專利名稱：攜帶修飾物的核苷酸及其制備方法和用于基因測序的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種攜帶修飾物的核苷酸及其制備 方法和用于基因測序的方法。
背景技術(shù)：
在傳統(tǒng)的基因測序技術(shù)中，采用的是雙脫氧鏈終止法(Sanger)。加入核苷酸到反 應(yīng)體系中進行DNA合成反應(yīng)，核苷酸上的堿基逐步結(jié)合到DNA待測模板的不同位點，在一次 合成結(jié)束時，由于每個堿基停止的位置不同，導(dǎo)致生成的各段DNA雙鏈長短不一，則利用電 泳將其分開，然后標記ATCG，根據(jù)不同的停止位點測定各堿基。目前采用的一種測序方法是首先將模板與引物雜交；然后加入DNA聚合酶和修 飾過的核苷酸，該核苷酸的3端-OH連接有熒光標記物(Fluorophore)，DNA聚合反應(yīng)時該 熒光標記物可使反應(yīng)暫停；反應(yīng)暫停時測定此處的堿基；最后去除3’端的熒光標記物，使 DNA聚合反應(yīng)繼續(xù)。由上可知，該方法采用將熒光標記物堵住核苷酸的3端-OH的方式來達 到暫停的目的，但是在后續(xù)去除熒光標記物時必須切除-0H，數(shù)次反應(yīng)之后將無法徹底切除 熒光標記物，這樣會導(dǎo)致反應(yīng)無法繼續(xù)進行，就不能測得更長的基因序列。目前采用的另一種測序方法，是基于焦磷酸的測序方法。測序合成反應(yīng)是基于常 規(guī)的合成方法，而信號檢測是通過對于焦磷酸的釋放過程的PPi的檢查，通過酶將PPi轉(zhuǎn)化 為光信號進行檢測。這種測序法是一種實時合成測序法，測序反應(yīng)中間并無暫停步驟。這 種方法的最大弱點是同聚物序列的檢測不準確，同樣的多個連續(xù)堿基的測量因為光信號的 線性度不準而測量不準。因此需要一種新的基因測序方法，能解決測序準確率低和測序長度較短的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種攜帶修飾物的核苷酸，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)測序準 確率低和測序長度較短的問題。為了實現(xiàn)發(fā)明目的，所述攜帶修飾物的核苷酸的結(jié)構(gòu)通式如下dNTP-R;式中 dNTP為核苷酸，修飾物-R連接在核苷酸中除脫氧核糖上-OH以外的位置，其包含至少一個 可切除位點、至少一個標記物。優(yōu)選地，，-R的結(jié)構(gòu)為-Rl_R2 ；其中，-Rl為第一修飾物，連接在堿基上；-R2是第 二修飾物，包含一個可切除位點、一個標記物。優(yōu)選地，所述第一修飾物-Rl攜帶氨基末端，第二修飾物-R2攜帶醛基末端，兩者 以酯鍵結(jié)合成為所述修飾物-R。優(yōu)選地，所述第一修飾物-Rl的結(jié)構(gòu)是長度為η的碳鏈并結(jié)合氨基末端， 即-CnHm-NH-，其中n、m均為正整數(shù)。優(yōu)選地，所述第二修飾物-R2的結(jié)構(gòu)為-R21-R22 ；其中，-R21是可切除位 點；-R22是標記物。
優(yōu)選地，所述可切除位點-R21的結(jié)構(gòu)由雙硫鍵構(gòu)成，即-S-S-，可通過還原劑打開。優(yōu)選地，所述可切除位點-R21為吡喃醇結(jié)構(gòu)，即
權(quán)利要求
一種攜帶修飾物的核苷酸，結(jié)構(gòu)通式如下dNTP R；式中dNTP為核苷酸，其特征在于修飾物 R連接在核苷酸中除脫氧核糖上 OH以外的位置，其包含至少一個可切除位點、至少一個標記物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的攜帶修飾物的核苷酸，其特征在于，-R的結(jié)構(gòu)為CR1-R2；其中，-R1為第一修飾物，連接在堿基上；-R2是第二修飾物，包含一個可切除位點、一個標記物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的攜帶修飾物的核苷酸，其特征在于，所述第一修飾物-R1攜帶 氨基末端，第二修飾物-R2攜帶醛基末端，兩者以酯鍵結(jié)合成為所述修飾物-R。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的攜帶修飾物的核苷酸，其特征在于，所述第一修飾物-R1的結(jié) 構(gòu)是長度為η的碳鏈并結(jié)合氨基末端，即-CnHm-NH-,其中n、m均為正整數(shù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的攜帶修飾物的核苷酸，其特征在于，所述第二修飾物-R2的結(jié) 構(gòu)為-R21-R22 ；其中，-R21是可切除位點；-R22是標記物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的攜帶修飾物的核苷酸，其特征在于，所述可切除位點-R21的 結(jié)構(gòu)由雙硫鍵構(gòu)成，即-s-s-，可通過還原劑打開。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的攜帶修飾物的核苷酸，其特征在于，所述可切除位點-R21為 吡喃醇結(jié)構(gòu)，即γ0γ0\可在其6h位置的C-O鍵打開。，
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的攜帶修飾物的核苷酸，其特征在于，所述標記物-R22包括熒 光標記物，或生物素標記物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的攜帶修飾物的核苷酸，其特征在于，核苷酸dNTP包括dATP、 dGTP、dCTP、dUTP。
10.一種攜帶修飾物的核苷酸的制備方法，其特征在于，所述方法包括將脫氧核糖上-OH以外的位置連有第一修飾物-R1的核苷酸，與帶有可切除位點的第 二修飾物-R2進行反應(yīng)，結(jié)合成為攜帶修飾物的核苷酸dNTP-R。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的攜帶修飾物的核苷酸的制備方法，其特征在于，所述方法 包括A.將第一修飾物-R1連接到核苷酸中除脫氧核糖上-OH以外的位置，生成ClNTP-R1；B.對標記物進行修飾，生成帶有一可切除位點的第二修飾物-R2；C.將連有第一修飾物的核苷酸ClNTP-R1與第二修飾物-R2結(jié)合，生成所述攜帶修飾物 的核苷酸dNTP-R ；其中，所述步驟A和B無先后順序。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的攜帶修飾物的核苷酸的制備方法，其特征在于，所述方法 包括Al.將攜帶氨基末端的第一修飾物-R1連接到核苷酸中除脫氧核糖上-OH以外的位置； Bi.對標記物進行修飾，生成帶有一可切除位點及醛基末端的第二修飾物-R2 ； Cl.將步驟Al中攜帶氨基末端的核苷酸，與攜帶醛基末端的第二修飾物-R2進行反應(yīng)， 以酯鍵結(jié)合，生成所述攜帶修飾物的核苷酸； 其中，所述步驟Al和Bl無先后順序。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的攜帶修飾物的核苷酸的制備方法，其特征在于，所述步驟 Al包括將結(jié)構(gòu)為-CnHm-NH2的氨基修飾物結(jié)合到核苷酸中的堿基上，其中n、m均為正整數(shù)。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的攜帶修飾物的核苷酸的制備方法，其特征在于，所述步驟 Bl包括Bll.對標記物進行化學(xué)修飾，使其包含一可切除位點；B12對標記物進行醛基修飾，生成攜帶醛基末端的第二修飾物_R2。
15.根據(jù)權(quán)利要求11、12或14所述的攜帶修飾物的核苷酸的制備方法，其特征在于，所 述可切除位點的生成過程包括對標記物進行化學(xué)修飾，生成雙硫鍵-S-S-作為可切除位點。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的攜帶修飾物的核苷酸的制備方法，其特征在于，所述步驟 Bll包括對標記物進行化學(xué)修飾，生成吡喃醇結(jié)構(gòu)作為可切除位點，即
17.一種利用攜帶修飾物的核苷酸進行基因測序的方法，其特征在于，在所述攜帶修飾 物的核苷酸dNTP-R中，修飾物-R連接在核苷酸中除脫氧核糖上-OH以外的位置，其包含至 少一個可切除位點、至少一個標記物，所述方法包括以下步驟A.利用攜帶修飾物的核苷酸dNTP-R在至少一個DNA待測模板上的第N個待測位點進 行延伸反應(yīng)，并通過所述標記物采集第N個待測位點對應(yīng)的熒光信號，其中N為正整數(shù)；B.從核苷酸中除脫氧核糖上-OH以外的位置切除修飾物，并回到步驟A以采集第N+1 個待測位點對應(yīng)的熒光信號；C.對采集到的熒光信號進行數(shù)據(jù)處理，確定待測位點的堿基；所述步驟B和C無先后順序。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的基因測序的方法，其特征在于，所述攜帶修飾物的核苷酸 dNTP-R 包括 4 種dATP-R、dGTP-R、dCTP-R、dUTP-R,則所述步驟 A 包括對于DNA待測模板上的任一待測位點，采用上述4種不同的核苷酸逐次進行延伸反應(yīng)， 并采集每次反應(yīng)結(jié)束后所述待測位點對應(yīng)的熒光信號，作為與所述任一待測位點對應(yīng)的一 組數(shù)據(jù)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的基因測序的方法，其特征在于，若N=1，則所述步驟A采 集第1個待測位點對應(yīng)的熒光信號的過程包括Al.將4種攜帶修飾物的核苷酸dNTP-R逐次與DNA待測模板上的引物進行延伸反應(yīng)；A2.對逐次反應(yīng)中標記物受激發(fā)產(chǎn)生的熒光信號進行采集，得到與第1個待測位點對應(yīng)的一組數(shù)據(jù)。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的基因測序的方法，其特征在于，若N= M> 1，則所述步驟 A采集第M個待測位點對應(yīng)的熒光信號的過程包括Al’.將4種攜帶修飾物的核苷酸dNTP-R逐次與前一個核苷酸的3’端進行延伸反應(yīng)； A2’ .對逐次反應(yīng)中標記物受激發(fā)產(chǎn)生的熒光信號進行采集。
21.根據(jù)權(quán)利要求17至20中任一項所述的基因測序的方法，其特征在于，若標記物是 熒光標記物，則對所述熒光信號進行采集的過程包括A21.利用激發(fā)光源照射所述標記物，產(chǎn)生熒光信號；A22.通過圖像采集方式或光電轉(zhuǎn)換方式，對所述熒光信號進行采集。
22.根據(jù)權(quán)利要求17至20中任一項所述的基因測序的方法，其特征在于，若標記物是 生物素標記物，則在所述步驟A21之前還包括A20.將帶有熒光標記的鏈酶親和素與所述生物素標記物結(jié)合。
23.根據(jù)權(quán)利要求17所述的基因測序的方法，其特征在于，若可切除位點的結(jié)構(gòu)由雙 硫鍵構(gòu)成，即-S-S-，則所述步驟B中切除修飾物的過程包括通過還原劑打開雙硫鍵。
24.根據(jù)權(quán)利要求17所述的基因測序的方法，其特征在于，若可切除位點為吡喃醇結(jié) 構(gòu)，即則所述步驟B中切除修飾物的過程包括
25.根據(jù)權(quán)利要求17所述的基因測序的方法，其特征在于，所述步驟C中的數(shù)據(jù)處理包括對與任一待測位點對應(yīng)的一組數(shù)據(jù)進行實時的數(shù)據(jù)處理；或 將多個待測位點對應(yīng)的各組數(shù)據(jù)進行非實時的集中數(shù)據(jù)處理。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的基因測序的方法，其特征在于，所述步驟C包括Cl.對于DNA待測模板上的任一待測位點，比較同一組數(shù)據(jù)中的多個熒光信號值，確定 成功的延伸反應(yīng)；C2.根據(jù)延伸反應(yīng)采用的對應(yīng)的核苷酸，通過堿基互補配對原則確定所述待測位點的堿基。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種攜帶修飾物的核苷酸及其制備方法和用于基因測序的方法。所述攜帶修飾物的核苷酸，結(jié)構(gòu)通式為dNTP-R；式中dNTP為核苷酸，修飾物-R連接在核苷酸中除脫氧核糖上-OH以外的位置，其包含至少一個可切除位點、至少一個標記物。其制備方法包括將脫氧核糖上-OH以外的位置連有第一修飾物-R1的核苷酸，與帶有可切除位點的第二修飾物-R2進行反應(yīng)，結(jié)合成為攜帶修飾物的核苷酸dNTP-R。此外，本發(fā)明還提供了一種利用攜帶修飾物的核苷酸進行基因測序的方法。利用本發(fā)明提供的攜帶修飾物的核苷酸進行基因測序，既能提高測序的準確率，又能測得更長的基因序列。
文檔編號G01N21/64GK101942000SQ201010155269
公開日2011年1月12日 申請日期2010年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月13日
發(fā)明者盛司潼 申請人:深圳華因康基因科技有限公司