專利名稱：激酶活性的測定方法及測定用試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及跨膜激酶活性的測定方法及用于測定激酶活性的試劑盒。
背景技術(shù)：
眾所周知，存在于細(xì)胞膜的跨膜型的激酶(以下稱受體激酶)很多都與細(xì)胞的癌變有關(guān)，在癌細(xì)胞中，受體激酶活性很高(或很低)。比如，已知人表皮生長因子受體(human epithelial growth factor receptor、以下稱HER)家族之一的HER1主要在肺癌上很活躍，屬于同一家族的HER2主要在乳腺癌上顯示高活性。HER1和HER2等受體激酶由配體結(jié)合而激活，導(dǎo)致自身磷酸化，從而得以最終將基質(zhì)磷酸化?；|(zhì)磷酸化后，細(xì)胞的增殖和凋亡等受下游信號傳遞系統(tǒng)控制。比如，一旦信號被傳遞到細(xì)胞內(nèi)的特定蛋白質(zhì)，并且有關(guān)細(xì)胞增殖的信號傳遞系統(tǒng)發(fā)生異常，則可能引起細(xì)胞的異常增殖，導(dǎo)致癌變。因此，測定激酶活性是判斷細(xì)胞是否癌變的指標(biāo)。
作為測定受體激酶活性的方法已知有比如Knutson等文獻(xiàn)(Victoria PKnutson and Ruth Ann Buck(1991)Archieves of Biochemistry and Biophysics285(2)197～204)上記載的方法。用其敘述的方法，可以檢測出受體激酶之一的胰島素受體的自身磷酸化。具體而言，將胰島素和培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)后，從該培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞膜回收胰島素受體，用放射性物質(zhì)標(biāo)記的抗磷酸酪氨酸抗體檢測自身磷酸化。然而，根據(jù)Knutson等文獻(xiàn)上記載的技術(shù)，無法判斷活化的受體激酶的酶活性能否讓基質(zhì)磷酸化。因此，要測定受體激酶活性，需要開發(fā)一種技術(shù)，它能夠檢出基質(zhì)磷酸化而不是受體激酶的自身磷酸化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠檢出基質(zhì)被活化的受體激酶酶活性磷酸化的方法及其試劑盒。
即，本發(fā)明提供一種檢測存在于細(xì)胞的細(xì)胞膜上的受體激酶活性的方法，它包括以下步驟從所述細(xì)胞分離出細(xì)胞質(zhì)，制備含有受體激酶的試樣；讓所述試樣中的受體激酶與基質(zhì)接觸，用受體激酶的活性使基質(zhì)磷酸化；讓標(biāo)記物與所述磷酸化基質(zhì)結(jié)合；以及根據(jù)與所述磷酸化基質(zhì)結(jié)合的標(biāo)記物的檢測結(jié)果，測定受體激酶的活性。
其中，在緩沖液中破碎所述細(xì)胞，將含有破碎細(xì)胞的所述緩沖液與表面活性劑混合，通過提取所得混合物的上清液，制備含受體激酶的試樣。其中所述緩沖液的pH值為4.0～9.0。其中所述表面活性劑是不與所述受體激酶結(jié)合的非離子型表面活性劑。
其中所述基質(zhì)具有親和標(biāo)簽，且所述方法進(jìn)一步包括以下步驟讓有所述具有親和標(biāo)簽的基質(zhì)與含有能連接所述親和標(biāo)簽的結(jié)合物的固相接觸，形成復(fù)合物；回收所述復(fù)合物；及離解結(jié)合物與親和標(biāo)簽的結(jié)合，以從所述回收的復(fù)合物中獲得所述基質(zhì)。
其中所述標(biāo)記物通過能結(jié)合到所述磷酸化基質(zhì)的一次抗體和能結(jié)合到所述第一抗體的二次抗體，與所述磷酸化基質(zhì)結(jié)合。
其中所述受體激酶為酪氨酸激酶。其中所述酪氨酸激酶選自以下物質(zhì)胰島素樣生長因子受體(insulin-like growth factor receptor；IGFR)、血小板衍生生長因子受體(platelet-derived growth factor receptor；PDGFR)、人表皮細(xì)胞生長因子受體(human epithelial growth factor receptor；HER)和血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor；VEGFR)。
其中所述基質(zhì)為與受體酪氨酸激酶配對的基質(zhì)。其中所述基質(zhì)選自以下物質(zhì)組成的群體生長因子受體結(jié)合蛋白質(zhì)2(Grb2)、堿性髓鞘蛋白(MBP)、組朊H2B(HH2B)和磷脂酶C-γ。其中所述基質(zhì)是可以被多種受體酪氨酸激酶磷酸化的基質(zhì)。其中所述基質(zhì)含有由含谷氨酸殘基和酪氨酸殘基的氨基酸序列構(gòu)成的肽。
其中所述氨基酸序列選自以下序列由谷氨酸殘基和酪氨酸殘基構(gòu)成、谷氨酸殘基和酪氨酸殘基的比率為4∶1的氨基酸序列A；由谷氨酸殘基和酪氨酸殘基構(gòu)成、谷氨酸殘基和酪氨酸殘基的比率為1∶1的氨基酸序列B；由谷氨酸殘基、酪氨酸殘基和氨基丙酸殘基構(gòu)成、谷氨酸殘基、氨基丙酸殘基和酪氨酸殘基的比率為6∶1∶3的氨基酸序列C；由谷氨酸殘基、酪氨酸殘基和氨基丙酸殘基構(gòu)成、谷氨酸殘基、氨基丙酸殘基和酪氨酸殘基的比率為1∶1∶1的氨基酸序列D；以及由谷氨酸殘基、酪氨酸殘基、氨基丙酸殘基和賴氨酸殘基構(gòu)成、谷氨酸殘基、酪氨酸殘基、氨基丙酸殘基和賴氨酸殘基的比率為2∶1∶6∶5的氨基酸序列E。
其中所述標(biāo)記物為熒光物質(zhì)或酶。
本發(fā)明還提供一種推斷受體激酶抑制劑對細(xì)胞影響的方法，其中包括以下步驟用權(quán)利要求1所述方法測定受體激酶活性，取得第1測定結(jié)果；用權(quán)利要求1所述方法測定接觸了所述抑制劑的受體激酶活性，取得第2測定結(jié)果；及根據(jù)第1和第2測定結(jié)果推斷抑制劑對細(xì)胞的影響。
本發(fā)明提供的另一種推斷受體激酶配體對細(xì)胞影響的方法，其中包括以下步驟用權(quán)利要求1所述方法測定受體激酶活性，取得第1測定結(jié)果；用權(quán)利要求1所述方法測定接觸了所述配體的受體激酶活性，取得第2測定結(jié)果；及根據(jù)第1和第2測定結(jié)果推斷配體對細(xì)胞的影響。
本發(fā)明同時提供一種測定存在于從生物采集的細(xì)胞細(xì)胞膜上的受體激酶活性的試劑盒，其包括對應(yīng)于所述激酶的基質(zhì)；含可被所述激酶活性攝入所述基質(zhì)的磷酸基的磷酸基供體；可結(jié)合到導(dǎo)入了磷酸基的所述基質(zhì)的標(biāo)記物。
所述的試劑盒中含有pH為4.0～9.0、用于破碎所述細(xì)胞的緩沖液以及可溶解細(xì)胞膜的表面活性劑。其中所述磷酸基供體為ATP或ADP。其中所述標(biāo)記物為熒光物質(zhì)或酶。


圖1顯示了實(shí)施例1的免疫印跡(Western bloting)的結(jié)果。
圖2顯示了實(shí)施例2的免疫印跡(Western bloting)的結(jié)果。
圖3顯示了實(shí)施例3的免疫印跡(Western bloting)的結(jié)果。
圖4顯示了實(shí)施例4的免疫印跡(Western bloting)的結(jié)果。
圖5顯示了實(shí)施例5的免疫印跡(Western bloting)的結(jié)果。
圖6顯示了實(shí)施例6的免疫印跡(Western bloting)的結(jié)果。
圖7為實(shí)施例7的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)的結(jié)果顯示圖。
圖8為實(shí)施例8的免疫印跡(Western bloting)的結(jié)果顯示圖。
圖9為實(shí)施例9的免疫印跡(Western bloting)的結(jié)果顯示圖。
圖10為實(shí)施例10的免疫印跡(Western bloting)的結(jié)果顯示圖。
圖11為實(shí)施例11的免疫印跡(Western bloting)的結(jié)果顯示圖。
具體實(shí)施例方式本實(shí)施方式的方法是通過檢測被從細(xì)胞膜回收的受體激酶的酶活性磷酸化的基質(zhì)來測定受體激酶活性的，具體而言，是測定存在于細(xì)胞膜上的受體激酶的活性，其包括以下步驟從所述細(xì)胞分離出細(xì)胞質(zhì)，制備含有受體激酶的試樣；讓所述試樣中的受體激酶與基質(zhì)接觸，用受體激酶的活性使基質(zhì)磷酸化；讓可檢測的標(biāo)記物結(jié)合到所述磷酸化基質(zhì)；以及根據(jù)結(jié)合到所述磷酸化基質(zhì)的標(biāo)記物的檢測結(jié)果，測定受體激酶的活性。
用此方法可以檢出被受體激酶的酶活性磷酸化的基質(zhì)，可根據(jù)檢測結(jié)果正確測定受體激酶的活性。
對于待測激酶沒有特別限定，只要是受體激酶即可。具體而言，比如可以是酪氨酸激酶、絲氨酸/蘇氨酸激酶等。作為酪氨酸激酶有是受體酪氨酸激酶的胰島素受體(insulin receptor；IR)和胰島素樣生長因子受體(insulin-like growth factor receptor；IGFR)、血小板衍生生長因子受體(platelet-derived growth factor receptor；PDGF)、成纖維細(xì)胞生長因子受體(fibroblast growth factor；FGFR)、人表皮細(xì)胞生長因子受體(humanepithelial growth factor receptor；HER)、血管內(nèi)皮生長因子受體(vascularendothelial growth factor；VEGFR)等生長因子受體。HER家族包括HER1、HER2、HER3和HER4。
待測受體激酶從細(xì)胞回收。細(xì)胞既可以是包含在從生物體采集的生物試樣中的細(xì)胞，也可以是將從生物體采集的細(xì)胞加以培養(yǎng)的培養(yǎng)細(xì)胞。受體激酶的回收方法沒有特別限定，只要是從細(xì)胞分離細(xì)胞質(zhì)制備含受體激酶的試樣的方法就可以。比如，可以用以下方法回收受體激酶。首先，在適當(dāng)?shù)木彌_液(以下稱均質(zhì)化試劑)中破碎細(xì)胞的細(xì)胞膜。離心破碎所得溶液，分離出上清和沉淀物后，棄上清。此上清中包含細(xì)胞質(zhì)源性蛋白質(zhì)等。沉淀物中有定位受體激酶的細(xì)胞膜碎片。將此沉淀物與含表面活性劑的溶液(以后稱增溶劑)混合，離心所得混合液，分離出上清和沉淀物。上清中的細(xì)胞膜含被表面活性劑膠束化的受體激酶。沉淀物中含不溶性蛋白質(zhì)和DNA等。然后，以此上清為含受體激酶的試樣。如此制備的試樣中，在受體激酶跨細(xì)胞膜碎片存在的狀態(tài)下，該細(xì)胞膜被表面活性劑膠束化。
已知，受體激酶中有的可通過配體結(jié)合形成同源二聚物或異源二聚物(heterodimerize)。用所述方法制備的試樣中含有受體激酶并保持立體結(jié)構(gòu)的狀態(tài)，其立體結(jié)構(gòu)甚至可形成這兩種二聚物。因此，使用用所述方法制備的試樣，可以更正確地測定受體激酶的活性。以HER1為例，通過作為配體的EGF結(jié)合進(jìn)來，2分子的HER1會結(jié)合形成二聚物，所述試樣中就會含有維持立體結(jié)構(gòu)狀態(tài)的二聚物。
均質(zhì)化試劑是為防止破碎細(xì)胞時受體激酶變性而使用。均質(zhì)化試劑的pH值以能夠在穩(wěn)定的狀態(tài)下回收、不引起受體激酶變性或失活為原則，無特別限定。均質(zhì)化試劑的pH值可為4.0～9.0，優(yōu)選4.5～8.5，最好為5.0～8.0。均質(zhì)化試劑最好含緩沖劑。作為緩沖劑，例如有磷酸緩沖劑、醋酸緩沖劑、檸檬酸緩沖劑、MOPS(3-(N-嗎啉)丙基磺酸)、HEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸)、Tris(三羥甲基氨基甲烷)或三(羥甲基)甲基甘氨酸等。增溶劑也最好包含所述那種緩沖劑，并與均質(zhì)化試劑有同樣的pH值。
均質(zhì)化試劑和/或增溶劑里也可添加蛋白酶抑制劑、脫磷酸化酶抑制劑、防止SH基氧化的試劑(以后稱SH基安定劑)等。
對于破碎細(xì)胞膜的方法無特別限定，只要能將細(xì)胞膜斷成碎片即可。比如可以用吸移管吸移排出、用渦動攪拌器攪拌、用混合器破碎、用杵加壓、用超聲波處理裝置超聲波處理等方法。
增溶劑中所含表面活性劑可用于溶解(膠束化)破碎的細(xì)胞膜。但是最好用不分解或不改變細(xì)胞膜所含受體激酶的性質(zhì)的表面活性劑。帶電的表面活性劑有可能結(jié)合到受體激酶，使立體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。因此，作為表面活性劑最好使用實(shí)際上不與受體激酶結(jié)合的非離子型表面活性劑。作為非離子型表面活性劑，比如可以舉出以十二(烷)醚、十六(烷)醚、十八(烷)醚和p-t-辛基苯醚等為基本結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。具體而言，作為這種非離子表面活性劑有乙基苯基聚乙二醇(NP-40、殼牌國際石油公司注冊商標(biāo))、曲拉通X(Union Carbide Chemicals and Plastics Company Inc公司注冊商標(biāo))、吐溫型乳化劑(ICI美國分公司注冊商標(biāo))、聚氧乙烯脂肪醇醚(ICI美國分公司注冊商標(biāo))和Emulgen(花王公司注冊商標(biāo))等。作為增溶劑中的表面活性劑濃度以0.05～5％為宜，0.1～3％更好，最好為0.1～1％。
蛋白酶抑制劑可以用于防止受體激酶被細(xì)胞中所含蛋白酶分解。作為蛋白酶抑制劑比如有諸如EDTA和EGTA那樣的金屬蛋白酶抑制劑、PMSF、胰朊酶抑制劑、胰凝乳朊酶等絲氨酸蛋白酶抑制劑、碘代乙酰胺和E-64等半胱氨酸蛋白酶抑制劑等。這些蛋白酶抑制劑可單獨(dú)使用也可混合使用。也可以使用蛋白酶抑制劑混合液(希格瑪(SIGMA)公司)那種事先將多種蛋白酶抑制劑混合在一起的市場銷售品。
脫磷酸化酶抑制劑可以用于防止受體激酶的酶活性因細(xì)胞內(nèi)所含脫磷酸化酶而下降。脫磷酸化酶抑制劑有酪氨酸脫磷酸化酶抑制劑、絲氨酸/蘇氨酸脫磷酸化酶抑制劑等。酪氨酸脫磷酸化酶抑制劑比如有正釩酸鈉(Na3VO4)等。作為絲氨酸/蘇氨酸脫磷酸化酶抑制劑，比如有氟化納(NaF)等。這些脫磷酸化酶抑制劑既可單獨(dú)使用也可混合使用。
SH基穩(wěn)定劑可用于防止受體激酶失活。酶中的SH基易于被氧化形成穩(wěn)定的二硫化物。二硫化物的形成會引起酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，有時會成為酶失活的原因。SH基的氧化可用含有SH基的試劑加以防止。SH基穩(wěn)定劑比如有二硫蘇糖醇(DTT)、2-巰基乙醇、谷胱甘肽、半胱氨酸、高半胱氨酸、輔酶A和二氫硫辛酸等。比如當(dāng)SH基穩(wěn)定劑為DTT時，均質(zhì)化試劑和/或增溶劑中的SH基穩(wěn)定劑濃度應(yīng)為0.05～2mM，0.07～1.7mM更好，最好為0.1～1.5mM。比如，SH基穩(wěn)定劑為2-巰基乙醇時，均質(zhì)化試劑和/或增溶劑中的SH基穩(wěn)定劑濃度以0.1～15mM為宜，0.3～13mM更好，最好為0.5～12mM。
讓從細(xì)胞中回收的受體激酶與基質(zhì)接觸可以引起酶反應(yīng)。最好將前面所述試樣(含受體激酶的試樣)與對應(yīng)于待測受體激酶的基質(zhì)和磷酸基供體混合，讓它們接觸，這樣就可通過激酶活性引起酶反應(yīng)。
用于酶反應(yīng)的基質(zhì)只要能被待測受體激酶磷酸化即可，無特別限定，可根據(jù)待測受體激酶適當(dāng)選擇。比如，當(dāng)測定對象是HER1時，基質(zhì)可以用Grb2、堿性髓鞘蛋白(MBP)、組蛋白H2B(HH2B)、磷脂酶C-γ等。也可使用對特定的受體激酶特異性高的基質(zhì)，比如，測定對象是HER1時，作為對HER1特異性高的基質(zhì)可以使用GST EGFR-基質(zhì)(Stratagene公司)等市場銷售品。GST-EGFR基質(zhì)是GST和人工合成的、能被HER1酶活性磷酸化的基質(zhì)的融合蛋白質(zhì)。在測定中使用這種基質(zhì)可以從數(shù)種受體激酶中特別檢測出HER1的活性。
另一方面，當(dāng)測定對象為數(shù)種受體激酶時，既可將待測受體激酶的基質(zhì)組合起來使用，也可使用能被所有受體激酶磷酸化的基質(zhì)。作為能被數(shù)種受體激酶磷酸化的基質(zhì)，眾所周知有人工合成為能被數(shù)種受體激酶活性磷酸化的合成肽。比如作為能被數(shù)種受體酪氨酸激酶磷酸化的基質(zhì)，在佐佐木等人的文獻(xiàn)(Norio Sasaki et al，1985，The Journal ofBiological Chemistry，Vol.260，No.17，9793～9804)、布勞恩等人的文獻(xiàn)(Sergei Braun et al，1984，The Journal of Biological Chemistry，Vol.259，No.4，2051～2054)、Abdel-Ghany等人的文獻(xiàn)(M.Abdel-Ghany et al，1990，Proceeding of The National Academy of Science，Vol.87，7061～7065)等列舉了作為酪氨酸激酶的基質(zhì)使用的合成肽。這些文獻(xiàn)上公開的合成肽由包含谷氨酸(以下簡稱為Glu)和酪氨酸殘基(以下簡稱Tyr)的氨基酸序列組成，Tyr為人工合成能被數(shù)種酪氨酸激酶磷酸化的合成肽。所述氨基酸序列具體而言可以舉出以下氨基酸排列方式。
由4個Glu和1個Tyr組成的序列反復(fù)2次的氨基酸序列(以下稱氨基酸序列A)由1個Glu和1個Tyr組成的序列反復(fù)2次的氨基酸序列(以下稱氨基酸序列B)由6個Glu、1個Tyr和3個丙氨酸殘基(以下簡稱Ala)組成的序列反復(fù)2次以上的氨基酸序列(以下稱氨基酸序列C)由1個Glu、1個Tyr和1個Ala組成的序列反復(fù)2次以上的氨基酸序列(以下稱氨基酸序列D)以及由2個Glu、1個Tyr、6個Ala和5個賴氨酸殘基(以下簡稱Lys)組成的序列反復(fù)2次以上的氨基酸序列(以下稱氨基酸序列E)。
另外，在亨特等人的文獻(xiàn)(Tony Hunter，1982，The Journal of BiologicalChemistry，Vol.257，No.9，4843～4848)中有報告說，在酪氨酸激酶引起酪氨酸殘基磷酸化的過程中，酸性氨基酸殘基發(fā)揮著重要作用。據(jù)此，特別是含有大量酸性的氨基酸Glu的氨基酸序列a和氨基酸序列c比較理想。通過在測定中使用這種氨基酸序列組成的肽作為基質(zhì)，可以測定受體激酶的總活性值。
在酶反應(yīng)中，因自身磷酸化而激活的受體激酶的酶活性使磷酸基供體的磷酸基攝入基質(zhì)。比如當(dāng)測定對象是酪氨酸激酶時，基質(zhì)中的酪氨酸殘基被磷酸化。
磷酸基供體可以例舉出三磷酸腺苷(ATP)、ATP-γS、32P標(biāo)記的γ-〔32P〕-ATP、二磷酸腺苷(ADP)、單磷酸腺苷(AMP)等。
酶反應(yīng)所用基質(zhì)最好有親和標(biāo)簽?？梢允褂糜H和標(biāo)簽和具有能與親和標(biāo)簽結(jié)合的結(jié)合物的固相(以后稱固相)回收基質(zhì)。具體來說，通過回收具有親和標(biāo)簽的基質(zhì)與固相結(jié)合生成的復(fù)合體，再離解回收的復(fù)合體中的親和標(biāo)簽和結(jié)合物質(zhì)的結(jié)合，就可最終回收基質(zhì)。
親和標(biāo)簽只要可以與結(jié)合物質(zhì)結(jié)合，并不妨礙基質(zhì)與受體激酶的結(jié)合和基質(zhì)的磷酸化即可，無特別限定。比如可以使用多肽、半抗原等。作為親和標(biāo)簽具體而言，可以使用谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶(以后稱GST)、組氨酸、麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)、FLAG肽(希格瑪公司)、Myc標(biāo)記、HA標(biāo)記、Strep標(biāo)記(IBA GmbH公司)生物素、親和素和鏈親和素(streptoavidin)等。
作為有親和標(biāo)簽的基質(zhì)比如可以使用基質(zhì)與親和標(biāo)簽的融合蛋白質(zhì)。作為融合蛋白質(zhì)也可使用使親和標(biāo)簽與基質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)，還可將具有表達(dá)基質(zhì)與親和標(biāo)簽的融合蛋白質(zhì)的重組基因?qū)胨拗鳌⑹褂迷撍拗餮苌娜诤系鞍踪|(zhì)。當(dāng)測定對象是HER1時，所述GST-EGFR基質(zhì)適用。
結(jié)合物只要能與親和標(biāo)簽結(jié)合并可離解結(jié)合即可，無特別限定。作為結(jié)合物質(zhì)比如可以舉出谷胱甘肽、鎳、直鏈淀粉、FLAG抗體(希格瑪公司)、Myc抗體、紅血球凝聚素(HA)抗體和Strep-Tactin(IBA GmbH公司)等。
對于固相沒有特別限定，只要是能與結(jié)合物結(jié)合的載體即可。作為固相的材質(zhì)比如有多糖類、塑料、玻璃等。作為固相的形狀諸如微珠、凝膠等。固相的具體例子有瓊脂糖凝膠(Sepharose)微珠、瓊脂糖(agarose)微珠、磁性微珠、玻璃微珠、硅凝膠等。也可將所述微珠和凝膠裝入柱內(nèi)使用。
如上所述，當(dāng)基質(zhì)為GST-EGFR基質(zhì)時，固相可以用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠微珠(以后稱谷胱甘肽微珠)。此時，用受體激酶的酶活性讓磷酸化的GST-EGFR基質(zhì)和谷胱甘肽微珠結(jié)合?；厥张cGST-EGFR基質(zhì)結(jié)合的谷胱甘肽微珠，在回收的谷胱甘肽微珠中添加還原型谷胱甘肽，即可離解GST與谷胱甘肽微珠的結(jié)合。這樣即可回收磷酸化的GST-EGFR基質(zhì)。
回收磷酸化的GST-EGFR基質(zhì)時，可先讓GST-EGFR基質(zhì)和谷胱甘肽微珠結(jié)合再用來進(jìn)行酶反應(yīng)，也可酶反應(yīng)后再讓GST-EGFR基質(zhì)和谷胱甘肽微珠結(jié)合。
作為所述以外的親和標(biāo)簽與固相的組合，可以舉出如下例子當(dāng)選擇組氨酸作為親和標(biāo)簽時，固相可用鎳瓊脂糖微粒。組氨酸與鎳的結(jié)合比如可以用甘氨酸-鹽酸鹽(Glycine-HCl)等酸和咪唑離解。
若選擇麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)作為親和標(biāo)簽，則固相可用直鏈淀粉磁性微珠。麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)與直鏈淀粉的結(jié)合比如可以通過添加游離的直鏈淀粉來離解。
若選擇FLAG肽作為親和標(biāo)簽，則固相可用希格瑪公司的FLAG親和凝膠。FLAG肽與FLAG親和凝膠的結(jié)合比如可以用甘氨酸-鹽酸鹽(Glycine-HCl)等酸和3XFLAG肽(希格瑪公司)來離解。
當(dāng)選擇Myc標(biāo)簽作為親和標(biāo)簽時，固相可用結(jié)合了Myc抗體的瓊脂糖微粒。若選擇HA標(biāo)簽作為親和標(biāo)簽，則固相可用結(jié)合了HA抗體的瓊脂糖微粒。通過加入酸和堿使蛋白質(zhì)變性，可以離解Myc標(biāo)簽和Myc抗體的結(jié)合、HA標(biāo)簽和HA抗體的結(jié)合。此時，最好選擇可以使變性蛋白質(zhì)還原的酸或堿。具體而言，酸可選鹽酸等，堿可選苛性鈉等。
若選擇Strep標(biāo)簽作為親和標(biāo)簽，固相可用IBA GmbH公司的Strep-Tactin固相化凝膠柱。Strep標(biāo)簽和Strep-Tactin的結(jié)合可用可逆性與鏈親和素反應(yīng)的脫硫生物素(desthiobiotin)離解。
也可以在催化試樣中的受體酪氨酸激酶和基質(zhì)發(fā)生酶反應(yīng)后、回收基質(zhì)前用加熱處理、冷卻處理或激酶抑制劑等終止酶反應(yīng)。在基質(zhì)回收工序中，有時會出現(xiàn)酶反應(yīng)過度的情況，這有可能造成每個試樣測定結(jié)果參差不一。然而，回收基質(zhì)前終止酶反應(yīng)則可以避免這個問題。比如，作為HER1的抑制劑可以用PD168393、PD153035(均為Calbiochem公司產(chǎn)品)等。
檢測磷酸化基質(zhì)要使用標(biāo)記物。作為標(biāo)記物比如有熒光物質(zhì)、酶和放射性同位素等，但不僅限于此。作為熒光物質(zhì)比如有熒光素、香豆素、四溴熒光素、二氮雜菲、芘、若丹明等。作為酶比如有堿性磷酸酶、過氧化物酶等。作為放射性同位素比如有32P、33P、131I、125I、3H、14C、35S等。
為了檢測磷酸化基質(zhì)，要讓標(biāo)記物結(jié)合到磷酸化基質(zhì)。比如，通過使用具有標(biāo)記物且能特異性地與磷酸化基質(zhì)結(jié)合的抗體即可讓標(biāo)記物結(jié)合到磷酸化基質(zhì)。
或者通過使用能特異性結(jié)合到磷酸化基質(zhì)的抗體(以后稱磷酸化基質(zhì)識別抗體)和能與磷酸化基質(zhì)識別抗體結(jié)合且具有標(biāo)記物的抗體(以下將能結(jié)合磷酸化基質(zhì)識別抗體的抗體稱為二次抗體)，可讓標(biāo)記物結(jié)合到磷酸化基質(zhì)。此時，通過磷酸化基質(zhì)識別抗體和二次抗體即可實(shí)際上讓標(biāo)記物結(jié)合到磷酸化基質(zhì)。
或者通過使用磷酸化基質(zhì)識別抗體、具有生物素的二次抗體和具有標(biāo)記物的抗生朊也可以使標(biāo)記物結(jié)合到磷酸化基質(zhì)。此時，通過磷酸化基質(zhì)識別抗體、二次抗體、生物素和抗生朊可以實(shí)際上將標(biāo)記物與磷酸化基質(zhì)結(jié)合起來。另，也可以是二次抗體有抗生朊，生物素有標(biāo)記物。
或許也可使用具有生物素的磷酸化基質(zhì)識別抗體和具有標(biāo)記物的抗生朊。還可使用含有抗生朊的磷酸化基質(zhì)識別抗體和含有標(biāo)記物的生物素。
通過檢測標(biāo)記物即可檢出磷酸化基質(zhì)，從而能夠最終測定受體激酶的活性。
所述磷酸化基質(zhì)識別抗體和二次抗體，可以使用讓動物接觸抗原促其免疫再精制該動物血液而得到的抗體、通過基因重組而得的抗體、多克隆抗體和單克隆抗體等。也可以將這些抗體的至少2種混合起來使用。在這里所說的抗體也包括抗體的碎片及其衍生物。作為抗體的具體例子有Fab碎片、F(ab’)碎片、F(ab)2碎片和sFv碎片等(Blazar et al.，1997，Journal of Immunology，1595821-5833及Bird et al.，1988，Science，242423-426)，抗體的類別可以使用IgG、IgM等，但并不局限于此。
檢測磷酸化基質(zhì)的方法可根據(jù)標(biāo)記物的種類適當(dāng)選擇。當(dāng)標(biāo)記物是熒光物質(zhì)時，可通過免疫印跡法檢測基質(zhì)的磷酸化。用膜分離磷酸化基質(zhì)，添加磷酸化基質(zhì)識別抗體讓其與磷酸化基質(zhì)結(jié)合，再讓有熒光物質(zhì)的二次抗體與磷酸化基質(zhì)識別抗體結(jié)合，即可檢測該熒光。如果已用所述親和標(biāo)簽預(yù)先分離了磷酸化基質(zhì)，則也可用Slot印跡法(Slotblot)取代免疫印跡法檢測基質(zhì)的磷酸化。作為標(biāo)記物還可用酶取代熒光物質(zhì)。此時，加入基質(zhì)讓二次抗體所含的酶發(fā)生顯色反應(yīng)，再檢測該顯色即可。
另外，將含有磷酸化基質(zhì)的溶液裝入試管，添加含有熒光物質(zhì)的磷酸化基質(zhì)識別抗體，與磷酸化基質(zhì)結(jié)合，測定熒光強(qiáng)度，也可以檢測基質(zhì)的磷酸化。
當(dāng)標(biāo)記物為酶時，可用固相酶聯(lián)免疫吸附劑測定法(以后稱ELISA法)檢測基質(zhì)的磷酸化。ELISA法包括直接吸附法和夾心法。
直接吸附法將磷酸化基質(zhì)吸附于固相的表面，添加含有酶的磷酸化基質(zhì)識別抗體，讓其與磷酸化基質(zhì)結(jié)合。然后添加基質(zhì)，讓含有磷酸化基質(zhì)識別抗體的酶發(fā)生顯色反應(yīng)，檢測該顯色即可。
根據(jù)夾心法，則讓磷酸化基質(zhì)識別抗體結(jié)合于固相(以后稱固相抗體)，加入磷酸化基質(zhì)與固相抗體結(jié)合。然后添加含有酶的磷酸化基質(zhì)識別抗體(以后稱標(biāo)記抗體)，使其與磷酸化基質(zhì)結(jié)合。再加入基質(zhì)使含有標(biāo)記抗體的酶發(fā)生顯色反應(yīng)，檢測該顯色即可。
比如如果酶是堿性磷酸酶，則可以使用氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)和5-溴-4-氯3-吲哚基磷酸(BCIP)的混合液作為基質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)，使其發(fā)生顯色反應(yīng)。當(dāng)酶為過氧化物酶時，可以用鹽酸聯(lián)苯胺(DAB)作為基質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)，產(chǎn)生顯色反應(yīng)。
使用夾心法時，固相抗體和標(biāo)記抗體最好處于磷酸化基質(zhì)不同的部位結(jié)合。即，最好磷酸化基質(zhì)有多個抗體結(jié)合位或使用的2種抗體能識別磷酸化基質(zhì)不同的抗原決定基。
當(dāng)標(biāo)記物為放射性同位素時，可以用放射免疫分析法(以后稱RIA)檢測基質(zhì)的磷酸化。具體而言，可以讓含有放射性同位素的磷酸化基質(zhì)識別抗體與磷酸化基質(zhì)結(jié)合，用閃爍計數(shù)器等測定，檢測基質(zhì)的磷酸化。
根據(jù)本實(shí)施方式的激酶活性測定法測得的結(jié)果，推斷有無細(xì)胞的癌變。已知過去有一種方法是通過測定蛋白質(zhì)有關(guān)細(xì)胞癌變的表達(dá)量來判斷有無癌細(xì)胞。但是，往往這些蛋白質(zhì)活性高或低時才引起癌變，很難僅憑表達(dá)量的多少來判斷癌變。因此，用本實(shí)施方式的激酶活性測定法獲取的激酶活性測定結(jié)果與單單測定激酶表達(dá)量時不同，可成為推斷細(xì)胞有無癌變的依據(jù)?；蛘咭部梢约っ副磉_(dá)量和激酶活性都測定。
還可以根據(jù)本實(shí)施方式的激酶活性測定法測得的結(jié)果，推斷細(xì)胞癌變的原因。比如，用本實(shí)施方式的激酶活性測定法測定細(xì)胞膜上的受體酪氨酸激酶的總活性值，從此總活性值可以推斷受體酪氨酸激酶是否為細(xì)胞癌變的原因。具體而言，在本實(shí)施方式的激酶活性測定法中，用可以被數(shù)種受體酪氨酸激酶磷酸化的基質(zhì)，測定癌細(xì)胞的細(xì)胞膜上的受體酪氨酸激酶總活性值，比較這些總活性值和與之對應(yīng)的閾值，如果總活性值高于閾值則可以推斷受體酪氨酸激酶是癌變的原因，如果低于閾值則可以推斷受體酪氨酸激酶不是癌變的原因。關(guān)于閾值的設(shè)定，比如，分別從受體酪氨酸激酶是癌變原因的癌癥患者群和受體酪氨酸激酶非癌變原因的癌癥患者群采集腫瘤細(xì)胞，測定各腫瘤細(xì)胞的受體酪氨酸激酶總活性值，對比各患者群的總活性值，即可將能高效地區(qū)分受體酪氨酸激酶是癌變原因的癌癥患者群和受體酪氨酸激酶非癌變原因的癌癥患者群的總活性值作為閾值。
根據(jù)本實(shí)施方式的測定抑制受體激酶活性的抑制劑(以后稱激酶抑制劑)的影響的方法所得結(jié)果，還可以取得能推斷激酶抑制劑的抑制功能的信息。作為激酶抑制劑，比如有通過抑制激酶活性顯示藥效的抗癌劑。這種抗癌劑比如有易瑞沙(阿斯利康公司)和赫賽汀(Genentech公司)。易瑞沙是HER1的抑制劑，赫賽汀是HER2的抑制劑。
要推斷激酶抑制劑的抑制功能可以列舉出以下方法首先，測定從生物身體上采集的細(xì)胞的激酶活性值，然后讓細(xì)胞與抑制劑接觸，測定接觸后的細(xì)胞激酶活性值。活性值因標(biāo)記物和檢測方法的不同而各異。比如，當(dāng)使用熒光物質(zhì)作為標(biāo)記物時，活性值可以通過測定熒光強(qiáng)度而求得。比較接觸激酶抑制劑前的細(xì)胞激酶活性值和接觸激酶抑制劑后的細(xì)胞激酶活性值，如果判斷活性值非偶然下降，則推斷由于與抑制劑接觸，激酶活性受到抑制。如果未得出活性值非偶然下降的結(jié)論，則推斷激酶活性沒有受到與抑制劑接觸的影響。
根據(jù)用本實(shí)施方式的方法推斷激活受體激酶的配體的影響所得結(jié)果，還可以取得能推斷存在與配體對應(yīng)的受體激酶的信息。作為配體可以使用眾所周知的受體激酶的配體。比如，表皮生長因子(EGF)、Heregulin、胰島素樣生長因子(IGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和血小板衍生生長因子(PDGF)等。EGF和Heregulin與HER結(jié)合，IGF與IGFR結(jié)合，F(xiàn)GF與FGFR結(jié)合，VEGF與VEGFR結(jié)合，PDGF與PDGFR結(jié)合。當(dāng)配體與受體激酶結(jié)合時，誘發(fā)受體激酶的二聚物化，一旦受體激酶的二聚物形成，存在于受體激酶膜內(nèi)區(qū)的酪氨酸激酶部位被激活。
要推斷受體激酶相對于配體的存在，可以舉出如下方法首先，測定從生物采集的細(xì)胞的激酶活性值，然后讓該細(xì)胞與配體接觸，測定接觸后的細(xì)胞的激酶活性值?；钚灾狄驑?biāo)記物和檢測方法的不同而異。比如，當(dāng)用熒光物質(zhì)作為標(biāo)記物時，活性值可以通過測定熒光強(qiáng)度而求得。比較接觸配體前的細(xì)胞激酶活性值和接觸配體后的細(xì)胞激酶活性值，如果判斷活性值非偶然上升，則推斷細(xì)胞中存在與配體對應(yīng)的受體激酶，此受體激酶由于與配體接觸而被激活。
可以以用于測定受體激酶活性的試劑作為試劑盒。此試劑盒包括與受體激酶相配的基質(zhì)、含有可以被受體激酶活性導(dǎo)入基質(zhì)的磷酸基的磷酸基供體以及能與導(dǎo)入了磷酸基的基質(zhì)結(jié)合的標(biāo)記物。
所述成份既可以裝入同一個容器中，也可以至少將一種成份裝入不同的容器。最好將含有基質(zhì)和磷酸基供體的試劑裝入第一容器，將含有標(biāo)記物的試劑裝入第二容器。如果標(biāo)記物由能與基質(zhì)結(jié)合的一次抗體和能與一次抗體結(jié)合、含有標(biāo)記物的二次抗體組成的話，最好一次抗體和二次抗體分別裝入不同的容器。所述試劑中也可含有緩沖液以調(diào)整pH值。緩沖液可以使用前面所述的溶液。
試劑盒也還含有均質(zhì)化試劑和/或增溶劑。
以下根據(jù)實(shí)施例，更具體地說明本發(fā)明的受體激酶的活性測定法。本發(fā)明不僅限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1通過活化HER1檢測基質(zhì)的磷酸化1.反應(yīng)用試樣的制備方法將來自乳腺癌的培養(yǎng)細(xì)胞(MDA-MB468)在225cm2燒瓶中培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)到80％匯合(confluent)狀態(tài)(約107個)。將此培養(yǎng)細(xì)胞與1ml細(xì)胞處理液(包含20mM HEPES pH7.4、20mM MnCl2、1mM DTT、0.2％蛋白酶抑制劑(以下稱PI)、10％甘油、100μM Na3VO4及50mM NaF)混合。然后，向通過用杵攪拌而得的混合液加壓，破壞混合液中的細(xì)胞膜，制備細(xì)胞溶液。PI用的是用于哺乳動物組織的蛋白酶抑制劑混合物(希格瑪公司制)。離心分離所得細(xì)胞溶液，棄上清液?；旌铣恋砦锖图?xì)胞膜增溶劑(含20mM HEPES pH7.4、20mM MnCl2、1mM DTT、1％NP-40、0.2％PI、10％甘油、100μM Na3VO4及50mM NaF)，通過對用杵攪拌而得的混合液加壓，溶解、離心分離細(xì)胞膜，回收上清。以此上清為反應(yīng)用試樣用于以下反應(yīng)。
2.酶反應(yīng)和反應(yīng)基質(zhì)的洗提i)樣品-1和樣品-2的制備將用所述方法取得的反應(yīng)用試樣25μl與25μl基質(zhì)溶液1(含20mMHEPES pH7.4、10mM MnCl2、1mM DTT、0.1％NP-40、0.2％PI、10％甘油、100μM Na3VO4、50mM NaF、200μM ATP及5μg基質(zhì))混合，以25℃培養(yǎng)30分鐘，以此作為樣品-1。
將反應(yīng)用試樣25μl與25μl基質(zhì)溶液2(含20mM HEPES pH7.4、10mM MnCl2、1mM DTT、0.1％NP-40、0.2％PI、10％甘油、100μMNa3VO4及5μg基質(zhì))混合，以25℃培養(yǎng)30分鐘，以此作為樣品-2?；|(zhì)使用的是結(jié)合到粒徑45～165μm瓊脂糖凝膠4B微球(Amersham公司)上的GST EGFR-基質(zhì)(Stratagene公司)。
ii)樣品-3和樣品-4的制備分別將樣品-1或樣品-2與50μl反應(yīng)終止液(含20mM HEPES pH7.4、10mM MnCl2、1mM DTT、0.1％NP-40、0.2％PI、10％甘油、100μMNa3VO4及10μM PD168393(EGFR抑制劑、Calbiochem公司))混合，離心分離。將從樣品-1得到的混合液上清作為樣品-3，將從樣品-2得到的混合液上清作為樣品-4。
iii)樣品-5和樣品-6的制備棄上清后，分別將樣品-3的沉淀物或樣品-4的沉淀物與200μl第1洗滌劑(含20mM HEPES pH7.4、10mM MnCl2、1mM DTT、0.1％NP-40、0.2％PI、10％甘油、100μM Na3VO4及100nM PD168393)混合，并離心分離。棄上清后，分別將樣品-3的沉淀物或樣品-4的沉淀物與200μl第2洗滌劑(含25mM Tris pH7.4、0.2％PI、100μM Na3VO4及150mM NaCl)混合，并離心分離。棄上清后，分別將樣品-3的沉淀物或樣品-4的沉淀物與190μl洗提液(含50mM Tris pH8.0、10mM還原型谷胱甘肽、100μM Na3VO4及0.2％PI)混合。將樣品-3的沉淀物和洗提液的混合液作為樣品-5，將樣品-4的沉淀物和洗提液的混合液作為樣品-6。
iv)樣品-7和樣品-8的制備離心分離樣品-5和樣品-6，取樣品-5的上清為樣品-7，取樣品-6的上清為樣品-8。
v)樣品-9和樣品-10的制備以在iv中得到的樣品-5的沉淀物為樣品-9，樣品-6的沉淀物為樣品-10。
3.用免疫印跡法檢測磷酸化基質(zhì)在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中進(jìn)行樣品-1～10所含蛋白質(zhì)的分離。分別在樣品-1和樣品-2中各加入12.5μl、在樣品-3～6、樣品-9和10中各加入10μl、在樣品-7和8中各加入5μl SDS樣品緩沖液pH6.8(含200mM Tris、40％甘油、8％SDS及10％2-巰基乙醇)，在100℃沸水浴中加熱5分鐘。將各樣品加到聚丙烯酰胺凝膠(PAG小“第一”4/20(13W)(第一化學(xué)藥品株式會社產(chǎn)品))的各樣品槽，用電泳儀(盒式電泳槽“第一”DPE-1020(小雙聯(lián)式)(第一化學(xué)藥品株式會社))以25mA電流進(jìn)行電泳70分鐘。將電泳分離出的蛋白質(zhì)用小型電轉(zhuǎn)槽(伯樂(BioRad)公司)加以100V電壓1小時，從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)錄到聚偏氟乙烯(PVDF)薄膜(Immobilon-FL 0.45μm孔徑尺寸(日本Millipore公司))。
用4％封閉液(大日本住友制藥株式會社)封閉此PVDF薄膜60分鐘。將封閉后的PVDF膜在2ml一次抗體溶液(含0.4％封閉液和0.5μg/ml抗磷酸化酪氨酸單克隆抗體4G10(Upstate公司))中振蕩60分種后，用TBS-T(含25mM Tris、150mM NaCl及0.1％Tween-20)沖洗3次。然后，將該P(yáng)VDF膜在2ml二次抗體溶液(含0.4％封閉液和2.7μg/ml FITC標(biāo)記兔抗鼠免疫球蛋白(DAKO公司))中振蕩60分種后，用TBS-T沖洗3次。晾干該P(yáng)VDF膜，用圖像分析裝置(Pharos FX system(伯樂公司))分析圖譜，檢測熒光。
4.結(jié)果圖1為顯示免疫印跡檢測結(jié)果的熒光照片。在樣品1～10的各照片中，奇數(shù)序號的樣品使用了不含ATP的反應(yīng)液。偶數(shù)序號的樣品使用了含ATP的反應(yīng)液。
樣品-1、3、5和7中之所以看不見條帶是因為反應(yīng)液中不含ATP，基質(zhì)沒有磷酸化。樣品-1、樣品-3中的磷酸化是由內(nèi)在的ATP提供的磷酸基導(dǎo)致的。
p-HER1范圍內(nèi)所看見的條帶是自身磷酸化的HER 1。p-GST-基質(zhì)范圍內(nèi)所見條帶是靠HER 1活性而磷酸化的基質(zhì)(EGFR-基質(zhì))。樣品-2、樣品-4泳道略靠中間處所見條帶被認(rèn)為是具有磷酸化酪氨酸的某種蛋白質(zhì)。
從樣品-2和4的結(jié)果中得知，即使數(shù)種磷酸化基質(zhì)混合在一起，也可以經(jīng)過免疫印跡法分離，檢測出目標(biāo)基質(zhì)的磷酸化。而且，磷酸化基質(zhì)包含在酶反應(yīng)后離心分離的反應(yīng)液的上清里。
樣品-5和6實(shí)際上是除去了結(jié)合到瓊脂糖凝膠微球上的基質(zhì)以外的蛋白質(zhì)、回收了結(jié)合到瓊脂糖凝膠微球上的基質(zhì)。從樣品-6的結(jié)果得知，能夠僅回收結(jié)合到瓊脂糖凝膠微球上的磷酸化基質(zhì)。
樣品-7和8則是洗提出結(jié)合到瓊脂糖凝膠微球上的基質(zhì)，回收基質(zhì)。從樣品-8的結(jié)果可以看出，能夠?qū)⒘姿峄|(zhì)從微球上離解，回收到純磷酸化基質(zhì)。
樣品-9和樣品-10為析出蛋白質(zhì)后的瓊脂糖凝膠微球，未見顯示含有磷酸化酪氨酸的蛋白質(zhì)的條帶。由此結(jié)果可知，成功離解了基質(zhì)所具有的GST與瓊脂糖凝膠微球的結(jié)合。
從以上所述得知，用本實(shí)施例的測定法能夠檢測基質(zhì)有無因激酶活化而磷酸化。
實(shí)施例2用Slot印跡法檢測磷酸化基質(zhì)用實(shí)施例1中制備的樣品-7和樣品-8檢測，通過Slot印跡法檢測磷酸化酪氨酸。
在底座上有PVDF膜(Immobilon-P(上標(biāo)SQ)轉(zhuǎn)印膜0.2μm孔徑尺寸(Millipore(密理博)公司))的狹縫(slot)印跡器(BIO-DOT SF(伯樂公司))的各個樣品孔里分別加入180μl樣品-7和樣品-8。用真空泵從PVDF膜背后抽吸樣品-7和樣品-8，將各樣品中含有的蛋白吸附于PVDF膜。從狹縫印跡器取下PVDF膜，在和實(shí)施例1一樣的一次抗體溶液2ml中振蕩60分鐘后，用TBS(含25mM Tris及150mM NaCl)沖洗三次。然后將此PVDF膜在和實(shí)施例1一樣的二次抗體溶液2ml中振蕩60分鐘后，用TBS沖洗三次，干燥，用圖像分析裝置分析圖譜，檢測熒光。
圖2是顯示Slot印跡分析結(jié)果的熒光照片。左邊為樣品-7、右邊為樣品-8的印跡分析結(jié)果。從樣品-7未能確認(rèn)顯示磷酸化的信號。這是因為反應(yīng)液中未含ATP，靠HER1的激酶活性攝入基質(zhì)的磷酸基不足，未引起基質(zhì)磷酸化。從樣品-8能夠確認(rèn)顯示磷酸化的信號。這是因為反應(yīng)液中所含ATP的磷酸基靠HER1的激酶活性攝入基質(zhì)，引起磷酸化。
從以上結(jié)果得知，通過Slot印跡法可以檢測基質(zhì)有無因激酶活性而磷酸化。
實(shí)施例3HER1抑制劑對HER1的激酶活性的影響使用與實(shí)施例1同樣的方法得到反應(yīng)用試樣，用該反應(yīng)用試樣調(diào)查HER1抑制劑對HER1的激酶活性的影響。
將所述反應(yīng)用試樣25μ分別放入2個試管。1個試管內(nèi)添加含有作為HER1抑制劑的PD168393(Calbiochem公司)200nM的反應(yīng)液(含20mMPIPES pH7.4、10mM MnCl2、1mM DTT、0.1％NP-40、0.2％PI、10％甘油、100μM Na3VO4、20μM ATP和3μg Grb2)25μl，另一個管內(nèi)添加不含PD168393的反應(yīng)液25μl，在25℃條件下培養(yǎng)30分鐘。以含PD168393的反應(yīng)液為PD+，以不含PD168393的反應(yīng)液為PD-。用此PD+和PD-，以與實(shí)施例1同樣的方法進(jìn)行免疫印跡。
生長因子受體結(jié)合蛋白(Grb2)用以下方法構(gòu)建。用以Grb2mRNA的鹽基序列為基礎(chǔ)設(shè)計的正鏈引物(Forwardprimer)(5’CGCGGATCCCATATGGAAGCCATCGCCAAATATG 3’序列號1)和外引物(5’CCCAAGCTTTTAGACGTTCCGGTTCAC 3’序列號2)、人cDNA和Proof Start(QIAGEN公司)進(jìn)行基因擴(kuò)增(PCR)。對所得擴(kuò)增產(chǎn)物(以下稱Grb2cDNA)和作為質(zhì)粒載體(plasmidvector)的pGEM3Z(普洛麥格(Promega)公司)進(jìn)行限制酶切(Sma)處理。用DNA連接試劑盒(TAKARA公司)將Grb2cDNA插入pGEM3Z構(gòu)建成重組擴(kuò)增質(zhì)粒。將此重組擴(kuò)增質(zhì)粒轉(zhuǎn)化為質(zhì)粒擴(kuò)增用大腸桿菌(DH5-α)，培養(yǎng)此大腸桿菌16小時。溶解培養(yǎng)后的大腸桿菌，回收擴(kuò)增用重組質(zhì)粒。
對回收的重組擴(kuò)增質(zhì)粒和作為質(zhì)粒載體的pET-28a(+)(Novagen公司)進(jìn)行限制酶切(EcoR I、HindIII)處理。從處理過的重組擴(kuò)增質(zhì)粒回收插入的Grb2cDNA，用DNA連接試劑盒(TAKARA公司)將Grb2cDNA插入pET-28a(+)，構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒。將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化為表達(dá)用大腸桿菌(BL21-AI)，培養(yǎng)16個小時。在培養(yǎng)的大腸桿菌中加入1mM IPTG和0.2％阿戊糖(均為培養(yǎng)液中的濃度)，再培養(yǎng)4個小時，誘發(fā)表達(dá)。然后溶解大腸桿菌，用鎳瓊脂糖微球回收Grb2。獲得的Grb2濃度為0.6μg/μl，因此，反應(yīng)液中使用了5μl。
圖3為顯示免疫印跡結(jié)果的熒光照片。左道為PD-、右道為PD+的印跡結(jié)果。
p-HER1內(nèi)可見條帶是自身磷酸化的HER1。PD+的泳道也出現(xiàn)有代表磷酸化的條帶，但這是作為反應(yīng)用試樣制備細(xì)胞以前已經(jīng)發(fā)生的磷酸化作為信號被檢出的緣故。PD-的泳道區(qū)域內(nèi)所見條帶是被HER1激酶活性磷酸化的Grb2。PD+的泳道的p-Grb2范圍內(nèi)未見條帶是因為HER1的激酶活性受到PD168393抑制的緣故。
PD-的泳道略靠中間可見條帶可認(rèn)為是被HER1活性磷酸化的某種蛋白質(zhì)。另一方面，PD+的泳道的同一位置未見條帶可以認(rèn)為是因為HER1的激酶活性受到PD168393抑制的緣故。
從以上結(jié)果可知，用本實(shí)施例的測定法可以推斷HER1抑制劑對HER1的激酶活性的抑制功能。
下面，舉例說明如何制備數(shù)種受體酪氨酸激酶基質(zhì)，用該基質(zhì)應(yīng)用本實(shí)施方式的測定方法。
實(shí)施例4酪氨酸激酶基質(zhì)的制備構(gòu)建由氨基酸序列(序列號3)構(gòu)成的肽(以下稱poly(Glu、Tyr)肽)與GST的融合蛋白質(zhì)，該氨基酸序列是4個谷氨酸殘基和1個酪氨酸殘基組成的序列反復(fù)五次而形成，將該融合蛋白質(zhì)作為可被數(shù)種酪氨酸激酶磷酸化的基質(zhì)使用。以下稱這種融合蛋白質(zhì)為GST-poly(Glu、Tyr)融合蛋白質(zhì)。
GST-poly(Glu、Tyr)融合蛋白質(zhì)用以下方法制作。用編碼poly(Glu、Tyr)肽的氨基酸序列(序列號3)的DNA(序列號4)、以該DNA的鹽基序列為基礎(chǔ)設(shè)計的上游引物(序列號5)和下游引物(序列號6)以及KOD plusDNA polymerase(東洋紡株式會社產(chǎn)品)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對由PCR擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物(以下稱poly(Glu，Tyr)DNA)和GST融合蛋白質(zhì)表達(dá)用的表達(dá)載體pGEX-4T-3(通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生物科技公司產(chǎn)品)進(jìn)行限制酶切(BamH1及EcoR1)處理，將poly(Glu，Tyr)DNA插入pGEX-4T-3，構(gòu)建重組質(zhì)粒。將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入JM109大腸桿菌，在液體培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)中培養(yǎng)此大腸桿菌直至培養(yǎng)液的吸光度(600nm)達(dá)到0.6。在培養(yǎng)后的大腸桿菌中添加1mM IPTG(培養(yǎng)液中濃度)培養(yǎng)4小時，誘導(dǎo)其表達(dá)。然后溶解大腸桿菌，用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B(通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生物科技公司產(chǎn)品)回收GST-poly(Glu，Tyr)融合蛋白質(zhì)。此GST-poly(Glu，Tyr)融合蛋白質(zhì)的氨基酸序列顯示為序列號7。
實(shí)施例5使用受體酪氨酸激酶的膜內(nèi)區(qū)時應(yīng)用免疫印跡技術(shù)檢測融合蛋白質(zhì)的磷酸化。
在這里，使用市場銷售的受體酪氨酸激酶(intracellular domain；ICD)磷酸化實(shí)施例4構(gòu)建的GST-poly(Glu，Tyr)融合蛋白質(zhì)，應(yīng)用免疫印跡技術(shù)檢測被磷酸化的GST-poly(Glu，Tyr)融合蛋白質(zhì)。另外，受體酪氨酸激酶由膜外區(qū)、跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)組成，膜內(nèi)區(qū)存在顯示酪氨酸激酶活性的部位。
1.反應(yīng)用試樣的制備方法將50μl緩沖液1(含20mM HEPES pH7.4、10mM MnCl2、1％NP40、1mM DTT、0.2％蛋白酶抑制劑(以下稱PI)、10％甘油、200μM Na3VO4及50mM NaF)和市場銷售的受體酪氨酸激酶的膜內(nèi)區(qū)ICD 0.5pmol混合，以此為反應(yīng)用試樣用于以下酶反應(yīng)。在本實(shí)施例中，作為ICD使用的是血小板衍生生長因子受體β激酶(以下稱PDGFR-β)、血管內(nèi)皮生長因子受體1激酶(以下稱VEGFR1)、血管內(nèi)皮生長因子受體2激酶(VEGFR2)、表皮生長因子受體1激酶(以下稱HER1)、ErbB2激酶(以下稱HER2)、ErbB4激酶(以下稱HER4)和胰島素樣生長因子-1受體激酶(以下稱IGF1R)(全部為Cell Signaling Technology(CST)公司產(chǎn)品)。將緩沖液1和PDGFR-β混合作為反應(yīng)用試樣i，將緩沖液1和VEGFR1混合作為反應(yīng)用試樣ii，將緩沖液1和VEGFR2混合作為反應(yīng)用試樣iii，將緩沖液1和HER1混合作為反應(yīng)用試樣iv，將緩沖液1和HER2混合作為反應(yīng)用試樣v，將緩沖液1和HER3混合作為反應(yīng)用試樣vi，將緩沖液1和IGF1R混合作為反應(yīng)用試樣vii。
2.酶反應(yīng)將25μl反應(yīng)用試樣i與含實(shí)施例4制備的GST-poly(Glu、Tyr)融合蛋白質(zhì)的基質(zhì)液3(含20mM HEPES pH7.4、10mM MnCl2、1mM DTT、1％NP40、0.2％PI、10％甘油、200μM Na3VO4、50mM NaF、40μMATP和5μgGST-poly(Glu、Tyr)融合蛋白質(zhì))混合，在25℃培養(yǎng)60分鐘。在此反應(yīng)液中加入實(shí)施例1中使用的SDS樣品緩沖液25μl，100℃沸浴中加熱5分鐘后停止酶反應(yīng)。以如此制備的溶液作為SDS用試樣i(+)。同樣從反應(yīng)用試樣ii～vii制備SDS用試樣ii(+)～vii(+)。
將25μl反應(yīng)用試樣i與不含ATP的基質(zhì)液4(含20mM HEPES pH7.4、10mM MnCl2、1mM DTT、1％NP40、0.2％PI、10％甘油、200μM Na3VO4、50mM NaF和5μgGST-poly(Glu、Tyr)融合蛋白質(zhì))混合，在25℃培養(yǎng)60分鐘。在此反應(yīng)液中加入實(shí)施例1中使用的SDS樣品緩沖液25μl，100℃沸浴中加熱5分鐘后停止酶反應(yīng)。以如此制備的溶液作為SDS用試樣i(-)。同樣從反應(yīng)用試樣ii～vii制備SDS用試樣ii(-)～vii(-)?；|(zhì)液4除不含ATP外，其余與基質(zhì)液3相同。且，SDS用試樣i(-)～vii(-)作為SDS用試樣i(+)～vii(+)的負(fù)控制組使用。
3.免疫印跡技術(shù)檢測磷酸化融合蛋白質(zhì)與實(shí)施例1一樣，運(yùn)用免疫印跡技術(shù)檢測SDS用試樣i(+)～vii(+)和SDS用試樣i(-)～vii(-)中所含的磷酸化GST-poly(Glu、Tyr)融合蛋白質(zhì)。
4.結(jié)果圖4為顯示免疫印跡技術(shù)檢測結(jié)果的熒光照片。圖中的i顯示使用PDGFR-β作為酪氨酸激酶時的結(jié)果，ii顯示使用VEGFR1作為酪氨酸激酶時的結(jié)果，iii顯示使用VEGFR2、iv顯示使用HER1、v顯示使用HER2、vi顯示使用HER4、vii顯示使用IGF1R作為酪氨酸激酶時的結(jié)果。在i～vii的各照片中，-是從使用不含ATP基質(zhì)液4制備的SDS用試樣中得出的結(jié)果。+是從使用含ATP基質(zhì)液3制備的SDS用試樣中得出的結(jié)果。P-ICD顯示自身磷酸化的酪氨酸激酶出現(xiàn)的位置，P-GST-poly(Glu、Tyr)則顯示磷酸化GST-poly(Glu、Tyr)融合蛋白質(zhì)出現(xiàn)的位置。
在全部(i～vii)+中，磷酸化GST-poly(Glu、Tyr)融合蛋白質(zhì)出現(xiàn)的位置可見單一的條帶。由此可知，實(shí)施例4中構(gòu)建的GST-poly(Glu、Tyr)融合蛋白質(zhì)可被各種酪氨酸激酶磷酸化。
另外，在ii、iii、iv、vi和vii的-中，磷酸化GST-poly(Glu、Tyr)融合蛋白質(zhì)出現(xiàn)的位置未見條帶，這是因為在酶反應(yīng)中反應(yīng)液不含ATP，GST-poly(Glu、Tyr)融合蛋白質(zhì)未被磷酸化。另一方面，在i和v的-中，磷酸化GST-poly(Glu、Tyr)融合蛋白質(zhì)出現(xiàn)的位置可見非常稀薄的條帶，這是因為檢測中使用的抗體的非特異性結(jié)合或測定中使用的制品中含有微量的ATP。
實(shí)施例6使用從細(xì)胞膜抽出的受體酪氨酸激酶時應(yīng)用免疫印跡技術(shù)檢測融合蛋白質(zhì)的磷酸化。
在這里，使用從乳腺癌源性培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞膜抽出的受體酪氨酸激酶，磷酸化實(shí)施例4構(gòu)建的GST-poly(Glu，Tyr)融合蛋白質(zhì)，應(yīng)用免疫印跡技術(shù)檢測磷酸化GST-poly(Glu，Tyr)融合蛋白質(zhì)。
1.反應(yīng)用試樣的制備方法在225cm2燒瓶中培養(yǎng)乳腺癌源性培養(yǎng)細(xì)胞(MDA-MB231)直至匯合度達(dá)到80％(約107個)。將此培養(yǎng)細(xì)胞和1ml細(xì)胞處理液(含20mM HEPESpH7.4、0.2％PI、10％甘油、200μM Na3VO4、50mM NaF)混合，用杵加壓以破碎細(xì)胞膜，制備細(xì)胞溶液。離心分離所得細(xì)胞溶液，棄上清。將沉淀物和細(xì)胞膜增溶劑(含20mM HEPES pH7.4、1％NP40、0.2％PI、10％甘油、200μM Na3VO4和50mMNaF)混合，用杵加壓以溶解細(xì)胞膜，離心分離，回收上清。將此上清作為反應(yīng)用試樣用于以下酶反應(yīng)。用同樣方法從乳腺癌源性培養(yǎng)細(xì)胞MDA-MB468和SKBr3分別制備反應(yīng)用試樣。在此，以由MDA-MB231制備的產(chǎn)物為反應(yīng)用試樣i，由MDA-MB468制備的產(chǎn)物作為反應(yīng)用試樣ii，由SKBr3制備的產(chǎn)物作為反應(yīng)用試樣iii。所有反應(yīng)用試樣都制備至所含蛋白質(zhì)濃度達(dá)0.8mg/ml。
2.酶反應(yīng)將25μl用所述方法所得反應(yīng)用試樣i與25μl基質(zhì)溶液5(含20mMHEPES pH7.4、20mM MnCl2、2mM DTT、1％NP40、0.2％PI、10％甘油、200μM Na3VO4、50mM NaF、100μM ATP和5μg GST-poly(Glu、Tyr)融合蛋白質(zhì))混合，在25℃培養(yǎng)30分鐘。在此反應(yīng)液中加入實(shí)施例1中使用的SDS樣品緩沖液25μl，100℃沸浴中加熱5分鐘后停止酶反應(yīng)。以如此制備的溶液作為SDS用試樣i。同樣從反應(yīng)用試樣ii和反應(yīng)用試樣iii制備SDS用試樣ii和SDS用試樣iii。
3.免疫印跡技術(shù)檢測磷酸化融合蛋白質(zhì)與實(shí)施例1一樣，運(yùn)用免疫印跡技術(shù)檢測SDS用試樣i～iii中所含的磷酸化GST-poly(Glu、Tyr)融合蛋白質(zhì)。
4.結(jié)果圖5為顯示免疫印跡技術(shù)檢測結(jié)果的熒光照片。圖中的i顯示使用從MDA-MB231細(xì)胞膜中抽出的受體酪氨酸激酶時的結(jié)果，ii顯示使用從MDA-MB468細(xì)胞膜中抽出VEGFR1后的受體酪氨酸激酶時的結(jié)果，iii顯示使用從SKBr3細(xì)胞膜中抽出的受體酪氨酸激酶時的結(jié)果。P-GST-poly(Glu、Tyr)顯示磷酸化GST-poly(Glu、Tyr)融合蛋白質(zhì)出現(xiàn)的位置。
在全部(i～iii)中，磷酸化GST-poly(Glu、Tyr)融合蛋白質(zhì)出現(xiàn)的位置可見單一的條帶。由此可知，GST-poly(Glu、Tyr)融合蛋白質(zhì)可被存在于細(xì)胞膜上的酪氨酸激酶磷酸化。如實(shí)施例5所示，GST-poly(Glu、Tyr)融合蛋白質(zhì)可被各種酪氨酸激酶磷酸化，因此，在此檢測出的條帶是被存在于細(xì)胞膜上的各種酪氨酸激酶磷酸化的GST-poly(Glu、Tyr)融合蛋白質(zhì)。
圖6圖示了在免疫印跡的熒光照片檢出的磷酸化GST-poly(Glu、Tyr)融合蛋白質(zhì)條帶的熒光強(qiáng)度用專用分析軟件數(shù)值化的結(jié)果。圖中i顯示使用從MDA-MB231細(xì)胞膜中抽出的受體酪氨酸激酶時的結(jié)果，ii顯示使用從MDA-MB468細(xì)胞膜中抽出VEGFR1后的受體酪氨酸激酶時的結(jié)果，iii顯示使用從SKBr3細(xì)胞膜中抽出的受體酪氨酸激酶時的結(jié)果?？v軸為條帶的熒光強(qiáng)度。
分別比較i～iii，可以看出i與ii和iii之間熒光強(qiáng)度有很大差異。這表示在MDA-MB23 1和MDA-MB468、SKBr3之間受體酪氨酸激酶的表達(dá)水平或/和酶活性水平存在很大差異。MDA-MB231、MDA-MB468和SKBr3都是來源于乳腺癌的培養(yǎng)細(xì)胞。由以上可以認(rèn)為，對于顯示出較強(qiáng)熒光強(qiáng)度的MDA-MB468和SKBr3來說，可以推斷受體酪氨酸激酶異常是癌變的原因之一。而對于顯示出較弱熒光強(qiáng)度的MDA-MB231來說，則可以推斷受體酪氨酸激酶異常不是癌變的原因。
實(shí)施例7使用從細(xì)胞膜抽出的受體酪氨酸激酶時運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法檢測融合蛋白質(zhì)的磷酸化在此，使用從乳腺癌源性培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞膜抽出的受體酪氨酸激酶，磷酸化實(shí)施例4構(gòu)建的GST-poly(Glu，Tyr)融合蛋白質(zhì)，應(yīng)用ELISA法檢測磷酸化GST-poly(Glu，Tyr)融合蛋白質(zhì)。
1.反應(yīng)用試樣的制備方法在225cm2燒瓶中培養(yǎng)乳腺癌源性培養(yǎng)細(xì)胞(MDA-MB468)直至匯合達(dá)到80％(約107個)。將此培養(yǎng)細(xì)胞和1ml實(shí)施例6使用的細(xì)胞處理液混合，用杵加壓以破碎細(xì)胞膜，制備細(xì)胞溶液。離心分離所得細(xì)胞溶液，棄上清。將沉淀物和實(shí)施例6使用的細(xì)胞膜增溶劑混合，用杵加壓以溶解細(xì)胞膜，離心分離，回收上清。將此上清用細(xì)胞膜增溶劑稀釋，分別制備出蛋白質(zhì)濃度為0.02g/ml、0.04g/ml及0.08g/ml的反應(yīng)用試樣。將細(xì)胞膜增溶劑作為如此制備的各反應(yīng)用試樣和不含蛋白質(zhì)反應(yīng)用試樣用于以下酶反應(yīng)中。
2.融合蛋白質(zhì)對ELISA用板的結(jié)合ELISA用板使用的是谷胱甘肽包被板(Reacti-Bind Clear GlutathioneCoated Plates，8-well Strip(PIERCE公司產(chǎn)品))。先用TBS-T(含25mM Tris、150mM NaCl及0.05％Tween-20)沖洗三遍板的各孔。再向各孔加入實(shí)施例4中制備的含GST-poly(Glu、Tyr)融合蛋白質(zhì)的基質(zhì)溶液6(含5μg/mlGST-poly(Glu、Tyr)融合蛋白質(zhì)的TBS))50μl，邊輕微振蕩，邊在25℃培養(yǎng)1小時。培養(yǎng)后用TBS-T沖洗二遍各孔，再用20mM HEPESpH7.4(含0.05％Tween20)清洗一次。如此，即讓GST-poly(Glu、Tyr)融合蛋白質(zhì)結(jié)合到ELISA用板的孔的表面。在以下酶反應(yīng)中使用此ELISA板。
3.檢測酶反應(yīng)和磷酸化融合蛋白質(zhì)將各反應(yīng)液50μl加入ELISA板的各個樣品孔，在25℃培養(yǎng)約30分鐘。培養(yǎng)后，在各孔添加100μl反應(yīng)終止液(含1mM EDTA的TBS-T)，再用TBS-T沖洗三遍。接著，將各孔用300μl StartingBlock T20(TBS)封閉液即用型(PIERCE公司產(chǎn)品)清洗后，用StartingBlock T20(TBS)封閉液即用型將HRP標(biāo)記一次抗體(p-Tyr(PY20)，sc-508 HRP(SANTA CruzBiotechnology公司))稀釋1000倍，配制成一次抗體液，將該一次抗體液100μl加入各孔，25℃輕搖培養(yǎng)約1小時30分鐘。培養(yǎng)后用TBS-T沖洗各孔五遍，在各孔中加入150μl TMB溶液(3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)用于ELISA的液體底物系統(tǒng)(希格瑪公司產(chǎn)品))，室溫避光適當(dāng)顯色5～30分鐘后，用VersaMax酶標(biāo)儀(分子儀器(Molecular Device)公司產(chǎn)品)測定吸光度(650nm)。
4.結(jié)果圖7為ELISA結(jié)果的顯示圖。圖中的縱軸表示吸光度(650nm)，橫軸表示每一個孔(50μl)的蛋白質(zhì)量(μg)。
在圖7中，隨著蛋白質(zhì)量的升高，即隨著酪氨酸激酶量的升高，測定值也增大。由此可知，GST-poly(Glu、Tyr)融合蛋白質(zhì)被存在于細(xì)胞膜上的酪氨酸激酶磷酸化。另如實(shí)施例5所示，GST-poly(Glu、Tyr)融合蛋白質(zhì)可以被多種酪氨酸激酶磷酸化，因此，可以認(rèn)為在此檢出的條帶是被存在于細(xì)胞膜上的多種酪氨酸激酶磷酸化的GST-poly(Glu、Tyr)融合蛋白質(zhì)。
實(shí)施例8抑制劑對跨膜型酪氨酸激酶的激酶活性的影響在此，用與實(shí)施例6同樣的方法得到的反應(yīng)用試樣(i～iii)調(diào)查各種抑制劑對跨膜型酪氨酸激酶的激酶活性的影響。
1.反應(yīng)用試樣的制備方法使用按實(shí)施例6同樣的方法得到的反應(yīng)用試樣(i～iii)。
2.酶反應(yīng)分別在4根試管中加入反應(yīng)用試樣25μl。4根管中，一根加含作為HER1及HER2抑制劑的PD158780(Calbiochem公司產(chǎn)品)100μM的反應(yīng)液(含20mM HEPES pH7.4、20mM MnCl2、2mM DTT、0.1％NP-40、0.2％PI、10％甘油、100μM Na3VO4、100μM ATP及5μg GST-poly(Glu、Tyr)融合蛋白質(zhì))25μl，一根加含作為HER1及HER2抑制劑的W4557(Calbiochem公司產(chǎn)品)100μM的反應(yīng)液25μl，另一根加含作為HER1及HER2抑制劑的AG1478(Calbiochem公司產(chǎn)品)100μM的反應(yīng)液25μl，最后一根加不含抑制劑的反應(yīng)液25μl，25℃培養(yǎng)30分鐘。設(shè)含PD158780的反應(yīng)液為PD，含W4557的反應(yīng)液為W，含AG1478的反應(yīng)液為AG，不含抑制劑的反應(yīng)液為C。
3.用免疫印跡法檢測磷酸化融合蛋白質(zhì)用所述PD、W、AG和C以與實(shí)施例6同樣的方法進(jìn)行免疫印跡。結(jié)果，經(jīng)專用分析軟件數(shù)字化的圖表顯示出在免疫印跡的熒光照片檢測出的磷酸化GST-poly(Glu、Tyr)融合蛋白質(zhì)條帶的熒光強(qiáng)度。
圖8是用反應(yīng)用試樣i制備的PD、W、AG和C獲得的結(jié)果。圖9是用反應(yīng)用試樣ii制備的PD、W、AG和C獲得的結(jié)果。圖10是用反應(yīng)用試樣iii制備的PD、W、AG和C獲得的結(jié)果。設(shè)使用不含抑制劑的反應(yīng)液(C)時的條帶熒光強(qiáng)度為100％，則縱軸以此時的值表示各條帶的熒光強(qiáng)度。
4.結(jié)果在圖9和10中，PD、W、AG的熒光強(qiáng)度比C低，這是因為存在于MDA-MB468和SKBr3細(xì)胞膜上的一部分受體酪氨酸激酶的酶活性受到PD158780、W4557、AG1478各抑制劑的抑制。另一方面，在圖8中，未見PD、W、AG的熒光強(qiáng)度下降。這是因為存在于MDA-MB231細(xì)胞膜上的受體酪氨酸激酶的酶活性沒有受到PD158780、W4557、AG1478各抑制劑的抑制。從以上結(jié)果得知，用本實(shí)施例的測定方法可以推斷抑制劑對受體酪氨酸激酶的酶活性的抑制功能。
實(shí)施例9配體對受體酪氨酸激酶的激酶活性的影響在此，使用實(shí)施例6同樣方法獲得的反應(yīng)用試樣iii調(diào)查HER3和HER4配體對受體酪氨酸激酶的激酶活性的影響。
1.反應(yīng)用試樣的制備方法使用實(shí)施例6同樣方法獲得的反應(yīng)用試樣iii。
2.酶反應(yīng)分別在2根試管中各加入25μl反應(yīng)用試樣iii。其中一根加含作為HER3配體的Heregulin(希格瑪公司產(chǎn)品)100ng的反應(yīng)液(含20mMHEPES pH7.4、20mM MnCl2、2mM DTT、0.1％NP-40、0.2％PI、10％甘油、100μM Na3VO4、100μM ATP及5μg GST-poly(Glu、Tyr)融合蛋白質(zhì))25μl，另一根加不含配體的反應(yīng)液25μl，25℃培養(yǎng)30分鐘。設(shè)含Heregulin的反應(yīng)液為H，不含Heregulin的反應(yīng)液為C。
3.用免疫印跡法檢測磷酸化融合蛋白質(zhì)用所述H和C以與實(shí)施例6同樣的方法進(jìn)行免疫印跡。并用專用分析軟件將熒光照片檢測出的磷酸化GST-poly(Glu、Tyr)融合蛋白質(zhì)的條帶熒光強(qiáng)度數(shù)字化。
圖11是用反應(yīng)用試樣iii制備的H和C獲得的結(jié)果。縱軸表示條帶的熒光強(qiáng)度。
4.結(jié)果在圖11中，H的熒光強(qiáng)度比C高。這是因為存在于SKBr3細(xì)胞膜的受體酪氨酸激酶被Heregulin激活。Heregulin是HER3和HER4的配體。已知，一旦Heregulin結(jié)合到HER3的膜外域，會誘導(dǎo)HER3和HER3以外的HER(HER1、HER2或HER4)二聚化，由此而顯示酪氨酸激酶活性。已知，Heregulin結(jié)合到HER4的膜外域會激活HER4。已知，在SKBr3，與HER2和HER3的表達(dá)極強(qiáng)相反，HER1和HER4的表達(dá)極少。根據(jù)以上原因，可以認(rèn)為，熒光強(qiáng)度在圖11的增強(qiáng)是由于Heregulin結(jié)合到HER3的膜外域使HER3和HER2形成復(fù)合體而引起的。
另外，已知，HER3的酪氨酸激酶部位沒有磷酸化活性。因此，HER3單獨(dú)不能顯示酪氨酸激酶的活性，只有和HER1、HER2或HER4形成二聚體才能顯示酪氨酸激酶活性。在圖11，由于可以看到Heregulin激活的受體酪氨酸激酶，因此可以認(rèn)為HER2和HER3形成了二聚體。由此可知，在本實(shí)施例的測定方法中，受體激酶被回收時仍然保持著形成活化時才能形成的立體結(jié)構(gòu)的功能。
序列表<110>希森美康<120>激酶活性的測定方法<130>IP3697<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于Grb2基因設(shè)計的DNA<400>1cgcggatccc atatggaagc catcgccaaa tatg 34<210>2<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于Grb2基因設(shè)計的DNA<400>2cccaagcttt tagacgttcc ggttcac 27<210>3<211>25<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>多(Glu，Tyr)肽氨基酸序列<400>3Glu Glu Glu Glu Tyr Glu Glu Glu Glu Tyr Glu Glu Glu Glu Tyr Glu1 5 10 15Glu Glu Glu Tyr Glu Glu Glu Glu Tyr20 25<210>4<211>75<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于多(Glu，Tyr)肽氨基酸序列設(shè)計的DNA<400>4gaggaggagg agtacgaaga agaagaatat gaagaagaag aatatgaaga agaagaatat 60gaggaggaag agtac 75<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于多(Glu，Tyr)肽核苷序列設(shè)計的DNA<400>5ccggggatcc gaggaggagg agtac25<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于多(Glu，Tyr)肽核苷序列設(shè)計的DNA<400>6cccggggaat tcgtactctt cttcctc 27<210>7<211>263<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>GST-poly(Glu，Tyr)融合蛋白氨基酸序列<400>7Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys lle Lys Gly Leu Val Gln Pro1 51015Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu20 25 30Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu35 40 45Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys50 55 60
Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn65 7075 80Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu85 90 95Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser100 105 110Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu115 120 125Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn130 135 140Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp145 150 155 160Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu165 170175Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr180 185 190Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala195 200 205Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg210215220Gly Ser Glu Glu Glu Glu Tyr Glu Glu Glu Glu Tyr Glu Glu Glu Glu225 230 235 240Tyr Glu Glu Glu Glu Tyr Glu Glu Glu Glu Tyr Glu Phe Pro Gly Arg245 250255Leu Glu Arg Pro His Arg Asp260
權(quán)利要求
1.一種測定存在于細(xì)胞膜的受體激酶活性的方法，包括以下步驟從所述細(xì)胞分離細(xì)胞質(zhì)，制備含受體激酶的試樣；讓所述試樣中的受體激酶與基質(zhì)接觸，用受體激酶活性使基質(zhì)磷酸化；讓所述磷酸化基質(zhì)與標(biāo)記物結(jié)合；及根據(jù)所述結(jié)合到磷酸化基質(zhì)的標(biāo)記物的檢測結(jié)果，測定跨膜型激酶活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在緩沖液中破碎所述細(xì)胞，將含有破碎細(xì)胞的所述緩沖液與表面活性劑混合，通過提取所得混合物的上清液，制備含受體激酶的試樣。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述緩沖液的pH值為4.0～9.0。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述表面活性劑是不與所述受體激酶結(jié)合的非離子型表面活性劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述基質(zhì)具有親和標(biāo)簽，且所述方法進(jìn)一步包括以下步驟讓有所述具有親和標(biāo)簽的基質(zhì)與含有能連接所述親和標(biāo)簽的結(jié)合物的固相接觸，形成復(fù)合物；回收所述復(fù)合物；及離解結(jié)合物與親和標(biāo)簽的結(jié)合，以從所述回收的復(fù)合物中獲得所述基質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述標(biāo)記物通過能結(jié)合到所述磷酸化基質(zhì)的一次抗體和能結(jié)合到所述第一抗體的二次抗體，與所述磷酸化基質(zhì)結(jié)合。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述受體激酶為酪氨酸激酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述酪氨酸激酶選自以下物質(zhì)胰島素樣生長因子受體、血小板衍生生長因子受體、人表皮細(xì)胞生長因子受體和血管內(nèi)皮生長因子受體。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述基質(zhì)為與受體酪氨酸激酶配對的基質(zhì)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述基質(zhì)選自以下物質(zhì)組成的群體生長因子受體結(jié)合蛋白質(zhì)2、堿性髓鞘蛋白、組朊H2B和磷脂酶C-γ。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述基質(zhì)是可以被多種受體酪氨酸激酶磷酸化的基質(zhì)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述基質(zhì)含有由含谷氨酸殘基和酪氨酸殘基的氨基酸序列構(gòu)成的肽。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述氨基酸序列選自以下序列由谷氨酸殘基和酪氨酸殘基構(gòu)成、谷氨酸殘基和酪氨酸殘基的比率為4∶1的氨基酸序列A；由谷氨酸殘基和酪氨酸殘基構(gòu)成、谷氨酸殘基和酪氨酸殘基的比率為1∶1的氨基酸序列B；由谷氨酸殘基、酪氨酸殘基和氨基丙酸殘基構(gòu)成、谷氨酸殘基、氨基丙酸殘基和酪氨酸殘基的比率為6∶1∶3的氨基酸序列C；由谷氨酸殘基、酪氨酸殘基和氨基丙酸殘基構(gòu)成、谷氨酸殘基、氨基丙酸殘基和酪氨酸殘基的比率為1∶1∶1的氨基酸序列D；以及由谷氨酸殘基、酪氨酸殘基、氨基丙酸殘基和賴氨酸殘基構(gòu)成、谷氨酸殘基、酪氨酸殘基、氨基丙酸殘基和賴氨酸殘基的比率為2∶1∶6∶5的氨基酸序列E。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述標(biāo)記物為熒光物質(zhì)或酶。
15.一種推斷受體激酶抑制劑對細(xì)胞影響的方法，其中包括以下步驟用權(quán)利要求1所述方法測定受體激酶活性，取得第1測定結(jié)果；用權(quán)利要求1所述方法測定接觸了所述抑制劑的受體激酶活性，取得第2測定結(jié)果；及根據(jù)第1和第2測定結(jié)果推斷抑制劑對細(xì)胞的影響。
16.一種推斷受體激酶配體對細(xì)胞影響的方法，其中包括以下步驟用權(quán)利要求1所述方法測定受體激酶活性，取得第1測定結(jié)果；用權(quán)利要求1所述方法測定接觸了所述配體的受體激酶活性，取得第2測定結(jié)果；及根據(jù)第1和第2測定結(jié)果推斷配體對細(xì)胞的影響。
17.一種測定存在于從生物采集的細(xì)胞細(xì)胞膜上的受體激酶活性的試劑盒，其包括對應(yīng)于所述激酶的基質(zhì)；含可被所述激酶活性攝入所述基質(zhì)的磷酸基的磷酸基供體；可結(jié)合到導(dǎo)入了磷酸基的所述基質(zhì)的標(biāo)記物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑盒，其中含有pH為4.0～9.0、用于破碎所述細(xì)胞的緩沖液以及可溶解細(xì)胞膜的表面活性劑。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑盒，其中所述磷酸基供體為ATP或ADP。
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑盒，其中所述標(biāo)記物為熒光物質(zhì)或酶。
全文摘要
本發(fā)明提供一種方法，用此方法可以檢測被存在于細(xì)胞膜的受體激酶的激酶活性磷酸化的基質(zhì)，并根據(jù)此檢測結(jié)果測定受體激酶活性。此方法包括以下步驟從細(xì)胞分離細(xì)胞質(zhì)，制備含受體激酶的試樣；讓所述試樣中的受體激酶與基質(zhì)接觸，用受體激酶活性使基質(zhì)磷酸化；讓標(biāo)記物結(jié)合到所述磷酸化基質(zhì)；根據(jù)結(jié)合到所述磷酸化基質(zhì)的標(biāo)記物的檢測結(jié)果，測定受體激酶活性。本發(fā)明還提供一種用于測定存在于細(xì)胞的細(xì)胞膜的受體激酶活性的試劑盒，其包括對應(yīng)于所述激酶的基質(zhì)；含可被所述激酶活性攝入所述基質(zhì)的磷酸基的磷酸基供體；可結(jié)合到導(dǎo)入了磷酸基的所述基質(zhì)的標(biāo)記物。
文檔編號G01N21/00GK101046475SQ20071008756
公開日2007年10月3日 申請日期2007年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月31日
發(fā)明者能登谷倫崇, 大山朋子, 田村茂行, 吉田智一, 石原英干 申請人:希森美康株式會社