一種恒河猴糖尿病腎病模型的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種恒河猴糖尿病腎病模型的制備方法，包括如下步驟：（1）將劑量為80～100mg/kg的鏈脲菌素施用于恒河猴；（2）血糖濃度升至11.1mmol/l后，餐前施用胰島素，使恒河猴血糖濃度為10-20mmol/L。本發(fā)明在糖尿病恒河猴的基礎上，采用血糖控制的方式，成功地誘導恒河猴糖尿病腎病模型。
【專利說明】一種恒河猴糖尿病腎病模型的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及恒河猴糖尿病腎病模型的制備方法。
【背景技術】
[0002]糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)的發(fā)病率呈快速增長的趨勢。據報道我國現(xiàn)約有9200萬DM和1.48億DM前期患者，成為繼美國之后的第二個糖尿病發(fā)病大國。隨著病情的逐漸發(fā)展加重，這些患者中約有30-40%的I型糖尿病患者和約20%的2型糖尿病患者伴隨嚴重的腎功能損害-糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy, DN)。
[0003]DN是糖尿病患者最嚴重的慢性并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者最主要的死亡原因。一旦DN患者出現(xiàn)了顯著的臨床癥狀，此時可選擇的藥物較少，且藥物的治療效果較差，病情往往呈進行性發(fā)展直至末期腎衰，給患者家庭和社會帶來巨大的經濟負擔。因此深入研究DN的發(fā)病機制及早期診斷方法，在此基礎上探索延緩或逆轉疾病進程的有效措施，是目前醫(yī)學研究的熱點和難點問題。
[0004]動物模型是研究人類重大疾病的基礎，建立與人類高度近似的DN動物模型，將會在研究其發(fā)病機理、早期診斷和干預治療等方面取得事半功倍的效果。非人靈長類動物作為人類的近親，在遺傳基因方面約96%以上同源，其形態(tài)結構、生理機能和生化代謝均同人類非常相似，建立一種非人靈長類動物DN模型對研究DN的發(fā)生發(fā)展、早期診斷和新藥研發(fā)等具有重要的科學意義和經濟價值。

【發(fā)明內容】
[0005]本發(fā)明的目的在于提供恒河猴糖尿病腎病模型的制備方法。
[0006]本發(fā)明恒河猴糖尿病腎病模型的制備方法，包括如下步驟:
[0007](I)將劑量為80?100mg/kg的鏈脲菌素施用于恒河猴；
[0008](2)血糖濃度升至11.lmmol/1后，餐前施用胰島素，使恒河猴血糖濃度為10-20mmol/Lo
[0009]本發(fā)明恒河猴糖尿病腎病模型的制備方法，包括如下步驟:
[0010](I)將劑量為80?100mg/kg的鏈脲菌素施用于恒河猴；
[0011](2)血糖濃度升聞至11.lmmol/1后，詞喂聞脂詞料，每天詞喂2次，詞喂量為
0.3-0.4kg/次.只，并在餐前施用胰島素，使恒河猴血糖濃度為10-20mmol/L，所述飼料包含如下重量配比的原料:標準猴飼料78份、動物油脂15份、糖5份、膽固醇2份。
[0012]標準猴飼料，是指《中華人名共和國國家標準GB14924.8-2001》規(guī)定的猴配合飼料。
[0013]動物油脂，是指來源于動物的脂肪，如:牛油、羊油、豬油。
[0014]步驟(I)中，所述的施用方式是靜脈注射。
[0015]步驟(2)中，所述的施用方式是皮下注射。
[0016]步驟(2)中，所述動物油脂是豬油；所述糖是蔗糖。[0017]本發(fā)明恒河猴糖尿病腎病模型的高脂飼料，它包含如下重量配比的原料:標準猴飼料78份、動物油脂15份、糖5份、膽固醇2份。
[0018]所述動物油脂是豬油；所述糖是蔗糖。
[0019]本發(fā)明前述方法制備的動物模型在篩選治療恒河猴糖尿病腎病的藥物中的用途。
[0020]本發(fā)明篩選治療恒河猴糖尿病腎病模型的藥物的方法，它包括如下步驟:
[0021]a、按照前述方法，建立恒河猴糖尿病腎病模型；
[0022]b、將候選藥物施用于動物模型；
[0023]c、用動物模型評價潛在的治療恒河猴糖尿病腎病的藥物。
[0024]本發(fā)明造模方法可以誘導恒河猴出現(xiàn)腎臟損傷、微量蛋白尿等糖尿病腎病的臨床癥狀，給藥方法簡單，可重復性強。
[0025]顯然，根據本發(fā)明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
`[0026]以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發(fā)明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內容所實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的范圍。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1血糖控制情況；[0028]圖2腎功能檢測結果；[0029]圖3致纖維化基因改變情況；[0030]圖4腎血流動力學參數(shù)和血流灌注系數(shù)；[0031]圖5腎臟B超檢查的血流分布和頻譜；[0032]圖6腎組織病理改變；[0033]圖7腎組織免疫熒光?！揪唧w實施方式】[0034]實施例1本發(fā)明恒河猴糖尿病腎病征模型的制備[0035]I實驗材料和儀器[0036]1.1供試品基本信息[0037]IL-1 β 抗體:abeam[0038]TNF-a 抗體:abeam[0039]TGF- β I 抗體:Bioworld[0040]CTGF 抗體:abeam[0041]Collagen IV 抗體:abeam[0042]Fibronection 抗體:Bioworld[0043]MCP-1 抗體:ebioscience[0044]CD68 (KPl)抗體:abeam[0045]eNOS 抗體:abeam[0046]動物組織總RNA提取試劑盒:天根[0047]iScript?cDNA 合成試劑盒:B10_RAD
[0048]iQ? SYBR? Green Supermix:BIO-RAD
[0049]1.2試驗所需主要儀器、器械
[0050]血糖檢測儀:羅康全活力型血糖檢測儀，羅康全活力型血糖試紙
[0051]全自動血液生化分析儀(瑞士Roche COBAS Integra400Plus,編號 MEB-02-01)
[0052]BIO-RAD CFX96 熒光定量 PCR 儀
[0053]BIO-RAD S200PCR 儀
[0054]LEICA DM4000B 熒光顯微鏡
[0055]Olympus BX51 光學顯微鏡
[0056]穿刺針，穿刺槍:BARD
[0057]彩超；Iu22philips
[0058]眼底熒光造影:Topcon TRC.50DX (日本拓普康公司生產)
[0059]1.3實驗動物
[0060]1.3.1實驗系統(tǒng)
[0061]恒河猴14只，體重3.5?5.5kg，擬由四川成都平安動物繁育研究基地(生產許可證號:SCXK(川)2004 - 013)引進。入室前一周進行結核菌素、寄生蟲、沙門氏菌、致賀氏菌檢查。
[0062]1.4動物飼養(yǎng)管理
[0063]1.4.1檢疫/環(huán)境適應
[0064]入室恒河猴試驗前先適應環(huán)境并檢疫一周，選擇健康雄性動物作為受試動物，檢疫內容:是否與訂購時要求的質量指標一致；體溫、攝食量、血生化、電解質；動物一般狀態(tài)；動物體重是否達到試驗要求體重的范圍。
[0065]1.4.2動物飼養(yǎng)
[0066]恒河猴飼養(yǎng)于國家成都中藥安全性評價中心普通動物房(實驗動物房使用許可證號:SYXK (JH) 2003 - 030)、恒河猴每只用不銹鋼鼠籠分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件符合國標GB14925-2001，室溫21±5°C (日溫差≤4° C)，相對濕度55± 15%，12小時明暗交替，換氣次數(shù)8?10次/小時。
[0067]1.4.3動物標識方法
[0068]恒河猴由胸牌·及籠上標簽共同標記
[0069]1.5實驗分組
[0070]分組包括正常組(3只)，實驗組A (STZ糖尿病造模后，通過每天餐前15分鐘皮下注射胰島素，控制血糖〈10mmol/l，3只)，實驗組B (STZ糖尿病造模后，通過每天餐前15分鐘皮下注射胰島素，控制血糖于10-20mmol/l，5只)，實驗組C (STZ糖尿病造模后，通過每天餐前15分鐘皮下注射胰島素，控制血糖于10-20mmol/l，并飼喂高脂飼料，3只)。
[0071]飼料配方:
[0072]實驗組A、B:猴標準猴飼料一商業(yè)化的猴顆粒飼料(購自四川省醫(yī)學科學院動物研究所，配方與《中華人名共和國國家標準GB14924.8-2001》規(guī)定的猴配合飼料相同)。
[0073]實驗組C:高脂飼料:15%精煉豬油(市售)，5%蔗糖(市售)，2%膽固醇(市售)，78%猴標準猴飼料。[0074]飼喂方式:每天飼喂2次，飼喂量為0.3-0.4kg/次.只。
[0075]2實驗方法
[0076]2.1動物一般狀況觀察
[0077]觀察動物外觀體征(包括動物的毛發(fā)、眼和粘膜)、行為活動、精神狀況、腺體分泌、呼吸、飲食、排泄物、注射局部等情況，檢測動物體重、血壓及攝食量。
[0078]2.2造模方法
[0079]實驗組A、B:
[0080]給藥前動物禁食禁飲12h以上，靜脈輸注生理鹽水IOOml擴容后，再推注配制好的STZ(80mg/kg)；
[0081]給予常規(guī)猴飼料喂養(yǎng)，每天飼喂2次，飼喂量為0.3-0.4kg/次.只；
[0082]檢測動物空腹血糖(FBG)，F(xiàn)BG連續(xù)2天高于11.lmmol/1后，通過每天餐前15分鐘皮下注射胰島素，控制血糖濃度。
[0083]實驗組C:
[0084]給藥前動物禁食禁飲12h以上，靜脈輸注生理鹽水IOOml擴容后，再推注配制好的STZ(80mg/kg)；
[0085]給予常規(guī)猴飼料喂養(yǎng)，每天飼喂2次，飼喂量為0.3-0.4kg/次.只；
.[0086]檢測動物空腹血糖(FBG), FBG連續(xù)2天高于11.lmmol/1后，通過每天餐前15分鐘皮下注射胰島素，控制血糖濃度，同時給與高脂飼料喂養(yǎng)，每天飼喂2次，飼喂量為
0.3-0.4kg/次.只。
[0087]2.3血液學檢查
[0088]檢測指標:紅細胞計數(shù)(RBC，電容法)、血紅蛋白(HGB，HiCN法)、紅細胞容積(HCT，電容積分法)、平均紅細胞容積(MCV，計算)、平均紅細胞血紅蛋白(MCH，計算)、平均紅細胞血紅蛋白濃度(MCHC，計算)、網織紅細胞計數(shù)(RET，熒光染色法)、白細胞計數(shù)(WBC，激光法)及分類(中性粒細胞NEU、淋巴細胞LYM、單核細胞MONO、嗜酸性粒細胞E0S、嗜堿性粒細胞BASO,激光法)、血小板計數(shù)(PLT，電容法)、網織紅細胞(RET，流氏+熒光染色法)、凝血酶原時間(PT，發(fā)色底物法)、活化部分凝血酶時間(APTT，發(fā)色底物法)。天門冬氨酸氨基轉移酶(AST，IFCC P-5’ -P法)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT，IFCC P_5’ -P法)、Y -谷氨酰轉移酶(GGT，L- Y -谷氨酰-3-羧基-對硝基苯胺法)、肌酸磷酸激酶(CK，HK-G6PD法)、堿性磷酸酶(ALP，4-NPP 法)、乳酸脫氫酶(LDH, IFCC 法)、尿素氮(Urea, Urease-GLDH-Kinetic 法)、總蛋白(TP，Biuret 法)、白蛋白(ALB，BCG 法)、血糖(GLU，GLK-G6PDH 法)、總膽紅素(TBIL，Diazo法)、肌酐(Crea，JAFF法)、總膽固醇(CHOL，CHOD-P法)、甘油三酯(TG，GPO-PAP法)、鈉離子濃度(Na+，離子選擇電極法)、鉀離子濃度(K+，離子選擇電極法)、氯離子濃度(Cl-，離子選擇電極法)等。
[0089]檢測時間--給STZ第1，4，周各測一次，以后每I?2月測一次。
[0090]方法:自恒河猴后腿大隱靜脈采血檢測。血液學檢查用血以EDTA抗凝，凝血時間用血以枸櫞酸鈉抗凝。
[0091]2.4 空腹血糖(Fasting blood glucose, FBG)及餐后血糖(Postprandial bloodglucose, PBG)檢測
[0092]檢測時間:每周2次檢測FBG (上午9點，空腹1?后)及PBG (進食后此)。[0093]檢測方法:取手指或腳趾末梢血，用羅氏血糖儀檢測。
[0094]2.5靜脈葡萄糖耐量實驗(IVGTT )
[0095]靜脈給予50%的葡萄糖注射液(0.5g/kg體重)，在推注后0，1，3，5，10，30，60和120分鐘測定血糖水平，同時檢查葡萄糖注射后0，I，3，5，30分鐘血樣中的胰島素水平(RIAor ELISA)
[0096]2.6空腹糖化血紅蛋白、血清胰島素及C肽(C-p印tide，C-P)水平檢測
[0097]檢測時間:每隔4周取血清檢測。
[0098]檢測方法:放射免疫法(RIA)試劑盒，酶聯(lián)免疫檢測法(ELISA)
[0099]2.7胰島素治療
[0100]空腹和餐后血糖監(jiān)控，根據血糖水平調整糖尿病猴皮下注射胰島素的種類、劑型及用量。24小時血糖監(jiān)控觀察治療效果，確定最優(yōu)方案。定期行血常規(guī)及生化檢查。
[0101]2.8眼底檢查
[0102]檢測時間:給藥前及給藥后觀察期結束時。
[0103]測定方法:恒河猴經鹽酸氯胺酮麻醉(肌肉注射，15mg/kg)，美多麗散瞳(滴眼，I滴/眼)，以雙目間接檢眼鏡進行檢查，所有影像學評估均在全麻狀態(tài)下進行(動物麻醉方法參考恒河猴手術麻醉S0P)。用眼底鏡觀察視神經乳頭的形狀、大小、色澤，邊緣是否清晰；黃斑部有無水腫、出血、滲出及色素紊亂；視網膜有無水腫、滲出、出血、剝離及新生血管等。
[0104]2.9腎B超和腎血管造影
[0105]彩超觀察腎臟形態(tài)和血流灌注分析血流動力學指標和血流灌注系數(shù)。造影劑SonoVue (Bracco SpA, Milan, Italy)通過大隱靜脈注射 Iml (5mg/ml),然后以 2ml 生理鹽水沖洗。之后再做左腎，中間間隔不小于10分鐘，中途加以flash爆破。
[0106]2.1OB超引導下腎穿刺活檢術
[0107]恒河猴肌注氯胺酮和安泰麻醉后去俯臥位，備皮消毒后鋪巾，穿刺點選擇左腎上極或下極，避開血管和腎盂。BARD腎穿刺針穿刺抽吸術，分別放入10%多聚甲醛和RNAlatter的EP管保存。所有固定組織進行HE、Masson、PAS常規(guī)染色，免疫熒光染色(CTGF、eNOS、IL-1 β、IV型膠原、纖連蛋白FN、TGF_0、MCP_1、TNF-α、⑶68)于顯微鏡下觀察病理組織學變化。RNA latter保存組織提取RNA逆轉錄后用熒光定量PCR檢測smad2、smad3、smad4、smad7、act in、NF- κ b 基因表達。
[0108]2.11液相芯片檢測
[0109]取不同病程的血漿，檢測因子(IL-1、IL-6、MCP-1、TNF-a、IL-17、IL-18)
[0110]2.12尿液檢測
[0111]恒河猴放入代謝籠中，收集晨尿和24小時尿，檢測尿常規(guī)，尿白蛋白和肌酐。
[0112]3實驗結果
[0113]3.1血糖控制情況
[0114]如圖1所示，各實驗組的血糖均保持在預先規(guī)定的范圍內。
[0115]3.2腎功能檢測
[0116]如圖2所示，尿液檢查示實驗組B和C在第36個月開始出現(xiàn)了微量蛋白尿(MAU)，并且，隨著病程推移有增加趨勢。血生化顯示42個月ABC三組血肌酐和尿素氮和正常組相比有明顯差異。[0117]3.3腎臟B超檢查的血流分布和頻譜
[0118]如圖5所示，早期腎血管床阻力增加，從而使腎內血流發(fā)生改變，隨著病情加重，動脈硬化的血管壁彈性減低，管腔狹窄，外周血管阻力增高，腎血流灌注減少，使腎血流呈低流，高阻狀態(tài)，其中，B組和C組的的病理改變非常明顯，C組最為明顯。
[0119]3.4腎血流動力學參數(shù)和血流灌注系數(shù)
[0120]如圖4所示，與對照組相比，ABC三組血流動力學參數(shù)阻力指數(shù)(RI)增加，舒張末期最低流速(EDV)降低，血流灌注系數(shù)曲線下面積(AUC)降低，C組與對照組的差異最大，B組其次，A組差異最小。
[0121]3.5腎組織病理改變
[0122]如圖6所示，與正常組相比A組無明顯改變，BC組炎性細胞侵潤、系膜細胞增生、基底膜增厚、膠原和糖原的沉積，C組更加顯著。
[0123]3.6腎組織免疫熒光
[0124]如圖7所示，腎組織免疫熒光顯示實驗組B C與正常組和實驗A組相比CTGF、eN0S、IL-l、IV型膠原、纖連蛋白(FN)、TGF_i3表達增加，并且在實驗組C更加顯著，同時實驗組C還出現(xiàn)MCPl和TNF- α表達。
[0125]3.7致纖維化基因改變
[0126]如圖3所示，Real-time PCR顯示實驗組B和C在第24個月開始出現(xiàn)Smad2和Smad3mRNA表達，實驗組C更顯著，并且在第42個月出現(xiàn)Smad7和NF- κ b mRNA表達增加。
.[0127]3.8眼科檢查
[0128]除一只(05539)有雙眼白內障未能檢查外，其余雙外眼無異常，結膜無充血水腫，角膜透明，前房無異常，瞳孔中度散大(均已滴用散瞳劑)。晶體透明，玻璃體無渾濁。眼底:雙眼豹紋狀眼底，視神經乳頭色淡紅，C/D=0.3-0.7，A:V=1:2，可見篩孔和血管波動。未見出血、滲出、微血管瘤及水腫,黃斑中心凹反光清。
[0129]綜上，實驗組A未出現(xiàn)糖尿病腎病的相關癥狀，實驗組B和C出現(xiàn)了糖尿病腎病的典型臨床癥狀:
[0130]1、實驗組B和C在第36個月開始出現(xiàn)了微量蛋白尿(MAU)并且隨著病程推移有增加趨勢；
[0131]2、腎組織HE、Masson、PAS染色顯示:實驗組A無病變，實驗組B和C腎臟從第24個月開始出現(xiàn)炎性細胞侵潤、系膜細胞增生、基底膜增厚、膠原和糖原的沉積，并且發(fā)現(xiàn)實驗組C在第42個月出現(xiàn)局部腎小球硬化。同時期腎組織免疫熒光顯示實驗組B C于正常組和實驗A組相比CTGF、eNOS、IL-1、IV型膠原、纖連蛋白(FN)、TGF-β表達增加，并且在實驗組C更加顯著，同時實驗組C還出現(xiàn)MCPl和TNF-α表達；
[0132]3、Real-time PCR顯示:實驗組B和C在第24個月開始出現(xiàn)Smad2和Smad3mRNA表達，實驗組C更顯著，并且在第42個月出現(xiàn)Smad7和NF- κ b mRNA表達增加；
[0133]4、腎血管造影顯示，實驗組B和C的血流灌注系數(shù)AUC和流動力學參數(shù)阻力指數(shù)RI顯著增加，舒張末期最低流速EDV降低(P〈0.05)，動脈硬化的血管壁彈性減低，管腔狹窄，外周血管阻力增高，腎血流灌注減少，使腎血流呈低流、高阻狀態(tài)；
[0134]本發(fā)明通過長期控制糖尿病恒河猴的血糖濃度范圍為10-20mmol/L，使得糖尿病恒河猴出現(xiàn)腎組織炎性細胞侵潤、系膜細胞增生、基底膜增厚、膠原和糖原的沉積、腎臟損傷、微量蛋白尿等糖尿病腎病的典型臨床癥狀，說明本發(fā)明恒河猴糖尿病腎病造模成功。
[0135]本發(fā)明通過長期控制糖尿病恒河猴的血糖濃度范圍為10-20mmol/L，結合長期高脂肪攝入的方式，使得糖尿病恒河猴的各種糖尿病腎病典型癥狀比單獨控制血糖的方式更為顯著，說明二者聯(lián)合處理的方式更優(yōu)。
[0136]實施例2用本發(fā)明模型篩選治療糖尿病腎病的藥物
[0137]a、按照實施例1方法建立的恒河猴糖尿病腎病模型；
[0138]b、將候選藥物施用于動物模型；
[0139]C、觀察候選藥物對代謝綜合征的各種指標的影響情況，評價潛在的治療糖尿病腎病疾病的藥物。
[0140]綜上，本發(fā)明造模方法通過長期控制血糖的方式，誘導恒河猴出現(xiàn)糖尿病腎病的臨床癥狀，另外，長期血糖控制與高脂攝入聯(lián)合的方式也可以誘導恒河猴出現(xiàn)糖尿病腎病的臨床癥狀，并且癥狀更為顯著，說明本發(fā)明兩種方式均可以有效建立恒河猴糖尿病腎病模型。
【權利要求】
1.一種恒河猴糖尿病腎病模型的制備方法，其特征在于:包括如下步驟:(1)將劑量為80?100mg/kg的鏈脲菌素施用于恒河猴；(2)血糖濃度升至11.1 mmol/1后，餐前施用胰島素,使恒河猴血糖濃度為10_20mmol/L0
2.—種恒河猴糖尿病腎病模型的制備方法，其特征在于:包括如下步驟:(1)將劑量為80?100mg/kg的鏈脲菌素施用于恒河猴；(2)血糖濃度升高至11.lmmol/1后，飼喂高脂飼料，每天飼喂2次，飼喂量為0.3-0.4kg/次.只，并在餐前施用胰島素，使恒河猴血糖濃度為10-20mmol/L，所述飼料包含如下重量配比的原料:標準猴飼料78份、動物油脂15份、糖5份、膽固醇2份。
3.根據權利要求1或2所述的制備方法，其特征在于:步驟(I)中，所述的施用方式是靜脈注射。
4.根據權利要求1或2所述的制備方法，其特征在于:步驟(2)中，所述的施用方式是皮下注射。
5.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于:步驟(2)中，所述動物油脂是豬油；所述糖是蔗糖。
6.一種建立恒河猴糖尿病腎病模型的飼料，其特征在于:它包含如下重量配比的原料:標準猴飼料78份、動物油脂15份、糖5份、膽固醇2份。
7.根據權利要求6所述的飼料，其特征在于:所述動物油脂是豬油；所述糖是蔗糖。
8.權利要求1?4任意一項所述方法制備的動物模型在篩選治療恒河猴糖尿病腎病的藥物中的用途。
9.一種篩選治療恒河猴糖尿病腎病模型的藥物的方法，其特征在于:它包括如下步驟:a、按照權利要求1?4任意一項所述方法，建立恒河猴糖尿病腎病模型；b、將候選藥物施用于動物模型；C、用動物模型評價潛在的治療恒河猴糖尿病腎病的藥物。
【文檔編號】A61K49/00GK103432572SQ201310250003
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年6月21日 優(yōu)先權日:2013年6月21日
【發(fā)明者】陸燕蓉, 程驚秋, 陳又南, 劉敬平, 劉芳, 楊立川, 王莉, 李宏霞, 張 杰, 王丹, 何斯榮, 王成世, 史梅梅, 袁玉佳, 趙久茗 申請人:四川大學華西醫(yī)院, 四川康城生物科技有限公司