肌 酸鈉濃度，繪制穿透曲線，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，以lBV/h和2BV/h的上樣速度上樣， 傳透體積更小，因此選擇lBV/h或2BV/h的速度上樣。
[0049] 3)洗脫劑濃度的選擇
[0050] 取上樣后的樹脂200g分為4份，用0? 05M、0. 2M、0. 4M、0. 8M的氯化鎂作為洗脫溶 液（500ml)進(jìn)行洗脫；分析各濃度下的洗脫液中的成分及含量，結(jié)果表2所示。
[0051] 表2、不同濃度的洗脫劑洗脫結(jié)果
[0052]
[0054] 結(jié)果顯示，0. 05M洗脫劑對(duì)肌酸的洗脫效果好，而對(duì)其他組分的解析率低；0. 4M洗 脫劑和0. 8M洗脫劑對(duì)肌酸、磷酸肌酸鈉的解析率均較好，但是0. 8M洗脫劑對(duì)AMP、ATP和 ADP的解析率也較高。因此可以使用，0. 05M的洗脫劑洗脫肌酸，然后用0. 4M洗脫劑洗脫磷 酸肌酸鈉能夠獲得純度較高的磷酸肌酸鈉。
[0055] 本實(shí)施例也可以使用氯化銨、氯化鈉或氯化鋅等電解質(zhì)作為洗脫劑，同樣能夠?qū)?現(xiàn)發(fā)明目的。
[0056] 4)洗脫液流速的考察
[0057] 根據(jù)洗脫劑濃度的選擇結(jié)果，擬定采取如下的洗脫程序：先用0. 05M溶液進(jìn)行洗 脫，監(jiān)測(cè)肌酸的含量，當(dāng)流出液無肌酸時(shí)再用〇. 4M溶液進(jìn)行洗脫并監(jiān)測(cè)磷酸肌酸的濃度。 分別以lBV/h、2BV/h、4BV/h、8BV/h的流速進(jìn)行洗脫，其結(jié)果如圖3和4所示。結(jié)果顯示，以 lBV/h和2BV/h的流速洗脫能夠以最少的洗脫液將肌酸和磷酸肌酸洗脫下來。
[0058] 三、精制（結(jié)晶）
[0059] ①不同乙醇濃度對(duì)結(jié)晶的影響
[0060] 分別取4份20ml經(jīng)樹脂純化后的溶液，含磷酸肌酸鈉濃度為16mg/ml，各加入適量 的無水乙醇，使其濃度為60 %、70 %、80 %、90 %，20°C靜置24h，然后檢測(cè)磷酸肌酸鈉的收 率和純度，結(jié)果如表3所不。
[0061 ] 表3、不同乙醇濃度對(duì)結(jié)晶的影響 [0062]
[0063] 結(jié)果顯示，乙醇濃度對(duì)磷酸肌酸鈉純度較小，而乙醇濃度越高，收率越高。
[0064] ②不同濃度的磷酸肌酸鈉對(duì)結(jié)晶的影響
[0065] 分別取含磷酸肌酸鈉濃度為8mg/ml、12mg/ml、16mg/ml的溶液20ml，加入4倍量的 用無水乙醇，20°C靜置24h，然后檢測(cè)磷酸肌酸鈉的收率和純度，結(jié)果如表4所示。
[0066] 表4、不同磷酸肌酸鈉濃度對(duì)結(jié)晶的影響
[0067]
[0068]
[0069] 結(jié)果顯示，磷酸肌酸鈉濃度對(duì)磷酸肌酸鈉的純度影響較小，而磷酸肌酸鈉濃度越 高，收率也約高。
[0070] ③不同溫度對(duì)結(jié)晶的影響
[0071 ] 分別取4份含磷酸肌酸鈉濃度為16mg/ml的溶液20ml，加入4倍量的用無水乙醇， 于-20°C、4°C、15°C、20°C靜置24h，然后檢測(cè)磷酸肌酸鈉的收率和純度，結(jié)果如表5所示。
[0072] 表5、不同溫度對(duì)結(jié)晶的影響
[0073]
[0074] 結(jié)果顯示，溫度對(duì)磷酸肌酸鈉的純度影響較小，而溫度越低收率越高。
[0075] 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)可以得到，用40 %~60 %的乙醇預(yù)處理，可以將以除去肌酸、ATP、 ADP，而50%的乙醇進(jìn)行預(yù)處理效果最佳，能除去80%的肌酸、ATP、ADP;色譜純化過程中1# 陰離子樹脂對(duì)磷酸肌酸鈉吸附能力最強(qiáng)，以此作為工作樹脂，在1~2BV/h的流速上樣均 可，2BV/h的流速進(jìn)行上樣最佳；上樣完后，用0. 05M的洗脫液以2BV/h-4BV/h的速度進(jìn)行 肌酸的洗脫，用0. 4M的洗脫液以4BV/h的速度對(duì)磷酸肌酸鈉進(jìn)行洗脫；洗脫液通過濃縮，使 磷酸肌酸鈉的濃度在3011^/ 1111以上，最后用80%的乙醇，在15-20°(：環(huán)境中靜置24-4811，抽 濾、減壓干燥得磷酸肌酸鈉。
[0076] 四、磷酸肌酸鈉的定性
[0077] 1、磷酸肌酸鈉定性分析
[0078] 分別取上述純化的磷酸肌酸鈉和磷酸肌酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度為0. 4mg/ml的溶 液，然后在200-400nm掃描，結(jié)果如圖5所示。紅外光譜掃描結(jié)果如圖6所示。結(jié)果顯示， 自制樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的紫外光譜圖和紅外光譜圖均一致，說明通過本發(fā)明純化得到的樣品為 磷酸肌酸鈉。
[0079] 2、色譜分析ATP系列物質(zhì)
[0080] 將上述純化的磷酸肌酸鈉用十八烷基鍵合硅膠為填充劑；以0. 2mol/L磷酸鹽緩 沖液（取磷酸氫二鈉35. 8g、磷酸二氫鉀13. 6g，加水900ml溶解，加入50ml含量為10%的四 丁基氫氧化銨溶液，調(diào)pH到7. 0,加水定容到1000ml)-甲醇（95:5)為流動(dòng)相；柱溫35°C，檢 測(cè)波長(zhǎng)210nm。供試品配制成含磷酸肌酸鈉的濃度為0. 4mg/ml的溶液，備用；然后取10y1 進(jìn)樣，記錄色譜圖，如圖7所示。結(jié)果顯示純化的磷酸肌酸鈉中不含有ATP系列物質(zhì)，純度 較高。
[0081] 3、色譜分析磷酸肌酸鈉系列有關(guān)物質(zhì)
[0082] 樣品配制與上述相同，同時(shí)配置相同濃度的磷酸肌酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品
[0083] 然后用十八烷基鍵合硅膠為填充劑；0. 5%的四丁基氫氧化銨為流動(dòng)相；柱溫 35°C，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，結(jié)果如圖8所示。結(jié)果顯示，檢測(cè)出現(xiàn)單一的峰，表明純化的磷酸肌 酸鈉純度較高。
[0084] 4、總回收率及純度測(cè)定
[0085] 由投料開始計(jì)算，到最終得到所需固體，其總的回收率大于40%。對(duì)結(jié)晶干燥后的 固體，按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，符合規(guī)定，其純度達(dá)到了 99. 80%左右；洗脫劑< 0.002%，在安全 限度以內(nèi)。
[0086] 最后說明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通 過上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在 形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 磷酸肌酸鈉的純化方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 將磷酸肌酸鈉母液用體積分?jǐn)?shù)為40~70%的乙醇預(yù)處理； (2) 將預(yù)處理后的磷酸肌酸鈉母液上樣，上樣完后，用0. 02~0. 15M的電解質(zhì)溶液作為 洗脫液洗脫肌酸，然后用〇. 2~0. 8M電解質(zhì)溶液作為洗脫液洗脫磷酸肌酸鈉，收集洗脫液， 結(jié)晶，干燥，得磷酸肌酸鈉。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述磷酸肌酸鈉的純化方法，其特征在于：所述電解質(zhì)溶液為氯化 鎂、氯化銨、氯化鈉、硫酸鈉或氯化鋅。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述磷酸肌酸鈉的純化方法，其特征在于：所述步驟（1)為將磷酸 肌酸鈉母液用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇預(yù)處理。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述磷酸肌酸鈉的純化方法，其特征在于：所述磷酸肌酸鈉母 液含有肌酸、磷酸肌酸鈉、ADP、ATP、鎂離子、AMP和氯離子。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述磷酸肌酸鈉的純化方法，其特征在于：所述磷酸肌酸鈉母液由 肌酸：ATP的摩爾比在2:1~10:1的范圍內(nèi)、在溫度為0~40°C、pH為7~11，鎂離子摩爾 濃度為〇. 5~5倍ATP，在固定化兔肌肌酸激酶催化下反應(yīng)制得。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述磷酸肌酸鈉的純化方法，其特征在于：步驟（2)中，所述上樣的 流速為1~4BV/h。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述磷酸肌酸鈉的純化方法，其特征在于：步驟（2)中，所述洗脫肌 酸的速度為lBV/h-4BV/h。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述磷酸肌酸鈉的純化方法，其特征在于：步驟（2)中，所述洗脫磷 酸肌酸鈉的速度為4BV/h。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述磷酸肌酸鈉的純化方法，其特征在于：步驟（2)中，所述結(jié)晶為 在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80-90%、溫度為4~30°C條件下靜置12h以上。
【專利摘要】本發(fā)明公開了磷酸肌酸鈉的純化方法，具體步驟為：將磷酸肌酸鈉母液用體積分?jǐn)?shù)為40～70％的乙醇預(yù)處理，然后將預(yù)處理后的磷酸肌酸鈉母液上樣，上樣后，用0.02～0.15M的電解質(zhì)溶液作為洗脫液洗脫肌酸，然后用0.2～0.8M的電解質(zhì)溶液作為洗脫液洗脫磷酸肌酸鈉，收集洗脫液，結(jié)晶，干燥，得磷酸肌酸鈉；本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單，不需要引入硫酸根和鋇，安全性好，并且制得的磷酸肌酸鈉回收率高，為40％，純度達(dá)到99.80％，符合藥用要求。
【IPC分類】C07F9/22
【公開號(hào)】CN105153222
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510679640
【發(fā)明人】陳真文, 廖鳳霞, 李玉林, 程永剛, 肖中元, 郭偉, 毛先兵
【申請(qǐng)人】西南藥業(yè)股份有限公司
【公開日】2015年12月16日
【申請(qǐng)日】2015年10月16日