專利名稱：：透皮免疫流感多價疫苗的制備及其方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種疫苗，特別涉及一種透皮免疫的流感多價疫苗。
背景技術：
：流感是由流感病毒(influenzavirus)引起的一種以侵害呼吸系統(tǒng)為主的疾病，在世界各國廣泛流行，是危害人類健康的重要傳染病之一。因此，冊O宣布對流感要嚴加監(jiān)控。20世紀曾有過3次全球性的流感大流行，僅第一次大流行(1918-1919年)就造成2000多萬人死亡，比第一次世界大戰(zhàn)死亡的總人數(shù)還要多，而且死亡的大多數(shù)是青壯年，造成巨大的社會和經濟損失。近年來，季節(jié)性流感周而復始的爆發(fā)流行，H5N1亞型高致病性禽流感病毒感染人的事件，以及H7N7、H9N2亞型流感病毒的出現(xiàn)，并已跨越種屬感染傳播的事實，再次給人類敲響了警鐘，流感的暴發(fā)不再是有或無的問題，而是早與晚的問題。據(jù)國家權威部門透露，我國每年流感的發(fā)病高達10億人次以上，經濟損失數(shù)百億元以上。近些年來，我國的生態(tài)環(huán)境嚴重破壞，流感的發(fā)生和發(fā)展規(guī)律發(fā)生了較大變化，發(fā)病頻率上升，造成了嚴重的社會影響和重大的經濟損失。目前，對于流感尚無有效的治療手段，而疫苗免疫接種是行之有效的手段，并發(fā)揮著重要的作用。給健康成年人群接種流感疫苗，60-80%的人會起到預防發(fā)病的效果(當傳播的病毒毒株與疫苗采用毒株相同時)，更重要的是，給高危人群接種疫苗可以明顯降低流感的發(fā)生，減少住院率及死亡率。冊0已為各國提供了制備流感疫苗的病毒株，國內外廣泛使用的仍然是上世紀70年代基于雞胚生產的流感滅活疫苗，主要以注射為主，并且滅活全病毒疫苗不能用于12歲以下兒童的接種、裂解疫苗抗原性弱、組分疫苗效果差，均不適用于突發(fā)性流感大流行和生物恐怖/生物戰(zhàn)劑造成的短期內流感大流行的預防，特別是現(xiàn)有的免疫程序對老年人及兒童保護效果欠佳，急需解決無針無痛、簡便快速、無交叉感染、安全高效的問題。因此，開展透皮免疫流感多價疫苗制備及其方法的研究成為迫切而又極為重要的科學問題。自從1940年流感病毒滅活全病毒疫苗、裂解疫苗相繼問世以來，老年人群的病死率及感染的發(fā)生率都明顯下降了。目前，已獲準上市的流感滅活病毒疫苗主要包括針對H1N1、H3N2和B型的流感三價滅活全病毒疫苗、三價滅活裂解疫苗和亞單位疫苗，這些疫苗主要經注射途徑接種，誘導血清中的抗HA/IgG抗體的產生，而不能誘導黏膜免疫sIgA抗體的產生，然而對異型流感病毒的交叉保護性反應，主要決定于自然感染過程中誘導的IgA抗體交叉反應性。而在2003年6月，美國FDA批準上市的流感三價減毒活疫苗(Flumist)，通過鼻腔接種，能夠誘導機體產生包括細胞免疫、體液免疫和黏膜局部免疫在內的較全面的免疫效應，但是主要適用于2-49歲的健康人群，而對流感的發(fā)病高危人群老年人和兒童存在安全性隱患，大大限制了其發(fā)展和應用。因此，隨著現(xiàn)代免疫學理論和技術及相關學科的迅速發(fā)展，一種針對刺激機體產生具有黏膜IgA免疫應答和系統(tǒng)免疫效應的流感多價疫苗以及一種新的免疫接種途徑--透皮免疫應運而生。直到二十世紀初，人們仍認為皮膚是微生物、化學物質和藥物不可透過的屏障，一次偶然的發(fā)現(xiàn)，二甲基亞砜與皮膚接觸后可被吸收進入體循環(huán)，才使上述觀點得以改變。1924年，Rein提出皮膚最外面的角質層是藥物透皮滲透的最主要的阻力，Blank對該假說作了進一步的證實。后來Scheuplein等人指出透皮滲透是受角質層限制的被動擴散過程。Michaels等測定了一些模型藥物在角質層中的表觀擴散系數(shù)，指出雖然皮膚有良好的屏障特點，但是某些藥物還是具有較大的滲透性。這些研究奠定了二十世紀七十年代后透皮給藥系統(tǒng)研發(fā)的基礎，并因此產生了第一個經FDA認證的商品，即劑量為3d/1次的東莨菪堿貼劑，用于治療暈動癥。FDA在最近的二十多年已經通過了35種透皮貼劑產品，大約有17種有效成分用于貼劑產品中，為透皮免疫疫苗的研究奠定了理論基礎。從人和動物的健康角度出發(fā)，在疫苗的投遞上發(fā)展一種安全而有效的途徑仍然是需要優(yōu)先考慮的問題。因為疫苗通過注射器或針頭接種可能會引起被接種者的皮膚膿腫和皮膚創(chuàng)傷疼痛，同時也有可能使得操作者受傷，并且5艾滋、肝炎等重大傳染病發(fā)病率居高不下與注射免疫交叉感染有關。此外，新型疫苗的投遞技術黏膜免疫，包括滴鼻和口服免疫，比傳統(tǒng)的非胃腸道途徑更簡單、容易、安全，在人和動物上成功地顯示了一種新的免疫接種途徑。但是，口服免疫易造成抗原在消化道受酶和酸的破壞，滴鼻免疫易造成大部分抗原流入食道，而被鼻黏膜吸收的部分很少，如何控制量效關系成為滴鼻、口服免疫亟待解決的問題。近些年，一種新的免疫接種途徑一透皮免疫(Transcutaneousimmunization,TCI)應運而生，這種途徑避免了以上途徑的缺點，潛在的減少了注射免疫的并發(fā)癥，避免了胃酸的消化作用及量效關系難以控制的影響，為疫苗的投遞提供了新技術。過去的疫苗制劑多數(shù)是用針注射入皮膚內的。用針注射疫苗有諸多缺點，如注射伴有痛感，需無菌針頭和注射器，需訓練有素的醫(yī)務人員來完成疫苗接種，注射會引起不適及用針穿刺皮膚會帶來一些潛在的并發(fā)癥。透皮免疫不再使用注射器，而是通過皮膚接種，避免了上述缺點，因而是疫苗遞送的一大進步。此外，透皮免疫優(yōu)于注射途徑接種，因為在前一情況下，使用靶向皮膚表面大面積的多位點免疫接種，可能會靶向于更多的免疫細胞。足以誘導免疫應答的有效量抗原既可在單一皮膚部位、又可在覆蓋多個引流淋巴結區(qū)一塊完整皮膚區(qū)域進行經皮遞送。與在單一部位，經皮內、皮下或肌內注射少量抗原相比，在遍布全身的各部位靠近大量不同淋巴結的這種部位進行接種會對免疫體系產生更廣泛而強烈的剌激。透皮免疫，即經皮接種免疫，通過在皮膚表面外敷抗原和佐劑，誘導系統(tǒng)免疫和黏膜免疫產生抗體。在這種方法中，抗原被應用到完整的皮膚表面，在穿越角質層后被定居在皮膚中的朗格漢斯細胞攝取并加工，然后被運輸?shù)揭髁馨徒Y以啟動免疫應答。常用的佐劑主要包括霍亂弧菌的CT和大腸桿菌的LT，當使用貼劑(patch)將志賀氏痢疾桿菌和沙門氏菌抗原、大腸桿菌CS6抗原與LT或CT透皮免疫時，在不同的動物模型以及近來的人體志愿者中既能激發(fā)抗體應答(IgG和IgA)，又能激發(fā)強烈的細胞免疫和黏膜免疫應答，并且未發(fā)現(xiàn)任何不良反應。位于美國馬里蘭州的IOMAI公司是透皮疫苗給藥的創(chuàng)造者，不僅證明透皮疫苗可提供有力的免疫反應，證明是安全的。IOMAI的研究人員己經證明，當以不同劑量通過皮貼劑透皮給藥時，可以安全地誘發(fā)出與口服免疫具有相同數(shù)量級的免疫反應，這些發(fā)現(xiàn)對于有效的無針疫苗接種戰(zhàn)略具有重要意義。透皮免疫的機制目前還不是十分清楚，但已有研究表明，起源于骨髓的樹突狀細胞--一朗格漢斯細胞LCs以及與其一起定居在表皮內的M細胞在免疫應答過程中發(fā)揮了重要作用。LCs主要有兩種功能免疫監(jiān)視和抗原遞呈功能，在被抗原激活后，遷移出皮膚，進入引流淋巴結，誘導T、B細胞的抗原特異性反應。在應用抗原的同時，透皮免疫還添加了免疫刺激劑(細菌毒素或激活信號)，可提供激活DCs成熟的必要信號，高水平表達共刺激分子、分泌因子，使之變成強大的抗原提呈細胞，聯(lián)合抗原引起初次免疫應答?，F(xiàn)已證實人和動物經透皮免疫后，這些毒素不會導致副作用的出現(xiàn)，從而保證了接種的安全性，并且透皮免疫避免了肝臟的首過效應，提高了生物利用度；避免了注射引起的疼痛；延長了作用時間，減少用藥次數(shù)；可自行用藥，并隨時停藥，使用方便，使用者順應性好。特別適用于兒童、老人和大聚集群體的免疫接種。透皮免疫途徑常用的劑型為貼劑(patch)，該制劑經皮膚敷貼方式免疫，既可引起局部反應，又可引起全身反應。除此之外，還包括軟膏劑、硬膏齊[J、涂劑和氣霧劑等。透皮制劑因為低價位和患者良好的順應性己被廣泛應用，使用呈明顯增加趨勢，尤其是兒童和老年人更喜歡使用透皮制劑。雌酮和睪丸激素透皮制劑的應用就是很好的例子。對婦女來講，可用7天的Climara/E透皮制劑(雌二醇透皮系統(tǒng))具有副作用最小，不用頻繁更換用藥的優(yōu)點，因而上市后很快得到了婦女患者的喜愛。對老年男性來講，幾年內將會出現(xiàn)的睪丸激素透皮制劑體積小，使用方便，并且價格也可能會比較低。現(xiàn)在還有幾個更新的透皮技術也在研發(fā)中。美國的Pharmetrix和NexMed公司正在開發(fā)滲透力增強劑，提高親脂性和親水性藥物在皮膚中的滲透能力。其它公司應用電穿孔技術使藥物更容易通過皮膚，如Noven公司和Elan公司正在應用電離子滲入法，使不同的藥物(包括多肽)更容易滲入皮膚，Noven公司還有一個哌甲酯的透皮制劑處于II期臨床階段。目前促進抗原滲7透皮膚的方法多種多樣，除促滲劑外，一些在藥物上使用的有效化學方法和物理方法，包括離子導入、電穿孔以及超聲、激光和放熱等促滲技術也正被引入到疫苗當中來。促滲劑一般分為兩類一類僅增加抗原在角質層的擴散，例如，丙酮、乙醇等。另一類則不僅增加抗原的擴散，還能促進抗原從角質層向活組織的分配，例如，二甲基亞砜(DMSO)、油酸、葵基甲基亞砜(DCMS)以及一些表面活性劑等。在透皮免疫中，佐劑與抗原共同應用才能誘導強烈的體液、細胞和黏膜免疫應答，因此尋找安全、有效的透皮免疫佐劑也具有重要的現(xiàn)實意義?？傊?，開發(fā)流感透皮疫苗代替?zhèn)鹘y(tǒng)的注射疫苗具有很大的應用前景，因為流感透皮疫苗具有簡單、安全、有效、適用于所有人群以及可以自我接種的特點。
發(fā)明內容本發(fā)明目的在于提供透皮免疫流感多價疫苗及其制備方法。本發(fā)明透皮免疫流感多價疫苗包含透皮免疫佐劑、流感多價疫苗抗原、促滲劑。本發(fā)明流感多價疫苗包含了流感三價(H1N1、H3N2、B)、四價(H1N1、H3N2、B、H5N1)或在此基礎上任意組合的多價(H1N1、H3N2、B、H5N1、H7N7、H9N2等亞型)疫苗抗原；也可以是包含了H1-H16亞型，Nl-N9亞型的所有組合得到的流感多價疫苗抗原；流感多價疫苗抗原為滅活疫苗抗原或減毒活疫苗抗原；疫苗中流感疫苗抗原為通常所使用的量，滅活疫苗抗原(全病毒、裂解病毒、病毒體、病毒樣顆粒)HA含量為1.5ug-100ug/0.2ml/人份，而減毒活疫苗抗原的量為IX106EID5。_50X106EID5。/0.2ml/人份或0.1X106'5_75TCID5。-10X106'5_7'5TCID5。/0.2ml/人份。本發(fā)明中涉及的促滲劑是二甲基亞砜(DMSO)、油酸、咪喹莫特、乙醇、丙二醇、丙酮或葵基甲基亞砜(DCMS)以及吡咯酮衍生物，優(yōu)選油酸或咪喹莫特；抗原與促滲劑的混合體積比例為5-20:1，優(yōu)選10:1(V/V)。本發(fā)明中涉及的透皮佐劑是細菌ADP-外毒素(bacterialADP-ribosylatingexotoxin,hARE)的成員，包括霍亂毒素(choleratoxin，CT)、大腸桿菌不而f熱毒素(Escherichiacoliheat-labileenterotoxin，LT)以及它們的突變體，此外還包括CpG等其他類型佐劑；透8皮佐劑與抗原的混合重量比例為1:1-1:10(w/w)，優(yōu)選l:l、1:2、1:9、1:5、1:7。本發(fā)明中涉及流感多價疫苗抗原包括四價(Hl、H3、H5、B)，五價(Hl、H3、H5、H7、B)也可是(Hl、H3、H5、H9、B)也可是(Hl、H3、H5、H7、H9)等等量組合；六價(Hl、H3、H5、H7、H9、B)也可是(Hl、H2、H3、H5、H7、H9)也可是(Hl、H2、H3、H4、H5、H6)等等量組合；八價(Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H9)也可是(Hl、H2、H3、H4、H5、朋、H7、B)也可是(Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H9、B)等等量組合；十價(Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H9、HIO、B)也可以是(Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10)等等量組合；十二價(Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、Hll、H12)也可是(Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、Hll、B)等等量組合；十四價(Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、Hll、H12、H13、H14)也可是(Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、Hll、H12、H13、B)等等量組合；十六價(Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、Hll、H12、H13、H14、H15、H16)也可以是(Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、Hll、H12、H13、H14、H15、B)等等量組合，也可以是包含了H1-H16亞型，N1-N9亞型的所有組合得到的流感多價疫苗抗原。上述流感多價疫苗抗原均可以采用CN20061007909.5專利申請的方法制備。本發(fā)明上述一種流感多價滅活疫苗貼劑的制備使用雞胚培養(yǎng)和傳統(tǒng)的分離純化方法；流感疫苗抗原的制備按照常規(guī)的方法感染雞胚獲得，也可用哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、2BS細胞等)進行培養(yǎng)獲得；獲得的疫苗抗原首先經福爾馬林滅活，然后除菌、超濾濃縮、柱層析或密度梯度離心進行分離純化；濃縮純化后的疫苗抗原與透皮免疫佐劑如LT、CT或CpG等、促滲劑如油酸或咪喹莫特等混合，加入常規(guī)醫(yī)用敷料制成透皮疫苗貼劑。上述本發(fā)明所提供的通過雞胚生產流感多價滅活疫苗的方法，包括以下1)雞胚大量培養(yǎng)病毒，收集病毒進行福爾馬林滅活，然后通過除菌、超濾濃縮、密度梯度離心或其它層析方法分離純化。2)濃縮純化后的流感疫苗抗原與透皮免疫佐劑如LT、CT或CpG等、促滲劑如油酸或咪喹莫特，加入常規(guī)醫(yī)用敷料制成透皮疫苗貼劑；上述本發(fā)明所提供的通過哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、二倍體細胞等)生產流感多價滅活疫苗的方法，包括以下步驟1)使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、二倍體細胞等)大量培養(yǎng)病毒，收集病毒進行福爾馬林滅活，然后通過除菌、超濾濃縮、密度梯度離心或其它層析方法分離純化；2)濃縮純化后的流感疫苗抗原與透皮免疫佐劑如LT、CT或CpG等、促滲劑如油酸或咪喹莫特混合，加入常規(guī)醫(yī)用敷料制成透皮疫苗貼劑。本發(fā)明還提供一種流感減毒活疫苗貼劑的制備通過反向遺傳學方法，A、B型多價疫苗抗原分別以冷適應減毒流感病毒株A/AnnArbor/6/60和B/ArmArbor/1/66為拯救病毒骨架，整合當年流行病毒株的表面抗原基因，利用流感病毒質粒拯救系統(tǒng)制備多價疫苗抗原，通過感染雞胚或哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、2BS細胞等)進行培養(yǎng)，然后除菌、超濾濃縮、蔗糖密度梯度離心或其他層析方法分離純化；濃縮純化后的多價疫苗抗原與透皮免疫佐劑如LT、CT或CpG等、促滲劑如油酸或咪喹莫特等混合，加入常規(guī)醫(yī)用敷料制成透皮疫苗貼劑。本發(fā)明上述所提供的通過雞胚生產流感多價減毒活疫苗的方法，包括以下步驟1)利用反向遺傳學方法，8、3或4個重組質粒共轉染哺乳動物細胞(如C0S1、C0S7、Vero、MDCK、293T等細胞或C0S/MDCK、293T/MDCK等共培養(yǎng)細胞)產生多價疫苗抗原；2)雞胚大量培養(yǎng)病毒，收集病毒通過除菌、超濾濃縮、蔗糖密度梯度離心或柱層析分離純化；3)濃縮純化后的流感多價疫苗抗原與透皮免疫佐劑如LT、CT或CpG等、促滲劑如油酸或咪喹莫特混合，加入常規(guī)醫(yī)用敷料制成透皮疫苗貼劑。10本發(fā)明上述所提供的通過哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、2BS細胞等)生產流感多價減毒活多價疫苗抗原的方法，包括以下步驟-1)利用反向遺傳學方法，8、3或4個重組質粒共轉染哺乳動物細胞(如C0S1、C0S7、Vero、MDCK、293T等細胞或COS/MDCK、293T/MDCK等共培養(yǎng)細胞)產生多價疫苗抗原；2)使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、2BS細胞等)大量培養(yǎng)多價疫苗抗原，收集病毒通過除菌、超濾濃縮、蔗糖密度梯度離心或柱層析分離純化；3)濃縮純化后的流感多價疫苗抗原與透皮免疫佐劑如LT、CT或CpG等、促滲劑如油酸或咪喹莫特等混合，加入常規(guī)醫(yī)用敷料制成透皮疫苗貼劑。本發(fā)明包含的流感病毒三價、四價及多價疫苗抗原可以是減毒或滅活多價疫苗抗原的任何一種抗原，其中滅活多價疫苗抗原可以是滅活全病毒疫苗、裂解疫苗、病毒體或病毒樣顆粒等其中的任何一種。本發(fā)明疫苗形式可采用液體、粉末狀、乳脂狀及乳化的促滲劑型，優(yōu)選粉末狀。疫苗成分還可以含有如穩(wěn)定劑、保濕劑及防腐劑等一系列添加物。本發(fā)明透皮免疫將抗原和佐劑應用于皮膚誘導抗原特異性免疫應答，是一種新穎的免疫策略，在人和動物上具有能誘導強烈的黏膜IgG和slgA抗體的產生和全身免疫應答的雙重效果，并且對毒素和強毒株病毒的黏膜攻擊有較好的免疫保護效果。此外，透皮免疫具有誘導系統(tǒng)免疫和黏膜免疫的雙重功效。透皮免疫接種還具有以下特點(1)使用安全、簡便，人人可以自己經皮接種，適合于流感大流行或家庭化；(2)維持恒定的血藥濃度或藥理效應，增強了治療效果，減少了副作用，避免了注射的疼痛和交叉感染；(3)—苗多效，既可預防普通流感，又可預防人禽流感；(4)雙重功效，既可產生系統(tǒng)免疫，又可產生黏膜免疫；(5)副反應低，既可用于成年，又可適用兒童與老年；(6)制備簡單、成本低廉，工藝流程簡單，可以大大降低生產成本。本發(fā)明為一種透皮免疫的流感多價疫苗，該疫苗的主要成分為利用反向遺傳學重配冷適應病毒株技術制備的流感三價、四價及多價(H1N1、H3N2、B、H5N1、H7N7、H9N2等亞型)減毒活病毒抗原或滅活流感病毒抗原，分別與一種透皮免疫佐劑(既可延長抗原停留時間對皮膚細胞的靶向性，又可增強抗原提呈細胞的抗原提呈功能)、一種促滲劑(既可增加抗原擴散，又可促進抗原從角質層向抗原提呈細胞中聚集)制備貼劑，可有效預防人普通流感病毒、高致病性人禽流感病毒的感染。實驗證明該疫苗在誘導黏膜slgA及系統(tǒng)性IgG抗體免疫應答方面效果顯著，能安全、有效地的預防人普通流感和高致病性人禽流感。本發(fā)明的優(yōu)點還在于，帶有LT、CT或CpG等佐劑透皮免疫的流感四價或多價滅活或減毒活疫苗，在哺乳動物中可同時誘導有效的黏膜免疫和系統(tǒng)免疫，并使機體產生高效價slgA和IgG、IgA，其效果較目前所應用的疫苗組分——無論是單純的流感滅活病毒顆粒、加佐劑的滅活病毒及活病毒都理想。本疫苗經實驗驗證，通過使用一種透皮免疫佐劑如LT、CT或CpG等經透皮免疫可以有效地提高疫苗的免疫原性，且無任何毒副作用，表明有很好的安全性。本發(fā)明的流感多價滅活或減毒活疫苗與以往疫苗免疫途徑及佐劑均不同。經透皮途徑免疫Balb/c小鼠，結果證明，按第O、14天兩次透皮免疫程序，可產生高效價的IgA和IgG抗體，即可同時誘導黏膜免疫和系統(tǒng)免疫?？梢院芎玫谋Ｗo小鼠免受流感病毒的攻擊，且產生了一定的交叉保護性，這是通常注射免疫的滅活流感疫苗所無可比擬的。經透皮途徑免疫雪貂和猴子，無論是流感多價滅活疫苗還是減毒活疫苗，均可產生較高的HI效價，進一步說明透皮免疫途徑為流感多價疫苗可供選擇的理想途徑之一。圖1流感病毒四價滅活疫苗兩種途徑免疫Balb/c小鼠血清IgG/IgA滴度比較具體實施例方式下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法；下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質量體積百分含量。實施例1:流感病毒的雞胚培養(yǎng)，采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法。A型流感病毒株包括(Hl、H3、H5等亞型)和B型流感病毒株由中國CDC和華蘭生物技術股份有限公司提供。流感病毒培養(yǎng)采取接種9-11日齡SPF雞胚尿囊腔，33-35。C培養(yǎng)48_72h(視病毒亞型不同培養(yǎng)時間略有不同)，4'C冰箱過夜凍死雞胚，收獲雞胚尿囊液獲得大量病毒。哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、二倍體細胞等)培養(yǎng)流感病毒，A型流感病毒株包括(Hl、H3、H5等亞型)和B型流感病毒株由中國CDC和華蘭生物技術股份有限公司提供。采用微載體系統(tǒng)(如Cytodex1、3等)在100mlWAVE反應器中培養(yǎng)，逐漸過渡到10L的生物發(fā)生器中培養(yǎng)，并加入3g/L微載體可獲得Vero細胞的良好生長，此時用流感病毒感染Vero細胞，在感染36-48小時后可獲得TCID50達到106-107/ml的病毒量。流感四價滅活疫苗抗原的制備A型流感病毒株Hl、H3、H5和B型流感病毒株由中國CDC和華蘭生物技術股份有限公司提供。采用傳統(tǒng)的雞胚尿囊腔培養(yǎng)流感病毒方法或微載體懸浮培養(yǎng)和馴服哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、2BS細胞等)培養(yǎng)流感病毒。①接種9-11日齡雞胚尿囊腔大量培養(yǎng)H1、H3、H5和B型流感病毒，收集病毒經福爾馬林滅活，除菌、超濾濃縮、蔗糖密度梯度離心或柱層析分離純化，透析及過濾除菌。②由哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、2BS細胞等)生產Hl、H3、H5和B型流感病毒，用無血清培養(yǎng)基，采用的方法有微載體懸浮培養(yǎng)和馴服哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、2BS細胞等)培養(yǎng)流感病毒。收集病毒經福爾馬林滅活，除菌、超濾濃縮、蔗糖密度梯度離心或柱層析分離純化，透析及過濾除菌，制備流感四價滅活疫苗抗原。流感四價減毒活疫苗抗原的制備A型流感病毒株H1、H3、H5和B型流感病毒株由中國CDC和華蘭生物技術股份有限公司提供。采用傳統(tǒng)的雞胚尿囊腔培養(yǎng)流感病毒方法或微載體懸浮培養(yǎng)和馴服哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、2BS細胞等)培養(yǎng)流感病毒。①利用現(xiàn)有反向遺傳學方法，A型多價病毒以冷適應減毒流感病毒株A/AnnArbor/6/60為病毒骨架，B型多價病毒以B/AnnArbor/1/66為拯救病毒骨架，分別整合當年流行A、B型流感病毒株的HA、NA表面抗原基因，即將H1N1、H3N2、H5N1和B型流感病毒基因片段構建的8、3或4個重組質粒共轉染哺乳動物細胞(如C0Sl、C0S7、Vero、MDCK、293T等細胞或C0S/MDCK、293T/MDCK等共培養(yǎng)細胞)產生4種多價病毒。②雞胚大量培養(yǎng)4種多價病毒，收集病毒通過除菌、超濾濃縮、蔗糖密度梯度離心或柱層析分離純化，透析及過濾除菌。③由哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、2BS細胞等)生產4種多價病毒用無血清培養(yǎng)基，采用的方法有微載體懸浮培養(yǎng)和馴服哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、2BS細胞等)培養(yǎng)流感病毒。收集病毒通過除菌、超濾濃縮、蔗糖密度梯度離心或柱層析分離純化，透析及過濾除菌，制備流感四價減毒活疫苗抗原。流感多價滅活疫苗抗原的制備A型流感病毒株Hl、H3、H5、H7、H9等亞型和B型流感病毒株由中國CDC和華蘭生物技術股份有限公司提供。采用傳統(tǒng)的雞胚尿囊腔培養(yǎng)流感病毒方法或微載體懸浮培養(yǎng)和馴服哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、2BS細胞等)培養(yǎng)流感病毒。①接種9-11日齡雞胚尿囊腔大量培養(yǎng)H1、H3、H5、H7、H9等亞型和B型流感病毒，收集病毒經福爾馬林滅活，除菌、超濾濃縮、蔗糖密度梯度離心或柱層析分離純化，透析及過濾除菌。②由哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、2BS細胞等)生產Hl、H3、H5和B型流感病毒，用無血清培養(yǎng)基，采用的方法有微載體懸浮培養(yǎng)和馴服哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、2BS細胞等)培養(yǎng)流感病毒。收集病毒經福爾馬林滅活，除菌、超濾濃縮、蔗糖密度梯度離心或柱層14析分離純化，透析及過濾除菌，制備流感多價滅活疫苗抗原。流感多價減毒活疫苗抗原的制備A型流感病毒株Hl、H3、H5、H7、H9等亞型和B型流感病毒株由中國CDC和華蘭生物技術股份有限公司提供。采用傳統(tǒng)的雞胚尿囊腔培養(yǎng)流感病毒方法或微載體懸浮培養(yǎng)和馴服哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、2BS細胞等)培養(yǎng)流感病毒。①利用現(xiàn)有反向遺傳學方法，A型多價病毒以冷適應減毒流感病毒株A/AnnArbor/6/60為病毒骨架，B型多價病毒以B/AnnArbor/1/66為拯救病毒骨架，分別整合當年流行A、B型流感病毒株的HA、NA表面抗原基因，即將H1、H3、H5、H7、H9等亞型和B型流感病毒基因片段構建的8、3或4個重組質粒共轉染哺乳動物細胞(如C0S1、C0S7、Vero、MDCK、293T等細胞或COS/MDCK、293T/MDCK等共培養(yǎng)細胞)產生多種多價病毒。②雞胚大量培養(yǎng)多種多價病毒，收集病毒通過除菌、超濾濃縮、蔗糖密度梯度離心或柱層析分離純化，透析及過濾除菌。③由哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、2BS細胞等)生產多種多價病毒用無血清培養(yǎng)基，采用的方法有微載體懸浮培養(yǎng)和馴服哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、2BS細胞等)培養(yǎng)流感病毒。收集病毒通過除菌、超濾濃縮、蔗糖密度梯度離心或柱層析分離純化，透析及過濾除菌，制備流感多價減毒活疫苗抗原。流感多價滅活疫苗透皮貼劑的制備①將A、B型及人禽流感病毒感染哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、2BS細胞等)，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)病毒，或按照雞胚培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法從感染雞胚的尿囊液中獲得病毒。②由細胞培養(yǎng)生產滅活病毒于感染的細胞上清液中加入福爾馬林，其終濃度為0.025%，于32"C孵育24小時，然后采用0-50%蔗糖連續(xù)梯度進行區(qū)帶離心，經DNA去除、透析及過濾除菌獲得成品，于-7(TC儲存。終產品經檢驗符合下列標準15DNA(Vero細胞)內毒素致熱原血凝素含量(HA)蛋白質含量蔗糖含量福爾馬林含量Benzonase含量③佐劑與抗原的混合將透皮免疫佐劑LT、CT或CpG等與多價疫苗抗原按照l:l、1:2、1:9、1:5或1:7(w/w)的比例混合，用IOOOOMW透析袋，PBS透析8-10天，即制備成疫苗；疫苗與促滲劑二甲基亞砜、油酸或咪喹莫特或葵基甲基亞砜按10:1(V/V)及常規(guī)醫(yī)用敷料比例混合制成貼劑。流感多價減毒活疫苗透皮貼劑的制備①利用反向遺傳學方法，8、3或4個重組質粒共轉染哺乳動物細胞(如C0S1、C0S7、Vero、MDCK、293T等細胞或C0S/MDCK、293T/MDCK等共培養(yǎng)細胞)產生多價流感病毒。②雞胚大量培養(yǎng)病毒，收集病毒采用0-5096蔗糖連續(xù)梯度進行區(qū)帶離心，經透析及過濾除菌獲得成品，于-7(TC儲存。③由哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、2BS細胞等)生產病毒-用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)病毒，采用0-50%蔗糖連續(xù)梯度進行區(qū)帶離心，經DNA去除、透析及過濾除菌獲得成品，于7(TC儲存。④佐劑與抗原的混合將透皮免疫佐劑LT、CT或CpG等與疫苗按照1:1(w/w)或1:2、1:9、1:5、l:7的比例混合，用10000MW透析袋，PBS透析8-10天，即制備成疫苗；疫苗與促滲劑二甲基亞砜、油酸或咪喹莫特或葵基甲基亞砜按10:1(V/V)及醫(yī)用敷料比例混合制成貼劑。實施例2:流感多價滅活/減毒活疫苗的小鼠體內效果觀察1、免疫計劃方案，使用不同劑型的(透皮，注射免疫為對照)流感病毒疫苗免疫小鼠①用40#剪刀對6-8周齡Balb/c小鼠剃毛。剃毛過程應不對皮膚造成任何損傷。剃毛范圍從胸闊中部至緊貼勁背下部。讓小鼠休息24h。此前己對小鼠作了標記以便辨認，并已預先取血以獲得免疫前血清。②然后按如下方法免疫小鼠。用20mg/ml甲苯噻嗪溶液0.03-0.06ml，100mg/ml氯胺酮0.5ml麻醉小鼠；這一劑量的麻醉劑使小鼠靜止不動約lh。(D將免疫溶液按以下方法加到小鼠的去毛背部皮膚上將1.2cmX1.6cm的鏤空聚苯乙烯板輕輕放在小鼠背部，用浸透鹽水的無菌紗布部分濕潤皮膚(可用免疫溶液)，然后用滴管將免疫溶液加在鏤空板處，形成2cm2的免疫溶液貼劑。或者在剃毛部位涂上固定體積的免疫溶液。小心使滴管尖不刮傷或擦傷皮膚。④使得免疫溶液(約100W至200W)在小鼠背部靜置60至180min。60min后，輕輕抓住小鼠的脖子和尾部，用大量微溫的自來水沖洗10秒鐘。然后用一塊無菌紗布將小鼠輕輕拍干，再洗10秒；再次拍干后將小鼠放回籠中。小鼠看起來對麻醉、免疫接種、洗滌過程或外毒素的毒性沒表現(xiàn)出任何不適反應。免疫接種后，未見皮膚剌激或紅腫，小鼠生存狀態(tài)良好。2、按照例1所制備佐劑/抗原混合體，同時將抗原用PBS稀釋到其HA濃度為^15ug/ml，減毒活疫苗的量》5X106EIDs。，作為無佐劑對照組(Tabl)。為制備適用于小鼠透皮免疫的劑型，可將溶液用PBS作適當稀釋。21組Balb/c小鼠分別接受不同劑型的疫苗透皮免疫，每只小鼠100u1含有佐劑的抗原溶液。分別于第O、14天進行免疫，并于第28天測定血清，唾液及肺灌洗液中的IgG、IgA及HAI效價。表l疫苗透皮免疫Balb/c小鼠的免疫方案組別(Balb/c)疫苗抗原種類劑量免疫途徑1.滅活疫苗(來源于Vero細胞)5X106EID6。lOOnl/透皮..2.滅活疫苗(來源于雞胚)5X106EID50lOOu1/透皮3減毒活疫苗(來源于Vero細胞)5X106EID50100u1/透皮4.減毒活疫苗(來源于雞胚)5X106EID50lOOu1/透皮5.Vero細胞對照5%of1uglOOu1/透皮6.雞胚對照5%of1uglOOu1/透皮3、血清，唾液及肺灌洗液中的IgG、IgA及HAI效價的測定①免疫后28天，取動物的唾液、肺臟及血清標本，測定每份標本的抗體效價。②用0.5mlPBS注入小鼠口腔，收集唾液測定其IgA含量。③肺組織裂解標本的制備處死小鼠，打開喉部，取出肺臟并用PBS清洗，研磨肺組織并離心勻漿去細胞組織，收集上清液并儲存于-2(TC，用于IgA效價測定。IgG和IgA效價測定使用商品化甲型或乙型流感病毒ELISA檢測試劑盒(GenzymeVirotech)。37'C孵育2小時后加入羊抗鼠IgG或IgA抗體(Pharmigen)及底物液和顯色液檢測特異性IgG和IgA抗體效價。⑤HAI效價測定取小鼠血液，按照Palmeretal指定方法測定甲型和乙型流感病毒HAI效價。⑥數(shù)據(jù)顯示在無佐劑的情況下，滅活的全病毒顆粒不能激發(fā)機體的IgA和IgG免疫應答，相反，如果在活病毒或滅活的全病毒顆粒中加入LT、CT或CpG等佐劑，可激發(fā)機體產生較高效價的IgA、IgG、和HAI(Tab2)。表2不同種類流感疫苗株透皮免疫小鼠后唾液、肺灌洗液中IgA效價以及血清IgG和HAI效價的測定結果效價IgAIgGHAI種類毒株佐劑唾液肺灌洗液血淸血清wsMLFluAFluAFluBFiuAFluBFluB訓l固2H5N1B滅活苗(來源于細胞)NC，WS，1T，ML1080102010320<1016C<10640<10320腳102,40010025，600160640803208032040160CT8020160160320320102,40051，200320160320160CpG4020320則64032051，2C025,60032060640320滅活苗(來源于雞胚)NC，WS，XJ，MLur<10801020160160<10320<10320痛5，120100102，400803201603208016040160CT80203201603203205UG051，200640160320160CpG802032016064032051,20025，60032032064:0320減毒活疫苗(來源于細胞)NC，WS，XJ"，ML2080402080160401608064080320320102'40032025，60016064080320160160160160CT804032016032032025，6。051,200320160320160CpG802032016064032051,2CO12,800320640160320減毒活疫苗(來源于雞胚)NC,WS，——2040808080化3208016016040XJ,MLLT802032016032032012，咖25，600640320320160CT402032016032032051,20012>80016032064016018CpG802032016064032051,20025,600320320160320—一<10<10n.dn.d<10<10<10<1080160<10<10—-<10<10n.dn.d<10<10<10<1080160<10<10LT<10<10<10<10<10<10<10<10<10<10<10<10CT<10<10<1D<10<10<10<10<10<10<10<10<10CpG<10<10<10<10<10<10<10<10<10<10<10<10NC表示NewCaledonia/20/99，WS表示Wisconsin/67/2005,XJ表示XiJiang/424/2004,ML表示Malaysia/2506/2004,PL表示肺灌洗液，n.d表示沒有測定3、以LT為佐劑的流感四價滅活疫苗不同免疫途徑的比較，將疫苗分別進行透皮免疫，肌肉注射兩種不同免疫途徑進行接種。結果表明，肌肉注射雖然產生了更高效價的IgG，但卻沒有檢測到明顯的IgA抗體。但透皮免疫卻產生了高效價的IgA。IgA抗體在對抗呼吸道的傳染病中發(fā)揮重要作用，說明流感多價疫苗透皮免疫途徑為可供選擇的理想途徑之一(圖l)。實施例3:流感多價滅活/減毒活疫苗的雪貂體內效果觀察1、免疫計劃，使用不同劑型的流感病毒疫苗免疫雪貂①按照例1所制備佐劑/抗原混合體的方法，制備適用于雪貂透皮免疫的劑型，可將溶液用PBS作適當稀釋LT。②6-10周齡的雄性和雌性雪貂，選取體重為1-2kg的用于本實驗，所有這些動物在實驗之前均為血清陰性。免疫后14天，雪貂通過頸靜脈取血測定HI效價。③6組雪貂，分別接受不同劑型的疫苗透皮免疫，每只lml含有佐劑如LT、CT或CpG等的抗原溶液，貼劑用于耳背或上肢外側，按照表3的組別分別進行免疫，并于第14天測定HI效價。2、血清HI效價測定雪貂頸靜脈取血，按照OIE標準指定的方法進行HI測定。3、實驗結果顯示，流感四價滅活或減毒活疫苗，無論是雞胚培養(yǎng)得到的，還是Vero細胞培養(yǎng)得到的病毒抗原，加佐劑如LT、CT、CpG等經透皮途徑免疫雪貂后，均可產生較高的HI效價。進一步說明透皮免疫途徑是流感多價疫苗可供選擇的理想途徑之一(表3)。細胞對照---雞胚對照一-19表3疫苗免疫雪貂后HI效價測定結果<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>c:Geometrimeantiter幾何平均效價實施例4:透皮流感多價滅活/減毒活疫苗的猴子體內效果觀察1、免疫計劃，使用不同劑型的流感病毒疫苗免疫猴子①按照例1所制備佐劑/抗原混合體的方法，制備適用于猴子透皮免疫的劑型，可將溶液用PBS作適當稀釋LT、CT、CpG等佐劑。②選取健康猴子用于本實驗，所有這些動物在實驗之前均為血清陰性。免疫之后14天，猴子通過頸靜脈取血測定HI效價。③6組猴子，分別接受不同劑型的疫苗透皮免疫，每只lml含有佐劑如LT、CT或CpG等的抗原溶液，貼劑用于耳背或上肢外側，按照表4的組別分別進行免疫，并于第14天測定HI效價。2、血清HI效價測定猴子頸靜脈取血，按照OIE標準指定的方法進行HI測定。3、實驗結果顯示，流感四價滅活或減毒活疫苗，無論是雞胚培養(yǎng)得到的，還是Vero細胞培養(yǎng)得到的病毒抗原，加佐劑如LT、CT、CpG等經透皮途徑免疫雪貂后，均可產生較高的HI效價。進一步說明透皮免疫途徑是流感多價疫苗可供選擇的理想途徑之一(表4)。表4疫苗免疫猴子后HI效價測定結果組別疫苗免疫劑量疫苗來源猴子個數(shù)免疫前血清HI效價GMTC免疫后14天HI效價GMTA滅活苗5X106EID50雞胚1A〈10<101602802A<101603A〈10320B減毒活疫苗5X106EIDM雞胚IB<10<106404002B<10320犯<10320C滅活苗5X106EIDM細胞1C<10<103204002C<106403C<10320D減毒活疫苗5X106EIDM細胞ID<10<103206402D<106403D<101280E雞胚尿囊液IE<10<10<10GO<102E<10<10犯<10FMDCK細胞介質IF<10<10〈10<10<102F<10<103F<10對照陽性猴子2560抗血清c:Geometrimeantiter幾何平均效價實施例5:流感四價減毒活疫苗的人體體內效果觀察1、在健康人群志愿者中，評價并比較透皮途徑給藥加AL(OH)3佐劑的流感滅活疫苗和流感四價減毒活疫苗和的免疫效果，貼劑用于耳背或上肢外2、開放的、受控制的，隨機的來評價了疫苗在男性和女性受試者的局部和系統(tǒng)免疫反應。3、所有受試者執(zhí)行下述檢測-0天，21天ELISA檢測黏膜IgA(局部免疫反應)，分別檢測疫苗中每一流感代表株。O天，21天檢測血清HA-HI抗體滴度，分別檢測每一流感代表株。4、數(shù)據(jù)來源下述項目(1)所有時間點血清HI抗體的幾何平均數(shù)GMTs(95%有效值)。(2)對HI:21天時血清轉化率。(3)對HI:21天時轉化系數(shù)。(4)對HI:21天時的保護率。(5)僅對IgA:從0-21天受試者IgA抗體滴度增加2-4倍的百分率。5、經過對局部和全身癥狀的8天隨訪期，兩種疫苗對安全性和反應性均耐受。關于接種無嚴重有害作用顯示。6、疫苗免疫原性的檢測通過血凝抑制滴度來決定血清轉化率(疫苗的百分率是根據(jù)21天HI滴度是0天至少增加4倍而限定的，每一疫苗株)，轉化系數(shù)(是根據(jù)21天比0天HI幾何平均滴度(GMTs)的倍增值而限定的，每一疫苗株)，血清保護率(接種后公認顯示保護HI滴度^40而限定的，每一疫苗株)，另外黏膜IgA抗體反應用ELISA來檢測。7、接種一劑量透皮流感滅活疫苗或四價減毒活疫苗21天后HI血清陽性，血清轉化率和血清保護率見表5。組別時間接種一劑量21天時HI的血清陽性、血清保護率和血清轉化率n血清陽性%血清保護率n%血清轉化率n%NC0天20420.00021天201890.01680.01575.0滅活苗o天20420.0420.021天201995.01890.01785.0wso天201050.0420.021天2020100.01995.01680.0滅活苗o天20945.015.021天201995.01890.01575.0XJo天20420.00021天201785.01575.016肌0滅活苗o天20840.0630,021天201995.01890.01470.0ML0天20420.00021天201785.01575.01680.0滅活苗o天20840.0630.021天201890.01785.01575.0血清陽性(n，％):編號和受試者的滴度^10血清保護率(n，％)*編號和受試者的滴度^4022血清轉化率(n,%):編號和受試者從0天到21天的滴度至少是4倍的增殖8、結果表明一劑量接種21天后，透皮免疫流感多價減毒活疫苗和滅活疫苗產生相似的血清陽性，血清轉化率和血清保護率。權利要求1、一種透皮免疫流感多價疫苗，其特征在于該透皮免疫流感多價疫苗包含透皮劑、透皮免疫佐劑和流感多價疫苗抗原；流感多價疫苗包含了流感三價、四價或多價疫苗；也就是包含了H1-H16亞型，N1-N9亞型的所有組合得到的流感多價疫苗；流感多價疫苗是滅活疫苗或減毒活疫苗；疫苗中流感病毒抗原為通常所使用的量，滅活疫苗抗原含量為1.5μg-100μg/0.2ml/人份，減毒活疫苗抗原的量為5×106EID50-50×106EID50/0.2ml/人份或0.1×106.5-7.5TCID50-10×106.5-7.5TCID50/0.2ml/人份；促滲劑為二甲基亞砜、油酸、咪喹莫特、乙醇、丙酮以及吡咯酮衍生物或葵基甲基亞砜；抗原與促滲劑的混合體積比例為5-20∶1；透皮佐劑為細菌ADP-外毒素的成員，包括霍亂毒素、大腸桿菌不耐熱毒素以及它們的突變體，此外還包括CpG等其他類型佐劑；透皮佐劑與抗原的混合重量比例為1∶1-110。2、如權利要求1所述的透皮免疫流感多價疫苗，其特征在于該透皮免疫流感多價疫苗中抗原與促滲劑的混合體積比例為10:1。3、如權利要求1所述的透皮免疫流感多價疫苗，其特征在于該透皮免疫流感多價疫苗中抗原與促滲劑的混合體積比例為1:2、1:9、1:5、1:7。4、如權利要求l、2或3所述的透皮免疫流感多價疫苗，其特征在于該透皮免疫流感多價疫苗中其中滅活疫苗是滅活全病毒疫苗、裂解疫苗、病毒體或病毒樣顆粒中的任何一種。5、如權利要求l、2或3所述的透皮免疫流感多價疫苗，其特征在于該透皮免疫流感多價疫苗采用液體、粉末、乳脂或乳化或貼片的透皮劑型。6、如權利要求4所述的透皮免疫流感多價疫苗，其特征在于該透皮免疫流感多價疫苗采用液體、粉末、乳脂或乳化或貼片的透皮劑型。7、如權利要求l、2、3或6所述的透皮免疫流感多價疫苗的制備方法，其特征在于該方法為通過反向遺傳學方法，A、B型多價疫苗抗原分別以冷適應減毒流感病毒株A/AnnArbor/6/60和B/AnnArbor/1/66為拯救病毒骨架，整合當年流行病毒株的表面抗原基因，利用流感病毒質粒拯救系統(tǒng)制備多價疫苗抗原，通過感染雞胚或哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、二倍體細胞等)進行培養(yǎng)，然后除菌、超濾濃縮、蔗糖密度梯度離心或其他層析方法分離純化；濃縮純化后的多價疫苗抗原與透皮免疫佐劑如LT、CT或CpG等、促滲劑如油酸或咪喹莫特混合制成疫苗貼劑。8、如權利要求5所述的透皮免疫流感多價疫苗的制備方法，其特征在于該方法為通過反向遺傳學方法，A、B型多價疫苗抗原分別以冷適應減毒流感病毒株A/ArmArbor/6/60和B/AnnArbor/1/66為拯救病毒骨架，整合當年流行病毒株的表面抗原基因，利用流感病毒質粒拯救系統(tǒng)制備多價疫苗抗原，通過感染雞胚或哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、二倍體細胞等)進行培養(yǎng)，然后除菌、超濾濃縮、蔗糖密度梯度離心或其他層析方法分離純化；濃縮純化后的多價疫苗抗原與透皮免疫佐劑如LT、CT或CpG等、促滲劑如油酸或咪喹莫特混合制成疫苗貼劑。9、如權利要求5所述的透皮免疫流感多價疫苗的制備方法，其特征在于該方法為通過反向遺傳學方法，A、B型多價疫苗抗原分別以冷適應減毒流感病毒株A/AnnArbor/6/60和B/AnnArbor/1/66為拯救病毒骨架，整合當年流行病毒株的表面抗原基因，利用流感病毒質粒拯救系統(tǒng)制備多價疫苗抗原，通過感染雞胚或哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、二倍體細胞等)進行培養(yǎng)，然后除菌、超濾濃縮、蔗糖密度梯度離心或其他層析方法分離純化；濃縮純化后的多價疫苗抗原與透皮免疫佐劑如LT、CT或CpG等、促滲劑如油酸或咪喹莫特混合制成疫苗貼劑。全文摘要本發(fā)明提供一種透皮免疫流感多價疫苗及其制備方法。本發(fā)明透皮免疫流感多價疫苗包含透皮免疫佐劑、流感多價疫苗抗原、促滲劑及醫(yī)用敷料等。本發(fā)明的流感多價滅活或減毒活疫苗與以往疫苗免疫途徑及佐劑均不同。經透皮途徑免疫Balb/c小鼠、雪貂、猴體及人體，結果證明可產生高效價的IgA和IgG抗體，即能夠同時誘導系統(tǒng)免疫和黏膜免疫，可用于普通流感、高致病性人禽流感的免疫預防。文檔編號A61K39/295GK101450209SQ20081024702公開日2009年6月10日申請日期2008年12月31日優(yōu)先權日2008年12月31日發(fā)明者楊鵬輝,段躍強,王希良,王金成,羅德炎,麗邢申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所