磷酸肌酸鈉的純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及磷酸肌酸鈉的純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 磷酸肌酸是人體內(nèi)的活性物質(zhì)。該物質(zhì)現(xiàn)以磷酸肌酸鈉四水合物的形式用于臨 床，主要用于治療心學(xué)管疾病和代謝性疾病。該藥市場巨大，前景廣闊，用藥人群廣泛。在 文獻報道中，現(xiàn)有的磷酸肌酸鈉的純化工藝是沉淀法或樹脂分離法。沉淀法會引入硫酸根 離子和鋇離子；吉林英聯(lián)制藥公司所用的樹脂分離法也引入了硫酸根和鋇離子；上述兩種 離子的毒性非常的大，因此要求在產(chǎn)品中的殘留非常的低，而這一要求提高了純化和結(jié)晶 的難度，同時為得到合格的產(chǎn)品而降低了收率。有的樹脂分離法使用的是氯化鈣進行洗脫， 盡管未引入硫酸根和鋇，但由于磷酸肌酸鈣在水中的溶解度極低，因此該方法生產(chǎn)效率也 非常低。
[0003] 為解決上述問題，急需一種安全性高、生產(chǎn)效率也高的磷酸肌酸鈉純化方法，純化 的磷酸肌酸鈉符合藥用要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供磷酸肌酸鈉的純化方法，安全性好、生產(chǎn)效率 尚。
[0005] 為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0006] 磷酸肌酸鈉的純化方法，包括如下步驟：
[0007] 1、磷酸肌酸鈉的純化方法，包括如下步驟：
[0008] (1)將磷酸肌酸鈉母液用體積分數(shù)為40~70%的乙醇預(yù)處理；
[0009] (2)將預(yù)處理后的磷酸肌酸鈉母液上樣，上樣完后，用0. 02~0. 15M的電解質(zhì)溶液 作為洗脫液洗脫肌酸，然后用〇. 2~0. 8M電解質(zhì)溶液作為洗脫液洗脫磷酸肌酸鈉，收集洗 脫液，結(jié)晶，干燥，得磷酸肌酸鈉。
[0010] 優(yōu)選的，所述電解質(zhì)溶液為氯化鎂、氯化銨、氯化鈉或氯化鋅。
[0011] 優(yōu)選的，所述步驟（1)為將磷酸肌酸鈉母液用體積分數(shù)為50%的乙醇預(yù)處理。
[0012] 更優(yōu)選的，所述磷酸肌酸鈉母液含有肌酸、磷酸肌酸鈉、ADP、ATP、鎂離子、AMP和氯 離子。
[0013] 更優(yōu)選的，所述磷酸肌酸鈉母液由肌酸：ATP的摩爾比在2:1~10:1的范圍內(nèi)、在 溫度為〇~40°C、pH為7~11，鎂離子摩爾濃度為0. 5~5倍ATP，在固定化兔肌肌酸激酶 催化下反應(yīng)制得。
[0014] 優(yōu)選的，步驟（2)中，所述上樣的流速為1~4BV/h。
[0015] 優(yōu)選的，步驟（2)中，所述洗脫肌酸的速度為lBV/h-4BV/h。
[0016] 優(yōu)選的，步驟（2)中，所述洗脫磷酸肌酸鈉的速度為4BV/h。
[0017] 優(yōu)選的，步驟（2)中，所述結(jié)晶為在乙醇體積分數(shù)為80%-90%、、溫度為4~30°C 條件下靜置12h以上結(jié)晶。
[0018] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供的磷酸肌酸鈉的純化方法，該方法不需要使 用硫酸根和鋇離子，因此安全性好，并且生產(chǎn)效率高，磷酸肌酸鈉收率大于40%，純度高達 99. 80%，符合藥用要求。
【附圖說明】
[0019] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0020] 圖1為最大吸附量試驗結(jié)果。
[0021] 圖2為不同上樣速度的穿透曲線。
[0022] 圖3為不同速度洗脫肌酸的試驗結(jié)果。
[0023] 圖4為不同速度洗脫磷酸肌酸鈉的試驗結(jié)果。
[0024] 圖5為自制樣品和磷酸肌酸鈉標(biāo)準品200~400nm掃描光譜圖（A:自制樣品；B: 磷酸肌酸鈉標(biāo)準品）。
[0025] 圖6為自制樣品和磷酸肌酸鈉標(biāo)準品標(biāo)準品紅外光譜圖。
[0026] 圖7為色譜分析ATP系列物質(zhì)色譜圖。
[0027] 圖8為色譜分析磷酸肌酸鈉色譜圖。
【具體實施方式】
[0028] 下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體 條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0029] 本發(fā)明中純化的磷酸肌酸鈉樣品為是由肌酸：ATP的摩爾比在2:1~10:1的范圍 內(nèi)、反應(yīng)時間在6h左右、溫度5~40 °C范圍內(nèi)、pH在9~11、鎂離子濃度應(yīng)在0. 5~1.5倍 ATP濃度范圍內(nèi)，在固定化兔肌肌酸激酶催化下反應(yīng)的產(chǎn)物，以下簡稱為磷酸肌酸鈉母液。 母液中含大量的肌酸、磷酸肌酸鈉、ADP、ATP、鎂離子，少量的AMP和氯離子。
[0030] 兔肌肌酸激酶由以下方法制備：
[0031] (1)取冷凍的兔大腿肌肉380g，去除結(jié)締組織和神經(jīng)后切成小塊，然后加入 1100ml濃度為0? 01mol/LKC1，再用絞肉機將兔肉打碎；
[0032] (2)將打碎的兔肉用縫隙為2ym左右的膠體磨破碎5~10分鐘；然后在室溫 (25°C)下攪拌提取30min后，再在0°C條件下，以8000r/min離心lOmin，棄去沉淀，收集上 清液，記為VI;
[0033] (3)在VI中加入研細的NH4C1 至NH4C1 濃度為 0?lmol/L，用 5mol/LNH40H調(diào)pH至 9.0,然后于室溫（25°C)下攪拌30min，加入1.5倍VI體積的95%冷乙醇，再在室溫（25°C) 下攪拌2. 5h，接著在0°C、8000r/min條件下離心lOmin，棄沉淀，再次收集上清液，記為V2， 取樣備用；
[0034] (4)在V2中加入2mol/L的MgS04(pH= 8. 5)至終濃度為0? 03mol/L，然后逐滴補 加相當(dāng)于MgSCVf^R1. 5倍的95%的冷乙醇，加畢攪拌30min，再在0°C、8000r/min條件下 離心10min，棄上清液，收集沉淀；
[0035] (5)將步驟⑷收集的沉淀稱重，取少量的沉淀用pH9. 0甘氨酸緩沖液進行溶解 后，記為V3,備用；剩余的沉淀-20°C保存。
[0036] 本工藝，酶的回收率為9. 2%，純化倍數(shù)為6. 7,純度90%左右，符合要求。
[0037] 然后將制得的兔肌肌酸激酶以樹脂A為載體進行固定化，其參數(shù)為：酶活力 (IU):樹脂（g)彡 100、25-35°C范圍內(nèi)、2-5h、pH8-10 ;固定化酶收率 37.4%，活性2611]/8， 半衰期265h，最適pH9-ll，最適溫度25-35°C。
[0038] 由于磷酸肌酸鈉母液中含大量的肌酸、磷酸肌酸鈉、ADP、ATP、鎂離子，少量的AMP、 氯離子。其中鎂離子為陽離子，在陰離子樹脂上不吸附；氯離子在氯型陰離子樹脂上無吸 附；肌酸在PH7. 0的環(huán)境中為兩性離子狀體，理論上在陰離子樹脂上也不吸附，實際情況下 有極少部分肌酸吸附；AMP的含量非常低，可忽略不計。磷酸肌酸鈉、ADP、ATP均有磷酸根， 在pH7. 0環(huán)境中均呈陰離子狀態(tài)，且磷酸肌酸鈉的電荷數(shù)<ADP<ATP。因此可用陰離子樹 脂將上述三種物質(zhì)吸附到樹脂上，并且樹脂對ADP和ATP的選擇能力強，因此可以通過洗脫 劑進行分步洗脫從而達到分離的目的。
[0039] 一、磷酸肌酸鈉母液預(yù)處理
[0040] 肌酸、磷酸肌酸鈉、ADP、ATP均微溶于乙醇，在不同濃度的乙醇溶液中，各物質(zhì)的溶 解度不一樣，因此取3份磷酸肌酸鈉母液適量，每份溶液加入無水乙醇，使乙醇的體積分數(shù) 分別為40%、50%、60%，溶液產(chǎn)生沉淀，檢測上清液各成分的含量，結(jié)果如表1所示。
[0041 ] 表1、反應(yīng)液預(yù)處理試驗結(jié)果
[0042]
[0043] 由表1可知，磷酸肌酸鈉母液各組分在水-乙醇體系中的溶解度不一致；在50% 時，溶液中的ATP+ADP的摩爾數(shù)之和/磷酸肌酸鈉摩爾數(shù)由原來的2~1. 25:1變?yōu)?:3. 3， 磷酸肌酸鈉損失20%左右；40%的乙醇處理后，ATP和ADP殘留太多；而60%的乙醇處理， 磷酸肌酸鈉的損失在40%左右。綜合考慮，最終確定用50%的乙醇進行預(yù)處理，不僅極大 的提高了樹脂對磷酸肌酸鈉的交換容量，同時也提高了純化的效率，降低了生產(chǎn)成本。
[0044] 二、動態(tài)吸附與洗脫
[0045] 1)最大吸附量
[0046] 將選擇好的1#陰離子樹脂經(jīng)過活化處理后，稱取100g裝柱，以lBV/h的流速上樣 預(yù)處理后的反應(yīng)液，測定其最大吸附量，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，測定700ml的流出液， 其磷酸肌酸鈉含量為3. 58mg/ml，共吸附4844mg。每克濕樹脂在該情況下對磷酸肌酸鈉的 最大吸附量為48mg左右。
[0047] 2)上樣流速的選擇
[0048] 分別以lBV/h、2BV/h、4BV/h、8BV/h的上樣速度進行上樣，監(jiān)測流出液中的磷酸