一種魚類組織中三種脫碘酶活性的測定方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種魚類組織中三種脫碘酶活性的測定方法，它主要包括配置組織勻漿、測定蛋白質(zhì)含量、在孵育夜中孵育、終止反應并計算含量幾步。本發(fā)明的測定方法樣品處理過程簡單，只需在加入還原劑DTT的PBS緩沖液中勻漿即可，操作過程也比較簡便，實驗儀器僅需要高速冷凍離心機，紫外分光光度計，水浴鍋和γ放射免疫計數(shù)儀即可。碘125標記物可在生物技術(shù)研究所定制合成，其半衰期較長，有利于實驗的開展，測定結(jié)果可靠，具有很強的實用性。
【專利說明】一種魚類組織中三種脫碘酶活性的測定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明動物生理學和生物化學【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種魚類組織中三種脫碘酶活性的測定方法。

【背景技術(shù)】
[0002]目前關(guān)于脫碘酶活性測定的方法僅有一篇于1996年發(fā)表在ClinicalB1chemistry上的“一種用碘125標記的反三碘原腺甲氨酸為底物測定肝臟和腎臟中I型脫碘酶的方法” (Hotz, C.S., Belonje, B., Fitzpatrick, D.ff., L’ abbe, M.R., 1996.A Methodfor the Determinat1n of Type I 1dothyronine De1d nase Activity in Liver andKidney Usingl251-LabeIled Reverse Tri1dothyronine as a Substrate.ClinicalB1chemistry29, 451-456.)。但該文獻沒有介紹II型和III型脫碘酶的測定方法。國內(nèi)外文獻中有多篇涉及脫碘酶活性測定的內(nèi)容，雖然都是利用放射性的碘標記物作為反應底物來測定脫碘酶的活性，但方法不盡相同，沒有統(tǒng)一的標準。
[0003]脫碘酶是一種硒蛋白，存在于細胞質(zhì)膜中，它們對甲狀腺激素的代謝過程有著非常重要的調(diào)節(jié)作用，測定其活性對甲狀腺功能的研究以及發(fā)病機理有重要作用。脫碘酶活性表示為:每分鐘每毫克蛋白質(zhì)釋放出的I的皮摩爾數(shù)或發(fā)摩爾數(shù)。(pmol/fmol Ireleased.mg protein-1.minute—1)。根據(jù)不同的物理化學特性、組織分布、底物特異性和對抑制劑的敏感性，脫碘酶可以分為三種類型:I型脫碘酶(IDl)、II型脫碘酶(ID2)、111型脫碘酶(ID3)。這三種脫碘酶分別有著各自最適的反應底物。測定的方法是，用碘125標記相應的底物，經(jīng)過一定時間的孵育之后，測定由脫碘酶脫下的碘離子的放射性強度，然后經(jīng)過公式計算出脫碘酶的活性，脫碘酶的活性表示為每分鐘每毫克蛋白質(zhì)釋放出的碘離子的發(fā)摩爾數(shù)。目前國內(nèi)外還尚未見有測定魚類組織中三種脫碘酶活性的試劑盒，也沒有標準的測定方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種動物組織中三種脫碘酶活性的測定方法，本測定方法操作簡單方便，成本低，測定結(jié)果直接可靠。
[0005]本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的:一種魚類組織中三種脫碘酶活性的測定方法，其步驟包括:(1)稱取動物組織后用緩沖液將動物組織配制成質(zhì)量濃度為1-2%的勻漿，并離心取上清夜；(2)測定所述上清液中蛋白質(zhì)含量；(3)將所述上清液按照體積比1:1加入孵育液在37°C下孵育120min ;將緩沖液按照同樣方法加入孵育液后在37°C下孵育120min作為對照組；測定I型脫碘酶活性的孵育液為50000cpm1251-rT3,0.1 μ M rT3，15mMDTT混合物；測定II型脫碘酶的孵育液為50000cpm1251-T4，lnM T4,30mM DTT混合物；測定III型脫碘酶的孵育液為150000cpm1251-T3，InM Ts,30mM DTT混合物；(4)加入BSA溶液終止反應后沉淀離心，取上清液用放射免疫計數(shù)儀分別測定總放射性及上清液的放射性cpm值，依據(jù)下述經(jīng)驗公式分別計算動物組織中三種脫碘酶活性:

【權(quán)利要求】
1.一種魚類組織中三種脫碘酶活性的測定方法，其步驟包括:(1)稱取動物組織后用緩沖液將動物組織配制成質(zhì)量濃度為1-5%的勻漿，并離心取上清夜；(2)測定所述上清液中蛋白質(zhì)含量；(3)將所述上清液按照體積比1:1加入孵育液在37°C下孵育120min ;將緩沖液按照同樣方法加入孵育液后在37°C下孵育120min作為對照組；測定I型脫碘酶活性的孵育液為50000cpm1251-rT3，0.1 μ M rT3，15mM DTT混合物；測定II型脫碘酶的孵育液為50000cpm1251-T4, InM T4，30mMDTT 混合物；測定III型脫碘酶的孵育液為 150000cpm1251-T3，InM T3, 30mM DTT混合物；(4)加入BSA溶液終止反應后沉淀離心，取上清液用放射免疫計數(shù)儀分別測定總放射性及上清液的放射性cpm值，依據(jù)下述經(jīng)驗公式分別計算動物組織中三種脫碘酶活性:
其中:其中SCc = SC - BC ； BC:對照管的放射性計數(shù)； SC:樣品管的放射性計數(shù)； SA:孵育液中反應底物的含量/TC ； TC:總放射性計數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述魚類組織中三種脫碘酶活性的測定方法，其特征在于:所述緩沖液為0.1M的pH = 7.0的PBS緩沖液,其中含有2mM EDTA, IMm DTT0
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述魚類組織中三種脫碘酶活性的測定方法，其特征在于:所述步驟(4)中BSA溶液4°C的質(zhì)量體積濃度為5 %的BSA溶液，BSA溶液的加入量與上清液的體積比為1:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述魚類組織中三種脫碘酶活性的測定方法，其特征在于:所述步驟(4)中加入BSA溶液后沉淀是加入了質(zhì)量體積濃度為10%的TCA溶液，并在3500r/min下離心30min，TCA溶液的加入量與上清液的體積比為2:1。
【文檔編號】G01N33/573GK104165988SQ201410369496
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月31日
【發(fā)明者】李大鵬, 劉子棟 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學