專利名稱：一種黃芪黃酮提取物、其醫(yī)藥用途及藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及天然藥物領域，具體涉及一種黃芪有效部位提取物，該提取物具有很強的抗心肌缺血活性。
背景技術：
黃芪為05版《中國藥典》的收載品種，蒙古黃芪(A.membranaceus var.monghollcus)和膜莢黃芪(A.membranaceus)為藥典黃芪的正品藥材。蒙古黃芪為豆科Leguminosae植物，別名白皮芪(陜西)，混其日(蒙藥音譯)。拉丁學名Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao，為多年生草本。主根長而粗壯，條較順直。莖直立，高40～80cm。奇數(shù)羽狀復葉，小葉12～18對；小葉片小，寬橢圓形、橢圓形或長圓形，長5～10mm，寬3～5mm，兩端近圓形，上面無毛，下面被柔毛；托葉披針形。總狀花序腋生，常比葉長，具花5～20余朵；花萼鐘狀，密被短柔毛，具5萼齒；花冠黃色至淡黃色，長18～20mm，旗瓣長圓狀倒卵形，翼瓣及龍骨瓣均有長爪；雄蕊10，兩體(9+1)；子房光滑無毛。莢果膜質，膨脹，半卵圓形，直徑11～15mm，先端有短喙，基部有長子房柄，均無毛?；ㄆ?～7月，果期7～9月。
生于向陽草地及山坡。野生或栽培。
主產(chǎn)于山西、內蒙古、黑龍江、河北等省。膜莢黃芪為豆科Leguminosae植物，別名山爆仗(山東)，箭桿花(陜甘寧)。Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.(A.membranaceus)。多年生草本。高50～80cm。主根深長，條直、粗壯或有少數(shù)分枝。奇數(shù)羽狀復葉，小葉6～13對；小葉片橢圓形至長橢圓形或橢圓狀卵形至長圓形卵形，長7～30mm，寬3～12mm，先端鈍、圓或微凹，有時具小尖刺，基部圓形，上面近無毛，下面伏生白色柔毛；托葉卵形至披針狀線形。長5～15mm。總狀花序腋生，通常生花10～20余朵；花萼鐘狀，被黑色或白色短毛，萼齒5；長為萼筒的1/5～1/4；花冠黃色至淡黃色，或有時稍帶淡紫紅色，長約16mm，旗瓣長圓狀倒卵形，翼瓣及龍骨瓣均具長爪及短耳；子房有柄，被柔毛。莢果膜質，膨脹，半卵圓形，長20～30mm，寬9～12mm，被黑色或黑白相間的短伏毛?；ㄆ?～8月，果期7～9月。生于林緣、灌叢、林間草地或疏林下。分布于黑龍江、吉林、遼寧、河北、山東、山西、內蒙古、陜西、寧夏、甘肅、青海、新疆、四川、云南等省區(qū)。
醫(yī)學研究證明黃芪具益氣升陽，固表斂汗、利水消腫，托瘡生肌等作用。適用于中氣下陷、氣虛乏力、食少便溏、便血崩漏、表虛自汗，慢性腎炎蛋白尿、糖尿病等?，F(xiàn)有報道的黃芪有效部位提取方法一般都是以水或醇提后濃縮制得，多以黃芪多糖和黃芪甲苷等皂苷類報道為主，如CN1539464A公開了一種用超臨界萃取方法制備黃芪提取物，其提取物中主要成分是黃芪多糖、黃芪甲甙、黃芪總皂甙和黃芪黃酮。CN1660167A公開了一種黃芪有效部位，它的制備方法是用乙醇提取物，提取物過大孔樹脂，再用70-90％乙醇洗脫，洗脫液濃縮即得，這種黃芪有效部位中黃芪總皂甙含50-60％，黃芪黃酮甙含10-20％。CN1560069A公開了一種黃芪黃酮和黃芪皂苷同時提取分離的方法，其主要采用乙醇提取，過三聯(lián)樹脂，丙酮洗脫，洗脫液再過陰離子交換樹脂，再洗脫，得黃芪黃酮類提取物，盡管這種方法得到的黃芪黃酮含量很高，達95％，但這種制備方法工藝過于復雜，并且產(chǎn)品得率較低，才0.068％，不適合工業(yè)化大生產(chǎn)。

發(fā)明內容
本發(fā)明公開了一種中藥黃芪的有效部位提取物，更具體的是中藥黃芪的黃酮類化合物提取物。
本發(fā)明的黃芪有效部位提取物由下列方法制備得到黃芪用熱水或乙醇提取，提取液濃縮；濃縮液上大孔樹脂柱，用水洗脫，再用乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮；用乙酸乙酯萃取，濃縮萃取液，干燥，即得。
上述制備中，用于提取的溶劑優(yōu)選乙醇。用于提取用的乙醇濃度優(yōu)選50-100％。本發(fā)明中百分比均為重量百分比。更優(yōu)選的乙醇濃度是60～80％。
用于洗脫的乙醇濃度優(yōu)選10～50％，進一步優(yōu)選45％。
上述制備中大孔樹脂優(yōu)選自D101、AB-8、HPD100、HPD300、D1或D2。
用于萃取的乙酸乙酯優(yōu)選水飽和用乙酸乙酯。
提取黃芪用的水或乙醇的重量優(yōu)選黃芪的5～20倍本發(fā)明所述黃芪優(yōu)選蒙古黃芪。
研究發(fā)現(xiàn)，黃芪有效部位的制備方法中，當用水或醇提取，提取液適當濃縮后，用大孔樹脂分段，依次用水，10～70％乙醇洗脫，收集每部分洗脫液，濃縮后定容，進高效液相檢測，分析結果顯示黃酮類成分主要集中在30％～45％乙醇洗脫液中，20％乙醇及50％乙醇均含有少量的黃酮類化合物，10％和70％乙醇洗脫液中未能檢測黃酮類化合物，說明50％乙醇已能將大部分黃酮洗脫完全。而用50％乙醇洗脫部分雜質較多，黃酮含量較少。工藝再經(jīng)優(yōu)化后，最優(yōu)的洗脫條件是依次用水及10％醇洗脫除去雜質后，再收集30～45％乙醇洗脫液，最優(yōu)的洗脫液是45％乙醇，這樣提取物中黃酮含量較高。具體圖譜見附圖1～5。
黃芪的黃酮類化合物為黃芪的有效成分之一，但是工業(yè)生產(chǎn)上大部分工藝均以皂苷為目標產(chǎn)物，極少涉及黃酮類化合物，未能真正體現(xiàn)黃芪的藥用價值，本發(fā)明的黃酮提取物富含有黃芪所特有的異黃酮類化合物，具有良好的藥理活性，其也可與黃芪皂苷類化合物合并以增加活性并更加體現(xiàn)中藥黃芪的整體療效。黃芪的皂苷純化工藝一般使用大孔樹脂，而收集的一般也只是70-90％醇洗部分，50％以下的醇洗部分一般棄之不用，而本發(fā)明的黃酮工藝收集的恰恰是這一部分，為同時純化黃芪的黃酮與皂苷類成分提供了可能，因此本發(fā)明對于充分利用黃芪有效成分具有很高的實用價值，即可節(jié)省浪費，又可提高黃芪的藥用價值?？傸S酮中主要含毛蕊異黃酮7-O-β-D-葡萄糖苷(約35％)，其次分別為芒柄花苷(約10％)，(6aR，11aR)-9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷(約3％)，(3R)-2′-羥基-3′，4′-二甲氧基異黃烷-7-O-β-D-葡萄糖苷(約2％)和毛蕊異黃酮(約3％)。因此，本發(fā)明可以以這5個異黃酮類化合物為指標成分研究本發(fā)明提取物的制備工藝，并可將這5個化合物作為中間體進行質量控制。以這5個化合物的含量之和計為總黃酮的含量，本發(fā)明提取物中5個黃酮類化合物之和占總提取物52％以上。用水提取的提取物含量稍低。本發(fā)明提取物制備工藝操作，方便，成本低，無有害溶劑，生產(chǎn)安全性高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
藥理學試驗表明，本發(fā)明的提取物具有很好的抗心肌缺血作用。
本發(fā)明提取物的抗心肌缺血活性研究試驗及結果材料藥物A是本發(fā)明的黃芪有效部位提取物；B是75％乙醇提取、濃縮的黃芪提取物；C是黃芪的水提物。
實驗動物SD大鼠，雌雄各半，220～280g心肌缺血模型與給藥方法1取體重220-280gSD大鼠110只，雌雄各半，按體重隨機分為11組陽性對照組給予口服丹參片324mg/kg；模型組給予生理鹽水；藥物組A為本發(fā)明的黃芪的總黃酮提取物，B為75％醇提物，C為水提物。計量設置以生藥濃度折算，高劑量0.60g生藥/ml、中劑量0.30g生藥/ml、低劑量0.15g生藥/ml設置.研磨后，稱取相應的藥用0.5％CMC鈉充分溶解，配成100ml均勻溶液。
各組給藥容積均為1ml/100g。對各組大鼠實行灌胃給藥，給藥5天，每天一次。手術當天給藥20分鐘后，進行垂體后葉素注射。手術時，先將大鼠用20％烏拉坦以1.0g/kg的劑量腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，分離一側股靜脈，記錄一段正常II導心電圖，觀察J點的高度，T波的幅度，單個R-R的間期的長短。靜脈推注腦垂體后葉素量為0.7u/kg，10秒內推完，于注射前(0sec)及注射后5sec、10sec、30sec、1min、2min、5min、10min、20min記錄心電圖。依據(jù)J點的高度T波的幅度，單個R-R的間期，三個不同參數(shù)，將每組大鼠注射垂體后葉素后各時間點心電圖各項指標減去注射前(0sec)的指標，得相應差值，各藥物組對應時間點的差值(給垂體后葉素后各時間點的值-未給垂體后葉素前的值)均與模型對照組的相應時間點的差值進行組間t檢驗比較，結果見表1。
表1.黃芪三種提取物對垂體后葉素所致大鼠心肌缺血J點(0.1mv)的影響 (x±s)(n＝10)

表2.黃芪三種提取物對垂體后葉素所致大鼠心肌缺血T波(0.1mv)的影響(x±s)(n＝10)

表3.黃芪三種提取物對垂體后葉素所致大鼠心肌缺血R-R單個間期(s)的影響(x±s)(n＝10)


##表示P＜0.01，#P＜0.05組內各時間點與給藥前比較，*P＜0.05，**P＜0.01，差值進行組間比較。
設計資料以x±s表示，數(shù)據(jù)取均值進行組間t檢驗，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。
由表可知本發(fā)明的黃芪黃酮總提物的中、高劑量，75％醇提物與水提物的中劑量在多個時間點均能顯著抑制J點抬高(J點抬高是心肌缺血的重要指征)、T波倒置(T波倒置是心肌缺血的重要指征，造模后T波下降是倒置的跡象)和R-R間期延長的趨勢(R-R間期延長的趨勢是心肌缺血的指征)。
方法2取體重220-280gSD大鼠110只，雌雄各半，按體重隨機分為11組；陽性對照組給予口服丹參片324mg/kg；模型組給予生理鹽水；黃芪三種提取物的劑量設置同方法1，取樣研磨后，稱取相應的藥用0.5％CMC鈉充分溶解，配成100ml均勻溶液。
連續(xù)灌藥六天，空白組灌服同體積生理鹽水。第3天開始，給模型組和各給藥組大鼠按照0.2mg/kg的劑量腹腔注射異丙腎上腺素，每12小時一次，連續(xù)60小時。第六天，灌藥1小時后，檢測血清中的LDH、SOD、MDA的含量。操作步驟按照試劑說明書進行。結果見表4。
表4黃芪三種提取物對實驗性大鼠慢性心肌缺血LDH、SOD、MDA的影響

**表示P＜0.01；*表示P＜0.05；正常與模型組P＜0.01，說明造模成功。n＝10統(tǒng)計學處理設計資料以x±s表示，數(shù)據(jù)取均值進行組間t檢驗，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。
LDH、SOD、MDA是可以反映心肌缺血的重要指征，從表4可以推論黃芪水提、醇提的中劑量，本發(fā)明黃芪總黃酮提取物的中、高劑量可以成功地激活機體SOD，提高酶活力，減少MDA的含量，抑制LDH的泄漏，從而減輕心肌缺血的損傷。
以上試驗證明，黃芪的三種提取物對垂體后葉素，異丙腎上腺素所致的大鼠心肌缺血有較強的保護作用。但是黃芪水提與醇提只有特定的劑量下(中劑量)才有明顯的抗心肌缺血作用，說明黃芪中可能有其它的成分會影響有效成分發(fā)揮作用，而提純后的黃芪總黃酮提取物抗心肌缺血作用則較明顯，并且呈一定的劑量依賴性。
本發(fā)明的黃芪黃酮提取物可以用于臨床，一般的用量為成人每日20～500mg。也可根據(jù)不同的疾病嚴重程度及不同的劑型偏離該范圍。
本發(fā)明的黃芪總黃酮提取物可單獨或與其它中藥及中藥提取物組配制成藥物。
本發(fā)明的黃芪總黃酮提取物可與藥學上可接受的載體混合，用于制備治療用藥物組合物。可制備成藥劑學上通用的劑型，如膠囊、片劑、丸劑、口服液、顆粒劑、酊劑、緩釋劑等胃腸道給藥劑型及注射劑、外用制劑等胃腸外給藥劑型。


圖1是混合標準品的液相色譜2是藥材75％提取液色譜3為大孔樹脂10％乙醇洗脫液的液相4為大孔樹脂45％乙醇洗脫液的液相5是本發(fā)明總黃酮提取物的液相色譜圖上述圖中各標識峰的含義1毛蕊異黃酮7-O-β-D-葡萄糖苷(calycosin-7-O-β-D-glc)，2芒柄花苷(ononin)，3(6aR，11aR)-9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷[(6aR，11aR)-9，10-dimethoxypterocarpan-3-O-β-D-glucoside]，4(3R)-2′-羥基-3′，4′-二甲氧基異黃烷-7-O-β-D-葡萄糖苷[(3R)-2′-hydroxy-3′，4′-dimethoxyisoflavan-7-O-β-D-glucoside]，5毛蕊異黃酮(calycosin)。
具體實施例方式
含量測定方法儀器與試劑 高效液相色譜儀Aglient1100系列，二元泵G1312A，自動進樣器，二極管陣列檢測器，Chemstation A.06.01化學工作站，色譜柱ZORBAX ODS C18 column(4.6×250mm I.D.，5μm)，預柱ZORBAX ODS C18 guard column(4.6×12.5mm I.D.，5μm)，純水(自制)，甲醇為色譜純，甲酸為分析純。
色譜條件 流動相A0.3％甲酸溶液，B乙腈，0～12min，18％B，12～20min，18～30％B，20～30min，30％B，30～38min，30～55％B，38～48min，55％B。流速為1.0mL·min-1，檢測波長為280nm，柱溫25℃。
實施例1取黃芪藥材20g，藥材重量12倍體積的70％乙醇，95℃熱回流提取三次，每次1.5小時。提取液合并，減壓回收溶劑。所得濃縮液經(jīng)D101大孔樹脂分段，先用水洗脫去雜質，再依次用10％、45％乙醇洗脫。濃縮45％洗脫液，用水溶解，用等體積的水飽和乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液，濃縮真空干燥即得，總黃酮含量為56.14％。
實施例2
取黃芪藥材20g，藥材重量10倍體積的80％乙醇，95℃熱回流提取三次，每次1.5小時。提取液合并，減壓回收溶劑。所得濃縮液經(jīng)HPD100大孔樹脂分段，先用水洗脫去雜，再用45％乙醇洗脫。45％乙醇洗脫液濃縮后，用水溶解，用水飽和乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液，濃縮真空干燥即得，總黃酮含量為52.35％實施例3取黃芪藥材20g，藥材重量8倍體積的60％乙醇，95℃熱回流提取二次，每次1小時。提取液合并，減壓回收溶劑。所得濃縮液經(jīng)D101大孔樹脂分段，先用水洗脫，再依次用10％、40％乙醇洗脫。40％乙醇洗脫液合并后濃縮，用水溶解，再用水飽和乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液，濃縮真空干燥即得，總黃酮含量為55.22％。
實施例4取黃芪藥材20g，藥材重量10倍體積的70％乙醇，95℃熱回流提取二次，每次1小時。提取液合并，減壓回收溶劑。所得濃縮液經(jīng)D101大孔樹脂分段，依次10％及40％乙醇洗脫。將40％醇洗脫液濃縮后，用水溶解，再用水飽和乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液，濃縮真空干燥即得，總黃酮含量為56.29％。
實施例5取黃芪藥材20g，藥材重量12倍體積的70％乙醇，95℃熱回流提取三次，每次1小時。提取液合并，減壓回收溶劑。所得濃縮液經(jīng)D101大孔樹脂分段，先用水洗脫，再45％乙醇洗脫。將45％醇洗脫液濃縮后，用水溶解，再用水飽和乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液，濃縮真空干燥即得，總黃酮含量為52.54％。
實施例6取黃芪藥材20g，藥材重量8倍體積的水，加熱回流提取三次，每次1小時。提取液合并，減壓回收溶劑。所得濃縮液經(jīng)HPD300大孔樹脂分段，先用水洗脫，再依次用10％、45％乙醇洗脫。將45％醇洗脫液濃縮后，用水溶解，再用水飽和乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液，濃縮真空干燥即得，總黃酮含量為50.46％。
實施例7取黃芪藥材20g，藥材重量10倍體積的水，加熱回流提取三次，每次1.5小時。提取液合并，減壓回收溶劑。所得濃縮液經(jīng)D101大孔樹脂分段，先用水洗脫，再依次用5％、30％乙醇洗脫。將30％醇洗脫液濃縮后，用水溶解，再用水飽和乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液，濃縮真空干燥即得，總黃酮含量為53.38％。
實施例8取黃芪藥材20g，藥材重量12倍體積的90％乙醇，95℃熱回流提取三次，每次1小時。提取液合并，減壓回收溶劑。所得濃縮液經(jīng)D101大孔樹脂分段，先用水洗脫，再35％乙醇洗脫。將35％醇洗脫液濃縮后，用水溶解，再用水飽和乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液，濃縮真空干燥即得，總黃酮含量為56.54％。
實施例9取實施例1方法制備的提取物100mg與淀粉100mg，糊精100mg混合，用適量30％乙醇作濕潤劑，制成軟材，常規(guī)方法制粒，加入適量硬脂酸鎂混合，制成片劑。
權利要求
1.一種黃芪提取物，其特征是由下列方法制備得到黃芪用熱水或乙醇提取，提取液濃縮；濃縮液上大孔樹脂柱，用水洗脫，再用10～50％乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮；用乙酸乙酯萃取，濃縮萃取液，干燥，即得。
2.權利要求1的黃芪提取物，其中提取溶劑是乙醇。
3.權利要求2的黃芪提取物，其中提取用乙醇濃度是50-100％，為重量百分比。
4.權利要求3的黃芪提取物，其中提取用乙醇濃度是60-80％，為重量百分比。
5.權利要求1的黃芪提取物，其中用于洗脫用的乙醇濃度是30～45％，為重量百分比。
6.權利要求1的黃芪提取物，其中用于提取黃芪用的水或乙醇的重量是黃芪的5～20倍。
7.權利要求1的黃芪提取物，其中大孔樹脂選自D101、AB-8、HPD100、HPD300、D1或D2。
8.權利要求1的黃芪提取物，其中黃芪是蒙古黃芪。
9.一種治療心血管疾病的藥物組合物，含有權利要求1至8中任一項的黃芪提取物及藥學上可接受的載體。
10.權利要求1至8中任一項的黃芪提取物用于制備抗心肌缺血藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及天然藥物領域，具體涉及一種黃芪有效部位提取物即黃芪總黃酮提取物，本發(fā)明黃芪黃酮提取物具有很強的抗心肌缺血活性。
文檔編號A61P9/10GK101040896SQ200710021630
公開日2007年9月26日 申請日期2007年4月18日 優(yōu)先權日2007年4月18日
發(fā)明者李萍, 余慶濤, 齊煉文, 張溪, 易玲 申請人:中國藥科大學