專(zhuān)利名稱(chēng)：一種人血清中酶活性穩(wěn)定的處理方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā) 明涉及醫(yī)學(xué)量值溯源領(lǐng)域，特別是涉及一種人體血清的處理方法。
背景技術(shù)：
量值溯源是近年檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題，其目的是解決臨床常規(guī)方法測(cè)量的準(zhǔn)確可比，核心問(wèn)題在于臨床常規(guī)方法的校準(zhǔn)品應(yīng)具有溯源性和與測(cè)量樣本良好的互通性。 2005年后中國(guó)已逐步建立起參考體系，校準(zhǔn)品的溯源性問(wèn)題從技術(shù)角度已基本解+決，互通性問(wèn)題仍是困擾臨床常規(guī)方法測(cè)量準(zhǔn)確可比的難題。由于人血清樣本的高度復(fù)雜性和不穩(wěn)定性，尋找并建立與人血清具有很好互通性并符合穩(wěn)定性要求的校準(zhǔn)品是解決臨床酶學(xué)項(xiàng)目量值溯源的核心問(wèn)題?；ネㄐ允侵钢苽湮锱c待測(cè)量樣本在相同分析系統(tǒng)中進(jìn)行測(cè)量時(shí)表現(xiàn)出的與待測(cè)量樣本在分析系統(tǒng)中的反應(yīng)一致的特性。在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)定量分析領(lǐng)域，待測(cè)量樣本為人血清， 由于其成分的高度復(fù)雜性、儲(chǔ)存的不穩(wěn)定性、來(lái)源的局限性等多種原因?qū)е略卺t(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室使用人血清基質(zhì)樣本為校準(zhǔn)品進(jìn)行人血清樣本測(cè)量的理想測(cè)量狀況無(wú)法實(shí)現(xiàn)，產(chǎn)品制造業(yè)不得不采用與人血清具有某些相似特性的易獲取的牛血清白蛋白溶液作校準(zhǔn)品的基質(zhì)或直接對(duì)一些分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的無(wú)機(jī)小分子采用水溶液作校準(zhǔn)品的基質(zhì)。但對(duì)于一些生物大分子類(lèi)物質(zhì)尤其是具有空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)如酶的測(cè)量采用上述基質(zhì)校準(zhǔn)品時(shí)，常導(dǎo)致校準(zhǔn)品中酶與待測(cè)量樣本人血清中同種酶在同一分析系統(tǒng)中表現(xiàn)出不一致的特性，即校準(zhǔn)品的基質(zhì)效應(yīng)。這是目前醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室酶學(xué)定量測(cè)量中導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室間測(cè)量變異大，缺乏準(zhǔn)確可比性的重要原因；也是北京市政府提出檢驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)一、互認(rèn)的最大技術(shù)障礙之一。酶是人體內(nèi)最重要的蛋白質(zhì)之一，其具有復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，它的催化活性通過(guò)其分子結(jié)構(gòu)中的催化活性中心暴露并與其催化底物結(jié)合實(shí)現(xiàn)催化人體內(nèi)各種復(fù)雜代謝反應(yīng)的作用。由于酶本質(zhì)是蛋白質(zhì)，多種因素如溫度、PH、離子濃度、滲透壓等變化均可致其變性，導(dǎo)致酶催化活性的改變或消失，實(shí)驗(yàn)室通過(guò)對(duì)酶催化活性的測(cè)量可監(jiān)測(cè)酶的變性與失活。因此，校準(zhǔn)品中酶的穩(wěn)定性對(duì)酶的準(zhǔn)確測(cè)量至關(guān)重要。由于酶本身易變性和實(shí)驗(yàn)室的酶測(cè)量絕大多數(shù)是基于催化活性測(cè)量的特性，校準(zhǔn)品的基質(zhì)即酶的載體對(duì)酶活性的穩(wěn)定作用明顯。既往的研究有二類(lèi)一類(lèi)是基于牛血清白蛋白基質(zhì)的血清酶校準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。此類(lèi)校準(zhǔn)品特點(diǎn)是校準(zhǔn)品(酶活性)穩(wěn)定期長(zhǎng)，但通常有明顯的基質(zhì)效應(yīng)，常導(dǎo)致不同分析系統(tǒng)測(cè)量結(jié)果變異大、缺乏可比性，以此類(lèi)校準(zhǔn)品校準(zhǔn)的各常規(guī)方法測(cè)量結(jié)果多不具有溯源性，即與國(guó)際公認(rèn)的參考方法的測(cè)量結(jié)果不一致；另一類(lèi)是基于人血清的校準(zhǔn)品，此類(lèi)校準(zhǔn)品的最大問(wèn)題是不穩(wěn)定。目前，國(guó)內(nèi)外均還沒(méi)有關(guān)于立足于采用與測(cè)量樣本基質(zhì)相同的人血清有效地解決互通性問(wèn)題的人血清中酶活性穩(wěn)定的研究成果。

發(fā)明內(nèi)容
通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)人血清中含有多種蛋白質(zhì)、代謝物、離子和微量元素等物質(zhì)，這些物質(zhì)在離體后仍會(huì)發(fā)生不斷變化，變化程度與處理過(guò)程、保存條件密切相關(guān)。某些因素的變化不導(dǎo)致酶活性的改變，但某些因素的微小變化都有可能導(dǎo)致酶活性的明顯改變或完全喪失。因此在人血清處理與保存過(guò)程中，對(duì)可能引起人血清中酶活性變化的關(guān)鍵因素進(jìn)行控制是解決酶活性穩(wěn)定的核心。本發(fā)明的目的在于提供一種人血清中酶活性穩(wěn)定的處理方法，立足于采用與測(cè)量樣本基質(zhì)相同的人血清來(lái)有效地解決互通性問(wèn)題。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的及技術(shù)方案為，一種人血清中酶活性穩(wěn)定的處理方法， 包括以下步驟步驟一，血清收集收集血液采集當(dāng)日新鮮人血清，放置在密閉容器中，凍至-20— 一-80°C以下，在冰柜中保存；步驟二，不穩(wěn)定成分去除 (1)將裝有人血清的容器從冰柜取出，在室溫下自然放置4-8小時(shí)，至肉眼觀(guān)察容器中塊狀冰凍血清完全溶解后，在-20--80°C以下冷凍2小時(shí)以上；(2)將裝有人血清的容器在2-10°C下放置10小時(shí)以上，至肉眼觀(guān)察容器中塊狀冰凍血清完全溶解后，再在-20--80°C以下冷凍2小時(shí)以上；(3)用10——20°C水沖洗裝有人血清容器的外表面，沖至肉眼觀(guān)察容器中塊狀冰凍血清完全溶解。使人血清中引起酶活性不穩(wěn)定的各種蛋白質(zhì)、凝血因子、離子、代謝物等物質(zhì)由易變狀態(tài)轉(zhuǎn)化為處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)；由于人血清成分相當(dāng)復(fù)雜，不僅含有K、Na等多種穩(wěn)定的電解質(zhì)，也含有葡萄糖、 尿素等小分子代謝物，同時(shí)還含有大量蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)屬性的各種代謝中間產(chǎn)物、各型維生素、甾體化合物等，通常認(rèn)為蛋白質(zhì)及具有蛋白質(zhì)屬性的各種代謝中間產(chǎn)物是引起人血清不穩(wěn)定的重要因素。經(jīng)冷凍、快速溶解、自然溶解和緩慢溶解四個(gè)物理過(guò)程，血清中絕大多數(shù)蛋白質(zhì)及具有蛋白質(zhì)屬性的各種代謝中間產(chǎn)物空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，在采用以保護(hù)酶活性為主要目的的多種復(fù)溶方式復(fù)溶后后，人血清中酶活性的穩(wěn)定性明顯提高。既往采用單一凍融方式時(shí)仍表現(xiàn)為部分酶活性的不穩(wěn)定，實(shí)質(zhì)是致酶易變因素去除不完全。步驟三、纖維蛋白等雜質(zhì)去除，采用濾紙濾除血清中的纖維蛋白絲、各種抗原抗體復(fù)合物和蛋白復(fù)合顆粒等雜質(zhì)。步驟四、無(wú)菌處理，經(jīng)步驟三處理過(guò)的人血清在常規(guī)無(wú)菌條件下使用微孔濾膜進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾。步驟五、分裝保存，包括以下步驟；(1)選用可密閉、防凍、不易破損的血清存儲(chǔ)容器分裝血清樣本。(2)對(duì)血清存儲(chǔ)容器進(jìn)行無(wú)菌處理。(3)在無(wú)菌狀態(tài)下檢查各血清存儲(chǔ)容器是否密閉。(4)無(wú)菌處理后的血清樣本在無(wú)菌條件下采用各種移液裝置如吸管、移液器、連續(xù)或不連續(xù)樣品分配器、自動(dòng)化分配裝置或儀器等進(jìn)行分裝，分裝過(guò)程應(yīng)控制在3小時(shí)以?xún)?nèi) (實(shí)施例)。(5)密閉各血清存儲(chǔ)容器并確認(rèn)。(6)標(biāo)記。(7)存儲(chǔ)于-80°C以下冰柜儲(chǔ)存。步驟六、無(wú)菌狀態(tài)檢查，分別取分裝過(guò)程的開(kāi)始、中間、最后三支人血清樣品進(jìn)行血液培養(yǎng)，驗(yàn)證人血清是否 處于無(wú)菌狀態(tài)；如果三支人血清樣品均為無(wú)菌狀態(tài)，則表明血清制備無(wú)菌過(guò)程合格，操作步驟結(jié)束；如果一個(gè)或多個(gè)人血清樣品未處于無(wú)菌狀態(tài)，則重復(fù)操作步驟四、步驟五和步驟六，直至血清制備無(wú)菌過(guò)程合格為止。進(jìn)一步，如上所述的一種人血清中酶活性穩(wěn)定的處理方法，其中，步驟一中新鮮人血清冷凍保存溫度范圍為-20 -80°C。進(jìn)一步，如上所述的一種人血清中酶活性穩(wěn)定的處理方法，其中，步驟二中第(2) 步血清的放置溫度為2-10°C。進(jìn)一步，如上所述的一種人血清中酶活性穩(wěn)定的處理方法，其中，步驟三中使用的濾紙為低——高速# 15-30cm定性濾紙。進(jìn)一步，如上所述的一種人血清中酶活性穩(wěn)定的處理方法，其中，步驟四中使用的微孔濾膜為# 50-2000mm、孔徑0. 20-0. SOum的微孔濾膜無(wú)菌過(guò)濾。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明立足于采用與測(cè)量樣本基質(zhì)相同的人血清來(lái)有效解決互通性問(wèn)題，將收集的人血清通過(guò)一系列技術(shù)處理，使人血清中酶活性在一定時(shí)期內(nèi)穩(wěn)定， 以滿(mǎn)足臨床使用需求，采用上述方案制備的人血清中酶活性至少能夠穩(wěn)定一年以上。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例步驟一、收集實(shí)驗(yàn)當(dāng)日的新鮮人血清放置到封閉的凍融管中，將其凍至-60°C以下，至收集至約1000ml。步驟二、將血清從冰柜取出，在室溫下自然放置4個(gè)小時(shí)，至肉眼觀(guān)察完全溶解， 在-60°C以下冷凍2小時(shí)以上；再將血清在4°C下放置10小時(shí)，至肉眼觀(guān)察完全溶解，然后在-60°C以下冷凍2小時(shí)；再用10°C的水沖洗裝血清的凍融管，沖至肉眼觀(guān)察完全溶解。步驟三、采用低——高速# 15-30cm定性濾紙濾除血清中的纖維蛋白絲、各種抗原抗體復(fù)合物和蛋白復(fù)合顆粒等雜質(zhì)。步驟四、初濾后的人血清在常規(guī)無(wú)菌條件下進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾，使用# 50-2000mm、孔徑0. 20-0. SOum的微孔濾膜，濾菌使用天津奧特賽恩斯儀器有限公司生產(chǎn)的autoscience
濾圉器。步驟五、在無(wú)菌狀態(tài)下檢查1. Oml的凍溶管的密閉性，對(duì)能夠密閉的容量為1. Oml 的凍溶管采用紫外線(xiàn)照射30分鐘方法消毒，進(jìn)行無(wú)菌處理，然后用液體分配器進(jìn)行血清分裝、標(biāo)記，并存儲(chǔ)于-80°C以下的冰柜中。步驟六、無(wú)菌狀態(tài)檢查取分裝過(guò)程開(kāi)始、中間、最后三支樣品進(jìn)行血液培養(yǎng)，經(jīng)驗(yàn)證，人血清皆處于無(wú)菌狀態(tài)，無(wú)菌狀態(tài)檢查采用現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行。試驗(yàn)例針對(duì)上述實(shí)施例中制備的人血清樣品，進(jìn)行Y-谷氨?；D(zhuǎn)移酶(GGT)、肌酸激酶 (CK)和淀粉酶(AMY)的穩(wěn)定性試驗(yàn)，試驗(yàn)中的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)方法、測(cè)量參數(shù)、數(shù)據(jù)有效性判斷標(biāo)準(zhǔn)均為現(xiàn)有技術(shù)。試驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論如下
權(quán)利要求
1.一種人血清中酶活性穩(wěn)定的處理方法，包括以下步驟步驟一，血清收集收集血液采集當(dāng)日新鮮人血清，放置在密閉容器中，凍至-20—— -80°C以下，在冰柜中保存；步驟二，不穩(wěn)定成分去除(1)將裝有人血清的容器從冰柜取出，在室溫下自然放置4-8小時(shí)，至肉眼觀(guān)察容器中塊狀冰凍血清完全溶解后，在-20--80°C以下冷凍2小時(shí)以上；(2)將裝有人血清的容器在2-10°C下放置10小時(shí)以上，至肉眼觀(guān)察容器中塊狀冰凍血清完全溶解后，再在-20--80°C以下冷凍2小時(shí)以上；(3)用10——20°C水沖洗裝有人血清容器的外表面，沖至肉眼觀(guān)察容器中塊狀冰凍血清完全溶解，使人血清中引起酶活性不穩(wěn)定的各種蛋白質(zhì)、凝血因子、離子、代謝物等物質(zhì)由易變狀態(tài)轉(zhuǎn)化為處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)；步驟三、纖維蛋白等雜質(zhì)去除，采用濾紙濾除血清中的纖維蛋白絲、各種抗原抗體復(fù)合物和蛋白復(fù)合顆粒等雜質(zhì)。步驟四、無(wú)菌處理，經(jīng)步驟三處理過(guò)的人血清在常規(guī)無(wú)菌條件下使用微孔濾膜進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾。步驟五、分裝保存，包括以下步驟；(1)選用可密閉、防凍、不易破損的血清存儲(chǔ)容器分裝血清樣本。(2)對(duì)血清存儲(chǔ)容器進(jìn)行無(wú)菌處理。 (3)在無(wú)菌狀態(tài)下檢查各血清存儲(chǔ)容器是否密閉。(4)無(wú)菌處理后的血清樣本在無(wú)菌條件下采用移液裝置進(jìn)行分裝，分裝過(guò)程應(yīng)控制在 3小時(shí)以?xún)?nèi)(實(shí)施例)。(5)密閉各血清存儲(chǔ)容器并確認(rèn)。(6)標(biāo)記。(7)存儲(chǔ)于-80°C以下冰柜儲(chǔ)存。步驟六、無(wú)菌狀態(tài)檢查，分別取分裝過(guò)程的開(kāi)始、中間、最后三支人血清樣品進(jìn)行血液培養(yǎng)，驗(yàn)證人血清是否處于無(wú)菌狀態(tài)；如果三支人血清樣品均為無(wú)菌狀態(tài)，則表明血清制備無(wú)菌過(guò)程合格，操作步驟結(jié)束；如果一個(gè)或多個(gè)人血清樣品未處于無(wú)菌狀態(tài)，則重復(fù)操作步驟四、步驟五和步驟六，直至血清制備無(wú)菌過(guò)程合格為止。
2.如權(quán)利要求1所述的一種人血清中酶活性穩(wěn)定的處理方法，其特征在于步驟一中新鮮人血清冷凍保存溫度范圍為-20 -80°C。
3.如權(quán)利要求1所述的一種人血清中酶活性穩(wěn)定的處理方法，其特征在于步驟二第 (2)步中人血清的放置溫度為2-10°C。
4.如權(quán)利要求1所述的一種人血清中酶活性穩(wěn)定的處理方法，其特征在于步驟三中使用的濾紙為低——高速# 15-30cm定性濾紙。
5.如權(quán)利要求1所述的一種人血清中酶活性穩(wěn)定的處理方法，其特征在于步驟四中使用的微孔濾膜為# 50-2000mm、孔徑0. 20-0. SOum的微孔濾膜無(wú)菌過(guò)濾。
全文摘要
一種人血清中酶活性穩(wěn)定的處理方法，包括以下步驟步驟一，血清收集；步驟二，不穩(wěn)定成分去除；步驟三、纖維蛋白等雜質(zhì)去除；步驟四、無(wú)菌處理；步驟五、分裝保存；步驟六、無(wú)菌狀態(tài)檢查。本發(fā)明立足于采用與測(cè)量樣本基質(zhì)相同的人血清來(lái)有效解決互通性問(wèn)題，將收集的人血清通過(guò)一系列技術(shù)處理，使人血清中酶活性在一定時(shí)期內(nèi)穩(wěn)定，以滿(mǎn)足臨床使用需求，采用上述方案制備的人血清中酶活性至少能夠穩(wěn)定一年以上。
文檔編號(hào)G01N1/34GK102221490SQ20101014882
公開(kāi)日2011年10月19日 申請(qǐng)日期2010年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月16日
發(fā)明者孫慧穎, 李月玲, 李玲, 胡濱, 邵燕, 陳寶榮, 陳琦 申請(qǐng)人:北京航天總醫(yī)院