專利名稱：：黃芪總黃酮在制備防治糖尿病腎病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及中藥制藥領(lǐng)域，具體的說，涉及黃芪總黃酮在制備防治糖尿病腎病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：糖尿病腎病(diabeticn印hropathy，DN)又稱為"糖尿病腎小球硬化癥"，是糖尿病常見的并發(fā)癥，是糖尿病全身性微血管病變表現(xiàn)之一，通常由于糖尿病引起的腎小球基底膜增厚，系膜擴(kuò)張以及胞外基質(zhì)增生，導(dǎo)致腎小球硬化。系膜細(xì)胞病變在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展過程中有極其重要的作用，腎小球系膜細(xì)胞是腎小球的主要成分，約占腎小球細(xì)胞總數(shù)的30-40%。腎小球系膜細(xì)胞具有多種功能，如分泌細(xì)胞基質(zhì)、產(chǎn)生細(xì)胞因子，吞噬清除大分子物質(zhì)以及類似平滑肌細(xì)胞的收縮功能，是分泌產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的主要細(xì)胞之一，而ECM聚集是腎小球硬化的關(guān)鍵機(jī)制。糖尿病腎病的臨床特征為蛋白尿，漸進(jìn)性腎功能損害，高血壓，水腫，晚期出現(xiàn)嚴(yán)重腎功能衰竭，是糖尿病患者的主要死亡原因之一。據(jù)統(tǒng)計，約3040%的糖尿病患者會出現(xiàn)腎臟損害。在美國，糖尿病腎病是導(dǎo)致終末期腎功能衰竭的首要原因，在歐洲居第二位。目前，我國糖尿病腎病在終末期腎功能衰竭患者中所占的比例也已上升至15%。隨著糖尿病發(fā)生率的不斷增高和社會人口老齡化，這個數(shù)字還將繼續(xù)攀升。目前針對糖尿病腎病尚無很好的治療藥物，臨床上的主要藥物是降糖藥，降壓藥等，如胰島素、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI，如卡托普利)等。然而，這些藥物長期應(yīng)用均會產(chǎn)生較嚴(yán)重的毒副作用，如糖尿病患者長期使用有可能加重高血鉀，另外部分患者服用后可因伴功能性或器質(zhì)性腎動脈狹窄而誘發(fā)急性腎功能衰竭，等等。因此，研制開發(fā)高效低毒的防治糖尿病腎病的天然藥物具有重要的社會和經(jīng)濟(jì)價值。黃芪為我國傳統(tǒng)常用中藥，具有補(bǔ)氣固表，利尿托毒，排膿，斂瘡生肌等功效。近年來，大量動物實驗和臨床療效證實，黃芪及其復(fù)方制劑對糖尿病腎病具有明確的治療作用。目前含黃芪的產(chǎn)品大多為傳統(tǒng)中藥復(fù)方，組方及成分復(fù)雜，雖然臨床證實有一定的療效，但其有效治療成分尚不清楚。同時還存在服用量大、起效慢、使用不方便以及質(zhì)量控制難等缺陷。因此，有必要對黃芪進(jìn)行深入研究，以開發(fā)出有效成分明確，作用機(jī)理清楚，質(zhì)量易于控制的防治糖尿病腎病的現(xiàn)代中藥制劑。黃酮類成分是黃芪中主要活性成分之一，主要包括毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷等。近年來，黃酮類成分因其良好的天然生物活性引起人們的廣泛關(guān)注。對于黃芪總黃酮，國內(nèi)外眾多學(xué)者也展開了大量的藥理研究，大部分集中在心血管活性方面，此外還有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗病毒、抗突變和抗骨質(zhì)疏松等多種生物學(xué)效應(yīng)。專利CN200710021630.7公開了黃芪總黃酮具有抗心肌缺血作用，專利CN200610172272.5公開了黃芪總黃酮具有抗腫瘤的作用。雖然文獻(xiàn)報道其具有多方面的藥理活性，然而，黃芪總黃酮對糖尿病腎病的防治效果如何，國內(nèi)外尚無報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種黃芪總黃酮在制備治療或預(yù)防糖尿病腎病的藥物中的新用途。本發(fā)明的目的還在于提供一種含有安全有效劑量的黃芪總黃酮，以及藥學(xué)上可接受的添加劑，對糖尿病腎病有治療或預(yù)防效果的藥物組合物。本發(fā)明所述的中藥組分黃芪總黃酮，是從中藥黃芪(RadixAstragali)-豆科植物蒙古黃甚Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根中提取精制得到的，主要成分包括毛蕊異黃酮(calycosin)、毛蕊異黃酮苷(calycosin-7-0-P-D-glucoside)、芒柄花苷(ononin)、(3R)-2'-羥基-3'，4'_二甲氧基異黃烷-7-0-P_D_葡萄糖苷((3R)-2'_hydroxy_3'，4'-dimethoxyisoflavan_7_0_P_D_glucoside)、(6aR，llaR)-9，10-二甲氧基紫檀烷-3-0-P-D-葡萄糖苷((6aR，11aR)-9，10-dimethoxypterocarpan-3-0-e-D-glucoside)等，具體結(jié)構(gòu)見圖l。本發(fā)明采用的黃芪總黃酮優(yōu)選黃芪的乙醇提取物，特別是通過以下方法制備的黃芪總黃酮取干燥黃芪藥材，加5-10倍體積50%95%乙醇提取2-4次，每次0.5_2.0小時，提取液濃縮至無醇味；靜置取上清液用大孔樹脂吸附，先用純水洗脫至流出液澄清，再分別用30%50%乙醇洗脫。收集乙醇洗脫液，濃縮后，用醋酸乙酯萃取，回收溶劑，真空或冷凍干燥，即得黃芪總黃酮。經(jīng)紫外分光光度法測得其總黃酮的含量大于50%。其中所述靜置是于04t:冷藏1-3天。黃芪總黃酮經(jīng)采用多種色譜技術(shù)等純化技術(shù)進(jìn)一步分離純化，可得到毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、(3R)-2'-羥基-3'，4'-二甲氧基異黃烷_7-0-|3-0-葡萄糖苷、(6aR，11aR)-9，10-二甲氧基紫檀烷-3_0-|3_D_葡萄糖苷等單體。本發(fā)明將上述黃芪總黃酮與黃芪水提液進(jìn)行藥理對比實驗，考察了對高糖及糖基化終末產(chǎn)物(advancedglycationendproducts,AGEs)誘發(fā)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)增生的影響。實驗結(jié)果表明，不同濃度的黃芪總黃酮均能抑制高糖和AGEs誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖，能顯著抑制高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)增生與膠原IV表達(dá)，且效果優(yōu)于黃芪水提液。本發(fā)明還采用dbldb自發(fā)性糖尿病腎病小鼠，以氨基胍作為陽性對照藥物，黃芪總黃酮作為治療藥物，觀察其對糖尿病腎病小鼠的治療作用。實驗結(jié)果表明，黃芪總黃酮能對抗糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展的細(xì)胞病理環(huán)節(jié)，對dbldb糖尿病腎病模型小鼠有保護(hù)作用；還有降低腎臟氧化應(yīng)激程度、減少糖基化終末產(chǎn)物引起纖維化等作用，且效果優(yōu)于黃芪水提液。另外，還對SD大鼠進(jìn)行了黃芪總黃酮的毒性實驗，證明黃芪總黃酮在0-300mg/kg/天的劑量下可以安全施用。由于腎小球系膜細(xì)胞是腎小球中最活躍的反應(yīng)性細(xì)胞，其病理變化在糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展中居于中心地位，是糖尿病腎病的靶細(xì)胞；腎小球系膜細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)增生，是糖尿病腎病等慢性腎病主要病理特征，也是糖尿病腎病的治療靶點(diǎn)之一，因此上述結(jié)果證明黃芪總黃酮可以在糖尿病腎病早期治療中發(fā)揮作用，而且說明其具有治療糖尿病腎病的藥理基礎(chǔ)。本發(fā)明提出了黃芪總黃酮在防治糖尿病腎病藥物中的新用途，也為治療和預(yù)防糖4尿病腎病提供了新的藥物選擇。圖1為黃芪總黃酮中主要化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)式。圖2黃芪總黃酮對高糖培養(yǎng)下的大鼠腎小球系膜細(xì)胞膠原IV表達(dá)的影響(200X)，其中A正常；B葡萄糖(25mM);C陰性對照(未加膠原IV抗體)；D黃芪總黃酮(0.01mg/L);E黃芪總黃酮(0.lmg/L);F黃芪總黃酮(lmg/L);G黃芪水提液(50mg生藥/ml)。具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1黃芪總黃酮及單體化合物制備取干燥黃芪藥材10kg，以8倍量80X乙醇回流提取3次(2小時，1小時，1小時)，過濾，合并濾液，減壓回收溶劑，濃縮至無醇味，得黃芪醇提液，置4t:冰箱中冷藏2天，上清液用D101型大孔樹脂吸附，先用純水洗脫至流出液澄清，再用50%乙醇洗脫至TLC檢測無毛蕊異黃酮苷斑點(diǎn)為止。收集50%乙醇洗脫液經(jīng)減壓濃縮后，用等體積的醋酸乙酯萃取7次，合并萃取液后回收溶劑，真空干燥，得到黃芪總黃酮。經(jīng)紫外分光光度法檢測總黃酮含量為54.3%。黃芪總黃酮再經(jīng)200300目硅膠柱層析，以氯仿-甲醇梯度洗脫(50:li:i)，薄層跟蹤檢測，合并相同的流份，靜置析晶，抽濾，甲醇重結(jié)晶，分別得到毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、(3R)-2'-羥基-3'，4'-二甲氧基異黃烷_7-0-|3-0-葡萄糖苷、(6aR，11aR)-9，10-二甲氧基紫檀烷-3_0-|3_D_葡萄糖苷等成分，以上各化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)均經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振等波譜手段確證，純度經(jīng)高效液相色譜檢測均大于98%。實施例2黃芪總黃酮及單體化合物制備取干燥黃芪藥材100kg，分別以10倍量80%乙醇、5倍量60%乙醇、5倍量90%乙醇回流提取3次(2小時，1小時，0.5小時)，過濾，合并濾液，減壓回收溶劑，濃縮至無醇味，得黃芪醇提液，置4t:冰箱中冷藏1天，上清液用AB-8型大孔樹脂吸附，先用純水洗脫至流出液澄清，再用40X乙醇洗脫至TLC檢測無毛蕊異黃酮苷斑點(diǎn)為止。收集40%乙醇洗脫液經(jīng)減壓濃縮后，用等體積的醋酸乙酯萃取7次，合并萃取液后回收溶劑，真空干燥，得到黃芪總黃酮。經(jīng)紫外分光光度法檢測總黃酮含量為53.3%。黃芪總黃酮再經(jīng)200300目硅膠柱層析，以氯仿-甲醇梯度洗脫(50:li:i)，薄層跟蹤檢測，合并相同的流份，靜置析晶，抽濾，甲醇重結(jié)晶，分別得到毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、(3R)-2'-羥基-3'，4'-二甲氧基異黃烷_7-0-|3-0-葡萄糖苷、(6aR，11aR)-9，10-二甲氧基紫檀烷-3_0-|3_D_葡萄糖苷等成分，以上各化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)均經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振等波譜手段確證，純度經(jīng)高效液相色譜檢測均大于98%。實施例3含黃芪總黃酮的膠囊(片劑)制劑處方黃芪總黃酮80g微晶纖維80g5淀粉20g乳糖18g糊精2g制法取實施例1制備的黃芪總黃酮提取物，粉碎，過80目篩，與上述輔料混合均勻后，用80%乙醇制粒，整粒；取一半裝膠囊，制成500粒；另一半壓制成片，制成500片。實施例4含黃芪總黃酮的顆粒劑顆粒劑處方黃芪總黃酮80g乳糖920g制法取實施例2制備的黃芪總黃酮提取物，粉碎，與乳糖混合均勻，用70%乙醇制軟材，制粒、干燥、整粒、分裝即得。實施例5含黃芪總黃酮的注射液注射液處方黃芪總黃酮10g注射用水加至1000ml制法取黃芪總黃酮提取物超微粉碎，加適量注射用水，加熱溶解，調(diào)pH值至7.0，加活性炭0.2g，加熱8(TC保溫，4號垂熔玻璃濾器預(yù)濾，加注射用水至1000ml，0.2iim微孔濾膜過濾，灌封，即得。實施例6黃芪總黃酮對腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響1.材料與試劑采用實施例5制備得到的黃芪總黃酮注射液。大鼠腎小球系膜細(xì)胞株HBZY21，武漢細(xì)胞生物研究所提供；DMEM培養(yǎng)基，GIBCO;新生牛血清，杭州四季青血清廠；Thiazolyl噻唑藍(lán)，Amresco分裝；牛血清白蛋白，D-葡萄糖，均為Sigma產(chǎn)品；二甲亞砜，AR級，上海久仡化學(xué)試劑有限公司。C02培養(yǎng)箱，NAPC05410，PERCISIONSCIENTIFIC;XSZ_D2倒置顯微鏡，重慶光學(xué)儀器廠；超凈工作臺，蘇州市潔凈技術(shù)研究所；MicroplateSpectrophotometer,SPECTRAmaxl90，美國AD公司；醫(yī)用離心機(jī)，LDZ5-2，北京醫(yī)用離心機(jī)廠。2.實驗方法2.1模型的建立取對數(shù)生長期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以1001/孔接種于96孔板，細(xì)胞數(shù)1X10V孔，37t:5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，加入無血清的DMEM，再孵育24h使細(xì)胞生長同步進(jìn)入休止期。吸棄細(xì)胞上清液，同一水平6孔并列，分別加入不同濃度的葡萄糖和AGEs，分別于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h、48h、72h和96h，MTT法觀察不同濃度葡萄糖或AGEs對鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明，25mM的葡萄糖或0.25mg/mlAGEs作用腎小球系膜細(xì)胞24h效果最好，作為本實驗造模條件。其中所用的AGEs的制備為將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的無球蛋白的牛血清白蛋白(BovineSerumAlbumin,BSA)與0.5mol/LD_葡萄糖共同溶解于0.2mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH二7.2)中，經(jīng)0.22ym濾膜過濾除菌后，置37t:培養(yǎng)箱內(nèi)孵育60d。糖基化產(chǎn)物孵育結(jié)束后，未結(jié)合的物質(zhì)通過對磷酸緩沖鹽溶液的廣泛透析而除去，F(xiàn)olin酚法測定AGEs濃度，并稀釋至實驗所需各濃度，然后再用0.22m濾膜過濾除菌備用。2.2對高糖誘發(fā)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖實驗給藥組加用純水梯度稀釋的本發(fā)明藥物溶液0.1ml/孔(終濃度分別為0.01、0.l、lmg/L)以及黃芪水提液(50mg生藥/ml)，每個稀釋度6個復(fù)孔。再加葡萄糖終濃度為25mM的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h，MTT法測定細(xì)胞增殖情況。正常對照組每孔加培養(yǎng)液(含5.5mM葡萄糖)0.1ml。高糖組每孔加培養(yǎng)液(含25mM葡萄糖)0.1ml。2.3對AGEs誘發(fā)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖實驗給藥組加注射用水梯度稀釋的本發(fā)明藥物溶液0.1ml/孔(終濃度分別為0.01、0.l、lmg/L)以及黃芪水提液(50mg生藥/ml)，每個稀釋度6個復(fù)孔。再加AGEs終濃度為含0.25mg/ml的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h，MTT法測定細(xì)胞增殖情況。正常對照組每孔加培養(yǎng)液0.1ml。AGEs組每孔加培養(yǎng)液(含0.25mg/mlAGEs)0.lml。3.實驗結(jié)果3.1黃芪總黃酮對高糖誘發(fā)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響實驗結(jié)果見表1所示，結(jié)果表明，25mM葡萄糖能顯著促進(jìn)大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖，中高劑量組黃芪總黃酮均能顯著抑制高糖作用下的大鼠系膜細(xì)胞的增殖，且高劑量組的效果更為明顯；中高劑量組的效果都優(yōu)于黃芪水提液組；低劑量的黃芪總黃酮(0.Olmg/L)的效果與黃芪水提組的效果接近，都對高糖誘發(fā)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖有抑制作用。表1黃芪總黃酮對高糖培養(yǎng)下的大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響(5々,n=6)組別樣本數(shù)(孔)劑量OD(X=490nm)正常6—0.35±0.04**葡萄糖625mM0.53±0.06黃芪水提液650mg/ml0.44±0.04*6O.Olmg/L0.45±0.02黃芪總黃酮6O.lmg/L0.39±0.05*6lmg/L0.34±0.03**#和葡萄糖組比較*p<0.05，**p<0.01;和黃芪水提組比較#p<0.053.2黃芪總黃酮對AGEs誘發(fā)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響實驗結(jié)果見表2，結(jié)果表明，O.25mg/mlAGEs能顯著促進(jìn)大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖，而低、中、高劑量組黃芪總黃酮均能顯著抑制AGEs誘導(dǎo)的大鼠系膜細(xì)胞的增殖，低劑量的黃芪總黃酮(O.Olmg/L)的效果與黃芪水提組的效果接近，中高劑量組的效果明顯優(yōu)于黃芪水提液組。表2黃芪總黃酮對AGEs培養(yǎng)下的鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響^±s，n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>和AGEs組比較:*p<0.05，**p<0.01;和黃芪水提組比較:#p<0.05腎小球系膜細(xì)胞是腎小球中最活躍的反應(yīng)性細(xì)胞，其病理變化在糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展中居于中心地位，是糖尿病腎病的靶細(xì)胞。實驗結(jié)果表明，高濃度葡萄糖、AGEs均能顯著促進(jìn)大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖，不同濃度的黃芪總黃酮(包括黃芪水提液)均能抑制高糖和AGEs誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖，且中高濃度的黃芪總黃酮的效果優(yōu)于黃芪水提液。這些表明黃芪總黃酮可以在糖尿病腎病早期治療中發(fā)揮一定作用。實施例7黃芪總黃酮對腎小球系膜細(xì)胞基質(zhì)增生的影響1.材料與試劑采用實施例1制備得到的黃芪總黃酮。大鼠腎小球系膜細(xì)胞株HBZY21，武漢細(xì)胞生物研究所提供；DMEM培養(yǎng)基，GIBCO;新生牛血清，杭州四季青血清廠；膠原IV，CantaCruz產(chǎn)品；二抗，晶美生物工程有限公司；即用型SABC免疫組化染色試劑盒，博士德公司產(chǎn)品；DAB顯色系統(tǒng)，GeneTechBiotechnologyCompanyLimited。C02培養(yǎng)箱，NAPC05410，PERCISI0NSCIENTIFIC;XSZ_D2倒置顯微鏡，重慶光學(xué)儀器廠；超凈工作臺，蘇州市潔凈技術(shù)研究所；醫(yī)用離心機(jī)，LDZ5-2，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；免疫組化濕盒，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。2.實驗方法細(xì)胞培養(yǎng)，藥物干預(yù)分組、對照組設(shè)置均同實施例6中2.2項。系膜細(xì)胞膠原IV表達(dá)應(yīng)用預(yù)先在24孔板孔內(nèi)放置蓋玻片，讓細(xì)胞貼附。細(xì)胞鋪滿玻片后，吸出細(xì)胞上清，作羥脯氨酸含量檢測；取出細(xì)胞爬片，固定，留作細(xì)胞免疫組化。膠原IV染色流程如下4%多聚甲醛固定細(xì)胞爬片30min;新配含3%H202的甲醇溶液滅活內(nèi)源性辣根過氧化物酶10min，蒸餾水洗3次；5XBSA封閉非特異性抗原20分鐘；滴加膠原IV—抗(1:500)，4t:過夜，PBS(pH7.4)洗2minX3次；滴加生物素化山羊抗小鼠抗體(二抗)，37°C30min，PBS(K17.4)洗2minX3次；滴加HRP標(biāo)記的親和素_生物素-過氧化物酶復(fù)合物，37。C30min，PBS(PH7.4)洗5minX4次；滴加50iUDAB染色液，室溫顯色15min，蒸餾水充分洗滌；蘇木素輕度復(fù)染lmin，水洗；酒精梯度脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。統(tǒng)計與分析測定各組中大鼠腎小球系膜細(xì)胞培養(yǎng)液中羥脯氨酸含量，測定結(jié)果用^士S表示，采用組間t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析；同時顯微鏡下觀測大鼠腎小球系膜細(xì)胞膠原IV的表達(dá)。3.實驗結(jié)果3.1對高糖誘發(fā)大鼠腎小球系膜細(xì)胞培養(yǎng)液中羥脯氨酸的影響實驗結(jié)果表明，25mM的葡萄糖能顯著提高大鼠腎小球系膜細(xì)胞培養(yǎng)液中羥脯氨酸的含量，不同濃度的黃芪總黃酮和黃芪水提液均能減少高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞培養(yǎng)液中羥脯氨酸的含量；本發(fā)明的黃芪總黃酮組效果優(yōu)于黃芪水提液組。表3黃芪總黃酮對高糖培養(yǎng)下的鼠腎小球系膜細(xì)胞上清液中羥脯氨酸含量的影響組別樣本數(shù)(孔)劑量羥脯氨酸(Ug/ml)正常6—3.50±1.93**葡萄糖625mM12.05±0,95黃芪水提液650mg/ml8.48±1.21*6O.Olmg/L8.89±1.47*黃芪總黃酮6O.lmg/L7,53±0.85**6lmg/L10.47±2.74和葡萄糖組比較:*p<0.05，**p<0.013.2對高糖誘發(fā)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞膠原IV表達(dá)的影響由圖2可見(A正常；B葡萄糖(25mM);C陰性對照(未加膠原IV抗體))，高糖(25mM)培養(yǎng)72h，系膜細(xì)胞的膠原IV表達(dá)明顯增加(圖2B)，而黃芪總黃酮0.Olmg/L(圖2D)，黃芪總黃酮0.lmg/L(圖2E)，黃芪總黃酮lmg/L(圖2F)，黃芪水提液50mg生藥/ml(圖2G)都顯示黃芪總黃酮對系膜細(xì)胞的膠原IV表達(dá)有抑制作用，說明黃芪總黃酮能降低高糖培養(yǎng)引起的腎小球系膜細(xì)胞膠原IV表達(dá)的增加，本發(fā)明提供的黃芪總黃酮的效果尤為顯著，優(yōu)于黃芪水提液。腎小球系膜細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)增生，是糖尿病腎病等慢性腎病主要病理特征，也是糖尿病腎病的治療靶點(diǎn)之一。實驗結(jié)果證明，黃芪總黃酮能夠顯著抑制高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)增生與膠原iv表達(dá)，表明本發(fā)明的黃芪總黃酮具有治療糖尿病腎病的藥理實施例8本發(fā)明藥物對dbIdb糖尿病腎病小鼠的治療作用1.材料與試劑黃芪總黃酮按實施例2制備得到。db|db小鼠，Be小鼠由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供；Accu-ChekAdvantage血糖儀，美國羅氏診斷公司；MicroplateSpectrophotometer,SPECTRAmax190，美國AD公司。尿素氮測定試劑盒，肌酐測定試劑盒，考馬斯亮蘭測定試劑盒等，均由南京建成生物工程研究所提供。2.實驗方法實驗期間，dbIdb和B6小鼠在層流柜中飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、進(jìn)水，每日更換水，墊料，保持籠內(nèi)清潔干燥，并固定水、飼料、墊料重，12h交替照明。所有器具及食物均每日消毒。將48只八周齡dbIdb小鼠隨機(jī)分為6組模型組、氨基胍組(100mg/kg)、黃芪總黃酮5、10、20mg/kg組、黃芪水提物組(5g生藥/kg)，另取8周齡B6小鼠8只作為正常對照組。各組同體積不同濃度灌胃給予相應(yīng)藥物或生理鹽水O.4ml，連續(xù)5周。各組每日測定進(jìn)食量、飲水量；每周稱體重1次；取血測定血糖值，每周一次。給藥結(jié)束后，收集24小時尿9液，測定尿量及尿總蛋白、微白蛋白、肌酐含量。取血，測定血清尿素氮、膽固醇、低密度脂蛋白、MDA、S0D、血肌酐、AGEs含量。統(tǒng)計與分析所有測定結(jié)果用5士s表示，采用組間t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。3.實驗結(jié)果3.l對dbldb糖尿病腎病小鼠尿蛋白及肌酐等的影響實驗結(jié)果見表4，結(jié)果表明，模型組動物24小時尿量、總蛋白排出量、微白蛋白排出量增加，尿液中肌酐排出明顯減少；施用黃芪總黃酮可明顯對抗模型動物的上述病理變化減少糖尿病腎病動物24小時尿量，降低24小時總蛋白、微白蛋白排出量，增加尿肌酐排出量；同時本發(fā)明的黃芪總黃酮在降低尿蛋白、尿肌酐含量等重要腎病指標(biāo)方面明顯優(yōu)于黃芪水提液組，在總蛋白、尿肌酐含量方面明顯優(yōu)于氨基胍的效果。表4黃芪總黃酮對dbldb鼠24h尿量、尿液中微白蛋白、總蛋白、尿肌酐的影響(x±s,n=8)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>與模型組比，*p<0.05，**p<0.01;和黃芪水提組比較:#p<0.05，##p<0.013.2對dbIdb糖尿病腎病小鼠血清生化指標(biāo)的影響實驗結(jié)果見表5，結(jié)果表明，黃芪總黃酮可明顯降低糖尿病腎病模型動物血清中總膽固醇、丙二醛、血肌酐、血尿素氮、AGEs、低密度脂蛋白(LDL)水平，顯著提高血清SOD的活性，效果與氨基胍接近或優(yōu)于氨基胍。表5黃芪總黃酮對dbIdb鼠血清生化指標(biāo)的影響(三±s，n=8)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>與模型組比，*p<0.05，**p<0.01，SOD為超氧化物歧化酶，AGEs為糖基化蛋白，LDL低密度脂蛋白顯然，黃芪總黃酮作為治療藥物能對抗糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展細(xì)胞病理環(huán)節(jié)，對db|db糖尿病腎病模型小鼠有保護(hù)作用；還有降低腎臟氧化應(yīng)激程度、減少糖基化終末產(chǎn)物引起的纖維化等作用，且效果優(yōu)于黃芪水提液。實施例8本發(fā)明藥物SD大鼠30天喂養(yǎng)試驗1.材料與試劑黃芪總黃酮按實施例1制備得到。SD大鼠，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供；Accu-ChekAdvantage血糖儀，美國羅氏診斷公司；CELL_DYN1700全自動全血細(xì)胞計數(shù)儀，美國雅培；AU-600大型生化分析儀，日本奧林巴斯。尿素氮測定試劑盒，肌酐測定試劑盒，考馬斯亮蘭測定試劑盒等，均由南京建成生物工程研究所提供。2.實驗方法選用清潔級SD大鼠80只，體重70-90g，隨機(jī)分成4組，每組20只，雌雄各半，單籠喂養(yǎng)。黃芪總黃酮設(shè)3個試驗劑量，分別為33.3mg/kg，100mg/kg和300mg/kg，另設(shè)1個正常對照組。黃芪總黃酮各組各鼠每天灌胃給予相應(yīng)受試物2ml，對照組給予相同體積的蒸餾水。動物自由攝食及飲水，連續(xù)喂養(yǎng)30天。每天觀察并記錄動物的一般表現(xiàn)、行為、中毒癥狀及死亡情況，每周記錄一次體重和兩次食物攝入量，計算每周的平均食物利用率。實驗結(jié)束時，采血檢測血液學(xué)指標(biāo)，包括血紅蛋白含量、紅細(xì)胞計數(shù)、白細(xì)胞計數(shù)及分類；檢測生化指標(biāo)，包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、血糖(Glu)、血清白蛋白(Alb)、總蛋白(TP)、總膽固醇(TCH)和甘油三酯(TG);同時剖開大鼠腹部，取出肝、腎、脾、睪丸(卵巢)稱重，計算臟/體比值，并對高劑量組和對照組動物肝、腎、脾、胃腸、睪丸及卵巢等組織進(jìn)行病理學(xué)檢查。統(tǒng)計與分析所有測定結(jié)果用5士s表示，采用組間t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。3.實驗結(jié)果[Cms]3.1—般狀況觀察在整個過程中，各組動物一般狀況良好，行為正常，未見任何中毒表現(xiàn)，亦無動物死亡。在30天喂養(yǎng)過程中，黃芪總黃酮對大鼠體重增長的影響見表6。結(jié)果差異均無顯著性(PX).05)，說明黃芪總黃酮對大鼠體重的增長無明顯的影響。黃芪總黃酮對大鼠食物總利用率的影響見表7。結(jié)果顯示各組間差異均無顯著性(PX).05)，說明黃芪總黃酮對大鼠的食物利用率無明顯影響。表6黃芪總黃酮對SD大鼠體重的影響"±s,n=20)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>與正常組比，*p<0.05**p<0.01表7黃芪總黃酮對SD大鼠食物利用率的影響(^±s,n=20)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>與正常組比，*p<0.05**p<0.013.2血液學(xué)指標(biāo)檢查大鼠紅細(xì)胞、血紅蛋白和白細(xì)胞的檢測結(jié)果見表8。從表8可見，紅細(xì)胞計數(shù)、血紅蛋白含量和白細(xì)胞計數(shù)均在正常值范圍內(nèi)，且各劑量受試物組與正常對照組相比，差異均無顯著性(P>0.05)。說明黃芪總黃酮對大鼠紅細(xì)胞總數(shù)、血紅蛋白含量和白細(xì)胞總數(shù)無黃芪總黃酮對大鼠白細(xì)胞分類的影響檢測結(jié)果見表9。從表9可見，SD大鼠的嗜酸性、中性、淋巴、單核等細(xì)胞均在正常值范圍內(nèi)，且各劑量受試物組與正常對照組相比，差異均無顯著性(P>0.05)，說明黃芪總黃酮對各型白細(xì)胞均無影響。表8黃芪總黃酮對SD大鼠食物血細(xì)胞數(shù)的影響(5±s,n=20)組別劑量樣本數(shù)(只)白細(xì)胞紅細(xì)胞血紅蛋白血小板mg/kg109/L1012/Lg/L109/L正?！?016.3±6.17.4±0.9149.3±12.3232.8±69.5黃芪總黃酮33.32017.5±4.77.6±0.8159.9±16.3240.3±92.51002014.2±3.47.3±0.8146.8±17.1227.0±69.23002019.5±6.27.2±0.7148.2±17.6254.6±69.4與正常組比，*p<0.05**p<0.01表9黃芪總黃酮對SD大鼠白細(xì)胞分類的影響(；±s,n=20)組別劑量mg/kg樣本數(shù)(只)淋巴細(xì)胞%單核細(xì)胞%中性粒細(xì)胞%嗜酸性粒細(xì)胞％嗜堿性粒細(xì)胞％正?！?077.9±9.44.2±1.524.4±10.91.5±0.90.11±0.10黃芪總黃酮33.32081.9±12.44.4±1.522.5±9.31.6±1.00.12±0.091002077.7±11.24.3±1.718.5±11.04.5±1.00.10±0.093002074.0±10.74.7±1.319.7±9.61.6±0.70.09±0.09與正常組比，*p<0.05**p<0.013.3血液化學(xué)指標(biāo)檢驗試驗結(jié)束后處死動物，分離大鼠血清，進(jìn)行血清生化指標(biāo)的檢測果表明，各項指標(biāo)均在正常值范圍內(nèi)，與正常對照組相比，差異無顯著性對大鼠血生化指標(biāo)無明顯影響。表10黃芪總黃酮對SD大鼠血清生化指標(biāo)的影響(；±s，n=20)組劑量樣本谷丙轉(zhuǎn)氨酶U/L谷草轉(zhuǎn)氨總蛋白白蛋白總膽固醇mmol/L甘油三酯mmol/L肌苦尿素氮血糖別mg/kg數(shù)(只)酶U/Lg/Lg幾mol/Lmmol/Lmmol/L正?！?027.8±6.289.0±20.058.6±2.530.0±1.51.4±0.30.6±0.354.9±6.35.0±1.56.7±1.2黃33.32025.8±6.188.3±21.556.7±3.830.7±1.51.5±0.30.5±0.356.2±5.05.0±1.97.0土1.1芪總黃B同1002025.8±7.394.2±20.258.2±1.728.9±1.41.5±0.40.5±0.252.9±5.05.5±1.96.9±1.63002029.7±7.996.6±15.558.8±2.529.3±1.31.5±0.20.4±0.357.8±7.25.4±1.66.2±1.513J，結(jié)果見表IO。結(jié)。說明黃芪總黃酮與正常組比，*p<0.05**p<0.013.4病理學(xué)檢查用黃芪總黃酮對大鼠染毒30天后，大體解剖檢查，各組動物重要臟器未見明顯病理改變的異常。大鼠臟體比的結(jié)果見表ll。結(jié)果表明，和正常對照組相比，各組主要臟器的臟/體比差異均無顯著性(P>0.05)。組織病理學(xué)檢查結(jié)果實驗組動物與對照組動物各20只，雌雄各半。每只檢查肝、腎、脾、胃腸、卵巢或睪丸。結(jié)果肝臟被膜完整，肝小葉結(jié)構(gòu)清楚，肝細(xì)胞索排列整齊。肝細(xì)胞偶見輕度變性，個別動物匯管區(qū)可見少量炎細(xì)胞浸潤。其中對照組1只，高劑量組2只，動物可見肝細(xì)胞空泡變性，兩組比較無明顯差異。腎臟被膜完整、腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常，腎間質(zhì)無異常。兩組動物的胃腸壁各層結(jié)構(gòu)清楚，黏膜上層完整，黏膜下各層未見充血、水腫、炎性細(xì)胞浸潤。脾臟被膜完整，脾小梁結(jié)構(gòu)正常，紅、白髓比例正常，無炎性細(xì)胞浸潤及色素沉著。卵巢上皮與白膜正常，各級卵泡發(fā)育良好，間質(zhì)未見淤血、炎性細(xì)胞浸潤。睪丸的曲細(xì)精管內(nèi)各級生精細(xì)胞發(fā)育良好，間質(zhì)未見水腫、出血、炎性細(xì)胞浸潤?？傊?，肝、脾、腎、胃、腸、睪丸(卵巢)均未見有關(guān)的病理組織學(xué)變化。表11黃芪總黃酮對SD大鼠臟體比的影響(x±s,n=20)組別劑量mg/kg樣本數(shù)(只)肝脾腎睪丸卵巢正?！?03.11±0.250.25±0.0.040.78±0.081.00±0.100.55±0.13黃芪總黃酮33.3203.02±0.210.26±0.050.79±0.081.02±0.100.59±0.15100203.24±0.200.26±0.050.76±0.111.04±0.110.61±0.13300203.04±0.310.27±0.060.78±0.071.02±0.100.57±0.12與正常組比，*p<0.05**p<0.0總之，本研究結(jié)果表明黃芪總黃酮對實驗動物的體重、食物利用率、血液學(xué)檢查(紅細(xì)胞計數(shù)，血紅蛋白，白細(xì)胞計數(shù)及分類)、血液生化學(xué)各項指標(biāo)的檢查(AST、ALT、Glu、BUN、TP、Alb、TC、TG、CRE)結(jié)果均與陰性對照組(正常動物)無顯著差異。黃芪總黃酮對實驗動物的肝、脾、腎、睪丸、胃腸、卵巢從大體解剖學(xué)上看均未檢出與陰性對照組的明顯差異，亦未發(fā)現(xiàn)與實驗因素有關(guān)的病理組織學(xué)變化。30天喂養(yǎng)試驗未見其對受試動物有明顯毒性損害作用。說明黃芪總黃酮可在0-300mg/kg/天的劑量下安全使用。1權(quán)利要求黃芪總黃酮在制備預(yù)防或治療糖尿病腎病藥物中的應(yīng)用。2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述黃芪總黃酮含有下列組分毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、(3R)-2'-羥基_3'，4'-二甲氧基異黃烷_7-0-|3-0-葡萄糖苷和(6aR，llaR)_9，10-二甲氧基紫檀烷_3_0-P-D-葡萄糖苷。3.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述黃芪總黃酮是黃芪的乙醇提取物。4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述黃芪總黃酮由下述方法制備將干燥黃芪藥材加5-10倍體積50%95%乙醇提取2-4次，每次0.5_2.0小時，提取液濃縮至無醇味；靜置，上清液用大孔樹脂吸附，再分別用30%50%乙醇洗脫；收集乙醇洗脫液，濃縮后，用醋酸乙酯萃取，回收溶劑，真空干燥或冷凍干燥。5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述靜置是在04t:冷藏1-3天。6.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述黃芪總黃酮的制備還包括將真空干燥或冷凍干燥的產(chǎn)物進(jìn)一步分離純化。7.含有權(quán)利要求1所述的黃芪總黃酮，預(yù)防或治療糖尿病腎病藥物組合物。8.如權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征在于，還含有藥學(xué)上可接受的添加劑。9.一種黃芪總黃酮的制備方法，包括將干燥黃芪藥材加5-10倍體積50%95%乙醇提取2-4次，每次0.5_2.0小時，提取液濃縮至無醇味；04t:冷藏1-3天，上清液用大孔樹脂吸附，再分別用30%50%乙醇洗脫；收集乙醇洗脫液，濃縮后，用醋酸乙酯萃取，回收溶劑，真空干燥或冷凍干燥。全文摘要本發(fā)明涉及中藥制藥領(lǐng)域，具體的說，涉及黃芪總黃酮在制備防治糖尿病腎病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明考察了黃芪總黃酮對大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)增生的影響，以及黃芪總黃酮對糖尿病腎病小鼠的治療作用，實驗結(jié)果證明黃芪總黃酮對糖尿病腎病有明顯的治療和預(yù)防作用，由此本發(fā)明提出了黃芪總黃酮在制備防治糖尿病腎病藥物中的應(yīng)用，并提供了含有黃芪總黃酮的防治糖尿病腎病藥物組合物，為治療和預(yù)防糖尿病腎病提供了新的藥物選擇。文檔編號A61P13/12GK101766678SQ20081024685公開日2010年7月7日申請日期2008年12月26日優(yōu)先權(quán)日2008年12月26日發(fā)明者何寶,朱荃,段婷婷,湯丹,王汝上,石興華,程慧荃,鄭兆廣,顧斐,黃曉玲,黃艷霞申請人:廣州康臣藥物研究有限公司