(nèi)體運(yùn)輸?shù)淖畲蟪叽?即包膜融合不是必需的)。病毒體還具有與衣殼的每個(gè)五鄰體基質(zhì)有關(guān)的獨(dú)特的“刺突”(spike)或纖維(fibre)，所述“刺突”或纖維有助于附著宿主細(xì)胞。AAV是依賴性細(xì)小病毒，根據(jù)定義，其需要與另一病毒(通常是腺病毒或皰疹病毒)共感染以啟動(dòng)和維持有生產(chǎn)能力的感染周期。不存在這樣的輔助病毒時(shí)，AAV仍能通過(guò)受體介導(dǎo)的結(jié)合和內(nèi)化、刺入非分裂細(xì)胞和分裂細(xì)胞的核而感染或轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞。進(jìn)入核以后，病毒脫殼并從許多不同的形式表達(dá)轉(zhuǎn)基因，其中最持久的形式是環(huán)狀單體。AAV將整合到穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中的1-5%的細(xì)胞的基因組(Nakai等人，J.Virol.7611343-349，2002)。轉(zhuǎn)基因的表達(dá)可以是特別穩(wěn)定的，在一個(gè)用AAV遞送因子IX的研究中，狗模型在用該病毒進(jìn)行單次直接輸注后4.5年持續(xù)表達(dá)治療水平的該蛋白。因?yàn)樵谳o助病毒不存在時(shí)AAV感染不產(chǎn)生后代病毒，所以轉(zhuǎn)導(dǎo)的范圍僅限于用AAV感染的初始細(xì)胞。這一特征使得AAV成為用于本發(fā)明的合適的基因治療載體。此外，與逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和單純皰疹病毒不同，AAV顯示缺乏人類致病性和毒性(Kay等人，Nature424251，2003禾口Thomas等人，NatureReviews,Genetics4:346_58，2003)。通常，AAV的基因組僅含有兩個(gè)基因。“r印”基因編碼DNA復(fù)制中使用的至少四種單獨(dú)的蛋白?！癱ap”基因產(chǎn)物被差異剪接以產(chǎn)生構(gòu)成病毒衣殼的三種蛋白。當(dāng)將基因組包裝成新生病毒時(shí)，只有反向末端重復(fù)序列(ITR)是必需的序列；r印和cap可被從基因組中缺失，并被替換為選擇的異源序列。然而，為了產(chǎn)生復(fù)制和將基于AAV-的異源構(gòu)建體包裝成新生病毒體需要的蛋白，必需以反式提供rep和cap蛋白。通常由與輔助病毒諸如腺病毒或皰疹病毒共感染提供的輔助功能也可以一種或多種DNA表達(dá)質(zhì)粒的形式反式提供。由于基因組通常僅編碼兩個(gè)基因，因此，作為遞送運(yùn)載體AAV的包裝能力限制為4.5千堿基(kb)單鏈也就不足為奇。不過(guò)，雖然此尺寸限制可能限制可以被遞送以替換基因治療的基因，但是它并不有害地影響較短序列諸如RNAi的包裝和表達(dá)。AAV對(duì)于RNAi應(yīng)用的功效已在使用AAV體外遞送shRNA以抑制p53和半胱天冬酶8表達(dá)的實(shí)驗(yàn)中展示(Tomar等人，Oncogene22:5712_15，2003)。將適當(dāng)?shù)男蛄锌寺〉娇諝?gutted)AAV-2載體之后，在HEK293細(xì)胞中產(chǎn)生了感染性AAV病毒體，并將該病毒體用于感染HeLaS3細(xì)胞。展示了內(nèi)源半胱天冬酶8和p53水平的劑量依賴性減少。Boden等人還使用AAV體外遞送shRNA以抑制組織培養(yǎng)系統(tǒng)中的HIV復(fù)制(Boden等人，J.Virol.77(21)115231-35,2003)，如通過(guò)耗盡的培養(yǎng)基中的p24產(chǎn)生所評(píng)估的。但是，必須解決使用AAV作為用于RNAi表達(dá)構(gòu)建體的運(yùn)載體的技術(shù)障礙。例如，人口的不同百分比可擁有針對(duì)某些AAV血清型的中和抗體。不過(guò)，由于存在若干種AAV血清型，含有其中一些血清型的中和抗體的個(gè)體百分比大大降低，可使用其他血清型，或可采用假分型(pseudo-typing)。存在至少九種不同的已表征的血清型，還有數(shù)十種其他血清型已被分離但是描述較不充分。另一限制是由于對(duì)AAV的可能的免疫應(yīng)答，基于AAV的治療可能僅施用一次；不過(guò)，使用替代的、非人類來(lái)源的血清型可允許重復(fù)施用。施用路徑、血清型和所遞送的基因組的組成均影響組織特異性。將未修改的AAV系統(tǒng)用于RNAi表達(dá)構(gòu)建體的另一限制是轉(zhuǎn)導(dǎo)可能是效率低下的。體內(nèi)穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)可限于5-10%的細(xì)胞。不過(guò)，本領(lǐng)域已知加強(qiáng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)水平的不同的方法。一種方法是采用假分型，其中使用其他血清型來(lái)源的cap蛋白包裝AAV-2基因組。例如，通過(guò)用AAV-5cap基因置換其AAV-2對(duì)等物，Mingozzi等人使穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)增加至大約15%的肝細(xì)胞(Mingozzi等人，J.Virol.76(20)10497-502,2002)。Thomas等人使用AAV8衣殼基因體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)了超過(guò)30%的小鼠肝細(xì)胞(Thomas等人，J.Virol.，發(fā)行中)。Grimm等人(Blood.2003-02-0495)詳盡地用AAV_1、AAV-3B、AAV-4、AAV_5和AAV-6將AAV-2假分型以用于組織培養(yǎng)研究。轉(zhuǎn)基因表達(dá)的最高水平由用AAV-6假分型的病毒體誘導(dǎo)；產(chǎn)生比AAV-2高接近2000%的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。因此，本發(fā)明包括使用假分型AAV病毒來(lái)實(shí)現(xiàn)高轉(zhuǎn)導(dǎo)水平，RNAi多啟動(dòng)子表達(dá)構(gòu)建體的表達(dá)相應(yīng)增加。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“腺伴隨病毒”(AAV)，包括但不限于，AAV1型、AAV2型、AAV3型(包括3A型和3B型)、AAV4型、AAV5型、AAV6型、AAV7型、AAV8型、AAV9型、AAV10型、AAV11型、禽AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV、羊AAV和現(xiàn)在已知的任何其他AAV。參見(jiàn)，如BERNARDN.FIELDS等人，VIROLOGY(病毒學(xué))，第2卷，第69章(第4版，Lippincott-RavenPublishers)。最近，許多推定的新的AAV血清型和進(jìn)化枝已被鑒定(參見(jiàn)，如Gao等人，(2004)J.Virology78:6381_6388；Moris等人，(2004)Virology33-:375_383)。在一種實(shí)施方案中，所述AAV是AAV9型。AAV的各種血清型的基因組序列和自主細(xì)小病毒的基因組序列，以及末端重復(fù)序列(TR)、Rep蛋白和衣殼亞基的序列是本領(lǐng)域已知的。此類序列可在文獻(xiàn)或公共數(shù)據(jù)庫(kù)諸如GenBank中找到，包括但不限于，GenBank登錄號(hào)NC_002077、NC_001401、NC_001729、NC_001863、NC_001829、NC_001862、NC_000883、NC_001701、NC_001510、NC_006152、NC_006261、AF063497、U89790、AF043303、AF028705、AF028704、J02275、J01901、J02275、X01457、AF28806UAH009962、AY028226、AY028223、NC_001358、NC_001540,AF51385UAF513852、AY530579；其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用并入本文以教導(dǎo)細(xì)小病毒和AAV核酸和氨基酸序列。另參見(jiàn)，如Srivistava等人，(1983)J.Virology45:555;Chiorini等人，(1998)J.Virology716823；Chiorini等人，(1999)J.Virology731309；Bantel-Schaal等人，(1999)J.Virology73:939;Xiao等人，(1999)J.Virology73:3994;Muramatsu等人，(1996)Virology221208；Shade等人，(1986)J.Virol58921；Gao等人，(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.USA9911854；Moris等人，(2004)Virology33-:375_383；國(guó)際專利公布WO00/28061、WO99/61601、WO98/11244；和美國(guó)專利第6，156，303號(hào)，通過(guò)引用并入本文如本文所用的術(shù)語(yǔ)“趨向性”指病毒優(yōu)先進(jìn)入某些細(xì)胞或組織，任選地接著在所述細(xì)胞中表達(dá)(如轉(zhuǎn)錄和，任選地，翻譯)病毒基因組攜帶的序列，如，對(duì)于重組的病毒，表達(dá)異源核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在不存在反式作用因子時(shí)，異源核酸序列從病毒基因組的轉(zhuǎn)錄可能不被啟動(dòng)，如對(duì)于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或以其他方式調(diào)節(jié)的核酸序列。在rAAV基因組的情形中，病毒基因組的基因表達(dá)可來(lái)自穩(wěn)定整合的原病毒、來(lái)自未整合的附加體以及病毒在細(xì)胞內(nèi)可采取的任何其他形式。如本文所用，除非另外說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“多肽”涵蓋肽和蛋白質(zhì)(包括天然存在的或非天然存在的)。如本文所用，“分離的”多肽(如，“分離的肽”或“分離的蛋白質(zhì)”)意指多肽至少部分地與天然存在的有機(jī)體或病毒的至少一些其他組分分開(kāi)，所述其他組分例如，細(xì)胞或病毒結(jié)構(gòu)組分或通常被發(fā)現(xiàn)與所述多肽締合的其他多肽或核酸。“多核苷酸”是核苷酸堿基的序列，并且可以是RNA、DNA或DNA-RNA雜種序列(包括天然存在的和非天然存在的核苷酸)，但在代表性實(shí)施方案中，其為單鏈或雙鏈DNA序列。如本文所用，“分離的”多核苷酸(如“分離的DNA”或“分離的RNA”)意指多核苷酸至少部分地與天然存在的有機(jī)體或病毒的至少一些其他組分分開(kāi)，所述其他組分例如，細(xì)胞或病毒結(jié)構(gòu)組分或通常被發(fā)現(xiàn)與所述多核苷酸締合的其他多肽或核酸。如本文所用，“分離”或“純化”(或語(yǔ)法等同物)病毒載體意指使病毒載體至少部分地與起始材料中的至少一些其他組分分開(kāi)?！爸委煻嚯摹笔强删徑饣驕p輕細(xì)胞或受治療者中由蛋白質(zhì)的缺乏或缺陷造成的癥狀的多肽?？蛇x地，“治療多肽”是以另外方式賦予受治療者益處、如抗心律失常效應(yīng)或從心力衰竭中存活的能力的改善的多肽?！稗D(zhuǎn)染”用于指細(xì)胞對(duì)核酸組合物的攝取。當(dāng)外源核酸組合物穿過(guò)細(xì)胞膜時(shí)，細(xì)胞即被“轉(zhuǎn)染”。許多轉(zhuǎn)染技術(shù)是本領(lǐng)域通常已知的。參見(jiàn)，如[69，70],Sambrook等人(1989)MolecularCloning,alaboratorymanual(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)),ColdSpringHarborLaboratories,NewYork,Davis等人(1986)BasicMethodsinMolecularBiology(分子生物學(xué)基本方法)，Elsevier，和[71]。此類技術(shù)可用于將一種或多種核酸組合物諸如質(zhì)粒載體和其他核酸分子引入合適的宿主細(xì)胞。該術(shù)語(yǔ)指遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定攝取和瞬時(shí)攝取兩方面。對(duì)于此發(fā)明目的，“轉(zhuǎn)導(dǎo)”是經(jīng)由病毒載體的特殊“轉(zhuǎn)染”形式?！稗D(zhuǎn)導(dǎo)”表示經(jīng)由病毒或病毒載體諸如經(jīng)由重組的AAV病毒體，在體內(nèi)、體外或活體外(exvivo)遞送核酸組合物到達(dá)、進(jìn)入受體細(xì)胞或在受體細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)導(dǎo)是轉(zhuǎn)染的特殊形式，即術(shù)語(yǔ)轉(zhuǎn)染包括術(shù)語(yǔ)轉(zhuǎn)導(dǎo)。術(shù)語(yǔ)“治療”，包括其語(yǔ)法等同物，意指受治療者的病癥的嚴(yán)重度得到減輕或至少部分改善或緩解，和/或?qū)崿F(xiàn)至少一種臨床癥狀的某種程度的緩解、緩和或降低，和/或病癥的進(jìn)展有延遲，和/或阻止或延遲了疾病或疾患的發(fā)作。因此，術(shù)語(yǔ)“治療”指預(yù)防性方案和治療性方案兩方面?！爱愒春塑账嵝蛄小被颉爱愒春怂帷笔侵覆皇遣《局刑烊淮嬖诘男蛄?。通常，異源核酸包含感興趣的多肽或非翻譯RNA的開(kāi)放閱讀框(如，用于遞送到細(xì)胞或受治療者)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“病毒載體”、“載體”或“基因遞送載體”指充當(dāng)核酸遞送運(yùn)載體的病毒(如，AAV)顆粒，以及包含包裝到AAV衣殼內(nèi)的載體基因組(如，病毒DNA[vDNA])的病毒顆粒?？蛇x地，在一些上下文中，術(shù)語(yǔ)“載體”可用于指單獨(dú)的載體基因組/VDNA。"rAAV載體基因組”或“rAAV基因組”是包含一種或多種異源核苷酸序列的AAV基因組(即vDNA)。rAAV載體通常只需要順式的145堿基末端重復(fù)序列(TR)來(lái)產(chǎn)生病毒。所有其它序列是非必須的，并可以反式提供(Muzyczka，(1992)Curr.TopicsMicrobiol.Immunol.158:97)。通常，rAAV載體基因組將僅保留最小TR序列以使可被載體有效包裝的轉(zhuǎn)基因的尺寸最大。結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)編碼序列可以反式提供(如，從載體，諸如質(zhì)粒，或通過(guò)將序列穩(wěn)定地整合到包裝的細(xì)胞中)。rAAV載體基因組包含至少一個(gè)TR序列(如，AAVTR序列)、任選地兩個(gè)TR(如，兩個(gè)AAVTR)，其通常在異源核苷酸序列的5'和3'端，但不需與所述異源核苷酸序列鄰接。TR可以彼此相同或不同?！癆AV末端重復(fù)序列”或“AAVTR”可來(lái)自任何AAV，包括但不限于血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11。AAV末端重復(fù)序列不需要具有野生型末端重復(fù)序列序列(如，野生型序列可通過(guò)插入、缺失、截短或錯(cuò)義突變而被改變)，只要該末端重復(fù)序列介導(dǎo)所需的功能，如復(fù)制、病毒包裝、整合、和/或原病毒拯救和類似功能。術(shù)語(yǔ)“末端重復(fù)序列”或“TR”包括形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)并充當(dāng)反向末端重復(fù)序列的任何病毒末端重復(fù)序列和合成序列，諸如授予Samulski等人的美國(guó)專利第5，478，745號(hào)中描述的“雙-D序列”。自主細(xì)小病毒和AAV的衣殼結(jié)構(gòu)更詳細(xì)地描述于BERNARDN.FIELDS等人，VIROLOGY(病毒學(xué))，第2卷，第69&70章(第4版，Lippincott-RavenPublishers)。另參見(jiàn)對(duì)以下的晶體結(jié)構(gòu)的描述:AAV2(Xie等人，(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.9910405-10)、AAV4(Padron等人、(2005)JVirol.79:5047_58),AAV5(Walters等人、(2004)JVirol.783361-71)和CPV(Xie等人，(1996)JMol.Biol.6:497_520和Tsao等人、(1991)Science251:1456-64)?！癆AV小基因”指至少包含AAVITR和異源核酸組合物的構(gòu)建體。對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的rAAV產(chǎn)生，小基因可被攜帶在任何適合的載體包括病毒載體、質(zhì)粒載體和類似載體上。本發(fā)明的病毒載體還可以是如國(guó)際專利公布WO0CV28004和Chao等人，(2000)MolecularTherapy2619中所述的“靶向”病毒載體(如，具有定向的趨向性)和/或“雜種”細(xì)小病毒(即，其中rAAV基因組和病毒衣殼來(lái)自不同的細(xì)小病毒)。本發(fā)明的病毒載體還可以是如國(guó)際專利申請(qǐng)公布第WO01/92551號(hào)中所述的雙鏈體細(xì)小病毒顆粒。因此，在一些實(shí)施方案中，可將雙鏈(雙鏈體)基因組包裝到本發(fā)明的病毒衣殼中。此外，病毒衣殼或基因組可含有其它修飾，包括插入、缺失和/或置換。因此，如本文所用，術(shù)語(yǔ)“病毒載體”涵蓋細(xì)小病毒和AAV的雜種、靶向和雙鏈體病毒顆粒，以及其他修飾形式。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“脊椎動(dòng)物”涵蓋哺乳動(dòng)物、禽類物種、魚或爬行動(dòng)物。例如，脊椎動(dòng)物可以是哺乳動(dòng)物。術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物”包括人類和非人靈長(zhǎng)類、農(nóng)畜類動(dòng)物(如綿羊、牛、山羊、豬、驢、馬)、實(shí)驗(yàn)室測(cè)試動(dòng)物(如大鼠、小鼠、兔、豚鼠、倉(cāng)鼠)、伴侶動(dòng)物(如狗、貓)或捕獲的野生動(dòng)物。哺乳動(dòng)物包括但不限于、人類和鼠科哺乳動(dòng)物。本發(fā)明部分是基于應(yīng)用促進(jìn)經(jīng)由RNAi的基因沉默的試劑下調(diào)或沉默一種或多種轉(zhuǎn)錄活性基因區(qū)域作為治療心力衰竭的方法，所述轉(zhuǎn)錄活性基因區(qū)域與心臟細(xì)胞中的鈣流量調(diào)節(jié)直接或間接相關(guān)。在一種實(shí)施方案中，公開(kāi)了治療心力衰竭的方法，包括向有相應(yīng)需要的受治療者施用治療有效量的RNAi表達(dá)盒，其中所述盒包括病毒體載體和其表達(dá)產(chǎn)物降低受磷蛋白(PLB)mRNA的表達(dá)的RNAi序列，所述施用以有效轉(zhuǎn)導(dǎo)所述受治療者的心肌細(xì)胞的量進(jìn)行，由此造成所述RNAi表達(dá)盒的表達(dá)并治療所述受治療者中的心力衰竭。術(shù)語(yǔ)“RNA干擾”通常指雙鏈RNA分子改變與雙鏈或短發(fā)夾分子具有大致的或完全的同源性的核酸序列的表達(dá)的過(guò)程。雖然不受理論束縛，作用的機(jī)制可包括但不限于，PLB基因的表達(dá)的直接或間接下調(diào)，PLBmRNA的減少，和/或PLB活性的降低。術(shù)語(yǔ)“RNAi”指引發(fā)RNA干擾并從載體轉(zhuǎn)錄的RNA序列。術(shù)語(yǔ)“短發(fā)夾RNA”或“shRNA”指具有雙鏈體區(qū)域和環(huán)狀區(qū)域的RNA結(jié)構(gòu)。該術(shù)語(yǔ)還應(yīng)被理解為特別包括具有莖-環(huán)或鍋柄樣二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA分子。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，RNAi最初被表達(dá)為shRNA。術(shù)語(yǔ)“RNAi表達(dá)盒”指根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案具有至少一個(gè)[啟動(dòng)子-RNAi-終止子]單元的盒。術(shù)語(yǔ)“多啟動(dòng)子RNAi表達(dá)盒”指包含兩個(gè)或多個(gè)[啟動(dòng)子-RNAi-終止子]單元的RNAi表達(dá)盒。術(shù)語(yǔ)“RNAi表達(dá)構(gòu)建體”或“RNAi表達(dá)載體”指含有至少一個(gè)RNAi表達(dá)盒的載體。RNAi通常通過(guò)靶和RNAi之間的相同序列優(yōu)化。RNA干擾現(xiàn)象可在低于100%同源性下觀察到，但是互補(bǔ)區(qū)域必須彼此足夠同源以形成特異性雙鏈區(qū)域。尚未完全鑒定得到有效造成RNA干擾的雙鏈區(qū)域的精確結(jié)構(gòu)規(guī)則，但是大約70%的同一性通常是足夠的。因此，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，RNAi和PLB之間的同源性是至少70%核苷酸序列同一性，并且可以是至少75%核苷酸序列同一性。同源性包括但不限于，至少80%核苷酸序列同一性，和至少85%或甚至90%核苷酸序列同一性。在一種實(shí)施方案中，靶序列和RNAi的有義鏈之間的序列同源性是至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核苷酸序列同一性。另一考慮因素是RNA中的堿基配對(duì)與DNA中的略有不同，即在RNA雙鏈體中G將與U配對(duì)，雖然不如與C的強(qiáng)烈。而且，對(duì)于RNAi效力，反義鏈與靶序列同源更為重要。在一些情況中，已知21個(gè)核苷酸中有17個(gè)同源足以啟動(dòng)RNAi，但在其他情況中，需要21個(gè)核苷酸中有19或20個(gè)核苷酸具有同一性。雖然不受理論束縛，在通常的水平，雙鏈區(qū)域的中央部分比其末端需要更大同源性。在僅尋求一定程度的沉默的情況中，可向特定構(gòu)建體中設(shè)計(jì)入完美同源性的某種預(yù)定程度的缺乏，以降低其RNAi活性，這將造成靶基因產(chǎn)物的部分沉默或抑制。在此類情形中，反義序列中僅有一個(gè)或兩個(gè)堿基可被改變。另一方面，有義鏈對(duì)突變更具耐受性。雖然不受理論束縛，這可能是因?yàn)榉戳x鏈?zhǔn)蔷哂写呋钚缘哪莻€(gè)。因此，有義鏈和靶基因的區(qū)域的轉(zhuǎn)錄物之間較低的同一性未必會(huì)降低RNAi活性，特別是當(dāng)反義鏈與該轉(zhuǎn)錄物完美雜交時(shí)。有義鏈中的突變(從而使它與靶基因的區(qū)域的轉(zhuǎn)錄物不同)可用于輔助發(fā)夾構(gòu)建體的測(cè)序并可能用于其它目的，諸如調(diào)節(jié)發(fā)夾轉(zhuǎn)錄物的切酶(dicer)加工或RNAi途徑的其他方面。術(shù)語(yǔ)“雜交”和“退火”，包括其語(yǔ)法等同物，在本說(shuō)明書中涉及核苷酸序列時(shí)可互換使用，并指由于其互補(bǔ)性而能夠形成Watson-Crick堿基對(duì)的核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，非Watson-Crick堿基配對(duì)也是可能的，尤其是在RNA序列環(huán)境中。例如，在RNA中的鳥(niǎo)嘌呤核苷和尿嘧啶殘基之間可形成所謂的“擺動(dòng)配對(duì)”。RNAi表達(dá)盒的RNA表達(dá)產(chǎn)物導(dǎo)致雙鏈RNA(dsRNA)復(fù)合體的產(chǎn)生以誘導(dǎo)RNA干擾并由此下調(diào)或降低哺乳動(dòng)物基因的表達(dá)?！癲sRNA”指包含兩條Watson-Crick堿基配對(duì)的互補(bǔ)RNA鏈的核糖核酸復(fù)合體。dsRNA復(fù)合體包含在嚴(yán)格條件下，包括在65°C的0.2xSSC清洗步驟，與至少一個(gè)哺乳動(dòng)物基因的核苷酸序列雜交的第一核苷酸序列和與所述第一核苷酸序列互補(bǔ)的第二核苷酸序列。所述第一核苷酸序列可通過(guò)第三核苷酸序列(如RNA環(huán))與所述第二核苷酸序列連接，從而使所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列成為同一RNA分子的部分；可選地，第一核苷酸序列可以是一個(gè)RNA分子的部分，而第二核苷酸序列可以是另一RNA分子的部分。因此，dsRNA復(fù)合體可通過(guò)分子內(nèi)雜交或退火形成，或者dsRNA復(fù)合體通過(guò)分子間雜交或退火形成?！盎パa(bǔ)”在本文以其通用方式使用以指Watson-Crick堿基配對(duì)，而“非互補(bǔ)”用于指非Watson-Crick堿基配對(duì)，即使此類非互補(bǔ)序列可形成擺動(dòng)配對(duì)或其他相互作用。然而，在本發(fā)明的上下文中，“非配對(duì)”序列的含義具體地指其間不形成Watson-Crick堿基對(duì)的序列。因此，根據(jù)本發(fā)明的間隔或鼓泡(bubble)序列的實(shí)施方案在本文被描述和闡明為非配對(duì)序列，無(wú)論理論上或?qū)嶋H上是否可發(fā)生Watson-Crick堿基配對(duì)。用于描述兩個(gè)或多個(gè)多核苷酸之間的序列關(guān)系的術(shù)語(yǔ)包括“參考序列”、“比較窗”、“序列相似性”、“序列同一性”、“序列相似性百分比”、“序列同一性百分比”、“大致相似的”和“大致同一性”?！皡⒖夹蛄小遍L(zhǎng)度為至少10個(gè)但常常15至25個(gè)、經(jīng)常大于25或以上諸如30個(gè)單體單元，包括核苷酸。因?yàn)閮蓚€(gè)多核苷酸可各自包含(1)在所述兩個(gè)多核苷酸之間相似的序列(即，僅為完整多核苷酸序列的一部分)和(2)在所述兩個(gè)多核苷酸之間差異的序列，所以兩個(gè)(或多個(gè))多核苷酸之間的序列比較通常通過(guò)在“比較窗”比較兩個(gè)多核苷酸以鑒定和比較序列相似性的局部區(qū)域來(lái)進(jìn)行?！氨容^窗”指與參考序列進(jìn)行比較通常至少約10連續(xù)殘基的概念區(qū)段。與參考序列(其不包含添加或缺失)相比，比較窗可包含約20%或更少的添加或缺失(S卩，缺口)以最優(yōu)地比較兩個(gè)序列。用于對(duì)比較窗進(jìn)行比對(duì)的序列的最優(yōu)比對(duì)可通過(guò)算法的計(jì)算機(jī)化實(shí)現(xiàn)來(lái)實(shí)施(如，WisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA禾口TFASTA，GeneticsComputerGroup,575ScienceDriveMadison,Wis，USA)或通過(guò)目測(cè)和由選擇的多種算法中的任何算法產(chǎn)生的最佳比對(duì)(即，在比較窗上產(chǎn)生最高同源性百分比)來(lái)實(shí)施。也可參考BLAST程序家族，如，例如由Altschul等人所公開(kāi)的。序列分析的詳細(xì)討論可在Ausubel等人的單元19.3中找到。例如，“序列同一性百分比”可通過(guò)以下來(lái)計(jì)算在比較窗上比較兩個(gè)最優(yōu)比對(duì)的序列，確定兩個(gè)序列中出現(xiàn)相同核酸堿基(如，A、T、C、G、I)的位置的數(shù)目以產(chǎn)生匹配位置數(shù)，將匹配位置數(shù)除以比較窗中的位置總數(shù)(即，窗尺寸)，將結(jié)果乘以100以產(chǎn)生序列同一性百分比。對(duì)于本發(fā)明目的，“序列同一性”將被理解為意指通過(guò)DNASIS計(jì)算機(jī)禾呈序(用于windows的版本2.5；可獲自HitachiSoftwareengineeringCo,Ltd,SouthSanFrancisco,Calif,USA)，使用軟件隨附的參考手冊(cè)中使用的標(biāo)準(zhǔn)默認(rèn)值計(jì)算的“匹配百分比”?？蛇x地，多核苷酸的同源性/同一性可通過(guò)雜交實(shí)驗(yàn)確定。如本文所用，認(rèn)為第一核酸序列或片段(諸如例如，引物或探針)與第二核酸序列選擇性雜交，因此，如果在以下條件下，此第二序列能夠與所述第一序列或變體特異性雜交或能夠特異性引發(fā)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，即表明“大致同源性”(i)在典型的雜交和清洗條件下，諸如，例如在Maniatis，(MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，第2版，1989)中描述的那些，其中雜交條件可以是具有更低嚴(yán)格性或更高嚴(yán)格性的那些；或(ii)使用允許至多約25-30%堿基對(duì)錯(cuò)配的嚴(yán)格清洗條件，例如，在2xSSC、0.1%SDS、室溫下清洗兩次，每次30分鐘；然后，在2xSSC、0.1%SDS、37°C下清洗一次30分鐘；在2xSSC、室溫下清洗兩次，每次10分鐘，或(iii)在標(biāo)準(zhǔn)PCR條件下或在“降落(touch-down)”PCR條件下。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“雜交條件”將指允許廣義地核酸的兩條互補(bǔ)鏈之間和特別地具有至少七個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的RNA的兩條互補(bǔ)鏈之間雜交的條件。雜交條件是本領(lǐng)域公知的，包括但不限于，生理?xiàng)l件，諸如但不限于胞內(nèi)生理?xiàng)l件。本發(fā)明的RNAi可包含在正常的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中無(wú)毒的短的、雙鏈或部分雙鏈(如，鍋柄、莖-環(huán)和發(fā)夾)RNA。對(duì)本發(fā)明的RNAi的長(zhǎng)度沒(méi)有特別限制，只要它們不顯示細(xì)胞毒性。RNAi可以是，例如，約10至71bp長(zhǎng)、約15至49bp長(zhǎng)、約15至35bp長(zhǎng)和約19至29bp長(zhǎng)或約19至21bp長(zhǎng)。RNAi的雙鏈RNA部分可以是完全同源的，或可由于序列錯(cuò)配(每條鏈上的對(duì)應(yīng)核苷酸不互補(bǔ))、凸出(一條鏈上缺乏對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)核苷酸)和類似原因而含有非配對(duì)的部分。在非配對(duì)的部分不顯著干擾RNAi雙鏈體形成或效力的程度，此類非配對(duì)的部分可被耐受?！皊iRNA”或短干擾RNA可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法諸如通過(guò)典型的寡核苷酸合成來(lái)制造，并且經(jīng)常包括化學(xué)修飾以增加siRNA的半衰期和/或效力、和/或以允許更強(qiáng)的遞送制劑。寡核苷酸的許多修飾是本領(lǐng)域已知的。例如，美國(guó)專利第6，620，805號(hào)公開(kāi)了與具有凈正電荷的大環(huán)諸如卟啉化合的寡核苷酸；美國(guó)專利第6，673，611號(hào)公開(kāi)了各種式；美國(guó)專利申請(qǐng)公布第2004/0171570、2004/0171032和2004/0171031號(hào)公開(kāi)包括包含多環(huán)糖代用品的修飾的寡聚體；諸如環(huán)丁基核苷、環(huán)戊基核苷、脯氨酸核苷、環(huán)己烯核苷、己糖核苷或環(huán)己烷核苷；和包括不含磷的核苷間連接的寡聚體；美國(guó)專利申請(qǐng)公布第2004/0171579號(hào)公開(kāi)了其中修飾為糖部分上的2’組成基團(tuán)不是H或OH的修飾寡核苷酸；美國(guó)專利申請(qǐng)公布第2004/0171030號(hào)公開(kāi)了用于結(jié)合相反鏈上的胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶堿基的修飾堿基，該相反鏈包含具有選自由以下組成的組的含硼取代基的膨化的C和U或T修飾的結(jié)合堿基-BH2CN、-BH3和-BH2COOR,其中R是Cl至C18烷基；美國(guó)專利申請(qǐng)公布第2004/0161844號(hào)公開(kāi)了具有氨基磷酸酯核苷間連接諸如3‘氨基氨基磷酸酯、氨基烷基氨基磷酸酯或氨基烷基硫代氨基磷酸酯核苷間連接的寡核苷酸；美國(guó)專利申請(qǐng)公布第2004/0161844號(hào)公開(kāi)了其它修飾的糖和/或主鏈修飾，其中在一些實(shí)施方案中，所述修飾是肽核酸、肽核酸模擬物、嗎啉代核酸、具有酰胺連接的己糖、環(huán)己烯基核酸(CeNA)或無(wú)環(huán)主鏈部分；美國(guó)專利申請(qǐng)公布第2004/0161777號(hào)公開(kāi)了具有3'末端帽基團(tuán)的寡核苷酸；美國(guó)專利申請(qǐng)公布第2004/0147470號(hào)公開(kāi)了包括一種或多種交聯(lián)的寡聚化合物，所述交聯(lián)改善所述寡聚化合物的核酸酶抗性，或者修改或增強(qiáng)所述寡聚化合物的藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和藥效學(xué)性質(zhì)，其中此類交聯(lián)包含二硫化物、酰胺、胺、肟、羥基胺、氧亞胺(oxyimine)、嗎啉代、硫醚、脲、硫脲或磺酰胺部分；美國(guó)專利申請(qǐng)公布第2004/0147023號(hào)公開(kāi)了包含具有第一類型的核苷酸的兩個(gè)末端RNA區(qū)段和具有第二類型的核苷酸的內(nèi)部RNA區(qū)段的gapmer，其中所述第一類型的核苷酸獨(dú)立地包括至少一個(gè)糖取代基，其中所述糖取代基包含鹵素、氨基、三氟烷基、三氟烷氧基、疊氮基、氨基氧、烷基、烯基、炔基、0—、S-或NOO-烷基；0—、S—或N(R*)-烯基；0—、S—或N(R*)-炔基；0—、S—或N-芳基、0—、S—或N(R*)-芳烷基基團(tuán)；其中所述烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基可以是取代的或未取代的烷基、烯基、炔基、芳烷基；并且其中，如果取代，所述取代是烷氧基、硫代烷氧基、酞酰亞胺基、商素、氨基、酮、羧基、硝基、亞硝基、氰基、三氟甲基、三氟甲氧基、咪唑基、疊氮基、胼基、氨基氧、異氰酸基、亞砜、砜、二硫化物、甲硅烷基、雜環(huán)或碳環(huán)基團(tuán)或嵌入劑、報(bào)告基團(tuán)、軛合物、聚胺、聚酰胺、聚亞烷基二醇或式(一O-烷基)m的聚醚，其中m是1至約10；和R*是氫、或保護(hù)基團(tuán)；或美國(guó)專利申請(qǐng)公布第2004/0147022號(hào)公開(kāi)了具有修飾的糖和/或主鏈修飾的寡核苷酸，諸如糖部分上的2'_0013取代基因此，在一方面，本發(fā)明公開(kāi)了用于治療心力衰竭的方法，包括向有相應(yīng)需要的受治療者施用治療有效量的RNAi表達(dá)盒，其中所述盒包括病毒體載體和其表達(dá)產(chǎn)物降低受磷蛋白(PLB)mRNA的表達(dá)的RNAi序列，所述施用以有效轉(zhuǎn)導(dǎo)所述受治療者的心肌細(xì)胞的量進(jìn)行，由此造成所述RNAi表達(dá)盒的表達(dá)并治療所述受治療者中的心力衰竭?！皢?dòng)子”或“啟動(dòng)子序列”在本文取其最廣泛背景下的含義，并包括能夠在細(xì)胞中結(jié)合RNA聚合酶和啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄多核苷酸或多肽編碼序列的DNA調(diào)節(jié)區(qū)域，所述編碼序列諸如信使RNA、核糖體RNA、小核核仁RNA(smallnuclearofnucleolarRNA)或由任何RNA聚合酶的任何類型轉(zhuǎn)錄的任何種類的RNA。本文預(yù)期的“啟動(dòng)子”還可包括經(jīng)典基因組基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，包括真核細(xì)胞中精確的轉(zhuǎn)錄起始所需的TATA框，含或不含CCAAT框序列和其它的調(diào)節(jié)元件(即，上游激活序列、增強(qiáng)子和沉默子)。啟動(dòng)子通常，但不是必須地，位于其所調(diào)節(jié)的序列的上游或5‘。而且，包含啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)元件通常位于要被調(diào)節(jié)的序列的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的2kb以內(nèi)。在本發(fā)明背景中，術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”還用于描述賦予、激活或增強(qiáng)分離的核酸分子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)的合成或融合分子或衍生物。還可需要另一或同一啟動(dòng)子以在植物、動(dòng)物、昆蟲(chóng)、真菌、酵母或細(xì)菌細(xì)胞中行使功能。啟動(dòng)子可含有進(jìn)一步增強(qiáng)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)的一種或多種特異性調(diào)節(jié)元件的另外拷貝，其轉(zhuǎn)而調(diào)節(jié)和/或改變基因的空間表達(dá)和/或時(shí)間表達(dá)。例如，賦予結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)的可誘導(dǎo)性的調(diào)節(jié)元件可被置于與驅(qū)動(dòng)核酸分子的表達(dá)的異源啟動(dòng)子序列相鄰。將序列置于啟動(dòng)子序列的調(diào)節(jié)控制下意指放置所述分子以使得表達(dá)受到啟動(dòng)子序列的控制。啟動(dòng)子通常被放置在它們控制的基因的5'(上游)。在構(gòu)建異源啟動(dòng)子/結(jié)構(gòu)基因組合中，通常啟動(dòng)子位置距基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的距離可以與啟動(dòng)子和它在其天然背景下控制的基因，即啟動(dòng)子衍生自的基因，之間的距離大約相同。如本領(lǐng)域已知的，可調(diào)整此距離的一些變化而不喪失啟動(dòng)子功能。相似地，調(diào)節(jié)序列元件相對(duì)于置于其控制下的異源基因的位置由該元件在其天然背景，即其所衍生自的基因的位置確定。同樣，如本領(lǐng)域已知的，此距離也可發(fā)生一些變化。啟動(dòng)子可組成地調(diào)節(jié)序列的表達(dá)，或就表達(dá)發(fā)生的細(xì)胞、組織或器官而言差異地調(diào)節(jié)序列的表達(dá)，或就表達(dá)發(fā)生的發(fā)育階段而言差異地調(diào)節(jié)序列的表達(dá)，或響應(yīng)于諸如生理應(yīng)激、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、激素、病原體或金屬離子以及其它的刺激而差異地調(diào)節(jié)序列的表達(dá)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中有用的啟動(dòng)子可以是組織特異性的或細(xì)胞特異性的。術(shù)語(yǔ)“組織特異性”在應(yīng)用于啟動(dòng)子時(shí)指能夠指導(dǎo)感興趣的核苷酸序列在特定類型的組織(如，肌肉組織)中的選擇性表達(dá)，而相對(duì)不存在感興趣的相同核苷酸序列在不同類型的組織(如，心臟)中的表達(dá)的啟動(dòng)子。術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞特異性”在應(yīng)用于啟動(dòng)子時(shí)指能夠指導(dǎo)感興趣的核苷酸序列在特定類型的細(xì)胞中的選擇性表達(dá)，而相對(duì)不存在感興趣的相同核苷酸序列在相同組織的不同類型的細(xì)胞中的表達(dá)的啟動(dòng)子(參見(jiàn)，如Higashibata等人，J.BoneMiner.Res.19(1):78_88，2004;Hoggatt等人，Circ.Res.91(12):1151_59，2002;Sohal等人，Circ.Res.89(1):20_25，2001；和Zhang等人，GenomeRes.14(1):79_89、2004)。術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞特異性”在應(yīng)用于啟動(dòng)子時(shí)還意指啟動(dòng)子能夠促進(jìn)感興趣的核苷酸序列在單個(gè)組織內(nèi)的區(qū)域中的選擇性表達(dá)。可選地，啟動(dòng)子可以是組成型的或可調(diào)節(jié)的。另外，啟動(dòng)子可被修改以便擁有不同的特異性。術(shù)語(yǔ)“組成型”在用于提及啟動(dòng)子時(shí)意指啟動(dòng)子能夠在不存在特異刺激(如，熱激、化學(xué)物、光和類似刺激)下指導(dǎo)可操作地連接的核酸序列的轉(zhuǎn)錄。通常，組成型啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)編碼序列在幾乎任何細(xì)胞和任何組織中的表達(dá)。用于轉(zhuǎn)錄RNAi的啟動(dòng)子可以是組成型啟動(dòng)子，諸如RNA聚合酶II控制的泛素、CMV、β-肌動(dòng)蛋白、組蛋白H4、EF-Iα或Pgk基因啟動(dòng)子，或RNA聚合酶I控制的啟動(dòng)子元件。在其它實(shí)施方案中，采用PolII啟動(dòng)子，諸如CMV、SV40、U1、β-肌動(dòng)蛋白或雜種PolII啟動(dòng)子。在其它實(shí)施方案中，使用RNA聚合酶III控制的啟動(dòng)子元件，諸如U6啟動(dòng)子(如，U6-l、TO-8、U6-9)、H1啟動(dòng)子、7SL啟動(dòng)子、人類Y啟動(dòng)子(hYl、hY3、hY4(參見(jiàn)Maraia等人，NucleicAcidsRes22(15):3045_52，1994)和hY5(參見(jiàn)Maraia等人，NucleicAcidsRes24(18)3552-59，1994)、人類MRP-7-2啟動(dòng)子、腺病毒VAl啟動(dòng)子、人類tRNA啟動(dòng)子、5s核糖體RNA啟動(dòng)子以及這些啟動(dòng)子中任何啟動(dòng)子的功能雜種和組合。可選地，在一些實(shí)施方案中，選擇允許RNAi的可誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子可能是最優(yōu)的。使用此類啟動(dòng)子的可誘導(dǎo)表達(dá)的許多系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于四環(huán)素響應(yīng)系統(tǒng)和Iac操縱子-阻遏物系統(tǒng)(參見(jiàn)W003/022052Al；和US2002/0162126Al)、蛻化素調(diào)節(jié)系統(tǒng)或受糖皮質(zhì)激素、孕酮、雌激素、RU-486、類固醇、甲狀腺激素、環(huán)式AMP、細(xì)胞因子、鈣化醇家族調(diào)節(jié)物調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子或金屬硫蛋白啟動(dòng)子(受無(wú)機(jī)金屬調(diào)節(jié))。一種或多種增強(qiáng)子也可存在于病毒多啟動(dòng)子RNAi表達(dá)構(gòu)建體以增加感興趣的基因的表達(dá)。適合用于本發(fā)明的實(shí)施方案的增強(qiáng)子包括ApoEHCR增強(qiáng)子、最近已描述的CMV增強(qiáng)子(參見(jiàn)，Xia等人，NucleicAcidsRes31-17，2003)和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他增強(qiáng)子。在本發(fā)明中，啟動(dòng)子可以能夠調(diào)節(jié)核酸分子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)，至少在靶基因在其中表達(dá)期間，以及在靶基因在所述細(xì)胞中的可檢測(cè)的表達(dá)即將開(kāi)始之前。啟動(dòng)子可以是組成型的、誘導(dǎo)型的或發(fā)育調(diào)節(jié)的。在本發(fā)明上下文中，術(shù)語(yǔ)“與…可操作地連接”或“可操作地處于…的控制下”或相似的諸如“可操作地連接于”將被視為表明細(xì)胞中結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)處于與其空間連接的啟動(dòng)子序列的控制下。在一些實(shí)施方案中，可在RNAi表達(dá)盒內(nèi)或包含多個(gè)RNAi表達(dá)盒的RNAi表達(dá)載體的不同盒之間采用不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子。例如，使用兩個(gè)或更多個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子(諸如PolIII-型啟動(dòng)子)可通過(guò)，如耗盡可利用的核苷酸庫(kù)或轉(zhuǎn)錄所需的其它細(xì)胞組分，而使細(xì)胞承受重負(fù)。此外或可選地，使用數(shù)個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子可造成細(xì)胞中毒性水平的RNAi表達(dá)。因此，在一些實(shí)施方案中，多啟動(dòng)子RNAi表達(dá)盒中的一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子可以比盒中的其它啟動(dòng)子更弱，或盒中的所有啟動(dòng)子可以低于最大速率的速率表達(dá)RNAi。啟動(dòng)子還可以或可以不使用分子技術(shù)或以其他方式如通過(guò)調(diào)節(jié)元件進(jìn)行修改以實(shí)現(xiàn)較弱的轉(zhuǎn)錄水平。載體還可含有其它的基因元件。載體中可包括的元件的類型不受任何形式的限制，并可由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇。例如，其他基因元件可包括報(bào)告基因，諸如一個(gè)或多個(gè)以下基因熒光標(biāo)記蛋白諸如GFP或RFP；容易測(cè)定的酶諸如β-半乳糖苷酶、螢光素酶、β-葡糖醛酸酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶或分泌的胚胎堿性磷酸酶；或易于進(jìn)行免疫測(cè)定的蛋白質(zhì)諸如激素或細(xì)胞因子?？捎糜诒景l(fā)明的實(shí)施方案的其它基因元件包括編碼賦予細(xì)胞選擇性生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的蛋白質(zhì)諸如腺苷脫氨酶、氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶、二氫葉酸還原酶、潮霉素-B-磷酸轉(zhuǎn)移酶、藥物抗性的那些基因，或編碼提供營(yíng)養(yǎng)缺陷型中缺失的生物合成能力的蛋白質(zhì)的那些基因。如果RNAi表達(dá)盒中包括了報(bào)告基因，則可包括內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)序列。其它的基因元件可與獨(dú)立的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子可操作地連接并受其控制。此夕卜，可采用用于在細(xì)菌中繁殖載體的合適的復(fù)制起點(diǎn)。復(fù)制起點(diǎn)的序列通常與RNAi和將在靶細(xì)胞、組織和/或器官中表達(dá)的其它基因序列隔開(kāi)。此類復(fù)制起點(diǎn)是本領(lǐng)域已知的，并包括pUC、ColEl、2-微米或SV40復(fù)制起點(diǎn)。本文描述的載體或其部分還可進(jìn)行修改以整合到表達(dá)其的細(xì)胞的基因組。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，為了實(shí)現(xiàn)基因序列或表達(dá)盒與宿主細(xì)胞基因組的整合，可能需要某些其它的基因序列。在一種實(shí)施方案中，所述載體的效應(yīng)是降低PLB的功能表達(dá)而不顯著降低PLB的轉(zhuǎn)錄水平?？蛇x地或此外，包括合成基因的基因構(gòu)建體不造成總RNA的穩(wěn)態(tài)水平的顯著下降。因此，在另一方面，本發(fā)明包括以下RNAi表達(dá)載體，其中所述RNAi表達(dá)載體包含如本文所定義的一個(gè)或多個(gè)RNAi表達(dá)盒。本發(fā)明的RNAi造成或以其它方式促進(jìn)靶轉(zhuǎn)錄物翻譯成表達(dá)產(chǎn)物的改變的翻譯能力。雖然表達(dá)產(chǎn)物通常是蛋白質(zhì)，但是本發(fā)明進(jìn)一步包括參與基因調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄的非編碼RNA、eRNA或從轉(zhuǎn)錄物中剪接下來(lái)的內(nèi)含子形式的表達(dá)產(chǎn)物?！案淖兊哪芰Α钡暮x包括但不限于相對(duì)于未進(jìn)行遺傳修飾的細(xì)胞的翻譯水平的下降，諸如約10%至約100%和約20%至約90%。在一種實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于靶內(nèi)源序列的基因基本上沒(méi)有被翻譯為蛋白質(zhì)產(chǎn)物。方便地，改變的翻譯能力通過(guò)表型的任何變化確定，其中在未進(jìn)行遺傳修飾的細(xì)胞中，所述表型由編碼PLB的基因的表達(dá)促成。攜帶本發(fā)明的遺傳因子的任何細(xì)胞被稱為是“遺傳修飾的”。遺傳修飾可以是永久的或瞬時(shí)的。瞬時(shí)的遺傳修飾發(fā)生于，例如，當(dāng)細(xì)胞攝取遺傳因子并允許產(chǎn)生其轉(zhuǎn)錄物時(shí)。可選地，該遺傳因子直接降低翻譯的水平，諸如通過(guò)施用反義寡核苷酸或更大的核酸分子。在任一種情況下，該分子促進(jìn)基因沉默機(jī)制，該機(jī)制可隨著細(xì)胞分裂被移除。永久的基因沉默更可能發(fā)生于當(dāng)該遺傳因子整合到細(xì)胞的基因組并且該因子被傳遞給子代細(xì)胞時(shí)?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)方法將RNAi或RNAi表達(dá)構(gòu)建體施用至細(xì)胞、組織或器官，目的是調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。施用的有用方法包括脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化、用減毒的病毒顆?；蚣?xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化細(xì)胞、細(xì)胞接合、本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或由Ausubel等人(1992)描述的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染程序。例如，核酸分子可以作為裸DNA或RNA、任選地封裝在脂質(zhì)體中、在作為減毒病毒的病毒顆粒中或以與病毒外殼或運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)或惰性載運(yùn)體諸如金締合的形式或作為重組的病毒載體或細(xì)菌載體或作為構(gòu)建體、以及其它形式引入。在一種實(shí)施方案中，可使用基于任何合適的病毒的病毒遞送系統(tǒng)來(lái)遞送本發(fā)明的RNAi表達(dá)構(gòu)建體。此外，雜種病毒系統(tǒng)也可能是有用的。病毒遞送系統(tǒng)的選擇將取決于多種參數(shù)，諸如遞送至心肌細(xì)胞或其它靶組織的效率、系統(tǒng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、致病能力、免疫和毒性考慮因素和類似參數(shù)。顯然不存在適于所有應(yīng)用的單一病毒系統(tǒng)。當(dāng)選擇用于本發(fā)明的病毒遞送系統(tǒng)時(shí)，重要的是選擇其中含有RNAi表達(dá)構(gòu)建體的病毒顆粒具有以下性質(zhì)的系統(tǒng)1)重復(fù)和穩(wěn)定地繁殖；2)能夠純化至高滴度；和3)能夠介導(dǎo)靶向遞送(將多啟動(dòng)子RNAi表達(dá)構(gòu)建體遞送至靶組織(如，心肌細(xì)胞)而不廣泛傳染)。此外，可使用雜種病毒系統(tǒng)以組合兩種或更多種病毒系統(tǒng)的有用性質(zhì)。例如，野生型AAV的位點(diǎn)特異性整合機(jī)制可與腺病毒的有效內(nèi)化和核靶向性質(zhì)偶聯(lián)。AAV在腺病毒或皰疹病毒存在下經(jīng)歷生產(chǎn)復(fù)制周期；然而，在不存在輔助功能時(shí)，AAV基因組整合到染色體19的特異性位點(diǎn)。AAV基因組的整合需要AAVr印蛋白質(zhì)的表達(dá)。因?yàn)槌Ｒ?guī)的rAAV載體缺失了包括r印在內(nèi)的所有基因，所以它們不能特異性地整合到染色體19。但是，在合適的雜種系統(tǒng)中可利用這一特征。另外，可在病毒遞送系統(tǒng)中使用非病毒基因元件以實(shí)現(xiàn)期望的性質(zhì)，諸如允許位點(diǎn)特異性重組的基因元件。將RNAi表達(dá)構(gòu)建體包裝到病毒顆粒中?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任何方法來(lái)產(chǎn)生感染性病毒顆粒，其基因組包含病毒RNAi表達(dá)構(gòu)建體的拷貝。包裝細(xì)胞系可以是能夠表達(dá)病毒蛋白質(zhì)的任何細(xì)胞系，包括但不限于293、HeLa,A549、PerC6、D17、MDCK,BHK、Cf2Th或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知或開(kāi)發(fā)的任何其它系。一種包裝細(xì)胞系描述于，例如美國(guó)專利第6，218，181號(hào)，通過(guò)引用并入本文。可選地，可將未穩(wěn)定表達(dá)必需的病毒蛋白質(zhì)的細(xì)胞系用兩種或更多種構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染以實(shí)現(xiàn)有效的功能顆粒產(chǎn)生。一種構(gòu)建體包含病毒RNAi表達(dá)盒，而其它的質(zhì)粒包含編碼允許細(xì)胞產(chǎn)生功能病毒(復(fù)制和包裝構(gòu)建體)以及其它輔助功能的蛋白質(zhì)的核酸。包裝細(xì)胞系或復(fù)制和包裝構(gòu)建體可不表達(dá)包膜基因產(chǎn)物。在這樣的實(shí)施方案中，編碼包膜基因的基因可在與病毒RNAi表達(dá)構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染的單獨(dú)的構(gòu)建體上提供。因?yàn)榘さ鞍踪|(zhì)部分負(fù)責(zé)病毒顆粒的宿主范圍，病毒可以被假分型?！凹俜中偷摹辈《臼蔷哂衼?lái)自與基因組所衍生自的病毒不同的病毒的包膜蛋白質(zhì)的病毒顆粒。本領(lǐng)域技術(shù)人員可針對(duì)使用的病毒遞送系統(tǒng)和要靶向的細(xì)胞而選擇適當(dāng)?shù)募傩?。除了賦予特異的宿主范圍外，選擇的假型可允許病毒被濃縮至非常高的滴度。可選地，可用將感染限制于特定物種的親嗜性包膜蛋白質(zhì)(如，親嗜性包膜僅允許感染例如鼠細(xì)胞，而雙嗜性包膜允許感染如人類和鼠細(xì)胞兩者)假分型病毒。另外，遺傳修飾的配體可用于細(xì)胞特異性靶向，諸如去唾液酸糖蛋白用于肝細(xì)胞，或轉(zhuǎn)鐵蛋白用于受體介導(dǎo)的結(jié)合在包裝細(xì)胞系中產(chǎn)生之后，純化并定量(滴定)含有RNAi表達(dá)盒的病毒顆粒。純化策略包括但不限于密度梯度離心或柱層析方法。本文公開(kāi)的RNAi或RNAi表達(dá)盒可通過(guò)經(jīng)由但不限于注射或灌注應(yīng)用于心臟而引入到心肌細(xì)胞。在一種實(shí)施方案中，可在體外或活體外將RNAi表達(dá)盒引入靶細(xì)胞，然后接著置于動(dòng)物內(nèi)以實(shí)現(xiàn)治療，或可通過(guò)體內(nèi)施用將RNAi表達(dá)盒直接施用于有機(jī)體、器官或細(xì)胞。通過(guò)病毒感染遞送可以是一種遞送方法。可使用任何方便的方案將包含盒的載體施用于哺乳動(dòng)物宿主，其中許多不同的此類方案是本領(lǐng)域已知的。通過(guò)使AAV載體溶解、懸浮或乳化在適當(dāng)?shù)?、藥學(xué)可接受的載運(yùn)體或稀釋劑中，可將它們配置成用于注射或施用的制品。此類藥學(xué)可接受的載運(yùn)體或稀釋劑的實(shí)例包括含水或不含水的溶劑諸如油、合成的脂肪酸甘油酯、高級(jí)脂肪酸酯或丙二醇；并且，如果需要，含有常規(guī)的添加劑諸如助溶劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。在一種實(shí)施方案中，公開(kāi)了包括重組的腺伴隨病毒(AAV)載體和藥學(xué)可接受的載運(yùn)體的藥物組合物，其中所述載體包括RNAi表達(dá)盒，其RNA表達(dá)產(chǎn)物導(dǎo)致細(xì)胞中受磷蛋白(PLB)mRNA的表達(dá)的下降和PLB蛋白質(zhì)的量的下降，并且其中所述RNAi表達(dá)盒的RNA表達(dá)產(chǎn)物包括在嚴(yán)格條件下與PLB基因mRNA的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。在一方面，RNAi表達(dá)盒包括核苷酸序列5‘GGATCCCGTACCTTACTCGCTCGGCTATTCAAGAGATAGCCGAGCGAGTAAGGTATTTTTTGGAAAAGCTT3'(SEQIDNO:1)。在另一方面，RNA表達(dá)產(chǎn)物包括靴序列5'UACCUUACUCGCUCGGCUA3'(SEQIDNO:2)。在又一方面，本發(fā)明考慮了包括RNAi表達(dá)構(gòu)建體的藥物組合物，其中所述RNAi構(gòu)建體包括各自包含RNAi靶向序列的一種或多種RNAi表達(dá)盒，所述RNAi靶向序列包括與包括PLB或其衍生物、直系同源物或同源物的核苷酸序列的至少部分具有至少70%同一性的核苷酸序列。本發(fā)明的方法和組合物涉及施用有效量的RNAi或RNAi盒以實(shí)現(xiàn)預(yù)定的或期望的基因表達(dá)調(diào)節(jié)結(jié)果。這通常是在表型上測(cè)量的。設(shè)想在一些情況下，一定程度的常規(guī)試驗(yàn)和誤差，如藥學(xué)領(lǐng)域公知的，可能是確定施用的最有效的量所必需的?！斑z傳治療”在本文的含義包括基因治療。本發(fā)明預(yù)期的遺傳治療還包括體細(xì)胞基因治療，由此細(xì)胞被取出、進(jìn)行遺傳修飾然后再放回個(gè)體中?；蛑委熆梢允撬矔r(shí)的或永久的。優(yōu)選地，所述動(dòng)物是人類。在另一方面，本發(fā)明還擴(kuò)展至包含如本文所述的ddRNAi表達(dá)盒或基因組整合形式或其部分的遺傳修飾的細(xì)胞。在一方面，所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在相關(guān)的方面，所述細(xì)胞是靈長(zhǎng)類動(dòng)物細(xì)胞或嚙齒動(dòng)物細(xì)胞，并可包括人類或小鼠細(xì)胞。還公開(kāi)了含有在用于施用的合適藥物懸浮液中的AAV載體的藥物試劑盒。在這一方面，本發(fā)明提供用于遞送所述重組的腺伴隨病毒載體或病毒體的藥物試劑盒。所述試劑盒可含有用于施用預(yù)定劑量的容器。所述試劑盒還可含有用于遞送預(yù)定劑量的含有基因轉(zhuǎn)移載體或病毒體的懸浮液，所述懸浮液包含(a)包含RNAi表達(dá)盒的AAV基因轉(zhuǎn)移載體或病毒體(b)生理學(xué)相容的載運(yùn)體。本發(fā)明還提供編碼能夠形成雙鏈RNA復(fù)合體并因此能夠誘導(dǎo)RNA干擾的RNA分子的RNAi表達(dá)盒。此類RNAi表達(dá)盒可以是作為rAAV基因組的部分的單一DNA分子，該DNA分子在被引入細(xì)胞中時(shí)產(chǎn)生能夠形成分子內(nèi)dsRNA復(fù)合體的單一RNA分子。然而，應(yīng)理解，根據(jù)下列描述，可同時(shí)或順序向細(xì)胞中引入多于一個(gè)rAAV基因組或RNAi表達(dá)盒或RNA編碼區(qū)以產(chǎn)生能夠形成分子內(nèi)dsRNA復(fù)合體的兩個(gè)或更多個(gè)RNA分子。通常，能夠形成無(wú)論是分子內(nèi)或分子間dsRNA復(fù)合體的兩個(gè)RNA部分是其表達(dá)要被下調(diào)或降低的基因或核酸序列的至少部分正義序列和至少部分反義序列。RNAi表達(dá)盒的設(shè)計(jì)不限制本發(fā)明的范圍?？蓱?yīng)用設(shè)計(jì)RNAi表達(dá)盒的不同策略，并且基于不同設(shè)計(jì)的RNAi表達(dá)盒將能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)RNA干擾。所有RNAi表達(dá)盒共同的特征是它們包含編碼能夠通過(guò)形成分子內(nèi)或分子間雙鏈RNA復(fù)合體而單獨(dú)或與另一RNA分子組合來(lái)誘導(dǎo)RNA干擾的RNA分子的RNA編碼區(qū)。可使用不同的設(shè)計(jì)原理來(lái)實(shí)現(xiàn)相同的目標(biāo)，這些設(shè)計(jì)原理是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，RNAi表達(dá)盒可編碼一種或多種RNA分子。在RNA從RNAi表達(dá)盒表達(dá)過(guò)程中或之后，可由單一的、自互補(bǔ)的RNA分子或兩個(gè)互補(bǔ)RNA分子形成雙鏈RNA復(fù)合體。dsRNA復(fù)合體的形成可在細(xì)胞核內(nèi)或細(xì)胞核外啟動(dòng)。在一方面，提供了雙鏈RNA復(fù)合體，其包含能夠在生理?xiàng)l件下與mRNA分子的至少一部分雜交的第一RNA部分，和第二RNA部分，其中所述第二RNA部分的至少一部分能夠在生理?xiàng)l件下與所述第一部分雜交。在一方面，所述第一部分和第二部分是同一RNA分子的部分，并且能夠在生理?xiàng)l件諸如細(xì)胞內(nèi)存在的條件下雜交，雜交后，所述第一部分和第二部分形成雙鏈RNA復(fù)合體。在另一方面，提供形成雙鏈RNA復(fù)合體的線性RNA分子，該RNA包含能夠與細(xì)胞內(nèi)mRNA分子的至少一部分雜交的第一部分，和第二部分，其中所述第二部分的至少一部分能夠與所述第一部分雜交以形成發(fā)夾dsRNA復(fù)合體。在又一方面，所述方法包括具有部分或完全體內(nèi)雙鏈性狀的AAV-介導(dǎo)的RNA的表達(dá)。在某些實(shí)施方案，本發(fā)明可采用含有核酶的RNA分子以產(chǎn)生dsRNA復(fù)合體，由此克服與產(chǎn)生dsRNA相關(guān)的某些已知的困難。例如，可使用核酶功能來(lái)移除聚腺苷酸化信號(hào)，由此阻止或最小化RNA分子從細(xì)胞核的釋放。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明是基于RNA分子的部分編碼增強(qiáng)dsRNA的比活性的RNA或蛋白質(zhì)的能力。RNA分子的此比活性增強(qiáng)部分的一個(gè)實(shí)例是抑制細(xì)胞內(nèi)dsRNA復(fù)合體降解的編碼HIVTat蛋白質(zhì)的分子的部分。本發(fā)明還提供通過(guò)抑制受治療者心臟中的PLB表達(dá)治療受治療者中的心力衰竭、或降低室性心律失常、或增加心力衰竭后的受治療者存活的方法，包括向所述受治療者施用治療有效量的包含rAAV病毒體的藥物組合物，所述rAAV病毒體包含編碼能夠形成dsRNA復(fù)合體的至少一個(gè)RNA分子的一種或多種RNAi表達(dá)盒，其中在雜交條件下，所述dsRNA復(fù)合體的部分能夠與PLB基因編碼的mRNA的至少一部分雜交。在另一實(shí)施方案中，公開(kāi)了增加肌質(zhì)網(wǎng)(SR)的鈣攝取的方法，包括使肌肉組織樣品與腺伴隨病毒(AAV)載體接觸，其中所述載體包括編碼RNAi表達(dá)產(chǎn)物的多核苷酸序列，其中所述RNAi包括在嚴(yán)格條件下與PLB靶基因mRNA的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，由此增加SR中的鈣攝取。對(duì)于本發(fā)明目的，“哺乳動(dòng)物受治療者”意指哺乳動(dòng)物類別的任何成員，包括但不限于人類和非人靈長(zhǎng)類諸如黑猩猩以及其他猿和猴類物種；農(nóng)畜諸如牛、綿羊、動(dòng)物、山羊和馬；家養(yǎng)哺乳動(dòng)物諸如狗和貓；實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物包括嚙齒動(dòng)物諸如小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、兔和豚鼠以及類似動(dòng)物。該術(shù)語(yǔ)不指明具體年齡或性別。因此，成年和新生受治療者以及胎兒，無(wú)論是雄性或雌性，均意欲涵蓋在內(nèi)。對(duì)于本發(fā)明目的，如本文所用的術(shù)語(yǔ)“個(gè)體”或“受治療者”或“患者”指脊椎動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物物種的成員，包括但不限于家養(yǎng)動(dòng)物、體育動(dòng)物(sportsanimal)、靈長(zhǎng)類和人類；更特別地，該術(shù)語(yǔ)指人類。本發(fā)明的病毒體可懸浮在藥學(xué)可接受的遞送運(yùn)載體(即生理相容的載運(yùn)體)中以施用于人類或非人類哺乳動(dòng)物患者。合適的載運(yùn)體可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地選擇，并可取決于選擇的核酸轉(zhuǎn)移載體的性質(zhì)。藥物組合物將包含足夠的遺傳物質(zhì)以產(chǎn)生治療有效量的dsRNA復(fù)合體。藥物組合物還將含有藥學(xué)可接受的賦形劑。此類賦形劑包括自身不誘導(dǎo)對(duì)接受組合物的個(gè)體有害的免疫應(yīng)答并且其施用不造成過(guò)多毒性的任何藥劑。藥學(xué)可接受的賦形劑包括但不限于，液體諸如水、鹽水、甘油和乙醇。其中可包括藥學(xué)可接受的鹽，例如礦物酸鹽諸如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽和類似礦物酸鹽；和有機(jī)酸鹽諸如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、安息香酸鹽和類似有機(jī)酸鹽。另外，此類運(yùn)載體中可存在輔助物質(zhì)，諸如潤(rùn)濕劑或乳化劑、PH緩沖物質(zhì)和類似輔助物質(zhì)。其他示例性載運(yùn)體包括乳糖、蔗糖、磷酸鈣、明膠、葡聚糖、瓊脂、果膠、花生油、芝麻油和水。載運(yùn)體的選擇不是本發(fā)明的限制因素。任選地，本發(fā)明的組合物可在AAV病毒體和運(yùn)載體之外含有其它常規(guī)的藥物成分，諸如防腐劑或化學(xué)穩(wěn)定劑。合適的示例性成分包括微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚山梨酯80、苯乙醇、氯丁醇、山梨酸鉀、山梨酸、二氧化硫、沒(méi)食子酸丙酯、對(duì)羥基苯甲酸酯類、乙基香草醛、甘油、苯酚、對(duì)氯酚、明膠和白蛋白。藥學(xué)可接受的賦形劑的詳盡討論可在REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES(雷明頓藥物科學(xué))(MackPub.Co,NJ.1991)中獲得?？芍亟ǖ倪f送系統(tǒng)的溶液、懸浮液和粉末包括運(yùn)載體，諸如懸浮劑(如樹(shù)膠類、黃原膠類(zanthans)、纖維素類和糖類)、濕潤(rùn)劑(如山梨醇)、助溶劑(如乙醇、水、PEG和丙二醇)、表面活性劑(如硫酸月桂酯鈉、司盤(Spans)、吐溫和十六烷基吡啶)、防腐劑和抗氧化劑(如對(duì)羥基苯甲酸酯類、維生素E和C、以及抗壞血酸)、抗結(jié)塊劑、包衣劑和螯合劑(如EDTA)。在此發(fā)明中，施用本發(fā)明藥物組合物可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法和遞送系統(tǒng)中的任何方法和遞送系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)或執(zhí)行。施用可例如靜脈內(nèi)、口服、經(jīng)由植入物、跨黏膜、經(jīng)皮、肌肉內(nèi)和皮下進(jìn)行。組合物可適于靜脈內(nèi)施用、動(dòng)脈內(nèi)施用、心室內(nèi)施用或心瓣膜灌注。此外，本發(fā)明藥物組合物理想地含有一種或多種常規(guī)使用的藥學(xué)可接受的載運(yùn)體。此類載運(yùn)體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。采用多種常規(guī)使用的載運(yùn)體的下列遞送系統(tǒng)僅是設(shè)想用于施用本發(fā)明組合物的許多實(shí)施方案的代表性實(shí)施方案。可注射藥物遞送系統(tǒng)包括溶液、懸浮液、凝膠、微球和聚合物注射劑(polymericinjectables)，并可包含賦形劑諸如改變?nèi)芙庑詣?如乙醇、丙二醇和蔗糖)和聚合物(如聚己內(nèi)酯(polycaprylactone)和PLGA)?？芍踩胂到y(tǒng)包括棒(rod)和盤(disc)，并可含有賦形劑諸如PLGA和聚己內(nèi)酯。確定本發(fā)明藥物組合物的治療或預(yù)防有效量可基于使用常規(guī)計(jì)算方法的動(dòng)物數(shù)據(jù)進(jìn)行。適當(dāng)?shù)膭┝繉⑷Q于不限于以下的因素選擇的轉(zhuǎn)移載體的特異性，施用路徑，受治療的哺乳動(dòng)物(如人類或非人靈長(zhǎng)類或其它哺乳動(dòng)物)，所治療的受治療者的年齡、體重和一般狀況，治療的疾患的嚴(yán)重度、治療的區(qū)域在心臟內(nèi)的位置和施用模式。因此，適當(dāng)?shù)膭┝靠筛鶕?jù)患者不同而變化。適當(dāng)?shù)挠行Я靠捎杀绢I(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。用于根據(jù)本發(fā)明的所述載體的體內(nèi)遞送的治療有效的人類劑量認(rèn)為是在約20至約50ml鹽水溶液中含有約IOki至IO14功能載體/ml溶液的濃度范圍。將調(diào)整劑量以平衡針對(duì)任何副作用的治療益處。在又一實(shí)施方案中，藥學(xué)有效的AAV劑量通常在約IxlO5至IxlO5ci基因組rAAV、約IO8至IO2tl基因組AAV、約IOltl至約IO16基因組或約IO11至IO16基因組AAV的濃度范圍內(nèi)。人類劑量可以是約IxIO13AAV基因組AAV。此類濃度可在約0.OOlml至100ml、0.05至50ml或10至25ml載運(yùn)體溶液中遞送。其它有效劑量可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過(guò)常規(guī)試驗(yàn)建立劑量響應(yīng)曲線而容易地建立。劑量治療可以是單一劑量方案或多劑量方案。而且，受治療者可接受適當(dāng)?shù)亩鄤┝渴┯?。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定適當(dāng)?shù)膭┝繑?shù)。然而，劑量可能需要調(diào)整以考慮可選的施用路徑、或平衡針對(duì)任何副作用的治療益處。此類劑量可根據(jù)重組載體所用于的治療應(yīng)用而變化。保證轉(zhuǎn)移的核酸組合物的足夠的功能水平，以提供治療益處而無(wú)過(guò)多的不利的效應(yīng)或具有醫(yī)學(xué)可接受的生理效應(yīng)，其可由醫(yī)學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員確定。任選地，在具體實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的AAV-介導(dǎo)的遞送可與通過(guò)其它病毒和非病毒載體的遞送組合。此類其他病毒載體，包括但不限于腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、單純皰疹病毒(HSV)載體和桿狀病毒載體，可以容易地選擇，并可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生。相似地，非病毒載體，包括但不限于脂質(zhì)體、基于脂質(zhì)的載體、多聚物(polyplex)載體、分子軛合物、多胺和聚陽(yáng)離子載體，可以容易地選擇，并可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生。當(dāng)通過(guò)這些可選的路徑施用時(shí)，劑量需要在上述范圍內(nèi)。動(dòng)物(包括人類)擁有針對(duì)具有dsRNA基因組的病原體的天然防御機(jī)制dsRNA在胞質(zhì)溶膠中的存在誘導(dǎo)干擾素相關(guān)途徑的激活，這些途徑抑制RNA干擾。因此，為了避免激活這些途徑，dsRNA復(fù)合體長(zhǎng)度不應(yīng)超過(guò)30堿基對(duì)一設(shè)計(jì)siRNA構(gòu)建體的首要規(guī)則。在某些實(shí)施方案中，dsRNA復(fù)合體的長(zhǎng)度是至少20、21或22堿基對(duì)，如對(duì)應(yīng)于切酶依賴的切割產(chǎn)生的RNA產(chǎn)物的尺寸。下列實(shí)施例意欲說(shuō)明而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例1材料和方法重組的腺病毒載體和AAV載體的開(kāi)發(fā)開(kāi)發(fā)重組的腺伴隨病毒(rAAV)載體，假分型rAAV2.6用于體外研究，而rAAV2.9用于體內(nèi)工作。二者含有相同的AAV2載體基因組以及所示的shRNA表達(dá)盒，并進(jìn)行相同的加工，只是分別使用質(zhì)粒AAV6cap用于rAAV2.6，使用AAV9cap用于rAAV2.9。在所有的體外和體內(nèi)研究中，僅使用自互補(bǔ)的(“二聚的”)rAAV基因組，因?yàn)榕c單鏈(“單體的”)rAAV載體相比它們具有增強(qiáng)的表現(xiàn)。從腺病毒(AdV)載體AdV-shPLB中先前使用的shRNA表達(dá)盒開(kāi)始，該shRNA表達(dá)盒有效和穩(wěn)定地沉默了培養(yǎng)的原代新生大鼠心肌細(xì)胞(PNCM)中的PLB表達(dá)，試圖開(kāi)發(fā)共表達(dá)shRNA和作為標(biāo)記的GFP的AdV和rAAV載體，這允許在使用心力衰竭(HF)動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)中通過(guò)體內(nèi)成像跟蹤載體。但是，構(gòu)建體rAAV-shPLB-CMV-GFP與不含CMV-GFP組件的原始AdV-shPLB載體相比顯示非常低的沉默活性(圖1A)。rAAV載體在CMV的控制下產(chǎn)生GFP，CMV-GFP盒中的轉(zhuǎn)錄與U6-啟動(dòng)子-shRNA盒以相反的方向運(yùn)行。為了檢驗(yàn)是否CMV啟動(dòng)子本身和/或GFP序列造成了沉默活性的損失，使用內(nèi)含子“填充”序列代替GFP構(gòu)建了載體rAAV-shPLB-CMV-β-內(nèi)含子。rAAV-shPLB-CMV-GFP(尺寸為2.30kb)和rAAV-shPLB-CMV-β-內(nèi)含子(尺寸為2.55kb)二者均具有包裝入衣殼的視為必要的尺寸。不含CMV也不含GFP或β-內(nèi)含子，而僅含有來(lái)自AdV-PLB的原始TO_shPLB盒的第三載體賦予了1.15kb的總載體基因組尺寸。雖然如此，這一“極小化”rAAV-shPLB在標(biāo)準(zhǔn)方案中被有效包裝，很可能是作為多聯(lián)體。載體圖譜顯示于圖1C病毒載體產(chǎn)牛和純化rAAV9-shGFP和rAAV9-shPLB使用由Zolotukin等人(GenTher(1999)6(6)973-985)描述的雙質(zhì)粒方案產(chǎn)生，方案有以下修改在添加磷酸鈣沉淀之前，在三個(gè)燒瓶中培養(yǎng)293-T細(xì)胞(ATCC，Manassas，VA)24h(DMEM，10%FBS)。72小時(shí)后，經(jīng)碘克沙醇密度梯度(Optipr印，GreinerBio-OneInc，Longwood，F(xiàn)L)、然后是肝素-瓊脂糖I型親和層析(Sigma-AldrichInc,St.Louis,M0)從benzonase處理的細(xì)胞粗裂解物中純化病毒。最后，使用Vivaspin20離心濃縮機(jī)50KMWCO(VivascienceInc，Carlsbad，CA)濃縮病毒并將其配制成乳酸林格氏液(BaxterHealthcareCorporation,Deerfield,IL)，儲(chǔ)存在_80°C。載體質(zhì)量評(píng)估和滴定通過(guò)電泳后的銀染色評(píng)估載體貯液的生物化學(xué)純度(>95%)。含有基因組的顆粒(gcp)通過(guò)實(shí)時(shí)PCR方法(LightCycler,RocheDiagnostics)確定，使用SYBRGREENTAQREADYMIX(SIGMA,Saint-Louis,MO)和引物CMV-F禾口CMV-R。心肌細(xì)胞培養(yǎng)物中的載體評(píng)估原代新生心肌細(xì)胞(NRCM)適于在決定性的體內(nèi)檢驗(yàn)之前預(yù)檢驗(yàn)任何基于RNAi的心臟治療，這是因?yàn)殡m然SERCA2a/PLB系統(tǒng)是發(fā)育調(diào)節(jié)的，但是其在NRCM中功能正常，而且靶向SERCA2a/PLB系統(tǒng)的腺病毒基因轉(zhuǎn)移策略在新生和成年心肌細(xì)胞二者中都取得了成功。雖然兩種細(xì)胞類型都非常適于體外預(yù)檢驗(yàn)，但是培養(yǎng)的心肌細(xì)胞和體內(nèi)完整的心臟之間的許多其他差異使得培養(yǎng)細(xì)胞中對(duì)基于RNA的治療的任何體外研究都是相當(dāng)初步的。細(xì)胞培養(yǎng)物原代心肌細(xì)胞(PNCM)和原代新生心肌細(xì)胞(NRCM)從1_3天大的Wistar大鼠幼仔的心室組織制備。將PNCMs在6-孔皿中培養(yǎng)。受磷蛋白沉默的評(píng)估NRCM和大鼠心臟中的PLB、Tnl、NCX和SERCA2amRNA和蛋白表達(dá)水平、以及大鼠心臟中的SERCA2a和NCX蛋白質(zhì)通過(guò)所述的Northern印跡分析確定(Fechner等人，GeneTherapy(2006)；發(fā)行中)。RNAi治療過(guò)程中的鈣瞬變用8μMFluo-4/AM加載NRCM20分鐘后，測(cè)量IHz電刺激過(guò)程中的[&2+幾瞬變(120HZ、8.3ms/圖像下的圖像捕獲)。研究了五個(gè)NRCM治療組(細(xì)胞數(shù)目):AAV9-shPLB(η=26)、AAV9_shGFP(η=26)、AdV_shPLB(η=71)、AdV_shGFP(η=49)和未治療的對(duì)照細(xì)胞(η=32)。測(cè)量了瞬變振幅(收縮期[Ca2+](F/FJ)、其到達(dá)峰值的時(shí)間(TTP)(ms)和其衰變的時(shí)間常數(shù)τ(ms)。AAV9_shPLB治療NRCM過(guò)程中的[Ca2Ii瞬變的測(cè)量(圖IE和1F)顯示，與AAV9-shGFP組相比，此載體導(dǎo)致顯著更高的振幅和加快的瞬變動(dòng)力學(xué)(具有縮短的TTP和τ)，AAV9-shGFP組具有與未治療的細(xì)胞不可分辨的瞬變。與AdV-shGFP組相比，AdV-shPLB治療還造成顯著更高的振幅。不過(guò)，與AAV9組相反，AdV-shPLB和AdV-shGFP中的TTP被延長(zhǎng)，而τ則無(wú)差異。因此，AdV組中的肌質(zhì)網(wǎng)(SR)Ca2+負(fù)荷的其他研究(圖1D)如下進(jìn)行在用SyMFluo-VAM加載NRCM20min、但接著迅速加入阻斷經(jīng)由SERCA2a的Ca2+進(jìn)入SR的再攝取的20mM咖啡因后，再次測(cè)量IHz電刺激過(guò)程中的[Ca2+Ji瞬變。比較電刺激的[Ca2+Ji瞬變和咖啡因誘導(dǎo)的[Ca2+Ji瞬變，并計(jì)算Ca2+的釋放分?jǐn)?shù)(參見(jiàn)Kockskamper等人Endothelin-IenhancesnuclearCa2+transientsinatrialmyocytesthroughIns(1,4,5)P3-dependentCa2+releasefromperinuclearCa2+stores(內(nèi)皮縮血管肽_1通過(guò)核周Ca2+存儲(chǔ)的Ins(1,4,5)P3-依賴性的Ca2+釋放增強(qiáng)心房肌細(xì)胞中的核Ca2+瞬變).JournalofCellScience.2008;121:186_195，和其中引用的參考文獻(xiàn))。肥大的誘導(dǎo)在部分體外研究中采用濃度為100μM的苯腎上腺素(PE)、10μM的血管緊張素II(Ang-II)和IOOnM的內(nèi)皮縮血管肽-I(ET-I)作為肥大性刺激。定量細(xì)胞內(nèi)miR的TAQMAN測(cè)定在PNCM/NRCM中在基線條件下(圖4A)或在肥大性劑存在下(圖4B-4D)進(jìn)行。肥大性劑在培養(yǎng)的第2天添加，其單獨(dú)或與相應(yīng)的RNAi載體一起添加。小RNA測(cè)定使用下列引物通過(guò)TAQMAN測(cè)定來(lái)確定短發(fā)夾RNA(shRNA)表達(dá)水平。在探究載體來(lái)源的shRNA對(duì)心臟細(xì)胞內(nèi)miRNA途徑的可能的載體劑量依賴性影響中，采用TAQMAN測(cè)定定量已知在心臟中表達(dá)的以下miR:miRNA-l、miRNA_24、miRNA_133a、miRNA-208和miRNA_195。通過(guò)Taaman測(cè)定定量基因表汰和shRNA產(chǎn)牛微RNA測(cè)定在探究載體來(lái)源的shRNA對(duì)心肌細(xì)胞miRNA的可能影響中，使用TAQMAN測(cè)定來(lái)定量(圖4A-4C)已知在心臟中功能表達(dá)的兩種miRNA(miRNA-I、miRNA-133a)。BNP測(cè)定通過(guò)TAQMAN同樣地定量載體治療的大鼠的心臟中的心臟BNP基因表達(dá)(圖3G)。shPLB產(chǎn)生不同RNAi載體的短發(fā)夾RNA轉(zhuǎn)錄的定量(圖1B)按先前公布的方案進(jìn)行(Fechner等人，HighlyEfficientandSpecificModulationofCardiacCalciumHomeostasisbyAdenovector-DerivedshorthairpinRNATargetingPhospho1amban(靶向受磷蛋白的腺病毒載體來(lái)源的短發(fā)夾RNA對(duì)心臟鈣穩(wěn)態(tài)的高效和特異性調(diào)節(jié))·GeneTherapy.2007；14:211-218；和Fechner等人，CoxsackievirusB3andadenovirusinfectionsofcardiaccellsareefficientlyinhibitedbyvector-mediatedRNAinterferencetargetingtheircommonreceptor(革巴向柯薩奇病毒B3和腺病毒的共同受體的載體介導(dǎo)的RNA干擾有效抑制它們對(duì)心臟細(xì)胞的感染).GeneTher.Jun2007；14(12):960_971)。主動(dòng)脈綁扎用腹膜內(nèi)戊巴比妥(65mg/kg)麻醉四周齡SpragueDawley大鼠(70_80g)并將其置于通氣機(jī)上。進(jìn)行胸骨切口以暴露主動(dòng)脈根，并將內(nèi)徑0.58mm的鉭夾(Week，Inc.)夾在升主動(dòng)脈上。模擬組中的動(dòng)物經(jīng)歷相似的程序但不插入夾子。然后閉合鎖骨切口，并將大鼠放回它們的籠子。進(jìn)行鎖骨方法是因?yàn)樵诨蜻f送過(guò)程中，開(kāi)胸術(shù)是必需的，而通過(guò)在初始的主動(dòng)脈綁扎中不打開(kāi)胸腔，避免了進(jìn)行基因遞送時(shí)的粘連。將動(dòng)物初始地分為兩組一組56只動(dòng)物進(jìn)行主動(dòng)脈綁扎，第二組12只動(dòng)物進(jìn)行模擬手術(shù)(模擬手術(shù)動(dòng)物中有10只存活)。在進(jìn)行主動(dòng)脈綁扎的動(dòng)物中，在進(jìn)行心臟基因轉(zhuǎn)移之前，我們等待了25-30周來(lái)讓動(dòng)物發(fā)展左心室舒張和使射血分?jǐn)?shù)降低25%。在經(jīng)歷壓力超負(fù)荷肥大(pressureoverloadhypertrophy)的初始的56只動(dòng)物中，僅有40只動(dòng)物存活，將它們進(jìn)一步分為接受Ad-shGFP(η=10)或Ad_shPLB(n=10)，或AAV9_shGFP(η=10)或AAV9-shPLB(η=10)。連續(xù)超聲波心動(dòng)描記評(píng)估在綁扎二十二周后，在輕微麻醉的動(dòng)物(戊巴比妥40mg/kg，腹膜內(nèi))中每周一次進(jìn)行連續(xù)超聲波心動(dòng)描記圖。使用GEVivid-7超聲機(jī)和12MHz寬頻轉(zhuǎn)換器進(jìn)行經(jīng)胸M-模式和二維超聲波心動(dòng)描記術(shù)。使用中乳頭水平左心室短軸視圖，并采集后壁厚度、左心室舒張期內(nèi)徑和縮短分?jǐn)?shù)測(cè)量。在檢測(cè)到與綁扎后12周的縮短分?jǐn)?shù)(FS)相比FS下降>25%的3天內(nèi)在所有動(dòng)物中進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。在模擬手術(shù)的大鼠中，基因遞送在第27周進(jìn)行。靜脈內(nèi)灃射后的AAV9載體的心臟分布向大鼠靜脈內(nèi)(i.v.)注射表達(dá)標(biāo)記蛋白質(zhì)GFP的載體rAAV9_GFP或注射鹽水。遞送rAAV9-GFP或鹽水后一個(gè)月，摘除心臟，并在510nm在熒光系統(tǒng)下顯現(xiàn)(MaestroInVivoImaging,Woburn,ΜΑ),490nm藍(lán)光處的單激發(fā)峰(圖2B和2C)顯示觀察到的圖像。除了宏觀水平的此GFP表達(dá)顯現(xiàn)外，還在i.v.注射rAAV9_GFP后一個(gè)月進(jìn)行GFP免疫組織化學(xué)染色以在微觀水平評(píng)估其分布(圖2D、2H和21)。30%過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源過(guò)氧化物酶之后，在PBS緩沖液中清洗，以11000稀釋度加入多克隆兔抗hrGFP抗體(VITALITY,目錄號(hào)240142，Stratagene)120min。清洗后，作為二級(jí)抗體，以150稀釋度使用多克隆山羊抗兔免疫球蛋白/HRP抗體(目錄號(hào)P0448，Dako，Glostrup,Denmark)60min。使用haemalaun的染色禾口復(fù)染如所述地進(jìn)行(Noutsias等人，HumanCoxsackie-Adenovirus-ReceptorisCo-LocalizedwithIntegrinsανβ3andανβ5οηtheCardiomyocyteSarcolemmaandUpregulatedinDilatedCardiomyopathy-ImplicationsforCardiotropicViralInfections(人類柯薩奇—腺病毒-受體與整聯(lián)蛋白ανβ3和ανβ5共定位于心肌細(xì)胞肌膜并在舒張性心肌病中上調(diào)-對(duì)親心性病毒感染的暗示)·Circulation.2001；104:275_280)。對(duì)于不同器官中GFP表達(dá)的Western印跡分析，以15000稀釋度使用多克隆兔抗hrGFP抗體(VITALITY，目錄號(hào)240142Stratagene)在4°C過(guò)夜。作為二級(jí)抗體，以12000稀釋度使用多克隆山羊抗兔免疫球蛋白/HRP抗體(目錄號(hào)P0448，Dako，Glostrup,Denmark)在室溫60min。然后將GFPWestern印跡對(duì)X-光膠片曝光5min。這些膠片的定量在圖2J中給出。體內(nèi)RNAi治療的實(shí)驗(yàn)方案腺病毒遞送系統(tǒng)是本領(lǐng)域公知的。簡(jiǎn)要而言，在麻醉大鼠和進(jìn)行開(kāi)胸術(shù)后，將含有200μ1腺病毒(3X10、^)溶液的22G導(dǎo)管從左心尖前進(jìn)至主動(dòng)脈根。在距導(dǎo)管部位的遠(yuǎn)端夾住主動(dòng)脈和肺動(dòng)脈主干40sec并注射溶液，然后閉合胸腔，讓動(dòng)物恢復(fù)。對(duì)于使用rAAV9的實(shí)驗(yàn)，使用5x10"個(gè)任一種rAAV9shRNA的載體基因組進(jìn)行簡(jiǎn)單的尾靜脈注射。模擬組的動(dòng)物注射鹽水。RNAi治療過(guò)程中的血液動(dòng)力學(xué)評(píng)估將不同治療組和處于腺病毒基因轉(zhuǎn)移的不同階段的大鼠用40mg/kg戊巴比妥麻醉和機(jī)械通氣。然后通過(guò)中線切口打開(kāi)胸腔，暴露出心臟。然后在左心尖開(kāi)一小口，向左心室引入2.OFr.高保真壓力轉(zhuǎn)換器(MILARInStrumentS，TX)。壓力測(cè)量在IKHz下進(jìn)行數(shù)字化并儲(chǔ)存用于進(jìn)一步的分析。測(cè)量或獲得了不同組的左心室收縮壓(LVSP)、舒張末期左心室壓力(LVDP)、最大壓力上升速率(+dP/dt)和最大壓力下降速率(-dP/dt)和松弛時(shí)間常數(shù)(t)。使用以下等式測(cè)量了等容松弛的時(shí)間過(guò)程V=Ρ^—μ+Ρβ，其中P是左心室等容壓力，Ptl是達(dá)到峰值-dP/dt時(shí)的壓力，Pb是殘余壓力。RNAi治療后的心臟組織學(xué)心肌細(xì)胞尺寸和心臟纖維化對(duì)動(dòng)物子集進(jìn)行組織學(xué)分析以評(píng)估肌細(xì)胞尺寸(CMD)和膠原蛋白含量(CAP)。將LV樣本用10%福爾馬林固定并在石蠟中包埋。切片(3μm厚)用蘇木精-曙紅染色以確定CMD或用Azan-Mallory染色以評(píng)估CAP。在縱向定向的心肌細(xì)胞中，跨核寬度測(cè)量為CMD(圖3F)。在每個(gè)Azan-Mallory切片的六個(gè)部位拍攝數(shù)碼照片。使用NIH成像儀通過(guò)計(jì)數(shù)計(jì)算機(jī)化的像素分別確定間隙/血管周圍膠原蛋白面積和肌細(xì)胞面積(圖3E)。統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)表示為平均值士SD。使用STATVIEW(AbacusConcepts,Barkeley,CA)通過(guò)ANOVA進(jìn)行多重比較。接受P<0.05水平的統(tǒng)計(jì)顯著性。進(jìn)行雙因子ANOVA以比較不同組之間的不同血液動(dòng)力學(xué)參數(shù)。對(duì)于回波數(shù)據(jù)，其中以不同的區(qū)間檢查變量，進(jìn)行重復(fù)測(cè)量的AN0VA。接受ρ<0.05水平的統(tǒng)計(jì)顯著性。實(shí)施例2RNAi載體系統(tǒng)的優(yōu)化研究了病毒RNAi載體沉默效力的決定因素，因?yàn)橛^察到具有顯然很小結(jié)構(gòu)差別的AAV-shPLB載體在體外在PNCM中顯示顯著不同的shRNA產(chǎn)生速率和靶沉默(圖1)。對(duì)于PNCM中的這些初始研究，使用了AAV2.6假型，其在體外具有比AAV2.9更高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效力。對(duì)于圖2和3中報(bào)告的稍晚的RNAi治療研究，僅使用了AAV2.9，其顯示更好的體內(nèi)心臟轉(zhuǎn)導(dǎo)。體外實(shí)驗(yàn)顯示共表達(dá)向含有shPLB載體的細(xì)胞加標(biāo)簽的GFP標(biāo)記蛋白質(zhì)幾乎消除了shPLB產(chǎn)生(圖1B)和PLB沉默(圖1A)。如果GFP由CMV驅(qū)動(dòng)，以及如果CMV連接于β-內(nèi)含子，含有用于shRNA轉(zhuǎn)錄的TO啟動(dòng)子的表達(dá)盒中CMV啟動(dòng)子的存在強(qiáng)烈降低shRNA產(chǎn)生(圖5Α)。圖1顯示到目前為止，最高的效力是由以前認(rèn)為太短而無(wú)法進(jìn)行有效包裝的AAV構(gòu)建體展示的。PNCM中AdV-shPLB與AAV6_shPLB的shRNA轉(zhuǎn)錄的比較顯示，到第10天腺病毒的表達(dá)下降了三分之一，而AAV載體的表達(dá)則不變(圖IB)。4xl03p/c劑量下，兩種載體的PLB表達(dá)消除都>98%。令人感興趣的是，允許通過(guò)體內(nèi)成像進(jìn)行檢測(cè)的CMV-GFP盒的并入意外地導(dǎo)致載體不能沉默其靶標(biāo)。CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的標(biāo)記基因表達(dá)顯然不適合用于U6-shRNA載體，因此僅有最簡(jiǎn)單和有效的TO-shRNA載體(圖1)被選擇用于體內(nèi)RNAi。由于rAAV9-shRNA與AdV-shPLB相比的高度穩(wěn)定的shRNA產(chǎn)生和長(zhǎng)期的體內(nèi)穩(wěn)定性，因此將其用于長(zhǎng)期體內(nèi)治療。對(duì)于短期治療，使用腺病毒載體。在體外，蛋白質(zhì)水平的PLB消除比mRNA水平的PLB消除滯后數(shù)天，在第7天，蛋白質(zhì)水平分別下降了基線的9%(AdV-shPLB)和12%(rAAV6-shPLB)(圖ID)。與AAV9_shGFP組相比，對(duì)AAV9_shPLB治療NRCM過(guò)程中的[Ca2Ii瞬變的測(cè)量(圖IE和1F)顯示此載體導(dǎo)致顯著更高的振幅和加快的瞬變動(dòng)力學(xué)(縮短的TTP和τ)，AAV9-shPLB組具有與未治療的細(xì)胞不可分辨的瞬變。與AdV-shGFP相比，AdV-shPLB治療還造成顯著更高的振幅。與AAV9組相反，AdV-shPLB和AdV-shGFP中的TTP被延長(zhǎng)，而τ則無(wú)差異。AdV組中的肌質(zhì)網(wǎng)(SR)Ca2+負(fù)荷研究顯示AdV-shPLB和AdV-shGFP組中增加的SRCa2+負(fù)荷和自SR的Ca2+釋放分?jǐn)?shù)(FR)(圖5D)。關(guān)于體外轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞間差異，圖5B顯示用rAAV-GFP標(biāo)記載體治療的NRCM中大致均勻的GFP表達(dá)，其可充當(dāng)對(duì)體外均勻的shPLB表達(dá)的直接展示的最佳可能逼近。使用現(xiàn)有的技術(shù)，均勻的shPLB表達(dá)可能無(wú)法直接顯現(xiàn)，原因是GFP與shPLB的共表達(dá)消滅了其沉默能力(圖IB和1C)。所述RNAi載體在體內(nèi)在大鼠心臟中均勻的空間和時(shí)間分布還由與用于RNAi治療(圖3A-3D)的相同類型的GFP載體(rAAV9)的熒光成像(圖2B和2C)間接推斷出來(lái)。圖2D和圖2H-2J顯示i.v.注射rAAV9-GFP后心臟和其它器官的GFP免疫組織化學(xué)染色。心臟中強(qiáng)烈和大致均勻的表達(dá)與肝和骨骼肌中的微弱染色以及肺中的無(wú)可見(jiàn)染色形成對(duì)比(定量參見(jiàn)圖2J)。實(shí)施例3體內(nèi)RNAi治療的效力跨主動(dòng)脈的縊痕在30周后導(dǎo)致大鼠中嚴(yán)重的HF。體內(nèi)RNAi治療的實(shí)驗(yàn)方案概述于圖2。與用于RNAi治療的相同類型(rAAV9)的GFP載體的熒光成像和免疫組織學(xué)分析在宏觀和微觀水平顯示了i.v.注射后一個(gè)月大致均勻的心臟GFP表達(dá)，并可被假定為接近RNAi載體產(chǎn)生的心臟shRNA表達(dá)水平(圖2B-2D)?，F(xiàn)有技術(shù)難以實(shí)施體內(nèi)shPLB產(chǎn)生的直接測(cè)量。圖2F和2G顯示用AdV-shPLB或rAAV9_shPLB治療后顯著下降的心臟PLB蛋白質(zhì)。SERCA2a蛋白質(zhì)在衰竭的心臟中是降低的，而shPLB治療伴有心臟SERCA2a蛋白質(zhì)的增加。NCX未發(fā)生顯著變化。與AdV-shGFP對(duì)照載體(產(chǎn)生針對(duì)GFP的shRNA序列)相比，通過(guò)主動(dòng)脈根注射AdV-shPLB的治療充當(dāng)嚴(yán)重HF的短期治療模型。注射后一個(gè)月，AdV-shPLB中的舒張功能(圖3A)顯著(ρ<0.05)好于對(duì)照組左心室舒張末期壓力(LVEDP)10士3mmHg對(duì)比14+4mmHg,LV壓力下降速率(_dp/dt)5215士540對(duì)比4017+471mmHg/sec，等容松弛時(shí)間常數(shù)1^11(1)17士3對(duì)比24+41^沈。收縮功能(圖3B)同樣得到改善，LV收縮壓(LVSP)90士5對(duì)比78士4mmHg、LV壓力上升速率(+dp/dt)7.448士659對(duì)比5.624士698mmHg/sec，和縮短分?jǐn)?shù)(FS)46.1士3.2對(duì)比39.1+3.7%。除了對(duì)血液動(dòng)力學(xué)的有益效應(yīng)之外，TAB后LV重量和舒張的大幅增加在一個(gè)月時(shí)也被顯著降低LV重量1.34士0.22對(duì)比1.87士0.21g，LV/體重(LV/BW)比2.4士0.2對(duì)比3.2士0.2x10"3,LV/脛骨長(zhǎng)度(LV/TL)比29.3士4對(duì)比43.3+5(圖3C)。這些死亡后形態(tài)測(cè)定數(shù)據(jù)與超聲波心動(dòng)描記術(shù)相關(guān)(圖3D)。存活率為8/10對(duì)比9/10。與AAV9_shGFP載體相比，通過(guò)尾靜脈注射最有效AAV9_shPLB的治療充當(dāng)慢性嚴(yán)重HF的長(zhǎng)期治療模型。注射后三個(gè)月，與對(duì)照組相比，AAV9-shPLB治療中的舒張功能(圖3A)得到顯著改善，并且不再顯著不同于模擬手術(shù)的(無(wú)主動(dòng)脈綁扎)非HF組LVEDP為8士3mmHg對(duì)比18士4(非HF:6士2)mmHg,-dp/dt5.722士503對(duì)比3.877+643(非HF6.O32士344)mmHg/sec，Tau16+3對(duì)比23士4(非HF:14士3)msec。收縮功能(圖3B)也得到恢復(fù)，盡管遜色于舒張功能參數(shù)LVSP92士4對(duì)比80+3(非HF:98士4)mmHg，+dp/dt7.851+803對(duì)比4.997士766(非HF8.772士832)mmHg/sec，F(xiàn)S50.1+2.1對(duì)比35.2+5.1%(非HF:52.2+4.1)。除了血液動(dòng)力學(xué)之外，這一治療在3個(gè)月時(shí)降低了LV肥大和舒張LV重量1.34+0.12對(duì)比1.76士0.27g(非HF1.11+0.09),LV/BW2.2士0.1對(duì)比3.1士0.2xl(T3(非HF:1·8+0.2)，LV/TL27.2士4對(duì)比45.3士5(非HF:24.5+4)(圖3C)。超聲波心動(dòng)描記術(shù)確證了LV壁厚和舒張的降低(圖3D)。組織學(xué)顯示rAAV9-shRNA治療3個(gè)月后心肌細(xì)胞尺寸和心臟膠原蛋白二者均有降低(圖3E和3F)。3個(gè)月后AAV9-shPLB-治療的動(dòng)物的存活率為9/10，對(duì)比對(duì)照組中的6/10。實(shí)施例4心力衰竭的RNAi治療這些數(shù)據(jù)表明，對(duì)于中間時(shí)間尺度，腺病毒載體可能是足夠的，甚至可提供超過(guò)長(zhǎng)期穩(wěn)定的AAV的優(yōu)點(diǎn)(Wang等人，NatBiotechnol(2005)23:321_328；Gregorevic等人，NatureMedicine(2004)10:828_834；Inagaki等人，MolTher(2006)14:45_53；Pacak等人，CirRes(2006)99:e3_9)，原因是在急性和可能逆轉(zhuǎn)的HF中僅短暫地需要RNAi。事實(shí)上，AdV-shPLB治療后一個(gè)月舒張和收縮功能以及LV形態(tài)學(xué)的顯著改善證明了腺病毒系統(tǒng)的至少功能性治療益處。先前顯示的用于經(jīng)典基因轉(zhuǎn)移治療的內(nèi)容(delMonte等人，ProcNatlAcadSciUSA(2004)101:5622_5627;Sakata等人，JMolCellCardiol(2007)42852-861；Sakata等人，AmJPhysiolHeartCircPhysiol(2007)292:Η1204_1207；Sakata等人，MolTher(2006)13:387_996)顯然也可適用于基于RNAi的策略，盡管存在對(duì)RNAi載體結(jié)構(gòu)的其他限制因素以避免損失治療效力(圖IA和1Β)和擾亂miRNA途徑。雖然從AAV產(chǎn)生shRNA在幾個(gè)方面不同于經(jīng)典的基因轉(zhuǎn)移(圖1)，但是來(lái)自本發(fā)明AAV組的數(shù)據(jù)提供了基于AAV的shRNA產(chǎn)生在能夠改善心臟功能和可能的存活的水平保持穩(wěn)定數(shù)個(gè)月的一手證據(jù)。本文使用的AAV9載體實(shí)現(xiàn)了應(yīng)用于人類HF的一個(gè)首要要求，因?yàn)樵陟`長(zhǎng)類中它是親心性的(Pacak等人，(2006))。與嚙齒動(dòng)物相反，可調(diào)節(jié)的PLB調(diào)節(jié)是人類中最可能需要的，因?yàn)橐褜⒂苫蚪M突變?cè)斐傻挠谰眯訮LB缺乏或PLB功能失調(diào)與心肌疾病關(guān)聯(lián)(Schmitt等人，Science(2003)2991410-1413；Haghighi等人，ProcNatlAcadSciUSA(2006)1031388-1393;Zhao等人，(2006)113:995-1004)。然而，藥物可調(diào)節(jié)的RNAi顯示在現(xiàn)有載體平臺(tái)上是可能的。RNAi治療后，發(fā)現(xiàn)與HF組相比，SERCA2a表達(dá)增加，這與RNAi治療使LV功能正?；氖聦?shí)一致。因?yàn)镾ERCA2a表達(dá)是HF程度的公知標(biāo)志物，其通過(guò)shPLB的RNAi治療后ERCA2a的增加反映了改善的心臟功能狀態(tài)。實(shí)施例5RNAi治療過(guò)程中的心肌細(xì)胞微RNA表達(dá)RNAi的細(xì)胞機(jī)器經(jīng)過(guò)數(shù)百萬(wàn)年的進(jìn)化，是已知用于特異性基因沉默的最有效和通用的機(jī)制。shRNA采用這一機(jī)器通過(guò)模擬內(nèi)源過(guò)程介導(dǎo)治療效應(yīng)，在遠(yuǎn)低于反義RNA的濃度下實(shí)現(xiàn)沉默，但可擾亂細(xì)胞miRNA途徑(Grimm等人，Nature(2006)441:537_541)。因?yàn)閙iR在心臟形態(tài)發(fā)生(Zhao等人，Cell(2007)129:303_317)、肥大(Care等人，NatureMedicine(2007)13613-618；vanRooij等人，Science(2007)316:575_579)、心律失常發(fā)生(Yang等人，NatureMedicine(2007)13486-491)和衰竭(Thum等人，Circulation(2007)116258-267；vanRooij等人，ProcNatlAcadSciUSA(2006)10318255-18260)中起重要作用，在PNCM/NRCM中在miRNA水平探究了RNAi載體的可能副作用。首先，在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下，然后在肥大誘導(dǎo)藥物苯腎上腺素(PE)存在下。在無(wú)此肥大性刺激時(shí)，體內(nèi)使用的載體無(wú)一對(duì)在心臟中具有已知的功能重要性的細(xì)胞miRl、21、133a、195,208具有任何顯著效應(yīng)(圖4B)。在PE存在下，在培養(yǎng)的第5天，幾種心肌細(xì)胞miRNA有顯著的下降(圖4A)。顯著地，具有抗肥大(Care等人(2007)MicroRNA-133controlscardiachypertrophy(微RNA-133控制心臟肥大)·NatMed13，613-8；和vanRooij等A(2007)Controlofstress-dependentcardiacgrowthandgeneexpressionbyaMicroRNA(微RNA控制應(yīng)激依賴的心臟生長(zhǎng)和基因表達(dá)).Science316，575-9)和抗心律失常發(fā)生(Yang等人(2007)Themuscle-specificmicroRNAmiR-lregulatescardiacarrhythmogenicpotentialbytargeticGJAlandKCNJ2(肌肉特異性微RNAmiR-I通過(guò)靶向GJAl和KCNJ2調(diào)節(jié)心臟心律失常發(fā)生潛能).NatMed13,486-191)潛能的miRNA的水平的這一下降在用AdV-shPLB或AAV6-shPLB治療的PNCM中被反轉(zhuǎn)，AdV-shPLB或AAV6-shPLB將這些miRNA的水平恢復(fù)至基線在PE存在下，在培養(yǎng)的第5天，心肌細(xì)胞miR有顯著的下降(圖4B)。顯著地，具有抗肥大(Zhao等人，(2007)；Care等人，(2007))和抗心律失常發(fā)生(Yang等人，(2007))潛能的miR的這一下降在用AdV-shPLB或AAV6_shPLB治療的PNCM中被反轉(zhuǎn)，AdV-shPLB或AAV6-shPLB將這些miRNA的水平恢復(fù)至基線，其中特別值得關(guān)注的是miRNA-133和miRNA-1。由于惡性心律失常是HF中重要的并發(fā)癥，新穎治療對(duì)任何心律失常相關(guān)的微RNA諸如miRNA-1的脫調(diào)節(jié)(Yang等人，(2007))應(yīng)被視為可能的嚴(yán)重有害作用。然而，體外數(shù)據(jù)顯示PE-誘導(dǎo)的miRNA-1降低被shPLB治療抵消(圖4A-4C)。結(jié)合AAV_shPLN治療組中存活改善的趨勢(shì)，目前為止沒(méi)有此治療的心律失常發(fā)生的副作用的證據(jù)。用shPLB載體治療的大鼠心臟具有比shGFP組更高的miRNA水平(圖2H-2J)。關(guān)于RNAi載體的可能副作用，載體注射后肝(圖2E)和其他器官的HE染色揭示無(wú)病理學(xué)發(fā)現(xiàn)。miRNA-133在控制心肌細(xì)胞尺寸中起關(guān)鍵作用(Care等人，(2007))，并且在通過(guò)RNAi治療降低肥大方面值得關(guān)注。不管體外shPLB治療恢復(fù)miRNA-133水平的分子機(jī)制如何，必須承認(rèn)它們的升高具有抗肥大效應(yīng)。雖然RNAi治療過(guò)程中改善的收縮和舒張功能是由其對(duì)經(jīng)由總體Ca2+瞬變的興奮-收縮偶聯(lián)(ECC)的影響直接造成的，觀察到的LV肥大和舒張的顯著降低(圖3C、3D和3F)是不容易推斷的，原因是RNAi治療主要僅靶向總體Ca2+循環(huán)的單個(gè)組分。意外的是，這一狹窄靶向的干預(yù)仍然將幾種PE誘導(dǎo)的miRNA抑制恢復(fù)到正常水平(圖4A)。由于在體外，無(wú)論是血液動(dòng)力學(xué)應(yīng)激，還是像體內(nèi)HF中那樣的細(xì)胞因子活化的神經(jīng)體液，都不能起任何作用，因此這一恢復(fù)顯然是由細(xì)胞水平的Ca2+穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)造成的。因?yàn)闊o(wú)法假定PLB消除對(duì)細(xì)胞內(nèi)miRNA的直接效應(yīng)，所以RNAi誘導(dǎo)的Ca2+穩(wěn)態(tài)變化顯然不僅影響收縮相關(guān)的總體Ca2+瞬變，而且還影響核周腔中產(chǎn)生的單獨(dú)的和隔離的Ca2+信號(hào)(Wu等人，JClinInvest(2006)116675-682；MolkentinJ,JClinInvest(2006)116623-626)，這些Ca2+信號(hào)決定肥大過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄變化。被PE誘導(dǎo)并且被RNAi校正的miRNA抑制可能僅反映改變的Ca2+穩(wěn)態(tài)引起的細(xì)胞調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的間接變化?？蛇x地，后者可作為第一靶標(biāo)直接影響miRNA表達(dá)。基于這些結(jié)果，開(kāi)發(fā)了針對(duì)心臟疾病的高效的局部化RNAi治療策略。當(dāng)使用優(yōu)化的RNAi載體和主動(dòng)脈根載體注射將RNAi限于心臟時(shí)，不存在毒性或擾亂miRNA途徑的證據(jù)。不被理論束縛，載體miRNA對(duì)肥大相關(guān)的miRNA的脫調(diào)節(jié)的矯正表明miRNA參與治療過(guò)程。雖然通過(guò)腺病毒載體的短期的RNAi-介導(dǎo)的PLB沉默在1個(gè)月后改善了心臟功能，但是來(lái)自優(yōu)化的親心性AAV9載體的長(zhǎng)期RNAi在3個(gè)月的時(shí)間段內(nèi)改善HF大鼠中的功能、形態(tài)和存活。此外，使用所公開(kāi)的載體在缺血灌注模型中造成降低的心室心律失常以及心室功能的改善。而且，PLB的抑制增加了具有轉(zhuǎn)變?yōu)樾牧λソ叩膲毫Τ?fù)荷肥大的動(dòng)物的存活。雖然已參考上述實(shí)施例描述了本發(fā)明，但是應(yīng)理解，修改和變化涵蓋在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明僅受下列權(quán)利要求的限制。權(quán)利要求一種治療受治療者中心力衰竭的方法，包括向有相應(yīng)需要的受治療者施用有效治療所述受治療者的心力衰竭的量的包含RNAi表達(dá)盒的載體，其中所述盒包含RNAi序列，所述RNAi序列的表達(dá)產(chǎn)物降低受磷蛋白(PLB)的表達(dá)或活性。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述RNAi表達(dá)盒包含SEQIDN0:1所列的核苷酸序列，由此與施用所述載體之前相比改善所述受治療者的收縮功能。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述載體是病毒體。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述載體是質(zhì)粒。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述病毒體是細(xì)小病毒。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述細(xì)小病毒是腺伴隨病毒(AAV)。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述AAV是血清型9。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中PLBmRNA的表達(dá)被抑制。9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中SEQIDNO:1的側(cè)翼為AAV末端重復(fù)序列。10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中病毒體載體的基因組是自互補(bǔ)的。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述受治療者是哺乳動(dòng)物。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述受治療者是人類。13.一種藥物組合物，包含重組的腺伴隨病毒(AAV)載體和藥學(xué)可接受的載運(yùn)體，其中所述載體包含其RNA表達(dá)產(chǎn)物導(dǎo)致受磷蛋白(PLB)的表達(dá)或PLB活性降低的RNAi表達(dá)盒。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其中所述RNAi表達(dá)盒的RNA表達(dá)產(chǎn)物包含在嚴(yán)格條件下與PLB基因mRNA的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其中所述RNAi表達(dá)盒包含SEQIDNO=I所列的核苷酸序列。16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其中所述RNA表達(dá)產(chǎn)物還包含SEQIDNO2所列的靶序列。17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其中所述組合物適于靜脈內(nèi)施用。18.根據(jù)權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其中所述組合物適于動(dòng)脈內(nèi)施用。19.根據(jù)權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其中所述組合物適于心室內(nèi)施用。20.根據(jù)權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其中所述組合物適于心瓣膜灌注。21.根據(jù)權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其中所述AAV是血清型9。22.—種腺伴隨病毒(AAV)載體，包含至少一個(gè)AAV末端重復(fù)序列，其中所述載體包含其RNAi表達(dá)產(chǎn)物導(dǎo)致受磷蛋白(PLB)mRNA的表達(dá)或PLB活性降低的RNAi表達(dá)盒。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的腺伴隨病毒，其中所述RNAi表達(dá)盒的RNA表達(dá)產(chǎn)物包含在嚴(yán)格條件下與PLB基因mRNA核苷酸序列雜交的核苷酸序列，由此轉(zhuǎn)導(dǎo)心肌細(xì)胞。24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的AAV載體，其中所述RNAi表達(dá)盒包含SEQIDNO1所列的核苷酸序列。25.根據(jù)權(quán)利要求22所述的AAV載體，其中所述RNA表達(dá)產(chǎn)物還包含SEQIDNO2所列的靶序列。26.根據(jù)權(quán)利要求22所述的AAV載體，其中所述AAV是血清型9。27.一種增加肌質(zhì)網(wǎng)(SR)的鈣攝取的方法，包括使肌肉組織樣品與腺伴隨病毒(AAV)載體接觸，其中所述載體包含編碼RNAi表達(dá)產(chǎn)物的多核苷酸序列，由此增加SR中的鈣攝取。28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述RNAi包含在嚴(yán)格條件下與PLB靶基因mRNA的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，由此與接觸所述載體之前的收縮性相比增強(qiáng)心肌細(xì)胞的收縮性。29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述載體還包含SEQIDNO:1所列的核苷酸序列。30.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述RNAi包含SEQIDNO:2所列的靶序列。31.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述RNAi表達(dá)盒的RNA編碼區(qū)的表達(dá)造成PLB基因的表達(dá)下調(diào)。32.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述RNAi載體包含與PLB靶基因的RNA編碼區(qū)具有至少約90%同一性的序列。33.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中PLB基因表達(dá)被抑制至少10%。34.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述AAV基因組是自互補(bǔ)的。35.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述AAV是血清型9。36.一種試劑盒，包含i)腺伴隨病毒(AAV)載體，其中所述載體包含編碼導(dǎo)致受磷蛋白(PLB)的表達(dá)或PLB活性降低的RNAi表達(dá)產(chǎn)物的多核苷酸序列；)一種或多種緩沖液；iii)使用(i)和(ii)組成部分的說(shuō)明；以及iv)包含(i)、(ii)和(iii)組成部分的容器。37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的試劑盒，其中所述RNAi包含在嚴(yán)格條件下與PLB靶基因mRNA轉(zhuǎn)錄物的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。38.根據(jù)權(quán)利要求36所述的試劑盒，其中所述載體包含SEQIDNO:1所列的核苷酸序列。39.根據(jù)權(quán)利要求36所述的試劑盒，其中所述RNAi還包含SEQIDNO:2所列的靶序列。40.根據(jù)權(quán)利要求36所述的試劑盒，其中所述AAV是血清型9。41.一種診斷受治療者對(duì)所述受治療者胞內(nèi)鈣失調(diào)所致的慢性心力衰竭(HF)的RNAi治療的易感性的方法，該方法包括(a)使受治療者的肌肉組織樣品與腺伴隨病毒(AAV)載體接觸，其中所述載體包含編碼導(dǎo)致受磷蛋白(PLB)mRNA的表達(dá)或活性降低的RNAi表達(dá)產(chǎn)物的多核苷酸序列；和(b)確定所述肌肉組織樣品與AAV9載體接觸之前和之后所述組織樣品中肌質(zhì)網(wǎng)鈣ATP酶泵(SERCA)的活性，其中SERCA活性的增加與受治療者對(duì)HF的RNAi治療的易感性相關(guān)。42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述RNAi包含在嚴(yán)格條件下與PLB靶基因mRNA的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。43.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述載體包含SEQIDNO:1所列的核苷酸序列。44.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述RNAi還包含SEQIDNO2所列的靶序列。45.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述受治療者是人類。46.一種改善具有慢性心力衰竭的受治療者的存活的方法，該方法包括施用載體，其中所述載體包含編碼導(dǎo)致受磷蛋白(PLB)mRNA的表達(dá)或PLB活性降低和收縮功能改善的RNAi表達(dá)產(chǎn)物的多核苷酸序列，由此改善所述受治療者的存活。47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述RNAi包含在嚴(yán)格條件下與PLB靶基因mRNA的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。48.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述載體是病毒體或質(zhì)粒。49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述病毒體是細(xì)小病毒。50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中所述細(xì)小病毒是腺伴隨病毒(AAV)。51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中所述AAV是血清型9。52.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述病毒體包含SEQIDN0:1所列的核苷酸序列。53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中SEQIDNO1的側(cè)翼為AAV末端重復(fù)序列。54.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述RNAi還包含SEQIDNO2所列的靶序列。55.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述受治療者是人類。56.一種降低受治療者的室性心律失常的方法，該方法包括施用包含編碼RNAi表達(dá)產(chǎn)物的多核苷酸序列的載體，其中所述RNAi包含改善心室功能的核苷酸序列，由此降低所述受治療者的室性心律失常。57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述載體是病毒體或質(zhì)粒。58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中所述病毒體是細(xì)小病毒。59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中所述細(xì)小病毒是腺伴隨病毒(AAV)。60.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中所述AAV是血清型9。61.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中所述病毒體包含SEQIDNO:1所列的核苷酸序列。62.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述RNAi還包含SEQIDNO2所列的靶序列。63.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述受治療者是人類。全文摘要本發(fā)明涉及通過(guò)調(diào)節(jié)缺陷的心臟Ca2+穩(wěn)態(tài)而治療心力衰竭的靶向RNAi，所述調(diào)節(jié)是經(jīng)由使用腺伴隨病毒(AAV)轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞來(lái)降低受磷蛋白(PLB)的表達(dá)或活性。還公開(kāi)了在受治療者中降低室性心律失常的方法，以及全面改善心力衰竭存活的方法。此外，本發(fā)明提供了可用于診斷對(duì)RNAi治療的易感性的方法，并包括包含RNAi序列的藥物組合物、試劑盒和載體。文檔編號(hào)C12N15/63GK101970051SQ200880125234公開(kāi)日2011年2月9日申請(qǐng)日期2008年12月23日優(yōu)先權(quán)日2007年12月31日發(fā)明者亨利·費(fèi)克納,沃爾夫?qū)h.·波爾,羅杰·J·哈賈申請(qǐng)人:納諾科爾治療公司