含高活性木質(zhì)纖維素酶的酶液及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種含高活性木質(zhì)纖維素酶的酶液及其制備方法，結(jié)合了現(xiàn)有固體發(fā)酵法和液體發(fā)酵法的特點(diǎn)，取得了驚人的技術(shù)效果。本發(fā)明方法，首先將產(chǎn)酶真菌、木質(zhì)纖維素基質(zhì)與第一營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基混合，實(shí)施靜置培養(yǎng)；然后，加入第二營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，實(shí)施搖床培養(yǎng)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)，測(cè)得本發(fā)明的最大漆酶活性是固體發(fā)酵方法的11.6倍，是液體發(fā)酵方法的8.2倍；由此可見(jiàn)，本發(fā)明為今后大量的低成本酶在生物領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用提供了可行性。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
含高活性木質(zhì)纖維素酶的酶液及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及微生物制酶的方法，尤其涉及一種高活性木質(zhì)纖維素酶的酶液及其制 備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 當(dāng)前，全球范圍內(nèi)對(duì)于礦物燃料和農(nóng)林廢棄物的關(guān)注度均處于迅速上升趨勢(shì)，主 要是由于農(nóng)林廢棄物中包含高比例的木質(zhì)纖維素，這些木質(zhì)纖維素可實(shí)現(xiàn)生物轉(zhuǎn)化，具有 量大和可循環(huán)再生等特點(diǎn)。而通過(guò)栽培真菌是利用這些農(nóng)林廢棄物、并產(chǎn)生能源的一種非 常有效的方法。
[0003] 目前，在發(fā)酵方法上，均集中于固體發(fā)酵(SSF)和液體發(fā)酵(SF)。這兩種發(fā)酵方法 所得的酶活性依然不夠理想，大量使用的成本很高，成為制約木質(zhì)纖維素酶被廣泛利用的 關(guān)鍵因素之一。因此，開(kāi)放一種新型的制備高活性木質(zhì)纖維素酶的方法，對(duì)于降低成本、促 進(jìn)生物降解領(lǐng)域的發(fā)展具有重要意義。本發(fā)明特征基于這樣的意義，提供了一種酶活性高 的酶液制備方法，為今后大量的低成本酶在生物領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用提供了可行性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種高活性木質(zhì)纖維素酶的酶液及其制備方法，以期降低 木質(zhì)纖維素酶的制備成本，為廣泛使用木質(zhì)纖維素酶提供一種有效可行的基礎(chǔ)。
[0005]為了達(dá)成本發(fā)明之目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下。
[0006] -種含高活性木質(zhì)纖維素酶的酶液制備方法，適于利用真菌生產(chǎn)木質(zhì)纖維素酶， 其特征在于包括以下步驟：
[0007] a.將產(chǎn)酶真菌、木質(zhì)纖維素基質(zhì)與第一營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基混合，實(shí)施靜置培養(yǎng)；
[0008] b.向步驟a靜置培養(yǎng)完成的混合物中加入第二營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，實(shí)施搖床培養(yǎng)；
[0009] 搖床培養(yǎng)完成，步驟b中的混合物即是所述含高活性木質(zhì)纖維素酶的酶液。
[0010] 含高活性木質(zhì)纖維素酶的酶液，采用上述步驟制備而成。
[0011] 在某些優(yōu)選的實(shí)施例中，所述第二營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基和第一營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基還可以是相同的 營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。
[0012] 在某些優(yōu)選的實(shí)施例中，提取步驟b完成后的上清液能夠獲得更高活性的酶液。
[0013] 在某些優(yōu)選的實(shí)施例中，所述產(chǎn)酶真菌是白腐真菌。
[0014] 在某些優(yōu)選的實(shí)施例中，所述白腐真菌是糙皮側(cè)耳。
[0015] 在某些優(yōu)選的實(shí)施例中，第一營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基有下列三種方案:方案一:按重量份，包 括以下成分：（NH4)2S〇4 1.4g、KH2P04 2g、MgS〇4.7H2〇 0.2g、蛋白胨5g、酵母浸粉2g、鹽溶液 1 g，pH自然;方案二：按重量份，包括以下成分:葡萄糖5g、酵母浸粉2g、蛋白胨5g、（NH4)2S04 1.4g、KH2P04 2g、MgS04 · 7H20 0.2g，pH自然；方案三：按重量份，包括以下成分：酵母浸粉 2g、蛋白胨5g、（NH4)2S〇4 1.4g、KH2P04 2g、MgS〇4.7H2〇 0.2g，pH自然。
[0016] 在某些優(yōu)選的實(shí)施例中，所述的鹽溶液按重量份，包括以下成分：FeS04 · 7H20 5mg、MnS〇4*H2〇 1.6mg、ZnS〇4*7H2〇 1.4mg、CoCl2 2mg，pH自然。
[0017] 在某些優(yōu)選的實(shí)施例中，所述木質(zhì)纖維素基質(zhì)包括北京楊、玉米芯和棉籽殼。
[0018] 在某些優(yōu)選的實(shí)施例中，步驟a中的產(chǎn)酶菌選用的是該產(chǎn)酶菌的菌絲均質(zhì)體。
[0019] 在某些優(yōu)選的實(shí)施例中，所述步驟a的混合物的濕度為75% (v/v)。
[0020] 本發(fā)明的含高活性木質(zhì)纖維素酶的酶液制備方法，結(jié)合了現(xiàn)有固體發(fā)酵法和液體 發(fā)酵法的特點(diǎn)，步驟a在本發(fā)明中是固體預(yù)培養(yǎng)的過(guò)程，步驟b在本發(fā)明中是液體培養(yǎng)的過(guò) 程。本發(fā)明方法綜合了現(xiàn)有固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)的特點(diǎn)，取得了驚人的技術(shù)效果;例如，在 本發(fā)明方法的指導(dǎo)下，選用糙皮側(cè)耳制備出的木質(zhì)纖維素酶的活性均較現(xiàn)有固體或液體發(fā) 酵方法來(lái)的高，通過(guò)實(shí)驗(yàn)，尤其測(cè)得最大漆酶活性是固體發(fā)酵方法的11.6倍，是液體發(fā)酵方 法的8.2倍;最大羧甲基纖維素酶活性是固體發(fā)酵方法的5.2倍，是液體發(fā)酵方法的2.9倍； 最大木聚糖酶活性是固體發(fā)酵方法的5.8倍，是液體發(fā)酵方法的3.1倍。由此可見(jiàn)，本發(fā)明方 法相比于現(xiàn)有的固體或液體發(fā)酵方法取得了顯著的有益效果。
[0021] 本發(fā)明人已經(jīng)在此
【發(fā)明內(nèi)容】
章節(jié)從整體上描述了本發(fā)明的必要特征和優(yōu)點(diǎn)；然 而，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言，本文中給出的另外的特征、優(yōu)點(diǎn)和實(shí)施方案，或者查看 了本文說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)將清楚另外的特征、優(yōu)點(diǎn)和事實(shí)方案都是本發(fā)明精神的體現(xiàn)， 都不脫離本發(fā)明之范圍。對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言，本發(fā)明已經(jīng)公開(kāi)了他能達(dá)成本發(fā) 明目的的必要特征，在【具體實(shí)施方式】的舉例介紹下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員完全可以聯(lián)想到 本發(fā)明精神所包含又難以窮舉的等同方案。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 根據(jù)發(fā)明之精神，制備具有高活性木質(zhì)纖維素酶的酶液的方法主要包括兩個(gè)步 驟：
[0023] a.將產(chǎn)酶真菌、木質(zhì)纖維素基質(zhì)與第一營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基混合，實(shí)施靜置培養(yǎng)；
[0024] b.向步驟a靜置培養(yǎng)完成的混合物中加入第二營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，實(shí)施搖床培養(yǎng)；
[0025] 于步驟b完成后，步驟b中的混合物即是所述含高活性木質(zhì)纖維素酶的酶液。如此， 以下將以糙皮側(cè)耳為產(chǎn)酶真菌，北京楊、玉米芯和棉籽殼為木質(zhì)纖維素基質(zhì)以及適宜糙皮 側(cè)耳之第一和第二營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基為本實(shí)施例之選，就本發(fā)明之精神以實(shí)施例之方式展開(kāi)描 述。
[0026] 本發(fā)明人在此舉實(shí)施例描述之目的是為了使本發(fā)明的目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更加 明顯易懂，在以下的描述中闡述了以便于充分理解本發(fā)明的具體實(shí)施例，但是，本發(fā)明能夠 以不同于以下描述的方式實(shí)施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類(lèi)似 推廣。因此，本發(fā)明不受以下公開(kāi)的具體實(shí)施例的限制。
[0027] 一、培養(yǎng)基
[0028]固體培養(yǎng)基(MEA):葡萄糖10g、麥芽浸粉20g、KH2P〇4 3g、瓊脂18g，定容至lL，pH自 然。
[0029] 基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基(BL):葡萄糖10g、酵母浸粉20g、KH2P〇43g、MgS〇4 · 7H20 0.5g，定 容至lL，pH自然。
[0030]鹽溶液（SL) :FeS〇4 · 7H20 5mg、MnS〇4 · H20 1.6mg、ZnS〇4 · 7H20 1.4mg、CoCl2 2mg，定容至lL，pH自然。
[0031] 營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基l(Nmedl):(NH4)2S〇4 1.4g、KH2P〇4 2g、MgS〇4 · 7H20 0.2g、蛋白胨5g、 酵母浸粉2g、鹽溶液1 g，定容至1L，pH自然。
[0032] 營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基2(Nmed2):葡萄糖5g、酵母浸粉2g、蛋白胨5g、（NH4)2S〇4 1.4g、 KH2P〇42g、MgS〇4· 7H20 0.2g，定容至lL，pH自然。
[0033] 營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基3(Nmed3):酵母浸粉2g、蛋白胨5g、（NH4)2S〇4 1.4g、KH2P〇4 2g、MgS〇4 · 7H20 0.2g，定容至lL，pH自然。
[0034] 注:培養(yǎng)基使用時(shí)經(jīng)121°C高壓滅菌30min;鹽溶液使用時(shí)經(jīng)20μπι微孔濾膜過(guò)濾;本 實(shí)施例的第一營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基和第二營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基均選自上述營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基1或營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基2或營(yíng) 養(yǎng)培養(yǎng)基3 〇
[0035]二、木質(zhì)纖維素基質(zhì)
[0036] 北京楊（Populus bei jingensis)木片（約3cmX lcmX0.3cm)、玉米芯和棉籽殼經(jīng) 風(fēng)干處理后粉碎，過(guò)40目標(biāo)準(zhǔn)篩，放入干燥器中保存?zhèn)溆谩?br>[0037] 三、菌絲均質(zhì)體的制備
[0038]糙皮側(cè)耳菌株CCEF 89在固體培養(yǎng)基上每月轉(zhuǎn)接一次，于4°C保存?zhèn)溆?。使用前?接種在新鮮制備的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，26°C恒溫培養(yǎng)6-7天。待菌絲長(zhǎng)滿平板后，用打 孔器打取直徑5mm接種物，每100mL基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中無(wú)菌條件下放入5個(gè)接種物，26°C、 150r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)5天后收集。利用內(nèi)切式勾衆(zhòng)機(jī)以5000r/min速度攪拌30s即得菌絲 均質(zhì)體，充分震蕩后4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0039]四、現(xiàn)有固體發(fā)酵方法
[0040]取5g木質(zhì)纖維素基質(zhì)即木肩、玉米芯和棉籽殼分別置于250mL三角瓶中，再分別添 加15mL營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基1、2、3以調(diào)節(jié)濕度為75%(v/v)，于121°C高壓滅菌30min。待冷卻至室溫 后無(wú)菌條件下加入3mL菌絲均質(zhì)體，26°C靜置培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，求平均值。
[00411 分別于培養(yǎng)第6天、第8天和第10天取樣，向每個(gè)三角瓶中加入100mL 50mM醋酸-醋 酸鈉緩沖液(PH5.5)，并在10± 1°C、120r/min條件下振蕩反應(yīng)5h。將每瓶發(fā)酵物經(jīng)雙層尼龍 布過(guò)濾后，4°C、12000r/min離心15min，所得上清液即為粗酶液，用于測(cè)定酶活。
[0042]五、現(xiàn)有液體發(fā)酵方法
[0043]取5g木質(zhì)纖維素基質(zhì)即木肩、玉米芯和棉籽殼分別置于250mL三角瓶中，再分別添 加100mL營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基1、2、3，121°C高壓滅菌30min。待冷卻至室溫后無(wú)菌條件下加入3mL菌絲 均質(zhì)體，26 °C、150r/min搖床培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，求平均值。分別于培養(yǎng)第6天、第8天和 第10天取樣，將每瓶發(fā)酵物經(jīng)雙層尼龍布過(guò)濾后，4°C、12000r/min離心15min，所得上清液 即為粗酶液，用于測(cè)定酶活。
[0044]六、根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)施的方法
[0045]取5g木質(zhì)纖維素基質(zhì)即木肩、玉米芯和棉籽殼分別置于250mL三角瓶中，再分別添 加15mL營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基1、2、3以調(diào)節(jié)濕度為75%(v/v)，于121°C高壓滅菌30min。
[0046] 待冷卻至室溫后無(wú)菌條件下加入3mL菌絲均質(zhì)體，26°C靜置培養(yǎng)1天后，分別加入 85mL已滅菌、且與之前固體預(yù)培養(yǎng)階段使用相同的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，于26°C恒溫條件下進(jìn)行 150r/min搖床培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，求平均值。
[0047] 分別于培養(yǎng)第6天、第8天和第10天取樣，將每瓶發(fā)酵物經(jīng)雙層尼龍布過(guò)濾后，4°C、 12000r/min離心15min，所得上清液即為粗酶液，用于測(cè)定酶活。
[0048] 七、酶活測(cè)定
[0049] 漆酶活性的測(cè)定：3.0mL反應(yīng)體系中，含1.95mL 50mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液 (pH4 · 2)、1 · OmL 1 · Ommo 1/L 2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS)和50 · OyL粗酶 液。25 °C反應(yīng)5min后，于420nm處測(cè)定吸光值，以煮沸滅活1 Omin酶液同體積的反應(yīng)混合液為 對(duì)照，設(shè)3個(gè)平行，求平均值。定義每分鐘催化轉(zhuǎn)化lymolABTS所需的酶量為一個(gè)酶活力單位 (UhABTS在420nm處摩爾吸光系數(shù)為e42Q = 3.6X104L mol-Vm-、
[0050]羧甲基纖維素酶活性的測(cè)定：向具塞刻度試管中加入1.5mL用50mmol/L檸檬酸-檸 檬酸鈉緩沖液(PH5.0)配制的1.0% (v/v)羧甲基纖維素鈉溶液和0.5mL適當(dāng)稀釋的粗酶液， 于40°C水浴準(zhǔn)確保溫30min，取出后立即加入3 . OmL 3，5-二硝基水楊酸（3,5_ Dinitrosalicylic acid，DNS)試劑，煮沸10min。流水冷卻至室溫，用蒸餾水定容至25.0mL， 混勻后于540nm處測(cè)定吸光值，以煮沸滅活10min酶液同體積的反應(yīng)混合液為對(duì)照，設(shè)3個(gè)平 行，求平均值。定義每分鐘催化羧甲基纖維素鈉生成lymol葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力 單位(U)。
[0051 ]木聚糖酶活性的測(cè)定：向具塞刻度試管中加入〇.9mL用50mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉 緩沖液(PH5.0)配制的1.0% (v/v)櫸木木聚糖溶液和0. lmL適當(dāng)稀釋的粗酶液，于40°C水浴 準(zhǔn)確保溫30min，取出后立即加入3.OmL DNS試劑，煮沸10min。流水冷卻至室溫，用蒸餾水定 容至25. OmL，混勾后于540nm處測(cè)定吸光值，以煮沸滅活1 Omin酶液同體積的反應(yīng)混合液為 對(duì)照，設(shè)3個(gè)平行，求平均值。定義每分鐘催化木聚糖水解生成Ιμπιο?木糖所需的酶量為一個(gè) 酶活力單位(U)。
[0052]以下接表一至表三，表三后接〈八、結(jié)果與分析〉。
[0053]表1白腐真菌糙皮側(cè)耳在固體發(fā)酵(SSF)條件下的木質(zhì)纖維素酶(U/L)活性
[0054]
[0055] 本表各表頭采用簡(jiǎn)稱，其中，木質(zhì)=木質(zhì)纖維素酶、羧甲=羧甲基纖維素酶、木聚 =木聚糖酶;M-Nl=M_Nmed 1=木肩+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基l(Nmed l);M-N2=M_Nmed 2 =木肩+營(yíng)養(yǎng) 培養(yǎng)基2(Nmed 2);M-N3=M_Nmed 3 =木肩+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基3(Nmed 3);Y-Nl = Y_Nmed 1 =玉米 芯+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基l(Nmed 1);Y-N2 = Y-Nmed 2 =玉米芯+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基2(Nmed 2);Y-N3 = Y-Nmed 3 =玉米芯+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基3(Nmed 3);N-Nl=N_Nmed 1 =棉軒殼+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基l(Nmed 1);N-N2 = N-Nmed2 =棉籽殼+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基2(Nmed 2);N-N3 = N-Nmed 3 =棉籽殼+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng) 基3(Nmed 3)〇
[0056] 表2白腐真菌糙皮側(cè)耳在液體發(fā)酵(SF)條件下的木質(zhì)纖維素酶(U/L)活性
[0057]
[0058] 本表各表頭采用簡(jiǎn)稱，其中，木質(zhì)=木質(zhì)纖維素酶、羧甲=羧甲基纖維素酶、木聚 =木聚糖酶;M-Nl=M_Nmed 1=木肩+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基l(Nmed l);M-N2=M_Nmed 2 =木肩+營(yíng)養(yǎng) 培養(yǎng)基2(Nmed 2);M-N3=M_Nmed 3 =木肩+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基3(Nmed 3);Y-Nl = Y_Nmed 1 =玉米 芯+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基l(Nmed 1);Y-N2 = Y-Nmed 2 =玉米芯+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基2(Nmed 2);Y-N3 = Y-Nmed 3 =玉米芯+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基3(Nmed 3);N-Nl=N_Nmed 1 =棉軒殼+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基l(Nmed 1);N-N2 = N-Nmed 2 =棉籽殼+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基2(Nmed 2);N-N3 = N-Nmed 3 =棉籽殼+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng) 基3(Nmed 3)〇
[0059] 表3白腐真菌糙皮側(cè)耳在本發(fā)明方法(先固體預(yù)培養(yǎng)后液體搖培發(fā)酵，SmF)條件下 的木質(zhì)纖維素酶(U/L)活性
[0060]
[0061] 本表各表頭采用簡(jiǎn)稱，其中，木質(zhì)=木質(zhì)纖維素酶、羧甲=羧甲基纖維素酶、木聚 =木聚糖酶;M-Nl=M_Nmed 1=木肩+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基l(Nmed l);M-N2=M_Nmed 2 =木肩+營(yíng)養(yǎng) 培養(yǎng)基2(Nmed 2);M-N3=M_Nmed 3 =木肩+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基3(Nmed 3);Y-Nl = Y_Nmed 1 =玉米 芯+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基l(Nmed 1);Y-N2 = Y-Nmed 2 =玉米芯+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基2(Nmed 2);Y-N3 = Y-Nmed 3 =玉米芯+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基3(Nmed 3);N-Nl=N_Nmed 1 =棉軒殼+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基l(Nmed 1);N-N2 = N-Nmed 2 =棉籽殼+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基2(Nmed 2);N-N3 = N-Nmed 3 =棉籽殼+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng) 基3(Nmed 3)〇
[0062] 八、結(jié)果與分析
[0063]如表1-3,所有數(shù)據(jù)以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差的形式表述。
[0064] 8.1木肩+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基1(M-Nmed 1)條件下的木質(zhì)纖維素酶活性
[0065] 在木肩+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基l(M_Nmed 1)條件下，無(wú)論在第6天、第8天或第10天，本發(fā)明方 法（SmF)相對(duì)于固體發(fā)酵（SSF)和液體發(fā)酵(SF)兩種傳統(tǒng)方法而言，使得糙皮側(cè)耳分泌漆 酶、羧甲基纖維素酶和木聚糖酶的能力都有所提升。
[0066]分別于培養(yǎng)第6天、第8天和第10天取樣測(cè)試，得到固體發(fā)酵(SSF)時(shí)糙皮側(cè)耳分泌 的漆酶活性分別為31 ± 1. 1U/L、3.0 ± 0.3U/L和17 ± 0.8U/L，羧甲基纖維素酶活性分別為33 ± 2 · 5U/L、79 ± 7 · 3U/L和52 ± 4 · 3U/L，木聚糖酶活性分別為 156 ± 2 · 6U/L、202 ± 15U/L和 120 ± 11U/L;液體發(fā)酵(SF)時(shí)的漆酶活性分別為0 ± 0U/L、17 ± 0.4U/L和81 ± 8.0U/L，羧甲基纖 維素酶活性分別為50 ± 3.8U/L、45 ± 0.3U/L和56 ± 3.4U/L，木聚糖酶活性分別為172 土 4 · 8U/L、168 ±4 · 3U/L和338 ± 24U/L;而以本發(fā)明方法（SmF)發(fā)酵時(shí)測(cè)得的漆酶活性分別為 495±421]/1、140±5.51]/1和122±2.61]/1，羧甲基纖維素酶活性分別為102±9.01]/1、54± 2.71]/1和91±6.01]/1，木聚糖酶活性分別為189±4.01]/1、233±6.61]/1和290±5.71]/1。 [0067]綜上所述，通過(guò)本發(fā)明方法(SmF)得到糙皮側(cè)耳在木肩+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基1(M-Nmed 1) 條件下分泌的漆酶(Lac)、羧甲基纖維素酶(CMC-Na)和木聚糖酶(Xyl)活性均高于傳統(tǒng)的固 體發(fā)酵(SSF)和液體發(fā)酵(SF)方法，且該過(guò)程所需時(shí)間較短，即短時(shí)間就可以達(dá)到較大酶活 性。
[0068] 8.2木肩+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基2(M-Nmed 2)條件下的木質(zhì)纖維素酶活性
[0069] 在木肩+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基2(M_Nmed 2)條件下，無(wú)論在第6天、第8天或第10天，本發(fā)明方 法（SmF)相對(duì)于固體發(fā)酵（SSF)和液體發(fā)酵(SF)兩種傳統(tǒng)方法而言，使得糙皮側(cè)耳分泌漆 酶、羧甲基纖維素酶和木聚糖酶的能力都有所提升。
[0070] 分別于培養(yǎng)第6天、第8天和第10天取樣測(cè)試，得到固體發(fā)酵(SSF)時(shí)糙皮側(cè)耳分泌 的漆酶活性分別為24 ± 0.6U/L、15 ± 0.1U/L和8.3 ± 0.5U/L，羧甲基纖維素酶活性分別為43 ± 3 · 1U/L、51 ± 2 · 4U/L 和 72 ± 7 · 1U/L，木聚糖酶活性分別為 37 ± 2 · 2U/L、142 ± 1 · 3U/L 和111 ± 7.1U/L;液體發(fā)酵(SF)時(shí)的漆酶活性分別為12±0.3U/L、23±2.3U/L和24 ± 2.1U/L，羧甲 基纖維素酶活性分別為81 ±4.3U/L、198± 19.7U/L和1249±94U/L，木聚糖酶活性分別為 144± 12U/L、196± 11U/L和1460± 111U/L;而以本發(fā)明方法(SmF)發(fā)酵時(shí)測(cè)得的漆酶活性分 別為50 ± 4.9U/L、33 ± 2.8U/L和53 ± 5.3U/L，羧甲基纖維素酶活性分別為131 ± 6.9U/L、772 ± 61U/L 和 2497 ± 213U/L，木聚糖酶活性分別為 299 ± 10U/L、838 ± 45U/L 和 2423 ± 153U/L。
[0071] 綜上所述，通過(guò)本發(fā)明方法(SmF)得到糙皮側(cè)耳在木肩+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基2(M-Nmed 2) 條件下分泌的漆酶(Lac)、羧甲基纖維素酶(CMC-Na)和木聚糖酶(Xyl)活性均高于傳統(tǒng)的固 體發(fā)酵(SSF)和液體發(fā)酵(SF)方法，且該過(guò)程所需時(shí)間較短，即短時(shí)間就可以達(dá)到較大酶活 性。
[0072] 8.3木肩+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基3(M-Nmed 3)條件下的木質(zhì)纖維素酶活性
[0073] 在木肩+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基3(M_Nmed 3)條件下，無(wú)論在第6天、第8天或第10天，本發(fā)明方 法（SmF)相對(duì)于固體發(fā)酵（SSF)和液體發(fā)酵(SF)兩種傳統(tǒng)方法而言，使得糙皮側(cè)耳分泌漆 酶、羧甲基纖維素酶和木聚糖酶的能力都有所提升。
[0074] 分別于培養(yǎng)第6天、第8天和第10天取樣測(cè)試，得到固體發(fā)酵(SSF)時(shí)糙皮側(cè)耳分泌 的漆酶活性分別為37 ± 2.7U/L、21 ± 1.9U/L和52 ± 3.8U/L，羧甲基纖維素酶活性分別為15 ± 0 · 6U/L、19 ± 1 · 1U/L 和 66 ± 5 · 7U/L，木聚糖酶活性分別為 47 ± 2 · 6U/L、111 ± 8 · 4U/L 和 227 ± 5.3U/L;液體發(fā)酵（SF)時(shí)的漆酶活性分別為9 ± 0.4U/L、7.6 ± 0.4U/L和10 ± 0.06U/L，羧 甲基纖維素酶活性分別為22 ± 1.9U/L、19 ± 0.7U/L和35 ± 3.0U/L，木聚糖酶活性分別為155 ± 3 · 1U/L、90 ± 1 · 3U/L和109 ± 10U/L;而以本發(fā)明方法(SmF)發(fā)酵時(shí)測(cè)得的漆酶活性分別為 39±3.21]/1、21±1.91]/1和29±2.21]/1，羧甲基纖維素酶活性分別為70±4.21]/1、76± 5.91]/1和188±4.51]/1，木聚糖酶活性分別為260±6.31]/1、276±251]/1和1495±611]/1。
[0075] 綜上所述，通過(guò)本發(fā)明方法(SmF)得到糙皮側(cè)耳在木肩+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基3(M-Nmed 3) 條件下分泌的漆酶(Lac)、羧甲基纖維素酶(CMC-Na)和木聚糖酶(Xyl)活性均高于傳統(tǒng)的固 體發(fā)酵(SSF)和液體發(fā)酵(SF)方法，且該過(guò)程所需時(shí)間較短，即短時(shí)間就可以達(dá)到較大酶活 性。
[0076] 8.4玉米芯+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基1(￥-_6(11)條件下的木質(zhì)纖維素酶活性
[0077]在玉米芯+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基1(Y-Nmed 1)條件下，無(wú)論在第6天、第8天或第10天，本發(fā)明 方法(SmF)相對(duì)于固體發(fā)酵(SSF)和液體發(fā)酵(SF)兩種傳統(tǒng)方法而言，使得糙皮側(cè)耳分泌漆 酶、羧甲基纖維素酶和木聚糖酶的能力都有所提升。
[0078]分別于培養(yǎng)第6天、第8天和第10天取樣測(cè)試，得到固體發(fā)酵(SSF)時(shí)糙皮側(cè)耳分泌 的漆酶活性分別為28 ± 1.8U/L、21 ± 1.7U/L和32 ± 2.6U/L，羧甲基纖維素酶活性分別為111 ± 7 · 5U/L、98 ± 8 · 5U/L 和 164 ± 11U/L，木聚糖酶活性分別為 209 ± 14U/L、209 ± 5 · 7U/L 和 128 ± 5.9U/L;液體發(fā)酵(SF)時(shí)的漆酶活性分別為15 ± 1.5U/L、65 ± 4.7U/L和93 ± 6.1U/L，羧甲 基纖維素酶活性分別為79 ± 3.6U/L、63 ± 5.1U/L和74 ± 0.4U/L，木聚糖酶活性分別為208 土 5.51]/1、278±161]/1和660±481]/1;而以本發(fā)明方法（511^)發(fā)酵時(shí)測(cè)得的漆酶活性分別為 192±151]/1、84±8.01]/1和141±5.71]/1，羧甲基纖維素酶活性分別為263±2.41]/1、193± 12U/L 和 286 ± 24U/L，木聚糖酶活性分別為 1280 ± 120U/L、1298 ± 66U/L 和 255 ± 22.5U/L。 [0079]綜上所述，通過(guò)本發(fā)明方法（SmF)得到糙皮側(cè)耳在玉米芯+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基1 (Y-Nmed 1) 條件下分泌的漆酶(Lac)、羧甲基纖維素酶(CMC-Na)和木聚糖酶(Xyl)活性均高于傳統(tǒng)的 固體發(fā)酵(SSF)和液體發(fā)酵(SF)方法，且該過(guò)程所需時(shí)間較短，即短時(shí)間就可以達(dá)到較大酶 活性。
[0080] 8.5玉米芯+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基2(￥-_6(12)條件下的木質(zhì)纖維素酶活性
[0081] 在玉米芯+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基2(Y-Nmed 2)條件下，無(wú)論在第6天、第8天或第10天，本發(fā)明 方法(SmF)相對(duì)于固體發(fā)酵(SSF)和液體發(fā)酵(SF)兩種傳統(tǒng)方法而言，使得糙皮側(cè)耳分泌漆 酶、羧甲基纖維素酶和木聚糖酶的能力都有所提升。
[0082] 分別于培養(yǎng)第6天、第8天和第10天取樣測(cè)試，得到固體發(fā)酵(SSF)時(shí)糙皮側(cè)耳分泌 的漆酶活性分別為15 ± 1.7U/L、65 ± 4.7U/L和28 ± 1.4U/L，羧甲基纖維素酶活性分別為255 ± 17U/L、384 ± 10U/L 和563 ± 20U/L，木聚糖酶活性分別為219 ± 14U/L、340 ± 22U/L 和320 土 16U/L;液體發(fā)酵(SF)時(shí)的漆酶活性分別為66 ± 3.8U/L、81 ± 8.0U/L和83 ± 5.8U/L，羧甲基 纖維素酶活性分別為463±411]/1、974±1191]/1和1565±1131]/1，木聚糖酶活性分別為413 ± 15U/L、244 ± 16U/L和1301 ± 112U/L;而以本發(fā)明方法（SmF)發(fā)酵時(shí)測(cè)得的漆酶活性分別 為 511±181]/1、417±401]/1和148±121]/1，羧甲基纖維素酶活性分別為1336±1191]/1、1847 ±1421]/1和2891±1801]/1，木聚糖酶活性分別為785±171]/1、862±261]/1和3064±401]/1。 [0083]綜上所述，通過(guò)本發(fā)明方法（SmF)得到糙皮側(cè)耳在玉米芯+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基2(Y-Nmed 2) 條件下分泌的漆酶(Lac)、羧甲基纖維素酶(CMC-Na)和木聚糖酶(Xyl)活性均高于傳統(tǒng)的 固體發(fā)酵(SSF)和液體發(fā)酵(SF)方法，且該過(guò)程所需時(shí)間較短，即短時(shí)間就可以達(dá)到較大酶 活性。
[0084] 8.6玉米芯+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基3(￥-_6(13)條件下的木質(zhì)纖維素酶活性
[0085]在玉米芯+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基3(Y-Nmed 3)條件下，無(wú)論在第6天、第8天或第10天，本發(fā)明 方法(SmF)相對(duì)于固體發(fā)酵(SSF)和液體發(fā)酵(SF)兩種傳統(tǒng)方法而言，使得糙皮側(cè)耳分泌漆 酶、羧甲基纖維素酶和木聚糖酶的能力都有所提升。
[0086]分別于培養(yǎng)第6天、第8天和第10天取樣測(cè)試，得到固體發(fā)酵(SSF)時(shí)糙皮側(cè)耳分泌 的漆酶活性分別為26 ± 1.0U/L、33 ± 2.9U/L和22 ± 2.0U/L，羧甲基纖維素酶活性分別為68 ±6.41]/1、75±6.71]/1和271±121]/1，木聚糖酶活性分別為128±111]/1、178±2.81]/1和219 ± 18U/L;液體發(fā)酵（SF)時(shí)的漆酶活性分別為23 ± 2.3U/L、16 ± 1.3U/L和15 ± 1.4U/L，羧甲 基纖維素酶活性分別為140 ± 8.6U/L、93 ± 7.8U/L和84 ± 7.4U/L，木聚糖酶活性分別為259 ± 9.0U/L、118 ± 9.9U/L和100 ± 9.9U/L;而以本發(fā)明方法(SmF)發(fā)酵時(shí)測(cè)得的漆酶活性分別 為21 ± 2 · 0U/L、100 ± 8 · 4U/L 和 86 ± 3 · 8U/L，羧甲基纖維素酶活性分別為189 ± 5 · 6U/L、144 ±12U/L 和 187±11U/L，木聚糖酶活性分別為 580±11U/L、724±47U/UP1720±158U/L。 [0087]綜上所述，通過(guò)本發(fā)明方法（SmF)得到糙皮側(cè)耳在玉米芯+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基3 (Y-Nmed 3)條件下分泌的漆酶(Lac)、羧甲基纖維素酶(CMC-Na)和木聚糖酶(Xyl)活性均高于傳統(tǒng)的 固體發(fā)酵(SSF)和液體發(fā)酵(SF)方法，且該過(guò)程所需時(shí)間較短，即短時(shí)間就可以達(dá)到較大酶 活性。
[0088] 8.7棉籽殼+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基10-^1^(11)條件下的木質(zhì)纖維素酶活性
[0089] 在棉籽殼+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基1(N-Nmed 1)條件下，無(wú)論在第6天、第8天或第10天，本發(fā)明 方法(SmF)相對(duì)于固體發(fā)酵(SSF)和液體發(fā)酵(SF)兩種傳統(tǒng)方法而言，使得糙皮側(cè)耳分泌漆 酶、羧甲基纖維素酶和木聚糖酶的能力都有所提升。
[0090] 分別于培養(yǎng)第6天、第8天和第10天取樣測(cè)試，得到固體發(fā)酵(SSF)時(shí)糙皮側(cè)耳分泌 的漆酶活性分別為39 ± 1.8U/L、58 ± 4.3U/L和77 ± 4.6U/L，羧甲基纖維素酶活性分別為140 ±10U/L、130±3.6U/L 和 157±11U/L，木聚糖酶活性分別為 218±17U/L、234±2.1U/L 和 143 ± 8.2U/L;液體發(fā)酵（SF)時(shí)的漆酶活性分別為0 ± 0U/L、25 ± 0.4U/L和54 ± 3.6U/L，羧甲基 纖維素酶活性分別為90 ± 6.7U/L、73 ± 7.0U/L和70 ± 6.2U/L，木聚糖酶活性分別為307 土 15U/L、448±39U/L和351±27U/L;而以本發(fā)明方法(SmF)發(fā)酵時(shí)測(cè)得的漆酶活性分別為543 ±21U/L、198±18U/L 和 184±15U/L，羧甲基纖維素酶活性分別為 159±3.0U/L、123±11U/L 和 148 ± 8.1U/L，木聚糖酶活性分別為 565 ± 13U/L、477 ± 33U/L 和 326 ± 9.2U/L。
[0091] 綜上所述，通過(guò)本發(fā)明方法（SmF)得到糙皮側(cè)耳在棉籽殼+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基1(N-Nmed 1)條件下分泌的漆酶(Lac)、羧甲基纖維素酶(CMC-Na)和木聚糖酶(Xyl)活性均高于傳統(tǒng)的 固體發(fā)酵(SSF)和液體發(fā)酵(SF)方法，且該過(guò)程所需時(shí)間較短，即短時(shí)間就可以達(dá)到較大酶 活性。
[0092] 8.8棉籽殼+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基20-^1^(12)條件下的木質(zhì)纖維素酶活性
[0093] 在棉籽殼+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基2(N-Nmed 2)條件下，無(wú)論在第6天、第8天或第10天，本發(fā)明 方法(SmF)相對(duì)于固體發(fā)酵(SSF)和液體發(fā)酵(SF)兩種傳統(tǒng)方法而言，使得糙皮側(cè)耳分泌漆 酶、羧甲基纖維素酶和木聚糖酶的能力都有所提升。
[0094] 分別于培養(yǎng)第6天、第8天和第10天取樣測(cè)試，得到固體發(fā)酵(SSF)時(shí)糙皮側(cè)耳分泌 的漆酶活性分別為47 ± 0.8U/L、25 ± 0.5U/L和51 ± 3.6U/L，羧甲基纖維素酶活性分別為126 ± 7 · 7U/L、96 ± 6 · 5U/L和 119 ± 8 · 0U/L，木聚糖酶活性分別為6 5 ± 3 · 6U/L、165 ± 14U/L和 138 ± 2.2U/L;液體發(fā)酵(SF)時(shí)的漆酶活性分別為45±2.6U/L、315±31 U/L和14 ± 1.3U/L，羧甲 基纖維素酶活性分別為116±6.61]/1、617±581]/1和1688±331]/1，木聚糖酶活性分別為140 ± 10U/L、369 ± 36U/L和1557 ± 90U/L;而以本發(fā)明方法(SmF)發(fā)酵時(shí)測(cè)得的漆酶活性分別為 7.4±0.71]/1、319±1.71]/1和207±131]/1，羧甲基纖維素酶活性分別為134±8.41]/1、1655 ±1051]/1和3152±1391]/1，木聚糖酶活性分別為175±9.21]/1、832±311]/1和2562±1311]/ L〇
[0095] 綜上所述，通過(guò)本發(fā)明方法（SmF)得到糙皮側(cè)耳在棉籽殼+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基2(N-Nmed 2) 條件下分泌的漆酶(Lac)、羧甲基纖維素酶(CMC-Na)和木聚糖酶(Xyl)活性均高于傳統(tǒng)的 固體發(fā)酵(SSF)和液體發(fā)酵(SF)方法，且該過(guò)程所需時(shí)間較短，即短時(shí)間就可以達(dá)到較大酶 活性。
[0096] 8.9棉籽殼+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基30-^1^(13)條件下的木質(zhì)纖維素酶活性
[0097] 在棉籽殼+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基3(N-Nmed 3)條件下，無(wú)論在第6天、第8天或第10天，本發(fā)明 方法(SmF)相對(duì)于固體發(fā)酵(SSF)和液體發(fā)酵(SF)兩種傳統(tǒng)方法而言，使得糙皮側(cè)耳分泌漆 酶、羧甲基纖維素酶和木聚糖酶的能力都有所提升。
[0098] 分別于培養(yǎng)第6天、第8天和第10天取樣測(cè)試，得到固體發(fā)酵(SSF)時(shí)糙皮側(cè)耳分泌 的漆酶活性分別為43 ± 1.3U/L、24 ± 1.9U/L和47 ± 3.8U/L，羧甲基纖維素酶活性分別為75 ±6.61]/1、91±4.51]/1和111±9.41]/1，木聚糖酶活性分別為68±6.01]/1、136±7.61]/1和 238±151]/1;液體發(fā)酵（3?)時(shí)的漆酶活性分別為14±1.31]/1、38±3.51]/1和3.6±0.31]/1， 羧甲基纖維素酶活性分別為53 ± 2.4U/L、50 ± 3.1U/L和50 ± 2.2U/L，木聚糖酶活性分別為 261±221]/1、145±141]/1和121±9.71]/1;而以本發(fā)明方法（511^)發(fā)酵時(shí)測(cè)得的漆酶活性分 別為98 ±6.9U/L、103 ±8.9U/L和40 ±4.0U/L，羧甲基纖維素酶活性分別為61 ± 5.6U/L、126 ±6.51]/1和201±111]/1，木聚糖酶活性分別為431±111]/1、322±8.71]/1和1499±211]/1。
[0099] 綜上所述，通過(guò)本發(fā)明方法（SmF)得到糙皮側(cè)耳在棉籽殼+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基3(N-Nmed 3) 條件下分泌的漆酶(Lac)、羧甲基纖維素酶(CMC-Na)和木聚糖酶(Xyl)活性均高于傳統(tǒng)的 固體發(fā)酵(SSF)和液體發(fā)酵(SF)方法，且該過(guò)程所需時(shí)間較短，即短時(shí)間就可以達(dá)到較大酶 活性。
[0100] 8.10發(fā)明方法與傳統(tǒng)方法的最大產(chǎn)酶活性比較
[0101] 此前的研究大都集中于固體發(fā)酵(SSF)和液體發(fā)酵(SF)，且多數(shù)以甘蔗渣、稻草等 農(nóng)林廢棄物作為誘導(dǎo)材料，本發(fā)明則以木質(zhì)纖維素含量差異較大的木肩、玉米芯和棉籽殼 作為誘導(dǎo)材料進(jìn)行研究。
[0102] 分別利用木肩+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基1(M-Nemd 1)、木肩+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基2(M-Nemd 2)、木肩+營(yíng) 養(yǎng)培養(yǎng)基3(M-Nemd 3)、玉米芯+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基1(Y-Nemd 1)、玉米芯+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基2(Y-Nemd2)、 玉米芯+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基3(Y-Nemd 3)、棉籽殼+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基1(N-Nemd 1)、棉籽殼+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基2 (N-Nemd 2)和棉籽殼+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基3(N-Nemd 3)6種培養(yǎng)基對(duì)糙皮側(cè)耳進(jìn)行培養(yǎng)，于第6天時(shí) 測(cè)得其在固體發(fā)酵(SSF)條件下的最大漆酶活性為47±0.8U/L，最大羧甲基纖維素酶活性 為255±17U/L，最大木聚糖酶活性為219±14U/L;在液體發(fā)酵(SF)條件下的最大漆酶活性 為66 ± 3.8U/L，最大羧甲基纖維素酶活性為463 ± 41U/L，最大木聚糖酶活性為413 ± 15U/L; 而在本發(fā)明方法(SmF)發(fā)酵條件下的最大漆酶活性為543±21U/L，最大羧甲基纖維素酶活 性為1336±119U/L，最大木聚糖酶活性為1280±120U/L?？梢?jiàn)，通過(guò)本發(fā)明方法（SmF)得到 糙皮側(cè)耳分泌的最大漆酶活性是固體發(fā)酵方法(SSF)的11.6倍，是液體發(fā)酵方法(SF)的8.2 倍;最大羧甲基纖維素酶活性是固體發(fā)酵方法(SSF)的5.2倍，是液體發(fā)酵方法（SF)的2.9 倍;最大木聚糖酶活性是固體發(fā)酵方法(SSF)的5.8倍，是液體發(fā)酵方法(SF)的3.1倍。
[0103] 于第8天時(shí)測(cè)得糙皮側(cè)耳在固體發(fā)酵(SSF)條件下的最大漆酶活性為65±4.7U/L， 最大羧甲基纖維素酶活性為384±10U/L，最大木聚糖酶活性為340±22U/L;在液體發(fā)酵 (SF)條件下的最大漆酶活性為315±31U/L，最大羧甲基纖維素酶活性為974±119U/L，最大 木聚糖酶活性為448±39U/L;而在本發(fā)明方法（SmF)發(fā)酵條件下的最大漆酶活性為417± 40U/L，最大羧甲基纖維素酶活性為1847±142U/L，最大木聚糖酶活性為1298±66U/L?？?見(jiàn)，通過(guò)本發(fā)明方法(SmF)得到糙皮側(cè)耳分泌的最大漆酶活性是固體發(fā)酵方法(SSF)的6.4 倍，是液體發(fā)酵方法（SF)的1.3倍;最大羧甲基纖維素酶活性是固體發(fā)酵方法(SSF)的4.8 倍，是液體發(fā)酵方法(SF)的1.9倍;最大木聚糖酶活性是固體發(fā)酵方法(SSF)的3.8倍，是液 體發(fā)酵方法(SF)的2.9倍。
[0104] 于第10天時(shí)測(cè)得糙皮側(cè)耳在固體發(fā)酵（SSF)條件下的最大漆酶活性為77±4.6U/ L，最大羧甲基纖維素酶活性為563 ± 20U/L，最大木聚糖酶活性為320 ± 16U/L;在液體發(fā)酵 (SF)條件下的最大漆酶活性為93 ± 6.1U/L，最大羧甲基纖維素酶活性為1688 ± 33U/L，最大 木聚糖酶活性為1557±90U/L;而在本發(fā)明方法(SmF)發(fā)酵條件下的最大漆酶活性為207± 131]/1，最大羧甲基纖維素酶活性為3152±1391]/1，最大木聚糖酶活性為3064±401]/1?？?見(jiàn)，通過(guò)本發(fā)明方法(SmF)得到糙皮側(cè)耳分泌的最大漆酶活性是固體發(fā)酵方法(SSF)的2.7 倍，是液體發(fā)酵方法（SF)的2.2倍;最大羧甲基纖維素酶活性是固體發(fā)酵方法(SSF)的5.6 倍，是液體發(fā)酵方法(SF)的1.9倍;最大木聚糖酶活性是固體發(fā)酵方法(SSF)的9.6倍，是液 體發(fā)酵方法(SF)的2.0倍。
[0105]九、結(jié)論
[0106] 通過(guò)對(duì)糙皮側(cè)耳菌株CCEF 89在木肩+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基1(M-Nemd 1)、木肩+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基 2(M-Nemd 2)、木肩+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基3(M-Nemd 3)、玉米芯+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基1(Y-Nemd 1)、玉米芯+營(yíng) 養(yǎng)培養(yǎng)基2(Y_Nemd 2)、玉米芯+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基3(Y-Nemd 3)、棉籽殼+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基1(N-Nemd 1)、棉籽殼+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基2(N_Nemd 2)和棉籽殼+營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基3(N_Nemd 3)6種培養(yǎng)基條件下 分泌的木質(zhì)纖維素酶活性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明方法(SmF)下測(cè)得的酶活性高于傳統(tǒng)的固 體(SSF)和液體(SF)發(fā)酵方法。
[0107] 通過(guò)本發(fā)明方法(SmF)得到糙皮側(cè)耳分泌的最大漆酶活性是固體發(fā)酵方法(SSF) 的11.6倍，是液體發(fā)酵方法(SF)的8.2倍;最大羧甲基纖維素酶活性是固體發(fā)酵方法(SSF) 的5.2倍，是液體發(fā)酵方法(SF)的2.9倍;最大木聚糖酶活性是固體發(fā)酵方法(SSF)的5.8倍， 是液體發(fā)酵方法(SF)的3.1倍。
[0108] 本發(fā)明有望成為一種能夠替代傳統(tǒng)發(fā)酵方法、充分利用農(nóng)林廢棄物以提高白腐真 菌產(chǎn)木質(zhì)纖維素酶的新技術(shù)。
[0109]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制。任 何本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍的情況下，都可利用上述揭示的技術(shù) 內(nèi)容對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案作出多種可能的變動(dòng)和修飾，或修改為等同變化的等效實(shí)施例。因 此，凡是不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所做的任何簡(jiǎn)單 修改、等同變化及修飾，均屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 含高活性木質(zhì)纖維素酶的酶液制備方法，適于利用真菌生產(chǎn)木質(zhì)纖維素酶，其特征 在于包括以下步驟： a. 將產(chǎn)酶真菌、木質(zhì)纖維素基質(zhì)與第一營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基混合，實(shí)施靜置培養(yǎng)； b. 向步驟a靜置培養(yǎng)完成的混合物中加入第二營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，實(shí)施搖床培養(yǎng)； 搖床培養(yǎng)完成，步驟b中的混合物即是所述含高活性木質(zhì)纖維素酶的酶液。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的含高活性木質(zhì)纖維素酶的酶液制備方法，其特征在于，所述第 二營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基和第一營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基是相同的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的含高活性木質(zhì)纖維素酶的酶液制備方法，其特征在于，提取步 驟b完成后的上清液能夠獲得更高活性的酶液。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的含高活性木質(zhì)纖維素酶的酶液制備方法，其特征在于， 所述產(chǎn)酶真菌是白腐真菌。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的含高活性木質(zhì)纖維素酶的酶液制備方法，其特征在于，所述白 腐真菌是糙皮側(cè)耳。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的含高活性木質(zhì)纖維素酶的酶液制備方法，其特征在于，第一營(yíng) 養(yǎng)培養(yǎng)基有下列三種方案： 方案一：按重量份，包括以下成分：（NH4)2S〇4 1.4g、KH2P〇4 2g、MgS〇4*7H20 0.2g、蛋白 胨5g、酵母浸粉2g、鹽溶液I g，pH自然； 方案二：按重量份，包括以下成分：葡萄糖5g、酵母浸粉2g、蛋白胨5g、（NH4)2S〇4 1.4g、 KH2PO4 2g、MgS〇4*7H20 0.2g，pH自然； 方案三:按重量份，包括以下成分:酵母浸粉2g、蛋白胨5g、（NH4)2S〇4 1.4g、KH2P〇4 2g、 MgS〇4 · 7H2O 0.2g，pH自然。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的含高活性木質(zhì)纖維素酶的酶液制備方法，其特征在于，所述的 鹽溶液按重量份，包括以下成分:FeS〇4.7H 20 5mg、MnS〇4，H20 1.6mg、ZnS〇4.7H20 1.4mg、 C0OI2 2mg，pH自然。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的含高活性木質(zhì)纖維素酶的酶液制備方法，其特征在于，所述木 質(zhì)纖維素基質(zhì)包括北京楊、玉米芯和棉籽殼。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的含高活性木質(zhì)纖維素酶的酶液制備方法，其特征在于，步驟a 中的產(chǎn)酶菌選用的是該產(chǎn)酶菌的菌絲均質(zhì)體。10. 含高活性木質(zhì)纖維素酶的酶液，其特征在于，采用權(quán)利要求1所述的方法制備。
【文檔編號(hào)】C12R1/645GK105886486SQ201610429934
【公開(kāi)日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年6月16日
【發(fā)明人】安琪, 司靜, 韓美玲, 崔寶凱, 鄭飛, 馬瑞豐, 戴玉成
【申請(qǐng)人】北京林業(yè)大學(xué)