專利名稱：磷酸肌酸二鈉鹽中雜質(zhì)的檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種磷酸肌酸二鈉鹽注射劑中雜質(zhì)的高效液相色譜檢測方法。
背景技術：
磷酸肌酸二鈉鹽是一種心肌保護劑，臨床用于心麻痹癥的心臟保護及心肌代謝窘迫的其他狀況，如心肌缺血、肥厚、心梗及心衰的治療。由于存在高能磷酸鍵，磷酸肌酸二鈉鹽在有水和質(zhì)子存在下，極易分解為磷酸鹽和肌酸；儲存過程中還會生成肌酸酐以及磷酸肌酸酐等雜質(zhì)；同時，該藥物極性大，只溶解于水，不溶于甲醇、乙醇等常用溶劑，制備過程中不容易除去水溶性的無機鹽，包括磷酸鹽、氯化物等。我們試驗發(fā)現(xiàn)，當產(chǎn)品中含有按重量比1％的無機磷酸鹽時，產(chǎn)品無法通過異常毒性檢查。該檢查方法依據(jù)《中華人民共和國藥典》2005年版二部附錄“注射劑異常毒性”規(guī)定執(zhí)行。
但是現(xiàn)有的檢測方法為無法檢測到無機磷酸鹽，比如文獻1“磷酸肌酸含量測定方法的研究”(郝蘇麗、劉金秀；《藥物分析雜志》，2003，23(4)，341)采用特異性聯(lián)合酶測定法測定含量，沒有檢測雜質(zhì)。文獻2“離子對色譜法測定磷酸肌酸二鈉鹽的穩(wěn)定性”(祁廣建、沈國英；《中國醫(yī)院藥學雜志》，2004，24(1)，11)和文獻3“高效液相色譜法測定磷酸肌酸二鈉鹽含量及應用”(張曉平、米沙天等；《天津藥學》，2003，15(1)，18)以及文獻4“反相離子對高效液相色譜法測定磷酸肌酸二鈉鹽的含量”(于忠輝、張寧等；《中國藥物與臨床》，2005，5(11)，865)，均用波長210nm的紫外檢測進行HPLC測定，該方法無法檢測沒有紫外吸收的磷酸鹽和其他無機鹽。只有用核磁共振儀進行P32NMR檢測是可以發(fā)現(xiàn)磷酸肌酸二鈉鹽中無機磷酸鹽，并根據(jù)磷元素信號的積分面積估計不同物質(zhì)中磷的相對量；但是這種核磁共振檢測儀器無法作為常規(guī)檢驗儀器使用，也不能定量檢測雜質(zhì)含量。
也就是說目前沒有好的方法控制其磷酸肌酸二鈉鹽生產(chǎn)及儲存過程存在的影響藥品質(zhì)量的雜質(zhì)。磷酸肌酸二鈉鹽本身以及其有機雜質(zhì)的紫外吸收光譜上，只有末端吸收，如210nm，無機雜質(zhì)根本就沒有紫外吸收。靠近紫外末端吸收，流動相及雜質(zhì)干擾也較大，沒有紫外吸收的根本就測不到，因此測定困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的測定磷酸肌酸二鈉鹽中有關雜質(zhì)的方法，特別是對于無機磷酸鹽的檢測控制。本發(fā)明所提供的檢測方法篩選出最佳的揮發(fā)性的離子對色譜流動相，采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測方法來測定磷酸肌酸二鈉鹽的全部已知有關雜質(zhì)，該方法也適用于磷酸肌酸二鈉鹽生產(chǎn)中的任何一步中間體的檢查。
本發(fā)明方法的特點在于采用蒸發(fā)光散射檢測器。蒸發(fā)光散射檢測器是一種質(zhì)量型、通用型檢測器，適合非揮發(fā)性成分的檢測，其響應信號只與樣品的濃度大小有關而與樣品分子中是否含有發(fā)色基團或其他光學、電學特性基團無關。另外，為適應蒸發(fā)光散射檢測器對流動相的要求，本發(fā)明篩選出揮發(fā)性良好的戊胺為離子對試劑加入流動性中，以離子對色譜的機理將氯離子、肌酸、肌酐、磷酸氫根和磷酸肌酸根在同一色譜系統(tǒng)分離測定。具體方法采用反相十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相；乙腈、甲醇或者甲醇和乙腈的混合液作為有機相；戊胺的水溶液作為水相(pH值用甲酸調(diào)到5.0-7.0之間)，有機相與水相以體積比0∶100～10∶90混合均勻為流動相。
本發(fā)明方法包括以下內(nèi)容色譜條件為1、色譜柱反相十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的分析型HPLC色譜柱。
2、流動相有機相為甲醇或乙腈，水相為含5～30mmol戊胺，用甲酸調(diào)pH值為5.0-7.0，取有機相與水相以體積比0∶100到10∶90混合即得；優(yōu)選的條件是乙腈-水溶液(含20mmol戊胺，甲酸調(diào)pH6.5)＝2∶98；采用等度洗脫。
3、流速0.5～1.5mL/min。
4、柱溫15℃～35℃；優(yōu)選25℃。
5、蒸發(fā)光散射檢測器的霧化溫度為60～80℃，優(yōu)選70℃；汽化溫度95～105℃；優(yōu)選100℃；以潔凈空氣或者氮氣作為霧化氣，霧化器流速為1.0～2.0L/min，優(yōu)選1.5L/min。
測定方法取肌酸，肌酐，氯化鈉，磷酸氫二鈉為已知雜質(zhì)對照品，配制成分別含有25～100μg/mL的混合水溶液作為對照品溶液，取磷酸肌酸二鈉鹽配制成1～10mg/mL的水溶液作為供試品溶液。分別取20～100μl進樣，記錄色譜圖，供試品色譜圖的雜質(zhì)峰面積不得大于對照品的峰面積(1.0％)。
系統(tǒng)適用性的要求將肌酸，肌酐，氯化鈉，磷酸氫二鈉等已知雜質(zhì)對照品加入到磷酸肌酸二鈉鹽對照品配制的溶液中，用上述HPLC檢查，各色譜峰這間的分離度應符合《中國藥典》2005年版二部附錄28頁關于高效液相色譜法關于系統(tǒng)適用性的規(guī)定，各雜質(zhì)峰的理論塔板數(shù)應不低于2000。
各雜質(zhì)和磷酸肌酸二鈉鹽在色譜中洗脫順序參見附圖1。
本發(fā)明的有益效果1、本發(fā)明采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法測定磷酸肌酸二鈉鹽的有關物質(zhì)，靈敏度高、可靠性強，適用于磷酸肌酸二鈉鹽合成過程中中間體的檢查及自身的質(zhì)量控制。
2、本發(fā)明方法操作簡捷，準確，快速。


附圖1磷酸肌酸二鈉鹽中有關雜質(zhì)的HPLC色譜圖。
說明色譜峰A為鈉等在色譜柱上無保留的陽離子；色譜峰B為肌酸；色譜峰C為肌酐；色譜峰D為氯化鈉；色譜峰E為磷酸氫二鈉，色譜峰F為磷酸肌酸二鈉鹽。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步闡述，但不限制本發(fā)明。
實施例 磷酸肌酸二鈉鹽有關雜質(zhì)測定1材料1.1儀器和材料Water515HPLC泵；手動進樣；SEDEX85LT-ELSD蒸發(fā)光散射檢測器。
1.2藥品與試劑乙腈色譜純(Tedia公司)；水蒸餾水；氯化鈉對照品中國醫(yī)藥上海化學試劑公司，批號F20030506，分析純；磷酸氫二鈉對照品上海新華化工廠，批號030701，分析純；肌酸對照品中國醫(yī)藥上海化學試劑公司，批號F20030506，分析純；肌酐對照品中國醫(yī)藥上海化學試劑公司，批號F20030506，分析純；供試樣品海南奇力制藥有限公司生產(chǎn)的磷酸肌酸二鈉鹽樣品。
1.3對照品儲備液用水將肌酸、肌酐、氯化鈉、磷酸氫二鈉分別配成含肌酸、肌酐、氯化鈉、磷酸氫二鈉分別為873.92μg/ml、990.00μg/ml、6070.90μg/ml、792.18μg/ml的對照品溶液為儲備液。
2實驗方法2.1色譜條件色譜柱迪馬C18(250×4.6mm，5μm)；流動相乙腈-戊胺溶液(20mmol/ml，用1％的甲酸調(diào)pH至6.5)(2∶98)；流速1ml/min；進樣量20μl；
柱溫室溫；蒸發(fā)光散射檢測器(SEDEX 85 LT-ELSD)的霧化溫度為70℃，氣化溫度100℃，氣流流速為1.5L/min。
2.2系統(tǒng)適應性試驗取雜質(zhì)對照品儲備液和磷酸肌酸二鈉鹽配制成含各雜質(zhì)濃度為100μg/ml，磷酸肌酸二鈉鹽濃度為10mg/ml。注入色譜儀20μl，記錄色譜圖，各雜質(zhì)分離度和理論塔板數(shù)均符合《中國藥典》2005年版二部附錄28頁關于高效液相色譜法關于系統(tǒng)適用性的規(guī)定。色譜圖見附圖1。
2.3準確度試驗先分別對肌酸、肌酐、氯化鈉、磷酸氫二鈉配成三分不同濃度的溶液，最后移取相同的體積至樣品中使的加入肌酸、肌酐、氯化鈉、磷酸氫二鈉量濃度分別為80，100，120μg/ml。另取同法干燥的肌酸、肌酐、氯化鈉、磷酸氫二鈉對照品適量，用水溶解稀釋成每1ml含100μg的對照溶液。進樣20μl。
表1 準確度試驗測定結(jié)果

2.4線性試驗用水將含肌酸、肌酐、氯化鈉、磷酸氫二鈉分別配制成不同濃度的溶液。分別各取20μl，在2.1所述的色譜條件下測定。以峰面積的常用對數(shù)值為縱坐標(Y)，進樣量濃度的常用對數(shù)值為橫坐標(X)，進行線性回歸，得到回歸方程如下表格

2.5精密度試驗2.5.1重復性取含肌酸、肌酐、氯化鈉、磷酸氫二鈉100μg/ml對照品溶液分別每次進樣20μl，連續(xù)進樣5次，記錄峰面積，計算精密度結(jié)果。肌酸RSD＝1.52％；肌酐RSD＝0.85％；氯化物RSD＝0.61％；磷酸鹽RSD＝1.23％。
2.5.2專屬性按實驗用蒸餾水為空白溶液，進樣在2.1所述的色譜條件下進行測定。沒有任何峰出現(xiàn)，結(jié)果表明空白溶液對測定沒有任何干擾。
2.5.3檢測限取各儲備液分別稀釋進樣得信噪比≥3，檢測限見下表

2.5.4耐用性我們分別考察了流動相比例變化±5％，pH變化±0.2，霧化溫度和氣化溫度變化±5℃等條件，結(jié)果表明，對我們的測定結(jié)果沒有任何影響。
2.5.5溶液穩(wěn)定性取含肌酸、肌酐、氯化鈉、磷酸氫二鈉濃度均為100μg/ml對照品溶液，每次進樣20μl，分別在0h、2h、4h、6h、12h進樣，比較測定結(jié)果，RSD均小于2.0％。
3結(jié)果對照溶液肌酸、肌酐、無機氯化物(以氯化鈉計)、無機磷酸鹽(以磷酸氫二鈉計)和供試品中磷酸肌酸二鈉鹽均能達基線分離，峰型好，磷酸肌酸二鈉鹽本身的色譜圖有些拖尾，是由于柱子過載原因造成，但是不影響我們對其有關物質(zhì)的測定。最小檢測限肌酸177.2ng，肌酐161.2ng，無機氯化物(以氯化鈉計)138.0ng，無機磷酸鹽(以磷酸氫二鈉計)316.9ng。
權利要求
1.一種磷酸肌酸二鈉鹽的雜質(zhì)的高效液相色譜檢測方法，其特征在于，該方法采用反相高效液相色譜法，色譜柱為反相C18色譜柱；以乙腈或甲醇為有機相；以含有甲酸和戊胺的水溶液為水相，有機相與水相混合為流動相，檢測器為蒸發(fā)光散射檢測器；配制對照品溶液和供試品溶液；取20～100μl進樣，記錄色譜圖。
2.根據(jù)權利要求1所述的磷酸肌酸二鈉鹽雜質(zhì)的高效液相色譜檢測方法，其特征在于，水相的pH為5.0～7.0，取有機相和水相按體積比0∶100～10∶90混合成為流動相。
3.根據(jù)權利要求1所述的磷酸肌酸二鈉鹽雜質(zhì)的高效液相色譜檢測方法，其特征在于，流動相的流速為0.5～1.5ml/min；色譜條件中柱溫為15℃～35℃。
4.根據(jù)權利要求1所述的磷酸肌酸二鈉鹽雜質(zhì)的高效液相色譜檢測方法，其特征在于，檢測的雜質(zhì)成分是肌酸、肌酐、以氯化鈉計的無機氯化物、以磷酸氫二鈉計的無機磷酸鹽。
5.根據(jù)權利要求1所述的磷酸肌酸二鈉鹽雜質(zhì)的高效液相色譜檢測方法，其特征在于，水相為含5～30mmol戊胺。
6.根據(jù)權利要求2所述的磷酸肌酸二鈉鹽雜質(zhì)的高效液相色譜檢測方法，其特征在于，流動相為乙腈-水溶液，體積比為2∶98，其中水相含20mmol戊胺，pH為6.5。
7.根據(jù)權利要求3所述的磷酸肌酸二鈉鹽雜質(zhì)的高效液相色譜檢測方法，其特征在于，柱溫為25℃。
8.根據(jù)權利要求1所述的磷酸肌酸二鈉鹽雜質(zhì)量的高效液相色譜檢測方法，其特征在于，蒸發(fā)光散射檢測器的霧化溫度為60～80℃，汽化溫度95～105℃，以潔凈空氣或者氮氣作為霧化氣，霧化器流速為1.0～2.0L/min。
9.根據(jù)權利要求1所述的磷酸肌酸二鈉鹽雜質(zhì)的高效液相色譜檢測方法，其特征在于，供試品色譜圖的雜質(zhì)峰面積不得大于對照品的峰面積。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種磷酸肌酸二鈉鹽中雜質(zhì)的高效液相色譜檢測方法，該方法采用蒸發(fā)光散射檢測器，反相高效液相色譜法，本方法靈敏度高、可靠性強，適用于磷酸肌酸二鈉鹽生產(chǎn)中的任何一步中間體的檢查，也適用于磷酸肌酸二鈉鹽本身的質(zhì)量控制。
文檔編號G01N30/34GK101034086SQ20071003883
公開日2007年9月12日 申請日期2007年3月30日 優(yōu)先權日2007年3月30日
發(fā)明者潘俊芳, 單園園, 方通, 傅麗君, 劉仕英, 翟振興 申請人:上海華拓醫(yī)藥科技發(fā)展股份有限公司