專利名稱：黃芪總黃酮在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及黃芪總黃酮的用途，尤其涉及其在制備抗腫瘤藥物中的用途。
背景技術(shù)：
腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，在我國城市人口中，腫瘤是第一位死因，占全部死亡率的1/4。
國內(nèi)外大量實驗證明自由基損傷、氧化損傷、輻射損傷、環(huán)境污染、慢性炎癥等均可導(dǎo)致基因突變或細(xì)胞損傷，如突變得不到修復(fù)或修復(fù)不及時就可引起細(xì)胞異常生長——出現(xiàn)癌變。
根據(jù)腫瘤形成的兩次打擊學(xué)說，由正常細(xì)胞向惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化將要經(jīng)歷漫長的突變和誘變過程。研究表明，大多數(shù)亞臨床狀態(tài)腫瘤發(fā)生的高危人群(亞健康狀態(tài)人群)，常出現(xiàn)血液中一項或多項腫瘤標(biāo)志物高于正常水平，但此時又難以出現(xiàn)影像學(xué)(如B超、CT、MRI等)證據(jù)或臨床癥狀，這類亞臨床患者的腫瘤標(biāo)志物可持續(xù)處于高水平狀態(tài)數(shù)月或數(shù)年而后再出現(xiàn)惡性腫瘤。如果能夠有針對性的治療這些高危人群，將可在一定程度上阻止或延緩惡性腫瘤的形成。
經(jīng)實驗研究，黃芪具有提高免疫力、抗腫瘤的作用，如中國專利申請CN 1723984 A介紹了黃芪的水提物用于治療血液系統(tǒng)腫瘤。但一般研究認(rèn)為，黃芪中發(fā)揮抗腫瘤作用的有效成分是黃芪多糖，上述專利申請中所述的黃芪水提物即是極性較大的水溶性成分。又如中國專利申請CN1557392 A介紹了黃芪多糖和黃芪總皂苷以3-5∶1的比例混合用于治療腫瘤。
所以，對于黃芪抗腫瘤的有效成分及其適應(yīng)癥，還需進一步研究。

發(fā)明內(nèi)容[要解決的技術(shù)問題]本發(fā)明的目的是提供黃芪總黃酮(TFA)在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明的另一個目的是提供上述黃芪總黃酮的制備方法。本發(fā)明提供了黃芪總黃酮在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，具體地說，所述的腫瘤是白血病或肉瘤。
白血病是一種造血組織的惡性疾病，俗稱“血癌”，特點是某一類型的白血病細(xì)胞在骨髓或其它造血組織中的腫瘤性增生，可浸潤體內(nèi)各器官、組織、使各個臟器的功能受損，產(chǎn)生相應(yīng)的癥狀和體征。本發(fā)明中用MTT法觀察了黃芪總黃酮對Molt-4細(xì)胞(急性淋巴母細(xì)胞白血病)，Raji細(xì)胞(Burkitt’s淋巴瘤)，KG-1細(xì)胞(髓系)和Jarkat-1細(xì)胞(T-細(xì)胞白血病)的半數(shù)抑制濃度(IC50)，結(jié)果顯示，黃芪總黃酮對T細(xì)胞系白血病細(xì)胞和髓系白血病細(xì)胞均有良好的抑制作用，這對臨床應(yīng)用有重要參考意義。
肉瘤是指來源于間葉組織(包括結(jié)締組織和肌肉)的惡性腫瘤。多發(fā)生于皮膚、皮下、骨膜及長骨兩端。如纖維肉瘤生長迅速，腫瘤晚期常有壞死、出血、切面灰紅色、質(zhì)均勻細(xì)如生魚肉狀。骨肉瘤以青年人為多，好發(fā)于四肢長骨之兩端，尤以股骨下端、脛骨上端和肱骨上端最多見。在黃芪總黃酮抗S180肉瘤細(xì)胞的實驗中，該藥物與對照組比較均有極顯著意義(p＜0.001)。
腫瘤的起因復(fù)雜多樣，在本發(fā)明的應(yīng)用中，所述的白血病或肉瘤主要是由基因突變(mutation)或細(xì)胞損傷引起的。
本發(fā)明所述的基因突變是指由氧自由基、紫外線輻射、電離輻射引起的基因突變。
近年來隨著對自由基對線粒體造成的氧應(yīng)激損傷的研究，氧自由基對線粒體DNA(mtDNA)攻擊可能是線粒體衰老的原因，并有人猜想，受到氧自由基攻擊并發(fā)生改變的部分mtDNA會逃離線粒體至核內(nèi)，并將已發(fā)生改變的DNA序列整合到染色體或核內(nèi)DNA中，造成細(xì)胞核內(nèi)DNA損傷或突變。在DNA氧化損傷中，8-羥基鳥嘌呤(8-OH-G)形成頻率最高，致突變能力最強，是DNA氧化損傷的代表性產(chǎn)物，是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要因素。
人皮膚因受紫外線照射而使同一條DNA鏈上相鄰的嘧啶或者嘌呤以共價鍵連成二聚體的頻率可達每小時5×104/細(xì)胞，它所誘導(dǎo)的突變一般只局限于皮膚中引起皮膚癌變。此外，紫外線照射還能引起DNA鏈斷裂等損傷。
電離輻射可導(dǎo)致DNA分子的多種變化，如堿基變化、脫氧核糖變化、DNA鏈斷裂和交聯(lián)，前述突變因素均可造成基因突變，如不能及時得到修復(fù)，最終均可能發(fā)展成惡性腫瘤。黃芪總黃酮對超氧陰離子自由基和羥自由基等活性氧有很好的清除效能。
本發(fā)明所述的細(xì)胞損傷是指由自由基引起的細(xì)胞膜損傷，化學(xué)試劑或藥物等所致的細(xì)胞、細(xì)胞器、蛋白質(zhì)和DNA等生物大分子的損傷，以及輻射或缺血再灌注所致的組織細(xì)胞損傷。
細(xì)胞膜上富含多不飽和脂肪酸，極易受自由基的損傷，誘發(fā)脂質(zhì)過氧化，造成結(jié)構(gòu)和功能的改變。黃芪總黃酮能夠顯著降低紫外線、過氧化氫及超氧陰離子自由基誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化損傷，對黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶和紫外線所致紅細(xì)胞溶血也有很好的抑制作用。
自由基可引起細(xì)胞膜脂的過氧化和膜蛋白的損傷，進而引起DNA的損傷和基因突變，從而誘發(fā)生理、病理變化，導(dǎo)致細(xì)胞損傷、凋亡甚至死亡，引起多種疾病，如心臟病、衰老和腫瘤等。黃芪總黃酮對這些損傷因子所致細(xì)胞蛋白質(zhì)、DNA的損傷均有不同程度的防護作用，其作用強度與藥物濃度成正比。
缺血再灌注可造成機體廣泛受損，其作用因子就是缺血再灌注后大量自由基的生成。黃芪總黃酮能明顯減少缺血再灌注時自由基的產(chǎn)生，即降低了自由基對心肌細(xì)胞的損害。
本發(fā)明還提供了上述黃芪總黃酮的制備方法，該方法包括以下步驟a、黃芪和/或葛根制成飲片、粗顆?；蛘叻勰?，用提取溶劑乙醇、甲醇或丙酮按質(zhì)量體積比(g/ml)1∶1-3進行回流提取1-3次，每次1-3h；b、合并濾液，回收該提取溶劑，所得殘渣用1-2倍體積的蒸餾水稀釋，再以同樣體積的醋酸乙酯萃取2-3次；c、合并萃取液，回收醋酸乙酯，在溫度50-70℃下干燥。
其中步驟a中所述的提取溶劑的濃度為70-95％。
步驟a中所述的黃芪別名黃耆、綿黃芪等，是豆科多年生草本植物黃芪Astragalus membranacens(Fisch)Bge.和內(nèi)蒙黃芪A.mongholicus Bge.的根。
所述的葛根為豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi Puerariathomsonii Benth.的干燥根。
對由上述方法得到的黃芪總黃酮進行HCl-Mg反應(yīng)、AlCl3反應(yīng)和熒光檢測，結(jié)果均呈陽性。
將本發(fā)明所述的黃芪總黃酮過硅膠(200-300目)柱層析，以石油醚(60-90℃)-丙酮(1∶0-9∶1-8∶2-7∶3-6∶4-5∶5-0∶1)梯度洗脫，將得到的流份經(jīng)葡萄糖凝膠Sephadex LH-20柱層析，以甲醇洗脫，得到的單一化合物經(jīng)核磁共振波譜儀(BrukerAV-600)分析，結(jié)果顯示所述的黃芪總黃酮中主要含有β-谷甾醇、芒柄花素、毛蕊異黃酮、β-谷甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和毛蕊異黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。
根據(jù)臨床需要，本發(fā)明所述的黃芪總黃酮可以和在藥學(xué)上可接受的輔料制成口服液、膠囊、片劑、丸劑、顆粒劑或注射劑等多種劑型。本發(fā)明提供的黃芪總黃酮在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，具有以下優(yōu)點
1、從單味中藥中提取的純天然有效部位，易于操作。
2、防止多種有害物質(zhì)引起細(xì)胞基因的突變和損傷，可預(yù)防惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。
3、對于接觸致突變因素的腫瘤高危人群(亞健康狀態(tài)人群)，是目前唯一能夠通過直接抑制突變、誘變過程，降低腫瘤標(biāo)志物而達到抗突變(腫瘤)作用的產(chǎn)品。
4、選擇性地抑制惡性腫瘤細(xì)胞的生長，可防止復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。
5、從常用的天然中藥中提取，無毒副作用。
具體實施方式通過下面給出的本發(fā)明具體實施例可以進一步清楚地理解本發(fā)明，但這些實施例不是對本發(fā)明保護范圍的限制。
實施例1 黃芪總黃酮的制備方法a、稱取50g黃芪飲片，用100ml 95％乙醇進行減壓回流提取2次，每次1.5h；b、合并提取液，回收乙醇，得到殘渣20ml，再加入30ml蒸餾水稀釋，然后用30ml醋酸乙酯萃取3次；c、合并萃取液，回收醋酸乙酯，所得浸膏于70℃下進行干燥。
將本發(fā)明所述的黃芪總黃酮過硅膠(200-300目)柱層析，以石油醚(60-90℃)-丙酮(1∶0-9；1-8∶2-7∶3-6∶4-5∶5-0∶1)梯度洗脫，將得到的流份經(jīng)葡萄糖凝膠Sephadex LH-20柱層析，以甲醇洗脫，得到的單一化合物經(jīng)核磁共振波譜儀(BrukerAV-600)分析，表明所述的黃芪總黃酮中主要含有β-谷甾醇、芒柄花素、毛蕊異黃酮、β-谷甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和毛蕊異黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。上述化合物的重量比例為23∶11∶12∶3∶22∶29。
實施例2 黃芪總黃酮對白血病細(xì)胞生長的抑制作用藥物與試劑取實施例1所得黃芪總黃酮浸膏經(jīng)高壓滅菌后用乙醇溶解(80mg/ml)作為供試藥，實驗前以培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。以柔紅霉素(Rubomycin.)(河北制藥廠生產(chǎn)，生產(chǎn)批號060120)為對照藥品，以生理鹽水稀釋至50μg/ml，實驗前用培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。
腫瘤細(xì)胞株培養(yǎng)Molt-4細(xì)胞(急性淋巴母細(xì)胞白血病)，Raji細(xì)胞(Burkitt’s淋巴瘤)，KG-1細(xì)胞(髓系)，Jarkat-1細(xì)胞(T-細(xì)胞白血病)。培養(yǎng)液為含10％小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco)，另添加適量的HEPES及抗菌素(100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，隔天換液。當(dāng)細(xì)胞生長至活力良好，于對數(shù)生長期時將細(xì)胞株調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/ml備用。
細(xì)胞毒測定(MTT法)參照Mosmann法(Rapid colorimetric assay forcellular growth and survialApplication to prdifereation and cytotoxicityassays.J Immunoloyical Methods，1983，6555-63.)。取不同的白血病細(xì)胞系細(xì)胞，用Hank’s液洗3次，用培養(yǎng)液稀釋，接種于96孔板(5×104個細(xì)胞/孔/100μl)，加入10μl不同濃度的黃芪總黃酮或柔紅霉素或同體積培養(yǎng)液，藥物設(shè)4-6個濃度，每個濃度4個復(fù)孔，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)44h后每孔再加入MTT10μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后每孔加入100μl 0.4N鹽酸異丙醇終止反應(yīng)，混勻后于波長595nm測定光密度值(OD)，按公式IC50＝(1-OD實驗組/OD對照組)×100％計算抑制率，求出IC50(半數(shù)抑制生長濃度)。
統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS10.0軟件計算半數(shù)抑制濃度。
實驗結(jié)果柔紅霉素對兩種白血病細(xì)胞均有較好的抑制作用，對Molt-4和Raji細(xì)胞的IC50分別為15.5±2.3和6.2±2.8μg/ml。本發(fā)明所述的黃芪總黃酮對以上4種白血病細(xì)胞均有較好的殺傷作用，其IC50分別為T(Molt-4)細(xì)胞系為30μg/ml，髓系(KG-1)細(xì)胞為84μg/ml，紅細(xì)胞系(Jartat-1)為164μg/ml，B細(xì)胞系(Raji)為184μg/mlμg/ml。
討論以往的研究認(rèn)為細(xì)胞毒作用是藥物抗腫瘤作用的唯一途徑，大量化療藥物也證實了藥物的細(xì)胞毒作用可有效的遏制腫瘤細(xì)胞的生長。本實驗中的陽性對照藥物柔紅霉素對Molt-4和Raji兩種細(xì)胞均有很好的抑制作用，其作用強度優(yōu)于黃芪總黃酮，然而基礎(chǔ)和臨床數(shù)據(jù)都有大量研究證明化療藥物的耐藥性已經(jīng)越來越嚴(yán)重。此外，化療藥物對人體健康的傷害也已經(jīng)引起了人們足夠的重視，因此，近年來，人們的研究方向以從過去篩選細(xì)胞毒藥物轉(zhuǎn)向篩選具有誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡和促進分化的和無毒或低毒的植物提取成分，換言之，研究具有選擇性抑制腫瘤細(xì)胞生長的藥物已越來越受到人們的關(guān)注。黃芪已在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中應(yīng)用數(shù)千年，從中分離出的黃芪總黃酮在大、小鼠兩種動物上的最大耐受量均超過21.5g/kg，相當(dāng)于臨床成人用量的300倍。
實施例3 黃芪總黃酮對S180肉瘤細(xì)胞的影響選取河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部提供的清潔級昆明小鼠180只，(批準(zhǔn)號醫(yī)動字第04054號)，體重18-22g，隨機分為6組，每組雌雄各半。按照徐淑云等主編的《藥理實驗方法學(xué)》(第1版，北京人民衛(wèi)生出版社，1994，1423)制備小鼠S180肉瘤模型。
取實施例1所得黃芪總黃酮浸膏作為供試藥，按給藥劑量分為2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg和17.5mg/kg組；對照藥品為環(huán)磷酰胺(上海華聯(lián)制藥廠生產(chǎn)，批號20050906)，給藥劑量為25mg/kg；陽性對照為生理鹽水。供試藥物各組每日灌胃給藥1次，陽性對照組給相同劑量的生理鹽水，環(huán)磷酰胺組腹腔注射給藥。連續(xù)給藥7d后將小鼠處死，將腫瘤組織取出后稱重，計算抑瘤率。
實驗重復(fù)三批，計算各組平均抑瘤率。結(jié)果表明當(dāng)供試藥給藥濃度為2.5、5.0、10mg/kg時其抑瘤率分別為35.17％、39.41％和49.58％，與陽性對照組比較均有極顯著意義(p＜0.001)。
中藥新藥抗腫瘤藥物的判斷標(biāo)準(zhǔn)表明當(dāng)中藥對腫瘤的抑瘤率高于30％時即認(rèn)為有效。由于環(huán)磷酰胺是常用的抗腫瘤化學(xué)藥物，故本實驗選它為陽性對照藥物，濃度為25mg/kg時其抑瘤率達81.36％，提示該實驗?zāi)Ｐ陀行?，實驗結(jié)果可靠。
權(quán)利要求
1.黃芪總黃酮在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的腫瘤是白血病或肉瘤。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的白血病是急性淋巴母細(xì)胞白血病、Burkitt’s淋巴瘤、髓系細(xì)胞白血病或T-細(xì)胞白血病。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的腫瘤是由基因突變或細(xì)胞損傷引起的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的基因突變是由氧自由基、紫外線輻射、電離輻射引起的基因突變。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的細(xì)胞損傷是由自由基引起的細(xì)胞膜損傷、化學(xué)試劑或藥物所致的細(xì)胞、細(xì)胞器、蛋白質(zhì)或DNA生物大分子的損傷，以及輻射或缺血再灌注所致的組織細(xì)胞損傷。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于所述的黃芪總黃酮是通過下述步驟制備得到的a、黃芪和/或葛根制成飲片、粗顆粒或者粉末，用提取溶劑乙醇、甲醇或丙酮按質(zhì)量體積比1∶1-3進行減壓回流提取1-3h，然后過濾，這種操作重復(fù)進行1-3次；b、合并濾液，回收溶劑，所得殘渣以1-2倍體積的蒸餾水稀釋，再以同樣體積的醋酸乙酯萃取2-3次；c、合并萃取液，回收醋酸乙酯，在溫度50-70℃下減壓干燥。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于根據(jù)臨床需要，所述的黃芪總黃酮可以和在藥學(xué)上可接受的輔料制成口服液、膠囊、片劑、丸劑、顆粒劑或注射劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了黃芪總黃酮在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述的腫瘤是白血病或肉瘤，尤其是基因突變或細(xì)胞損傷引起的白血病或肉瘤。所述的黃芪總黃酮對超氧陰離子自由基和羥自由基等活性氧有很好的清除效能，對自由基所致細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和DNA等生物大分子的損傷具有明顯的防護作用，可顯著降低輻射和缺血再灌注所致組織細(xì)胞損傷，并具有良好的抗紫外線損傷作用。本發(fā)明還提供了所述黃芪總黃酮的制備方法。
文檔編號A61K9/10GK1985876SQ20061017227
公開日2007年6月27日 申請日期2006年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月30日
發(fā)明者汪德清, 田亞平, 董振南 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院