一種nadp磷酸酶活性測(cè)定試劑盒及其方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生命科學(xué)領(lǐng)域領(lǐng)域，涉及一種試劑盒，具體涉及一種NADP磷酸酶活性 測(cè)定試劑盒及其方法。
【背景技術(shù)】
[0002] NADP磷酸酶主要存在于植物組織中，是生物體內(nèi)唯一催化NADP+降解為NAD+的酶， 與NADK-起調(diào)控NAD和NADP之間的平衡。
[0003] 目前已有兩種NADP磷酸酶活性的測(cè)定方法，一種是通過乙醇脫氫酶循環(huán)測(cè)定NAD 變化，另一種是通過孔雀綠定磷法測(cè)定NAD變化。通過乙醇脫氫酶循環(huán)測(cè)定NAD變化的方法 需要嚴(yán)格控制反應(yīng)的溫度和時(shí)間，反應(yīng)條件不易控制，試劑成本較高。孔雀綠定磷法適用于 測(cè)定磷濃度在〇. 〇6-2yg范圍內(nèi)的樣品，若樣品中NADP磷酸酶催化產(chǎn)生的磷含量過高則需要 稀釋后測(cè)定。而且測(cè)定過程需要做預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定樣本中NADP磷酸酶活性產(chǎn)生的無機(jī)磷是 否超過了測(cè)定范圍，較為繁瑣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明旨在提供一種NADP磷酸酶活性測(cè)定試劑盒及其 方法，可快速準(zhǔn)確的計(jì)算出NADP磷酸酶活性。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，達(dá)到上述技術(shù)效果，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)： 一種NADP磷酸酶活性測(cè)定試劑盒，包括以下試劑： 提取液，1瓶，4 °C保存，由蔗糖、EDTA、牛血清白蛋白和苯甲基磺酰氟溶于Tr i s-HCl緩沖 溶液后配制而成，置于60mL試劑瓶中； 試劑一，液體X 1瓶，4°C保存，由Tris溶于水與冰乙酸的混合液后配制而成，置于30mL 試劑瓶中； 試劑二，粉劑X 5支，-20 °C保存，均由NADP組成，置于lmL離心管中； 試劑三，粉劑X 1瓶，4°C保存，由抗壞血酸組成，置于25mL試劑瓶中； 試劑四，粉劑X 1瓶，4°C保存，由鉬酸銨組成，置于25mL試劑瓶中； 試劑五，液體X 1瓶，室溫保存，由濃硫酸與水混合而成，置于25mL試劑瓶中； 試劑六，10mmol/L標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液X 1瓶，4°C保存，由Na2HP〇4 · 12H20溶于水后配制而成， 置于10mL試劑瓶中。
[0006] 進(jìn)一步的，所述提取液中，Tr iS-HC1緩沖溶液的濃度為50mmo 1/L，pH=7.4，體積為 60mL，鹿糖的質(zhì)量為5. lg，EDTA的質(zhì)量為52.6mg，牛血清白蛋白的質(zhì)量為0.3g，苯甲基磺酰 氟的質(zhì)量為lmg; 進(jìn)一步的，所述試劑一中，Tris的質(zhì)量為0.182g，Tris溶于水后與冰乙酸的混合液的pH =5.5，體積為3〇1^; 進(jìn)一步的，所述試劑二中，每支離心管內(nèi)的NADP的質(zhì)量均為5.5mg; 進(jìn)一步的，所述試劑三中，抗壞血酸的質(zhì)量為2.5g; 進(jìn)一步的，所述試劑四中，鉬酸銨的質(zhì)量為〇.625g; 進(jìn)一步的，所述試劑五中，濃硫酸的體積為3.47mL，水的體積為21.53mL; 進(jìn)一步的，所述試劑六中，Na2HP〇4 · 12H20的質(zhì)量為35.814mg，水的體積為10mL。
[0007] NADP磷酸酶催化NADP水解生成NAD和無機(jī)磷，可通過測(cè)定NAD或無機(jī)磷的變化來間 接反映 NADP磷酸酶活性的高低。
[0008] 一種基于分光光度法的NADP磷酸酶活性測(cè)定方法，包括以下步驟： 步驟1儀器和用品的準(zhǔn)備； 準(zhǔn)備可見分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、lmL玻璃比色皿、研缽、 冰和蒸餾水； 步驟2樣本的前處理； 按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1: (5~10)的比例，進(jìn)行冰浴勻漿，再采用離心率 8000g，在4°C下，離心10min，取上清，置冰上待測(cè)； 步驟3試劑臨用前的準(zhǔn)備； 1)在每支所述試劑二中加入1 mL所述試劑一，充分溶解備用，現(xiàn)配現(xiàn)用； 2 )在所述試劑三中加入25mL蒸餾水，溶解后備用； 3 )在所述試劑四中加入25mL蒸餾水，溶解后備用； 步驟4 0.5ymol/mL標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制： 將所述試劑六進(jìn)行20倍稀釋，即取0.5mL所述試劑六加入9.5mL蒸餾水，充分混勻； 步驟5定磷試劑的配制； 按水:試劑三:試劑四：試劑五=2:1:1:1的比例配制，配好的定磷試劑應(yīng)為淺黃色，若無 色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配； 步驟6酶促反應(yīng)；
1) 在第測(cè)定管和對(duì)照管中均加入300yL的所述試劑一和100yL的所述試劑二，并均在37 °C (哺乳動(dòng)物)或25°C (其它物種)下預(yù)熱5min; 2) 在所述測(cè)定管中再加入100此步驟2中前處理過的樣本，在所述對(duì)照管中再加入100μ L蒸餾水； 3) 將所述測(cè)定管在37°C (哺乳動(dòng)物)或25°C (其它物種)下準(zhǔn)確反應(yīng)30min，接著沸水浴 5min(蓋緊，以防止水分散失），冷卻后，再采用離心率10000g，常溫下離心5min，最后取上清 液； 步驟7定磷；
1) 在標(biāo)準(zhǔn)管中加入lOOyL的0.5ymol/mL標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液和lOOOyL的定磷試劑，在空白管 中加入l〇〇yL的蒸餾水和lOOOyL的定磷試劑，在測(cè)定管中加入100yL步驟6中提取的上清液 和1 OOOyL的定磷試劑，在對(duì)照管中加入1 OOyL步驟6中提取的上清液和1 OOOyL的定磷試劑； 2) 將各管內(nèi)的物質(zhì)混勻，在37°C(哺乳動(dòng)物)或25°C(其它物種)下分別水浴30min; 3) 然后將各管冷卻至室溫，接著將分光光度計(jì)的波長(zhǎng)調(diào)節(jié)在660nm處，蒸餾水調(diào)零，記 錄各管吸光值； 步驟8根據(jù)步驟7中得出的各管吸光值，計(jì)算NADP磷酸酶活性； 1) 按組織蛋白濃度計(jì)算： 定義:每小時(shí)每毫克組織蛋白NADP磷酸酶分解NADP產(chǎn)生Ιμπιο?無機(jī)磷的量為一個(gè)NADP 磷酸酶活力單位； NADP磷酸酶(U/mg prot) = (C雛fX V總）X (Aji賭-細(xì){蹐）+ (Afi繼-Aset) + (V樣X Cpr) +Τ= 5 X (Α灘遭-細(xì)蹐）+ (Afi繼-Aset) + Cpr; 2) 按樣本鮮重計(jì)算： 定義:每小時(shí)每g組織NADP磷酸酶分解NADP產(chǎn)生Ιμπιο?無機(jī)磷的量為一個(gè)NADP磷酸酶活 力單位； NADP磷酸酶（U/g鮮重) = (C_1=X V總）X (Α灘證-細(xì)贈(zèng))+ (Α標(biāo)體-AsesO X V總+ (WX V樣+ 觸)+T=5 X (A灘遭-細(xì)蹐)+ (Afi繼-Aset) + ff; 其中，A表示步驟7中各管的吸光值； C?隹t=0.5μηιο 1/mL，表示標(biāo)準(zhǔn)管的濃度； V總=0.5mL，表示酶促反應(yīng)的總體積； V樣=0. lmL，表示加入樣本的體積； V：tm=lmL，表示加入提取液的體積； T=0.5h，表示反應(yīng)時(shí)間； Cpr表示樣本蛋白質(zhì)的濃度，單位為mg/mL; W表示樣本的鮮重，單位為g。
[0009]本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明的方法基于分光光度法，并通過鉬酸銨定磷法來間接測(cè)定NADP磷酸酶活性，相 比孔雀綠定磷法，測(cè)定范圍更廣泛，測(cè)定管吸光值和標(biāo)準(zhǔn)管吸光值比對(duì)即可計(jì)算出NADP磷 酸酶活性，適用于測(cè)定不同NADP磷酸酶活性的樣品，因此不需要將樣品進(jìn)行稀釋。本發(fā)明的 試劑盒所用試劑均為常用試劑，成本極低。本發(fā)明的試劑盒不僅檢測(cè)方便，快速，而且可同 時(shí)測(cè)定多個(gè)樣本，顯色后24小時(shí)內(nèi)，重復(fù)性較好。
[0010]上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段， 并可依照說明書的內(nèi)容予以實(shí)施，以下以本發(fā)明的較佳實(shí)施例詳細(xì)說明。本發(fā)明的具體實(shí) 施方式由以下實(shí)施例詳細(xì)給出。
【具體實(shí)施方式】
[0011]下面將結(jié)合實(shí)施例，來詳細(xì)說明本發(fā)明。
[0012] 實(shí)施例1 一種NADP磷酸酶活性測(cè)定試劑盒，包括以下試劑： 提取液，1瓶，4°C保存，由5. lg蔗糖、52.6mgEDTA、0.3g牛血清白蛋白和lmg苯甲基磺酰 氟溶于濃度為5〇1111]1〇1/1^!1=7.4，體積為6〇111]^的1'1^8-!1(]1緩沖溶液后配制而成，置于6〇1]11^試 劑瓶中； 試劑一，液體X 1瓶，4°C保存，由0.182gTris溶于少量水后用冰乙酸調(diào)節(jié)pH=5.5，最后 用水定容至30mL配制而成，置于30mL試劑瓶中； 試劑二，粉劑X 5支，-20 °C保存，均由5.5mgNADP組成，置于lmL離心管中； 試劑三，粉劑X 1瓶，4°C保存，由2.5g抗壞血酸組成，置于25mL試劑瓶中； 試劑四，粉劑X 1瓶，4°C保存，由0.625g鉬酸銨組成，置于25mL試劑瓶中； 試劑五，液體X 1瓶，室溫保存，由3.47mL濃硫酸與21.53mL水混合而成，置于25mL試劑 瓶中； 試劑六，10mm〇l/L標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液X 1瓶，4°C保存，由35.814mgNa2HP〇4 · 12H20溶于10mL 水后配制而成，置于10mL試劑瓶中。
[0013] 一種基于分光光度法且利用上述試劑盒測(cè)定NADP磷酸酶活性的方法，包括以下步 驟： 步驟1儀器和用品的準(zhǔn)備； 準(zhǔn)備可見分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、lmL玻璃比色皿、研缽、 冰和蒸餾水； 步驟2樣本的前處理； 按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1: (5~10)的比例(建議稱取約O.lg組織，加入lmL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿，再采用離心率8000g，在4°C下，離心10min，取上清，置冰上待測(cè)； 步驟3試劑臨用前的準(zhǔn)備； 1)在每支所述試劑二中加入1 mL所述試劑一，充分溶解備用，現(xiàn)配現(xiàn)用； 2 )在所述試劑三中加入25mL蒸餾水，溶解后備用； 3 )在所述試劑四中加入25mL蒸餾水，溶解后備用； 步驟4 0.5ymol/mL標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制： 將所述試劑六進(jìn)行20倍稀釋，即取0.5mL所述試劑六加入9.5mL蒸餾水，充分混勻； 步驟5定磷試劑的配制； 按水:試劑三:試劑四：試劑五=2:1:1:1的比例配制，配好的定磷試劑應(yīng)為淺黃色，若無 色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配； 步驟6酶促反應(yīng)；
1) 在測(cè)定管和對(duì)照管中均加入300yL的所述試劑一和lOOyL的所述試劑二，并均在37°C (哺乳動(dòng)物)或25°C (其它物種)下預(yù)熱5min; 2) 在所述測(cè)定管中再加入100此步驟2中前處理過的樣本，在所述對(duì)照管中再加入100μ L蒸餾水； 3) 將所述測(cè)定管在37°C (哺乳動(dòng)物)或25°C (其它物種)下準(zhǔn)確反應(yīng)30min，接著沸水浴 5min(蓋緊，以防止水分散失），冷卻后，再采用離心率lOOOOg，常溫下離心5min，最后取上清 液； 步驟7定磷；
1) 在標(biāo)準(zhǔn)管中加入100yL的0.5ymol/mL標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液和lOOOyL的定磷試劑，在空白管 中加入l〇〇yL的蒸餾水和lOOOyL的定磷試劑，在測(cè)定管中加入100yL步驟6中提取的上清液 和1 OOOyL的定磷試劑，在對(duì)照管中加入1 OOyL步驟6中提取的上清液和1 OOOyL的定磷試劑； 2) 將各管內(nèi)的物質(zhì)混勻，在37°C(哺乳動(dòng)物)或25°C(其它物種)下分別水浴30min; 3) 然后將各管冷卻至室溫，接著將分光光度計(jì)的波長(zhǎng)調(diào)節(jié)在660nm處，蒸餾水調(diào)零，記 錄各管吸光值； 步驟8根據(jù)步驟7中得出的各管吸光值，并按組織蛋白濃度，計(jì)算NADP磷酸酶活性計(jì) 算； 定義:每小時(shí)每毫克組織蛋白NADP磷酸酶分解NADP產(chǎn)生Ιμπιο?無機(jī)磷的量為一個(gè)NADP 磷酸酶