專利名稱：：Hla遺傳標(biāo)記預(yù)測(cè)糖尿病腎病危險(xiǎn)的方法及其易感基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及使用基因芯片檢測(cè)HLA遺傳標(biāo)記來(lái)預(yù)測(cè)天津地區(qū)2型糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展成或者疑似患有腎病的一種方法，特別是使用HLA-All、HLA-DR9、HLA-DQA1*0302遺傳標(biāo)記檢測(cè)天津地區(qū)2型糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展成或者疑似患有腎病的一種方法。
背景技術(shù)：
：人類白細(xì)胞抗原(humanleucocyteantigen,HLA)是人類主要組織相容性復(fù)合物基因的編碼產(chǎn)物，定位于第6號(hào)染色體短臂的一個(gè)狹窄區(qū)域，包含有128個(gè)功能基因和96個(gè)假基因，很多基因座位存在大量的復(fù)等位基因，具有高度的多態(tài)性。1999年確認(rèn)的HLA復(fù)等位基因已達(dá)到1029個(gè)。HLA作為是人體內(nèi)最復(fù)雜的遺傳多態(tài)性系統(tǒng),在免疫調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮重要作用，是人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)與疾病有明確關(guān)聯(lián)的遺傳系統(tǒng)，已發(fā)現(xiàn)70余種疾病與該系統(tǒng)有關(guān)聯(lián)，DM即為其中的一種。HLA多態(tài)性檢測(cè)在醫(yī)學(xué)實(shí)'踐和科研中具有十分重要意義，為器官、組織移植配型,疾病相關(guān)性研究,人類學(xué)及法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用等領(lǐng)域的發(fā)展提供了可靠的技術(shù)方法和有價(jià)值的資料。血清學(xué)方法是HLA-B抗原傳統(tǒng)的經(jīng)典分型方法，但是隨著對(duì)HLA研究的深入和對(duì)分型技術(shù)要求的不斷提高,以及越來(lái)越多的等位基因陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)和命名，血清學(xué)方法已經(jīng)無(wú)法獲得足夠的單特異性抗體，不能夠分辨出所有的特異性，而且標(biāo)準(zhǔn)抗血清的篩選技術(shù)復(fù)雜,難度大,人力物力消耗大,另外血清學(xué)方法之間存在較多，較強(qiáng)的交叉反應(yīng)，使HLAI、II類抗原亞型的分辨較為困難。隨著生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，HLA分型技術(shù)從傳統(tǒng)的血清學(xué)、細(xì)胞學(xué)分型轉(zhuǎn)向以PCR為基本方法的基因分型。近年來(lái)對(duì)I、II類抗原的基因分型研究取得了較大進(jìn)展，其中PCR-SSP、PCR-SS0、PCR-SSCP(單鏈構(gòu)像多態(tài)性分析)3種分型方法對(duì)I類抗原的分型均獲得成功。但這些方法也存在一些明顯的不足,如PCR-SSP方法,主要依賴于PCR技術(shù)，對(duì)某一基因個(gè)體進(jìn)行分型時(shí)往往要設(shè)計(jì)大量的引物，這將很難避免接下來(lái)PCR過(guò)程中的污染問(wèn)題而導(dǎo)致假陽(yáng)性，而且操作復(fù)雜，需要通過(guò)多次的電泳來(lái)判斷最后的結(jié)果，不適合大批量樣本的分型，使其在臨床應(yīng)用上受到限制；PCR—SSCP法對(duì)分析小于400bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物十分有效，但此法僅能探知基因變異的存在，而無(wú)法確定變異的確切位置及內(nèi)容，一般僅用作HLA匹配程度的分析，而不用來(lái)進(jìn)行HLA的具體分型?；蛐酒墙陙?lái)興起的一項(xiàng)前沿生物技術(shù)，是對(duì)傳統(tǒng)生物技術(shù)如DNA雜交、分型和測(cè)序技術(shù)重大的飛躍和創(chuàng)新，是涉及到生物信息學(xué)，微電子技術(shù)，計(jì)算機(jī)科學(xué)，半導(dǎo)體技術(shù)等諸多自然學(xué)科的綜合性技術(shù)，在生命科學(xué)領(lǐng)域中顯出了巨大的潛能和誘人前景?；蛐酒侵笇⒃S多特定的寡核昔酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律的排列固定于支持物上，然后與待測(cè)的標(biāo)記過(guò)的樣本基因進(jìn)行特異性雜交，通過(guò)激光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)芯片進(jìn)行掃描，并配以計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一個(gè)探針上的熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，從而得出大量信息?；蛐酒哂懈叨燃珊筒⑿刑幚淼奶攸c(diǎn)，所需試劑和樣本量少，結(jié)果由計(jì)算機(jī)軟件自動(dòng)分析，是解決HLA眾多等位基因分型的有效方法。由于HLA個(gè)體遺傳學(xué)差異的本質(zhì)是在編碼其抗原產(chǎn)物的基因水平上，所以分析HLA基因型無(wú)疑是對(duì)HLA型別分析的最準(zhǔn)確的方法,其準(zhǔn)確性遠(yuǎn)高于血清學(xué)與細(xì)胞學(xué)分型，并已逐漸取代了前兩者的位置，因此HLA抗原的DNA分型成為必然趨勢(shì)。自從70年代HLA免疫學(xué)分型方法迅速發(fā)展并應(yīng)用于人類疾病的關(guān)系研究以來(lái)，各國(guó)學(xué)者開(kāi)展了HLA與DM發(fā)展關(guān)系的研究，但大多數(shù)僅限于T1DM與HLA的研究，僅有少數(shù)關(guān)于T2DM與HLA關(guān)聯(lián)的研究報(bào)道，而且大多數(shù)認(rèn)為HLA與T2DM的發(fā)病無(wú)關(guān)。隨著對(duì)T2DM異質(zhì)狀況研究的深入，發(fā)現(xiàn)遺傳學(xué)因素在T2DM的發(fā)病過(guò)程中扮演重要角色，同時(shí)發(fā)現(xiàn)T2DM與HLA存在著某種關(guān)聯(lián)，特別是進(jìn)入上世紀(jì)90年代后，分子生物學(xué)基因分型方法的廣泛應(yīng)用，對(duì)HLA與T2DM關(guān)聯(lián)的研究又廣泛開(kāi)展。DiamantopoulosEJ等研究表明HLA-A3是T2DM發(fā)生早期動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù)基因；Tuomilehto-WolfE等研究發(fā)現(xiàn)HLA單倍型純合子T2DM的發(fā)病率明顯增加。糖尿病腎病(diabeticnephropathy,DN)是糖尿病常見(jiàn)微血管并發(fā)癥之一，終末期腎病是糖尿病的主要死亡原因。我國(guó)住院糖尿病患者腎臟并發(fā)癥患病率為33.6%，巳成為威脅糖尿病患者生命健康的嚴(yán)重并發(fā)癥，越來(lái)越受到醫(yī)護(hù)工作者和糖尿病患者的重視。血糖控制不良及糖尿病病程長(zhǎng)是導(dǎo)致糖尿病慢性并發(fā)癥的主要危險(xiǎn)因素，但并不足以解釋糖尿病發(fā)生并發(fā)癥的差異，研究發(fā)現(xiàn)遺傳素質(zhì)也影響糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。約30%糖尿病患者無(wú)論血糖控制如何均發(fā)生DN，而且在家族內(nèi)有多發(fā)傾向。流行病學(xué)調(diào)査發(fā)現(xiàn)，血糖控制的好壞與最終是否發(fā)展為DN不完全成相關(guān)關(guān)系；眾多關(guān)于DN家族聚集性、DN發(fā)病率在不同種族間存在很大差異的報(bào)道，均提示遺傳因素參與DN的發(fā)病，但確切機(jī)理不明。HLA作為人體重要的遺傳學(xué)標(biāo)志，可能與DN有關(guān)。DyckR等認(rèn)為在糖尿病終末期腎病患者中HLA-A2/DR4和HLA-A2/DR8單倍體頻率明顯增加。本課題采用寡核苷酸芯片分型方法，依據(jù)第十三屆國(guó)際組織相容性工作會(huì)議報(bào)告及相關(guān)文獻(xiàn)，同時(shí)考慮遺傳的連鎖不平衡，選擇了中國(guó)人群基因頻率較高的等位基因，根據(jù)HLA-A、HLA-B、HLA-DR、HLA-DQB1、HLA-DQA1不同基因亞型的獨(dú)特序列，完成了探針的設(shè)計(jì)與篩選，最后設(shè)計(jì)了213條探針(HLA-A56條，HLA-B66條，HLA-DQAP22條，HLA-DQB1*38條，HLA-DR31條)，制成基因分型芯片，這些探針可完成中分辨度分辨，完全可以滿足臨床配型工作的需要。通過(guò)帶熒光標(biāo)記的引物使待測(cè)樣本經(jīng)PCR擴(kuò)增后所得到的目的片斷帶上熒光標(biāo)記，PCR產(chǎn)物與芯片上的探針雜交，根據(jù)雜交信號(hào)強(qiáng)弱及位置確定樣品的基因型，將此方法用于462份樣本的HLAI、II類基因型分型。以HLA-B分型為例共使用3條引物(其中下游為混合引物)，66條探針,分型結(jié)果與PCR-SSP方法驗(yàn)證對(duì)比，結(jié)果有6種等位基因是PCR-SSP方法沒(méi)有鑒別出來(lái)的，具有更大的靈敏度。用于分型的探針具有高度特異性，只要PCR擴(kuò)增成功，雜交后的信號(hào)都很強(qiáng)，預(yù)計(jì)陽(yáng)性的探針均全部出現(xiàn)。應(yīng)用芯片檢測(cè)時(shí)，每份樣本只需作一次PCR，結(jié)果判讀通過(guò)熒光掃描，計(jì)算機(jī)自動(dòng)分析，一次可以同時(shí)檢測(cè)多份樣本。在分辨度選擇上，我們采用了中分辨度方法。分辨度過(guò)低，只能分辨出范圍較寬的抗原特異性，滿足不了實(shí)際應(yīng)用；分辨度過(guò)高，不但增加了分型所需時(shí)間和經(jīng)費(fèi)，而且過(guò)細(xì)的分型結(jié)果增加了尋找匹配供，受者的難度。而中分辨度方法能夠分辨出所有血清學(xué)方法所分辨出的特異性，并可對(duì)部分等位基因的特異性作出分辨，在實(shí)際應(yīng)用中定型準(zhǔn)確快速，可實(shí)現(xiàn)一張芯片多人份，提高了檢測(cè)的速度和準(zhǔn)確性，適于臨床推廣。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供使用HLA遺傳標(biāo)記來(lái)預(yù)測(cè)天津地區(qū)2型糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展成或者疑似患有腎病的一種方法。為實(shí)現(xiàn)這一目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案采用寡核苷酸芯片分型方法，依據(jù)第十三屆國(guó)際組織相容性工作會(huì)議報(bào)告及相關(guān)文獻(xiàn)，同時(shí)考慮遺傳的連鎖不平衡，選擇了中國(guó)人群基因頻率較高的等位基因，根據(jù)HLA-A、HLA-B、HLA-DR、HLA-DQB1、HLA-DQA1不同基因亞型的獨(dú)特序列，完成了探針的設(shè)計(jì)與篩選，最后設(shè)計(jì)了213條探針(HLA-A56條，HLA-B66條，HLA-DQA1*22條，HLA-DQB1*38條，HLA-DR31條)，制成基因分型芯片，這些探針可完成中分辨度分辨，完全可以滿足臨床配型工作的需要。通過(guò)帶熒光標(biāo)記的引物使待測(cè)樣本經(jīng)PCR擴(kuò)增后所得到的目的片斷帶上熒光標(biāo)記，PCR產(chǎn)物與芯片上的探針雜交，根據(jù)雜交信號(hào)強(qiáng)弱及位置確定樣品的基因型，將此方法用于462份樣本的HLAI、II類基因型分型。使用本發(fā)明提供的方法，攜帶HLA-All、HLA-DR9、HLA-DQA1*0302遺傳標(biāo)記的天津地區(qū)2型糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展成或者疑似患有腎病的危險(xiǎn)性明顯增加。具體實(shí)施例方式1.基因探針的序列設(shè)計(jì)及處理依據(jù)第十三屆國(guó)際組織相容性工作會(huì)議報(bào)告及相關(guān)文獻(xiàn)，同時(shí)考慮遺傳的連鎖不平衡，選擇了中國(guó)北方漢族人群基因頻率較高的等位基因，根據(jù)HLA-A、HLA-B、HLA-DR、HLA-DQB1、HLA-DQA1不同基因亞型的獨(dú)特序列，完成了探針的設(shè)計(jì)與篩選，最后設(shè)計(jì)了213條探針(其中HLA-A56條，HLA-B66條，HLA-DQAP22條，HLA-DQB"38條，HLA-DR31條)。這些探針完全可以完成中分辨率的組織配型，較臨床現(xiàn)在常用的進(jìn)口試劑盒有更高的分辨率而且可同時(shí)完成HLA-I、II類基因的檢測(cè)，經(jīng)NH2修飾后可用于芯片點(diǎn)樣。我們?cè)O(shè)計(jì)了可以用來(lái)特異性擴(kuò)增HLA-A、HLA-B、HLA-DR、HLA-DQB1、HLA-DQA1有意義外顯子片段的上下游引物，通過(guò)調(diào)節(jié)退火溫度，上下游引物濃度等方法優(yōu)化PCR擴(kuò)增，并嘗試用二次PCR,不對(duì)稱PCR，混合PCR等方法優(yōu)化熒光標(biāo)記的強(qiáng)度，建立對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行熒光標(biāo)記的最佳方法。針對(duì)HLA-B座位的exon2和exon3區(qū)域分別設(shè)計(jì)上下游引物(下游為混合引物)，產(chǎn)物長(zhǎng)度在900bp左右，序列如下正鏈5，—GGGTCCCAGTTCTAAAGTCCCCACG—3，，反鏈5，—CCATCCCCGGCGACCTATAGGAGATG—3，，5，一AGGCCATCCCGGGCGATCTAT—3'。標(biāo)記PCR:50ulPCR擴(kuò)增體系，通過(guò)帶熒光的引物使PCR產(chǎn)物帶上Cy3標(biāo)記。根據(jù)genenmer軟件及我們?cè)O(shè)計(jì)的引物，初步建立擴(kuò)增條件..通過(guò)單一標(biāo)本，其他條件確定的梯度PCR，摸索退火溫度及循環(huán)數(shù)，使PCR保持在指數(shù)增長(zhǎng)期，最終選擇96。C5min;94°C22s、62°C50s、72°C30s，40個(gè)循環(huán);72°C10min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色檢測(cè)。為了達(dá)到最好的PCR結(jié)果，預(yù)實(shí)驗(yàn)中上游引物我們選擇了0.1-0.5Umol/L之間的9個(gè)濃度(0.1umol/L,0.15ymol/L,0.2umol/L,0.25Pmol/L,0.3umol/L,0.35umol/L,0.4umol/L,0.45Pmol/L,0.5Pmol/L)，每個(gè)濃度與下游引物的比例分別為1:1，1:50，1:100,共27組，以一個(gè)模板用同樣條件進(jìn)行PCR，以最終PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果的亮度來(lái)確定哪個(gè)PCR條件最佳，上游引物濃度為0.4umol/L,上下游引物的比例分別為1:50時(shí)條帶最亮，也就是PCR產(chǎn)物的量最大，這樣有利于我們后期的雜交，選擇該濃度作為實(shí)驗(yàn)濃度。對(duì)于HLA-A，在其座位的exon2和exon3區(qū)域分別設(shè)計(jì)上下游引物，為雙下游和雙上游引物進(jìn)行嵌套氏PCR，產(chǎn)物長(zhǎng)度在800bp左右，序列如下正鏈5'-GGCCTCTGT/CGGGGAGAAGCAA-3',5，-GTCCCAATTGTCTCCCCTCCTT-3',反鏈5，-AGCCGCGCCG/TGGAAGAGGGTCG-3，，5'-GGCCCCTGGTACCCGTGCGCTG-3，。擴(kuò)增條件為第一次PCR:96。C3min;96°C25s、65°C45s、72°C30s，26個(gè)循環(huán)；96°C25s、55°Clmin、72°C2min，4個(gè)循環(huán)；72°C5min。第二次PCR(NestedPCR):96。C3min;960C30s、56。C30s、72°C30s,30個(gè)循環(huán)；96。C30s、56。Clmin、72。C2min，4個(gè)循環(huán)；72。C5min。方法同前選擇最佳條件，建立引入熒光標(biāo)記的PCR體系。在HLA-DRB座位的exon2區(qū)域分別設(shè)計(jì)上下游引物，產(chǎn)物長(zhǎng)度在274bp左右，序列如下正鏈5，隱CCCCACAGCACGTTTCTTG-3'，反鏈5'-CCGCTGCACTGTGAAGCTCT-3'。在HLA-DQB1座位的exon2分別設(shè)計(jì)上下游引物，下游為混合引物，產(chǎn)物長(zhǎng)度在260bp左右，序列如下正鏈5，-CA/CTGTGCTACTTCACCAAC/TGG-3，，反鏈5，-CTG/CTAGTTGTGTCTGCAC/TAC-3，。在HLA-DQA1座位的exon2區(qū)域分別設(shè)計(jì)上下游引物，產(chǎn)物長(zhǎng)度在240bp左右，序列如下正鏈5，-A/GC/TGGTGTAAACTTGTACCAGT-3',反鏈5，-TTGGTAGCAGCA/GGTAGAGTTG-3，。經(jīng)過(guò)摸索條件，將HLA-DRB、HLA-DQB1及HLA-DQA1的標(biāo)記PCR擴(kuò)增條件統(tǒng)一為95°C5min，94°C30s、57°C30s、72°Clmin，40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色檢測(cè)。方法同前選擇最佳條件，建立引入熒光標(biāo)記的PCR體系。用統(tǒng)一得HLA-DRB、HLA-DQB1及HLA-DQA1擴(kuò)增條件擴(kuò)增，不但能達(dá)到最好的擴(kuò)增效果，而且優(yōu)化了操作過(guò)程，更利于將此種檢測(cè)手段推向臨床。2.DNA分型探針的設(shè)計(jì)及制備不同分辨度探針可滿足不同的實(shí)際需要。低分辨度探針?lè)直娣秶^寬，實(shí)際應(yīng)用很少；高分辨度探針?biāo)钑r(shí)間及成本均高，一般用于個(gè)別復(fù)雜基因位點(diǎn)的檢測(cè)。而中分辨度探針即可保持一定的分型精確度，又可避免臨床應(yīng)用中不必要的過(guò)細(xì)的分型，因此本文依據(jù)第十三屆國(guó)際組織相容性工作會(huì)議報(bào)告，選擇了中國(guó)北方漢族人群基因頻率較高的等位基因，針對(duì)HLA-B不同基因亞型的獨(dú)特序列，共設(shè)計(jì)了66條中分辨度探針，HLA-DQA1的相關(guān)探針22條探針，HLA-DRB相關(guān)探針31條，HLA-DQB1相關(guān)探針38條，HLA-A相關(guān)探針56條，經(jīng)NH2-修飾后用于芯片點(diǎn)樣。通過(guò)NH2-與環(huán)氧基的化學(xué)結(jié)合，將探針固定在環(huán)氧片基上。將濃度為100umol/L的寡核苷酸探針與點(diǎn)樣緩沖液1:1混合加入到96孔板中，用點(diǎn)樣儀點(diǎn)成所需矩陣。從左向右，每五個(gè)點(diǎn)代表一條探針，共分五個(gè)矩陣，分別是HLA-A，HLA-B，HLA-DQA1，HLA-DQB1,HLA-DRB五組探針。點(diǎn)樣后封閉過(guò)夜，待其自然干燥后，130。C烘烤30min,95。C水浴lmin，封閉待其自然干燥，-20°0保存?zhèn)溆谩?.雜交及相應(yīng)雜交溫度、時(shí)間的摸索將10ul雜交buffer，18ulPCR產(chǎn)物與lul鮭精DNA(鮭精DNA用來(lái)降低雜交背景)充分混合，將同一樣本的HLA-A，HLA-B,HLA-DQA1，HLA-DQB1，HLA-DRB的五種不同PCR產(chǎn)物用移液器加樣到相應(yīng)點(diǎn)樣區(qū)域，根據(jù)區(qū)域大小選擇合適大小的蓋玻片，蓋上蓋玻片。放入分子雜交儀中，雜交條件分別為40'C，半小時(shí)；40°C,l小時(shí)；60°C，l小時(shí)；60°C，半小時(shí)；40°C，過(guò)夜；60°C，過(guò)夜，然后根據(jù)雜交信號(hào)的強(qiáng)度，選擇40°C，l小時(shí)作為最優(yōu)化的雜交條件。4.雜交后背景洗脫及洗液濃度、浸泡時(shí)間的選擇從雜交儀中取出芯片，分為六組第一組5X洗脫液洗脫，浸泡5分鐘；取出后放入3X洗脫液中浸泡5分鐘；再用ddH20洗2次(每一步浸泡清洗后，都必須迅速離心)。第二組6X洗脫液洗脫，浸泡5分鐘；取出后放入5X洗脫液中浸泡5分鐘再放入3X洗脫液中浸泡5分鐘；再用ddH20洗2次。第三組3X洗脫液浸泡5分鐘；用ddH20洗2次。后三組將所有時(shí)間均改為3分鐘。根據(jù)最終掃描結(jié)果選擇5X洗脫液洗脫，浸泡5分鐘；取出芯片后放入3X洗脫液中浸泡5分鐘；再用ddH20洗2次(每一步浸泡清洗后，都必須迅速離心)作為最終選擇方案。將洗過(guò)的芯片置于室溫自然晾干，干燥后用ScanarryGx掃描。5.HLA組織配型芯片分型結(jié)果判斷(圖像掃描及數(shù)據(jù)處理)通過(guò)分析軟件，將直觀的信號(hào)強(qiáng)弱轉(zhuǎn)化為信號(hào)比值，根據(jù)比值及具體位置上標(biāo)記的探針序列，即可確定樣本的基因型。當(dāng)帶熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物與芯片上的探針雜交時(shí)，探針如果與PCR產(chǎn)物完全互補(bǔ)，則掃描出的雜交信號(hào)強(qiáng)，顏色在黃白之間；如果與PCR產(chǎn)物完全不互補(bǔ)，掃描出的信號(hào)弱，顏色為藍(lán)或無(wú)色；如果與PCR產(chǎn)物部分互補(bǔ)，則掃描出的信號(hào)和顏色介于兩者之間。通過(guò)特定分析軟件，將直觀的顏色強(qiáng)弱轉(zhuǎn)化為信號(hào)的比值，可以方便的得出分型結(jié)果。HLA配型芯片設(shè)計(jì)了陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照而且每個(gè)探針都有5次重復(fù)，使系統(tǒng)的可靠性、穩(wěn)定性、科學(xué)性得到了有效保證。6.臨床樣本分析-6.1樣本來(lái)源(1)正常對(duì)照組100例(男50例，女50例)，平均年齡56士4.7歲，北方漢族，為某單位退休職工健康查體。(2)試驗(yàn)組①2型糖尿病無(wú)腎病組100例(男47例，女53例)，平均年齡58土9.5歲。②早期糖尿病腎病組104例(男50例女54例)，平均年齡57土4.3歲。③臨床糖尿病腎病組106例(男51例女55例)，平均年齡59土6.4歲。終末期糖尿病腎病組52例(男27例女25例)，平均年齡60士5.2歲。試驗(yàn)組均來(lái)源于天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院20032005年住院患者，均符合1997年ADA診斷標(biāo)準(zhǔn)，均為天津地區(qū)的漢族人。各組間年齡、病程、均無(wú)明顯差異，依據(jù)中國(guó)糖尿病指南進(jìn)行DN分期留取24h尿測(cè)尿微量白蛋白(UMA)，早期DN期UMA》30mg/d和UMA《300mg/d;臨床DN期UMA》300mg/d;腎功能衰竭期。基因組DNA提取采用QIAGEN公司DNA提取試劑盒，嚴(yán)格按照操作說(shuō)明進(jìn)行。6.2試驗(yàn)組各組間臨床表型特征比較表1試驗(yàn)組各組間臨床表型特征比較Non-DN早期DN臨床DN終末期DNBMI22.89±3.1924.52±3.74#25.15±3.77*23.19±3.39ABUN5.92±1.956.60±2.728.98±5.73BiS15.84±6.67#《ACr71.94±22.0787,8473.07145.69±159.01*《296.92±239.92*《AUA256.01±90.08298.18±108.22#346.78±123.12*《429.40±160.61*"TC5.12±1.135.53±1.64#5.90土1.30林5.76±1.31#TG1.48±1.202.09土2.04"2.23±1.93**1.51±0.6嚴(yán)LDL3.26±0.921.38±0.142.08±0.21#2.68±0.38#VLDL0.41±0,180.54±0.26*0.59±0.29s0.46±0.17《AHDL1.44±0,321.40±0.341.44±0,291.47±0.36FIB3.37±1.073.89±1.37*4.34土1.51"※4.33±1.42#GHb9.48±2.639.18±2.188.74±2.01#8.24±2.02#iSUMA14.19±5.37106.61±67.97#408.31±33.55fl《402.00±14.14*《FPG10.06±3.4610.54±4.029.94±4.209.53±4.62與Non-DN相比P0.05;※與早期DN相比PO.05;與臨床DN相比P〈0.056.3臨床樣本分型結(jié)果對(duì)462例臨床樣本進(jìn)行了檢測(cè)，芯片檢測(cè)結(jié)果用國(guó)際知名的onelambda公司的MicroSSPTMClassI&IIGenericTray，MicroSSPTMAlleleSpecficDQB1，MicroSSPTMAlleleSpecficDRB進(jìn)行平行對(duì)照試驗(yàn)?；蚍中徒Y(jié)果與用國(guó)際公認(rèn)的onelambda試劑盒所得出的基因分型結(jié)果基本一致。對(duì)不一致的樣本進(jìn)行了測(cè)序?qū)φ?，測(cè)序結(jié)果與芯片分析結(jié)果完全一致。3.1HLA配型芯片可分辨HLA-A抗原特異性18個(gè)，等位基因196個(gè)。462份臨床樣本進(jìn)行芯片檢測(cè)，隨即選取樣本進(jìn)行經(jīng)測(cè)序(由上海博亞公司完成)驗(yàn)證芯片結(jié)果正確。樣本檢測(cè)結(jié)果如表2。表2.2型糖尿病及各亞組與正常對(duì)照組HLA-A等位基因頻率比較HLA-A等位基因AlA2A3AllA23A24A25A26A28糖尿病組100111615186221412(0.06)(0.08)(0.08)(0.09)(0.03)(0.11)(0.07)(0.06)(0.01)腎病in期組10412181516101615114(0.06)(0.09)(0.07)(0.08)(0.04)(0.08)(0.07)(0.06)(0.01)腎病rv期組10612221219101818144(0.05)(0.11)(0.06)(0.1)(0.02)(0.09)(0.09)(0.07)(0.02)腎病v期組52917961(0.05)(0.09)(0.07)(0.17)(0.05)(0.09)(0.07)(0.06)(0.01)正常對(duì)照組100861878516102(0.04)(0.03)(0.09)(0.04)(0.04)(0.03)(0.08)(0.05)(0.01)1.0539.7561.39812.7382.47211.3l.賜0.7921.288p0.9020.0450.8450.0130.650.0230.8930.940.863HLA-A等位基因A30A31A32A33A34A36A66A69A74糖尿病組腦2126624412162(0.01)(0.06)(0.03)(0.03)(0.12)(0.02)(0.06)(0.08)(0.01)腎病III期組104415889616214(0.02)(0.08)(0.04)(0.04)(0.05)(0.03)(0.08)(0.11)(0.02)腎病IV期組1064128610614184(0.01)(0.06)(0.03)(0.03)(0.05)(0.02)(0.07)(0.09)(0.02)腎病v期組520544101(0.)(0.05)(0.05)(0.02)(0.04)(0.03)(0.07)(0.1)(001)正常對(duì)照組100148222681822(0.01)(0.07)(0.04)(0.11)(0.13)(0.04(0.09)(0.11)(0.01)50.581T^j10.3162.5610.9491.317P0.8240.9650.5360.80.0350.6340.9170.8580.816天津地區(qū)2型糖尿病及各亞組腎病患者的A2(P<0.05,RR=1.68)、All(P<0.05，RR=1.78)和A24(P<0.05,RR=1.83)等位基因頻率明顯高于正常對(duì)照組，2型糖尿病及各亞組腎病患者A33等位基因頻率明顯低于對(duì)照組(P<0.05,RR=0.37)。天津地區(qū)2型糖尿病并發(fā)腎病V期組患者的All等位基因頻率明顯高于無(wú)腎病患者(P<0.05,RR=2.79),各亞組腎病組A34等位基因頻率明顯低于2型糖尿病無(wú)腎病組及正常對(duì)照組(P<0.05，RR=0.15)。3.2HLA配型芯片可分辨HLA-B抗原特異性41個(gè)，等位基因402個(gè)。462份臨床樣本進(jìn)行芯片檢測(cè)，隨即選取樣本經(jīng)測(cè)序(由上海博亞公司完成)驗(yàn)證芯片結(jié)果正確。樣本檢測(cè)結(jié)果如表3。表32型糖尿病及各亞組與正常對(duì)照組HLA-B等位基因頻率比較<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>組別HLA-B等位基因天津地區(qū)2型糖尿病及各亞組腎病患者的B40(P<0.01,RR=3.67)、B41(P<0.01,RR=3)和B54(P<0.01，RR=2.6)等位基因頻率明顯高于正常對(duì)照組，2型糖尿病及各亞組腎病患者B50等位基因頻率明顯低于對(duì)照組(PO.Ol，RR=0.33)，天津地區(qū)2型糖尿病并腎病患者與無(wú)腎病患者HLA-B無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。3.3HLA配型芯片可分辨HLA-DRB抗原特異性18個(gè)，等位基因432個(gè)。462份臨床樣本進(jìn)行芯片檢測(cè)，隨即選取樣本進(jìn)行經(jīng)測(cè)序(由上海博亞公司完成)驗(yàn)證芯片結(jié)果正確。樣本檢測(cè)結(jié)果如表4。表42型糖尿病及各亞組與正常對(duì)照組HLA-DRB等位基因頻率比較組別N-HLA-DRB等位基因DR1DR3DR4DR7DR8DR9DR10DR11DR12糖尿病組10042218108613149(0.02)(0.11)(0.09)(0.05)(0.04)(0.03)(0.07)(0.07)(0.04)腎病III期組1046181812106121411(0.03)(0.09)(0.09)(O夠(0.05)(0.03)(0.05)(0.06)(0.05)腎病IV期組1065182011912131411(0.02)(0.09)(0.1)(0.05)(0.04)(0.06)(0.06)(0.07)(0.06)腎病v期組5231211489(0.01)(0.06)(0.06)(0.02)(0.02)(0.04)(0.03)(0.02)(0.05)正常對(duì)照組10018612103141211(0.09)(0.03)(0.03)(0.06)(0.05)(0.02)(0.07)(0.06)(0.06)x219.68511.19211.0730.7920.96510.8061.0631.2952.806p0.0010.0240.0260.9390.9150.0290.90.8620.591組別N.HLA-DRB等位基因DR13DR14DR15DR16DR17DR18DR51DR52DR53糖尿病組10013"7810121314910(0.07)(0.03)(0.04)(0.05)(0.06)(0.07)(0.07)(0.05)(0.05)腎病III期組104腎病IV期組106腎病V期組52正常對(duì)照組100糖尿病組腎病in期組腎病iv期組腎病v期組正常對(duì)照組x2pB75B7624(0.01)(0.02)16(0.004)(0.03)24(0.01)(0.02)02(0)(0.02)26(0.01)(0.03)1.3680.9320.850.926(0.03)8(0.04)(0.04)8(0.04)0.4250.983(0.02)(0.04)3(0.03)7(0.04)1.9210.756(0.03)6(0.03)3(0.03)7(0.04)0.4950.9746(0.03)(0.04)(0.03)8(0.04)0.820.93610010410652100B62(0,01)(0.01)(0.01)1(o.oi)(o.oi)01.00B631(0.01)1(0.004)0(0)0(0)1(0.01)1.5050.826B640(0)1(o細(xì))1(B65(0.01)3(0.02)B679(0.05)8(0.04)88(0.04)9(0.05)3(0.03)9(0.05)0.6510.9571u91BooooOI!C;00oooooo3oo/IN003o一ooS64刀6oS18力49"oo9S1oo0302n^40:9KB-SSscsa435o3n-9o<u1o2oddd774945-SoS1^620704oooowg;天津地區(qū)2型糖尿病及腎病各亞組患者的DR3(P<0.05,RR=3)、DR4(P<0.05,RR=2.43)和DR9(P<0.05,RR=3)等位基因頻率明顯高于正常對(duì)照組，DR1等位基因頻率明顯低于對(duì)照組(P<0.05，RR=0.53)。天津地區(qū)2型糖尿病并發(fā)腎病IV、V期患者的DR9等位基因頻率明顯高于腎病m期組和無(wú)腎病組，(P<0.05,RR=3)。3.4HLA配型芯片可分辨HLA-DQBl抗原特異性6個(gè)，等位基因51個(gè)。462份臨床樣本進(jìn)行芯片檢測(cè)，隨即選取樣本經(jīng)測(cè)序(由上海博亞公司完成)驗(yàn)證芯片結(jié)果正確。樣本檢測(cè)結(jié)果如表5。表5天津地區(qū)2型糖尿病及各亞組與正常對(duì)照組HLA-DQB1等位基因頻率比較:'HI.A-DQB1等位基肉~~—~—<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>天津地區(qū)2型糖尿病并發(fā)腎病患者的HLA-DQBl*05等位基因頻率明顯低于正常對(duì)照組和無(wú)腎病組患者(P<0.05,RR=0.6)。8.5HLA配型芯片可分辨HLA-DQA1抗原特異性6個(gè)，等位基因28個(gè)。462份臨床樣本進(jìn)行芯片檢測(cè)，隨即選取樣本經(jīng)測(cè)序(由上海博亞公司完成)驗(yàn)證芯片結(jié)果正確。樣本檢測(cè)結(jié)果如表6。表6天津地區(qū)2型糖尿病患者與正常對(duì)照HLA-DQA1等位基因頻率比較<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>p<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>權(quán)利要求1.一種應(yīng)用HLA遺傳標(biāo)記預(yù)測(cè)糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展成、或者疑似患有腎病的方法，包括如下步驟檢測(cè)來(lái)自糖尿病患者的樣品中是否含有下列HLA遺傳標(biāo)記中的至少一種HLA-A11、HLA-DR9、HLA-DQA1＊0302，這些遺傳標(biāo)記的存在表明該糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展成、或者疑似患有腎病。2.根據(jù)權(quán)利要求1還包括易患糖尿病腎病HLA遺傳標(biāo)記HLA-A11、HLA-DR9、HLA-DQA1女0302。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括從患者中取樣的方法。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所取樣品為血樣。5.根據(jù)權(quán)利要求l，HLA遺傳標(biāo)記應(yīng)用基因芯片檢測(cè)。6.根據(jù)權(quán)利要求l、2、3、4，其中所述患者為己患有、將有可能發(fā)展成、或者疑似患有2型糖尿病的患者。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了檢測(cè)糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展成或疑似患有腎病的方法，以及糖尿病腎病的易感基因。該方法包括應(yīng)用基因芯片檢測(cè)來(lái)自糖尿病患者的樣品中HLA遺傳標(biāo)記。并且證明HLA-A11、HLA-DR9、HLA-DQA1*0302，這些遺傳標(biāo)記的存在表明該糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展成、或者疑似患有腎病。文檔編號(hào)G01N33/68GK101294215SQ200710057228公開(kāi)日2008年10月29日申請(qǐng)日期2007年4月26日優(yōu)先權(quán)日2007年4月26日發(fā)明者蓓孫,瑞張,剛郭,陳莉明申請(qǐng)人:天津醫(yī)科大學(xué)