專利名稱：有機溶劑增強高gc含量dna片段擴增效率的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子生物學領域的聚合酶鏈式反應(PCR)擴增，尤其是一種應 用有機溶劑為優(yōu)化劑增強高GC含量DNA片段擴增效率的方法。
背景技術：
PCR技術是在核酸研究的基礎上發(fā)展起來的，自1930年正式提出DNA和 RNA兩種核酸的概念后，人們對核酸的化學組成、結(jié)構(gòu)及其功能進行了更為 深入的研究，1953年Watson和Crisk根據(jù)X—射線衍射圖形及各種化學分析數(shù) 據(jù)提出的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及其半保留復制模型，是生物科學史上的一個飛躍， 使得對基因在體外克隆、表達、調(diào)控等方面取得了長足的進展，并由此拉開 基因工程的序幕。隨著大量科學家的不斷研究，在1985年美國PE-Cetus公司 人類遺傳研究室的Mullis等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈式反應(PCR)。
但是聚合酶鏈式反應(PCR)發(fā)展到今天已經(jīng)有20多年的時間了，隨著技 術不斷的發(fā)展、進步，PCR已經(jīng)成為分子生物學研究中不可缺少的一項實驗 技術，并廣泛應用于遺傳學、微生物學、乃至整個生命科學領域的研究中。 但是自PCR建立以來，在實際應用中也表現(xiàn)出了它所具有的不足，尤其是針 對GC含量很高的序列更是不容易得到理想的結(jié)果，甚至有時候基本上擴增不 出靶基因。因為G、 C之間形成三對氫鍵，解鏈所需能量較高，模板較難打 開，而高GC含量模板擴增中所面臨的主要困難還是模板中容易形成穩(wěn)定的二 級結(jié)構(gòu)，妨礙了DNA聚合酶在模板上的推進，以及模板上可能存在多個非特 異性的引物局部復性位點，導致非特異性擴增。
針對此方面的研究有很多，過去曾研發(fā)一些有效的手段來優(yōu)化PCR效率。 為解決此問題，人們采取了各種措施如增加變性及退火溫度，調(diào)節(jié)Mg^濃度， 用NaOH進行DNA模板變性，用堿基類似物7-deaza-dGTP和dITP替代dGTP 以降低被取代DNA的解鏈溫度Tm ，采用Touch-down方法進行擴增；也有人 在PCR反應體系中加入各種促進劑，如甲酰胺、砜類(DMSO)、甘油、BSA、 非離子去污劑及氯化四甲基銨等，以增加PCR的特異性和產(chǎn)量。上述措施對 有些GC含量高的DNA模板的PCR擴增有效，但有時無效，其原因前尚不清楚。 因此找到切之有效的手段來優(yōu)化PCR效率顯得十分的重要，對這一問題的研 究就很有意義，也對以后的研究工作也有一定的幫助作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中高GC含量DNA片段擴增的常見問題而
提供一種有機溶劑增強高GC含量DNA片段擴增效率的方法，該方法通過 在PCR反應體系中添加有機溶劑達到對DNA片段的有效擴增，對高GC含量 DNA片段擴增的效果明顯。
本發(fā)明采取的技術方案是-
一種有機溶劑增強高GC含量DNA片段擴增效率的方法，包括(l).待擴增 DNA的提取、(2).PCR體系的配置及優(yōu)化、(3).PCR條件的設定與運行、 (4).PCR產(chǎn)物電泳檢測，其特征在于PCR體系的優(yōu)化是在PCR反應體系中添 加有機溶劑，PCR產(chǎn)物的電泳檢測采用W。瓊脂糖凝膠，跑膠后用EB液(溴化乙 啶Ethidium bromide)染色，然后用紫外分光透射儀觀察擴增片段在凝膠中的 位置，并與相應的分子量標準做對照。
而且，所述的有機試劑為下述化學試劑的一種或者兩種以上混合物，包 括系列醇類，如l， 2-丙二醇，乙二醇，異丙醇等；系列酯類，如乙酸乙酯， 乙酸丙酯，2-丁酯，丁酸乙酯等；系列烷類，如正戊烷。
而且，所述有機溶劑為純度為分析純及以上級別的試劑。
而且，所述的PCR擴增包括常規(guī)PCR、低拷貝數(shù)PCR擴增、長片段 PCR、復雜模板PCR、高GC含量的PCR、反復擴增的PCR以及含有較多重 復序列的PCR擴增。
而且，所述的EB液為溴化乙啶。
本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是-
(1) .本發(fā)明應用于高GC含量DNA片段擴增的有機溶劑1， 2-丙二醇和乙 二醇，比已有提高高GC含量DNA片段的PCR添加劑具有更優(yōu)的效果，對高 GC模板的擴增效果明顯，副作用少。這一發(fā)現(xiàn)對于高GC含量片段的擴增是 一個新的突破，為滿足不同實驗內(nèi)容的高GC擴增提供了有效的方法和借鑒。
(2) .本發(fā)明中所涉及的應用有機溶劑增強高GC含量DNA片段的擴增方 法，與已有的方法相比，該方法所用的PCR促進劑為普通化學試劑，價格便 宜，可獲得性強；促進劑易于長期室溫保存，使用方便。
(3) .本發(fā)明對富含GC堿基DNA片段的擴增效果明顯，使得針對高GC含 量序列的擴增更具有效率和目的性，對分子生物學技術試驗的發(fā)展將具有重 大理論意義和應用價值。


圖1為本發(fā)明擴增GC%=68.8 圖2為本發(fā)明擴增GC%=69.6 圖3為本發(fā)明擴增GC%=62.1 圖4為本發(fā)明擴增GC%=71.1 圖5為本發(fā)明擴增GC%=71.2
、長度為780bp的DNA片段的結(jié)果 、長度為771bp的DNA片段的結(jié)果 、長度為739bp的DNA片段的結(jié)果 、長度為796bp的DNA片段的結(jié)果 、長度為775bp的DNA片段的結(jié)果
圖6為本發(fā)明擴增GC%=71.6、長度為728bp的DNA片段的結(jié)果； 圖7為本發(fā)明擴增GC%=73.3、產(chǎn)度為806bp的DNA片段的結(jié)果； 圖8為本發(fā)明擴增GC%=78.1、長度為735bp的DNA片段的結(jié)果； 圖9為本發(fā)明擴增GC%=76.9、長度為729bp的DNA片段的結(jié)果； 圖10為本發(fā)明擴增GC%=76.3、長度為754bp的DNA片段的結(jié)果； 圖11為本發(fā)明擴增GC%=75.9、長度為714bp的DNA片段的結(jié)果。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明進一步說明；下述實施例是說明性的，不是 限定性的，不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護范圍。
本發(fā)明所涉及的PCR技術的優(yōu)化方法是通過向PCR體系中添加有機溶劑 來實現(xiàn)的，其具體操作方法如下
1. 待擴增人類基因組DNA的提取
2. PCR體系的配置及優(yōu)化
PCR體系根據(jù)現(xiàn)有的技術，由待擴增DNA片斷的不同而各不相同。具體 表現(xiàn)在dNTP、模板、Mg2+、引物的添加量根據(jù)不同的模板和不同的擴增片段 長度來選擇；
PCR反應體系中的H20為雙蒸水及以上級別水,體系中水的添加量應根據(jù) 有機溶劑添加的體積進行調(diào)整，即應扣除相應添加的有機溶劑的體積。在上 述PCR反應體系中加入一定體積的所選用的某一種有機溶劑。為適合PCR反 應的特殊需要，所有有機溶劑均需用一定的方法滅DNA酶和RNA酶。滅酶的 方法有多種，本發(fā)明采用的方法是真空濾膜過濾滅酶法。對于直接購買的已 經(jīng)滅DNA酶和RNA酶的產(chǎn)品，無需再做滅酶處理。
3. PCR條件的設定與運行
PCR反應條件中的預變性、變性及退火各階段的溫度和對應時間應根據(jù) 不同模板和引物融解溫度來選擇；其中的延伸溫度根據(jù)所用聚合酶的合適溫 度來選擇；延伸時間根據(jù)所擴增片段的長度來選擇；循環(huán)次數(shù)根據(jù)個人試驗 目的和需要進行選擇。
4. PCR產(chǎn)物的檢測
一般用瓊脂糖凝膠電泳技術進行檢測，瓊脂糖凝膠的濃度及PCR產(chǎn)物的 上樣體積需根據(jù)具體情況而定。
本發(fā)明所采用的瓊脂糖凝膠電泳技術依照已有方法概括如下
(1) .瓊脂糖凝膠的具體濃度大小應根據(jù)擴增DNA片段的大小來確定。
(2) .吸取一定體積的PCR產(chǎn)物上電泳槽點樣，同時點上合適分子量標記作 為參照。
(3) .加上3—4V/cm的電壓進行電泳。
(4).待指示劑到合適位置時，取出膠板于凝膠成象系統(tǒng)下觀察并照相記錄。
本發(fā)明采用的有機溶劑為下述之一，或者兩種以上的混合物，包括系列 酯類，如乙酸乙酯，乙酸丙酯，乙酸丁酯等；系列醇類，如丙醇，異丙醇， 正丁醇，異丁醇，仲丁醇，叔丁醇，正己醇等；系列酮類，如2-丁酮。而且 所有的有機溶劑純度為分析純及以上級別的試劑。
本發(fā)明中PCR體系的優(yōu)化是指直接在體系中加入一定體積的一種或幾 種上述有機溶劑，所用有機溶劑無需任何方式的稀釋。
本發(fā)明所稱的PCR擴增包括常規(guī)PCR、低拷貝數(shù)PCR擴增、長片段 PCR、復雜模板PCR、高GC含量的PCR、反復擴增的PCR以及含有較多重 復序列的PCR擴增。
具體示例
一種有機溶劑增強高GC含量DNA片段擴增效率的方法，其步驟是-
1. 待擴增人類基因組DNA的提取
2. PCR反應體系的配置
按以下順序和添加量配置體系于薄壁PCR管中。
10XPCR緩沖液 2. 5uL
dNTP底物(2, 5mM) 3 u L
引物1(4.0txM) 2uL
引物2(4.0pM) 2uL
模板(O. :Ug/uL) 2uL
Mg2+(25mM) 1.5uL Taq酶(5U/uU 0. 5 u L
有機溶劑 1.5pL
其中，模板為Genomic DNA，從人類血液中提取；Taq酶及有機溶劑來自北 京三博遠志生物工程公司。采用的方法是真空濾膜過濾滅酶法。對于直接購 買的己經(jīng)滅DNA酶和RNA酶的產(chǎn)品，無需再做滅酶處理。 3.PCR體系的優(yōu)化與運行
在多種有機溶劑對低GC含量DNA的作用下，選擇擴增效果顯著試劑，運 用選擇出的有機溶劑對高GC難擴增的DNA片段進行實驗。
通過本實驗，發(fā)現(xiàn)l， 2-丙二醇和乙二醇對高GC難擴增的DNA片段擴增 有顯著作用。
對不同GC含量的DNA片段，每個片段都配置4管，且從0 3編號。 每個片段的0 3管，分別添加不用的試劑，添加試劑分別為 O號管本身擴增，無添加任何試劑；
1號管添加Betaine; 2號管添加l， 2-丙二醇； 3號管添加乙二醇。
3.按以下條件在PCR儀上設定循環(huán)條件進行PCR熱循環(huán), 預變性 95°C 3min
95 。C 57 。C 72 °C
30s 50s 50s
一40循環(huán)
完全延伸 72°C 15min
4.對擴增完成后的PCR產(chǎn)物進行瓊酯糖凝膠電泳檢測。
PCR產(chǎn)物的電泳檢測采用1%瓊脂糖凝膠，跑膠后用EB液(溴化乙啶 Ethidium br。mide)染色，然后用紫外分光透射儀觀察擴增片段在凝膠中的位 置，并與相應的分子量標準做對照。
具體擴增結(jié)果如圖l所示，在圖中標記M代表分子量標準帶的位置，此 圖中分子量標準為DNA2000。
從其他附圖中可以看出，與未加任何添加劑的PCR體系擴增的結(jié)果相比， 用公認的對高GC擴增有顯著效果的試劑Betaine作用，這些片段也不能成功 擴增；而在有機溶劑l， 2-丙二醇和乙二醇的作用下，這些高GC含量的難擴 增的DNA片段成功擴增。這表明有機溶劑l， 2-丙二醇和乙二醇均對高GC難 擴增DNA片段的擴增有顯著的作用。
權利要求
1. 一種有機溶劑增強高GC含量DNA片段擴增效率的方法，包括(1).待擴增DNA的提取、(2).PCR體系的配置及優(yōu)化、(3).PCR條件的設定與運行、(4).PCR產(chǎn)物電泳檢測，其特征在于PCR體系的優(yōu)化是在PCR反應體系中添加有機溶劑，PCR產(chǎn)物的電泳檢測采用1％瓊脂糖凝膠，跑膠后用EB液染色，然后用紫外分光透射儀觀察擴增片段在凝膠中的位置，并與相應的分子量標準做對照。
2. 根據(jù)權利要求1所述的有機溶劑增強高GC含量DNA片段擴增效率 的方法，其特征在于所述的有機試劑為下述化學試劑的一種或者兩種以上 混合物，包括系列醇類，如1， 2-丙二醇，乙二醇，異丙醇等；系列酯類， 如乙酸乙酯，乙酸丙酯，2-丁酯，丁酸乙酯等；系列烷類，如正戊烷；最優(yōu) 為1， 2-丙二醇和乙二醇。
3. 根據(jù)權利要求2所述的有機溶劑增強高GC含量DNA片段擴增效率的 方法，其特征在于所述有機溶劑為純度為分析純及以上級別的試劑。
4. 根據(jù)權利要求1所述的有機溶劑增強高GC含量DNA片段擴增效率 的方法，其特征在于所述的PCR擴增包括常規(guī)PCR、低拷貝數(shù)PCR擴 增、長片段PCR、復雜模板PCR、高GC含量的PCR、反復擴增的PCR以 及含有較多重復序列的PCR擴增。
5. 根據(jù)權利要求1所述的有機溶劑增強高GC含量DNA片段擴增效率 的方法，其特征在于所述的EB液為溴化乙啶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種有機溶劑增強高GC含量DNA片段擴增效率的方法，包括(1).待擴增DNA的提取、(2).PCR體系的配置及優(yōu)化、(3).PCR條件的設定與運行、(4).PCR產(chǎn)物電泳檢測，其中PCR體系的優(yōu)化是在PCR反應體系中添加有機溶劑，PCR產(chǎn)物電泳檢測采用1％瓊脂糖凝膠，跑膠后用EB液染色，然后用紫外分光透射儀觀察擴增片段在凝膠中的位置，并與相應的分子量標準做對照。本發(fā)明使用的優(yōu)化劑為普通化學試劑，價格便宜，可獲得性強；優(yōu)化劑易于長期室溫保存，使用方便。本發(fā)明對富含GC堿基DNA片段的擴增效果明顯，使得針對高GC含量序列的擴增更具有效率和目的性。這對分子生物學技術試驗的發(fā)展將具有重大理論意義和應用價值。
文檔編號C12P19/34GK101381755SQ20081015127
公開日2009年3月11日 申請日期2008年9月10日 優(yōu)先權日2008年9月10日
發(fā)明者芳 劉, 孟良玉, 張治洲, 霞 楊 申請人:天津科技大學