一種gbss1比酶活測定方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種GBSS1比酶活測定方法。提供了一種顆粒結(jié)合型淀粉合成酶(GBSS1酶)比酶活測定的方法，應(yīng)用ELISA技術(shù)對酶提取物在GBSS1蛋白水平上進(jìn)行了定量，并對以往的GBSS1酶活測定步驟進(jìn)行了簡化。
【專利說明】—種GBSS1比酶活測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】；更具體地，本發(fā)明涉及一種GBSS I比酶活測定方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]水稻臘質(zhì)基因(Wx)編碼的GBSSl (Granule-Bound Starch Synthase I,2.4.1.242)負(fù)責(zé)水稻種子胚乳中直鏈淀粉的合成(Sano Y et al (1985).Gamma FieldSymp, 24:63-77 ；Shapter et al (2009).J.Cereal Sci, 49:4-11)。水稻臘質(zhì)基因的表達(dá)量、GBSSl酶活的高低與胚乳中直鏈淀粉的含量呈顯著正相關(guān)(Wang ZY et al (1995).ThePlant Journal, 7:613-622 ；Sano Y et al (2008).Theor Appl Genet, 116:979-989)。近20多年來，水稻蠟質(zhì)基因的表達(dá)與調(diào)控規(guī)律的研究及其在稻米品質(zhì)改良上的應(yīng)用研究取得了極大的進(jìn)展。在上述研究過程中，GBSSl酶活的測定是經(jīng)常用到的常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法。
[0003]已有的GBSSl酶活的測定方法有兩種，兩種方法的原理都是根據(jù)GBSSl參與的酶促反應(yīng)。第一種方法是用14C標(biāo)記GBSSl酶促反應(yīng)底物ADPG (腺苷二磷酸葡萄糖)中的葡萄糖加入反應(yīng)體系，然后根據(jù)14C摻入反應(yīng)產(chǎn)物中的量來定義其酶活水平(Singletary Gffet al (1997).Plant Physiol, 113:293-304)。第二種是間接測定的方法，它根據(jù) GBSSl 參與的酶促反應(yīng)中葡萄糖分子被轉(zhuǎn)移入淀粉后，底物ADPG釋放出ADP，再通過兩步反應(yīng)，最后檢測NADPH的量來間接反映GBSSl的酶活。反應(yīng)過程如下:
[0004]第一步反應(yīng)是
[0005]
【權(quán)利要求】
1.一種測定作物種子中顆粒結(jié)合型淀粉合成酶的比酶活的方法，其特征在于，所述方法包括: (1)從作物種子中提取顆粒結(jié)合型淀粉合成酶，獲得酶提取液，作為待測樣品；采用酶聯(lián)免疫吸附測定獲得待測樣品中顆粒結(jié)合型淀粉合成酶的蛋白量； (2)將待測樣品與支鏈淀粉、底物ADPG進(jìn)行如(I)反應(yīng)并記錄顆粒結(jié)合型淀粉合成酶反應(yīng)時(shí)間:
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，采用制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法獲得待測樣品中顆粒結(jié)合型淀粉合成酶的蛋白量。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，標(biāo)準(zhǔn)曲線如下制作:將顆粒結(jié)合型淀粉合成酶標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋，記錄每一梯度酶濃度，蛋白變性后，應(yīng)用酶顆粒結(jié)合型淀粉合成酶特異性抗體以及與酶顆粒結(jié)合 型淀粉合成酶特異性抗體結(jié)合的帶顯色標(biāo)記的二抗進(jìn)行免疫反應(yīng)，之后顯色反應(yīng)，測定光吸收值，將每一梯度酶濃度樣品的光吸收值對酶濃度制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
4.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，獲得待測樣品中顆粒結(jié)合型淀粉合成酶的蛋白量包括:將待測樣品進(jìn)行蛋白變性，應(yīng)用顆粒結(jié)合型淀粉合成酶特異性抗體以及與酶顆粒結(jié)合型淀粉合成酶特異性抗體結(jié)合的帶顯色標(biāo)記的二抗進(jìn)行免疫反應(yīng)，之后進(jìn)行顯色反應(yīng)，測定光吸收值；根據(jù)該獲得的光吸收值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中獲得相應(yīng)的顆粒結(jié)合型淀粉合成酶的濃度；進(jìn)而獲得顆粒結(jié)合型淀粉合成酶的蛋白量。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，采用制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定產(chǎn)物ATP量。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，將ATP標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋，測定每一梯度濃度ATP的發(fā)光值，將獲得的每一梯度濃度ATP的發(fā)光值對ATP濃度制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
7.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，測定產(chǎn)物ATP量的方法包括: 測定產(chǎn)物中ATP的發(fā)光值；根據(jù)該獲得的光吸收值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中獲得相應(yīng)的ATP濃度；進(jìn)而獲得產(chǎn)物ATP量。
8.如權(quán)利要求2-7任一所述的方法，其特征在于，對所述的待測樣品、產(chǎn)物進(jìn)行倍數(shù)稀釋。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，(I)反應(yīng)包括:將待測樣品加入到反應(yīng)液I中，待測樣品與反應(yīng)液I體積比為:1: (1.5-2.1)，反應(yīng)10-30min，終止反應(yīng)后冰??；其中反應(yīng)液 I 包括:50mmol/L HEPES-NaOH ；1.6mmol/L ADPG ；0.7mg/ml 支鏈淀粉；15mmol/L DTT。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，(II)反應(yīng)包括:在(I)反應(yīng)的產(chǎn)物中加入反應(yīng)液II，30±2°C反應(yīng)20±10min，終止反應(yīng)；其中反應(yīng)液II包括:50mmoI/LHEPES-NaOH ；4mmol/L PEP-K ；200mmol/L KCl ；10mmol/L MgCl2 ；1.2 單位丙酮酸激酶。
【文檔編號】G01N33/573GK103808929SQ201210445572
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年11月8日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月8日
【發(fā)明者】蔡秀玲, 劉德瑞 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院