體外酶法鉀測定試劑、其制備方法及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開體外酶法鉀測定試劑，包括分裝的體積相同的第一試劑和第二試劑，所述第一試劑內物質濃度如下：pH為7.3溫度為25℃的MOPS緩沖液200mmol/L、白蛋白1.00g/L、三磷酸苷5.62mmol/L、EGTA0.982mmol/L、α-酮戊二酸32.7mmol/L、尿素38.3mmol/L、尿素氨基水解酶230u/L、谷氨酸水解酶4320u/L和NaN30.50g/L，第二試劑內物質濃度如下：NaHCO330.9mmol/L、NADH0.845mmol/L、MgSO416mmol/L和NaN30.30g/L，所述第一試劑和第二試劑中的溶劑均為純水。本發(fā)明體外酶法鉀測定試劑可長期穩(wěn)定保存，測定準確性高、成本低、解決Shigeki方法不能應用的問題。
【專利說明】體外酶法鉀測定試劑、其制備方法及其使用方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及鉀測定試劑，特別是涉及體外酶法鉀測定試劑。
[0002] 本發(fā)明還涉及上述體外酶法鉀測定試劑的制備方法以及該體外酶法鉀測定試劑 的使用方法。

【背景技術】
[0003] 人體血清中鉀的含量測定是臨床體外診斷測定項目之一，也是臨床常規(guī)急診診斷 中不可缺少的項目。血清鉀高于參考值上限，多見于腎上腺皮質功能減退，特別危重患者， 血清鉀上升至8mmol/L，患者可能發(fā)生心室纖顫；血清鉀低于參考值下限，多見于腎小管疾 病，出現(xiàn)嚴重腹瀉、嘔吐，腎上腺皮質功能亢進等癥狀。
[0004] 目前醫(yī)院測定血清鉀多使用離子選擇電極（ISE)。其電極是對鉀專一性強的纈霉 素膜，是比較理想的測定血清或尿中鉀離子濃度方法。纈霉素膜專一性強，但使用壽命短， 一般三個月左右就要更換一次。
[0005] 酶法測定鉀的優(yōu)點是利用分光光度計原理，在全自動生化分析儀上進行測定，全 自動生化儀是醫(yī)院測定其它眾多項目必備儀器，利用生化儀測定鉀，醫(yī)院不需要再購置和 維護離子選擇電極設備。上生化儀測定，操作方便，節(jié)省開支。酶法測定結果與離子電極法 等效。同樣是醫(yī)院測定鉀的理想方法之一。
[0006] 酶法測定鉀的方法是上世紀80年代末由Berry. MN等人提出的，他是利用K+是丙 酮酸激酶的激活劑原理，建立起酶法測定血清鉀的基本方法，隨后德國B. Μ公司正式推出 酶法測定鉀的試劑盒，并在全世界市場上銷售，受到醫(yī)院的歡迎。但Berry的原理中，Κ+離 子是丙酮酸激酶的激活劑，Na+離子也是該酶的激活劑，而且血清中Na+離子濃度是K+離子 的12倍。為了保證測定K+離子專一性，必須去除血清中的Na+離子，去除Na+離子依靠加 入一種對Na+專一的人工合成離子穴（Cryptand)。此離子穴價格昂貴，造成鉀試劑成本奇 高。這是Berry方法的不利方面。
[0007] 1987年日本人Shigeki Kimura等人提出另一個測定鉀的酶法原理，它利用K+是 尿素氨基水解酶（Urea amidolyase簡稱UAL. EC3. 5. 1. 45)水解尿素的激活劑原理，建立測 定K+的方法。
[0008] 起反應如下：
[0009] (l)Urca (尿素）+ATP(三磷酸腺苷）+HC03_(碳酸氫 鈉）UAL(願=縣角權)-ADP (二磷酸腺苷）+HC03-+NHJ氨離子）+0H_ Mg2 ·Κ+
[0010] (2)NH； +a_酮戊二酸+NADH GLDH(谷氨酸脫氫酶）
[0011] UAL水解Urea時需加入ATP、HC03_作為底物，在Mg++和K+離子激活下，生成NH 4+和 0H+,生成的MV,加入a-酮戊二酸和NADH，在GLDH的作用下生成glutamate和NAD+,在 340nm波長下，激活劑K+的多少與NADH下降成正比，建立起測定K+基本方法。
[0012] Shigeki等人的具體測定試劑分為試劑1和試劑2 :各試劑內成分及濃度如下：
[0013] 試劑 1 :
[0014] BSA(白蛋白）....................3g/L
[0015] a-酮戊二酸…· · 14. 4mmol/L
[0016] NADH............................................0.53臟01/1
[0017] Urea............................................4. 47mmol/L
[0018] NaHC03........................................... 51. 4mmol/L
[0019] EGTA.............................................. 0. 5mmol/L
[0020] Magnesium acetate......................... . 7. 2mmol/L
[0021] UAL...............................................330.4U/L
[0022] GIDH.............................................· 43. 2Ku/L
[0023] Imidazole buffer......· · 200mmol/L pH7. 0 37°C
[0024] 試劑 2
[0025] BSA (白蛋白）....................................3g/L
[0026] ATP................................................9. 72mmol/L
[0027] Urea.............................................. 4. 47mmol/L
[0028] NaHC03........................................... 51. 4mmol/L
[0029] EDTA.............................................. 0. 5mmol/L
[0030] Magnuesium acetate (醋酸緩）............· 7. 2mmol/L
[0031] Imidazole buffer…·200mmol/L ρΗ7· 0 37°C
[0032] 其中，NADH為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，是一種轉遞質子（更準確來說是氫離子） 的輔酶，它出現(xiàn)在細胞很多代謝反應中。EGTA為乙二醇二乙醚二胺四乙酸，即GEDTA，EGTA 是最為被廣泛使用的鈣離子選擇性的螯合劑，用于在鎂存在下，測定鈣。它與鈣離子形成的 復合物比與鎂離子形成的復合物要穩(wěn)定100, 〇〇〇倍，被用來制備鈣緩沖液和控制鈣離子 的濃度。容量分析及光度分析中測量微量金屬的絡合劑、掩蔽劑。也可滴定鋇、鍶、銅、鎂 和鋅。Magnesium acetate是乙酸鎂,無色單斜晶體，易潮解。溶于水，水溶液通常為中性 或弱酸性。在空氣中易潮解，加熱脫水。用作試劑、醫(yī)藥、催化劑等。UAL是尿素氨基水解 酶，別名 Urea-amidohydrolase。GIDH 是 glutamate dehydrogenase，即谷氨酸脫氫酶，催化 谷氨酸脫氨生成α-酮戊二酸和氨的反應。且谷氨酸脫氫酶是唯一既能利用NAD+又能利 用NADH+作為還原當量的酶。是一種不需氧的脫氫酶。Imidazole buffer為咪唑緩沖液， 分子式C3H4N2,分子量68,08g/mol，微溶于苯、石油醚，溶于乙醚、丙酮、氯仿、吡啶，易溶于 水、乙醇。緩沖范圍：6. 27. 8?？捎糜诤蠬is蛋白質親和層析中做洗脫液（樹脂上的 二價陽離子Ni2+可與咪唑基團結合。BSA是牛血清白蛋白，是牛血清中的一種白蛋白，包含 583個氨基酸殘基，分子量為66. 430kDa，等電點為4. 7。牛血清白蛋白在生化實驗中有廣泛 的應用，例如在western blot中作為Blocking agent;在酶切反應緩沖液中加入BSA，通過 提高溶液中蛋白質的濃度，對酶起保護作用。防止酶的分解和非特異性吸附，能減輕有些酶 的變性，能減輕有些不利環(huán)境因素如加熱，表面張力及化學因素引起的變性的。ATP是三磷 酸腺苷的縮寫，其結構式是:A-P?P?P，它是一種含有高能磷酸鍵的有機化合物，它的大 量化學能就儲存在高能磷酸鍵中。
[0033] 用Shigeki方法，基本原理與Berry相同，它的優(yōu)點不受Na+干擾，不需要用昂貴的 Na+離子穴（crgptand),試劑成本低，簡單易行。但主要的缺點是試劑1和試劑2隨存放時 間延長，其測定值迅速下降。
[0034]

【權利要求】
1. 體外酶法鉀測定試劑，其特征在于：包括分開包裝的體積相同的第一試劑和第 二試劑，所述第一試劑內的物質及各物質濃度如下所示：pH為7. 3溫度為25°C的MOPS 緩沖液 200mmol/L、白蛋白 1. 00g/L、三磷酸苷 5. 62mmol/L、EGTA 0· 982mmol/L、α -酮 戊二酸32. 7mmol/L、尿素38. 3mmol/L、尿素氨基水解酶230u/L、谷氨酸水解酶4320u/ L和NaN30. 50g/L，第二試劑內的物質及各物質濃度如下所示：NaHC0330. 9mmol/L、 NADHO. 845mmol/L、MgS0416mmol/L和疊氨鈉0. 30g/L，所述第一試劑和第二試劑中的溶劑均 為純水。
2. 權利要求1所述的體外酶法鉀測定試劑的制備方法，其特征在于：包括以下步驟： A. 制備第一試劑：在溫度為25°C的條件下將PH為7. 3的MOPS緩沖液200mmol、白蛋 白 1. 00g、三磷酸苷 5. 62mmol、EGTAO. 982mmol、α -酮戊二酸 32. 7mmol、尿素 38. 3mmol、尿 素氨基水解酶230u、谷氨酸水解酶4320u、NaN30. 50g依次加入純水中配置成1L溶液，攪拌 25-35分鐘后按照160ml -份分開封閉包裝； B. 制備第二試劑：將 NaHC0330. 9mmol、NADH 0· 845mmol、MgS0416mmol、疊氨鈉 0· 30g 和 純水配置成1L溶液，攪拌25-35分鐘后按照160ml -份分開封閉包裝； C. 組合包裝，將一份包裝后的第一試劑與一份包裝后的第二試劑封裝在測定試劑盒 內。
3. 權利要求1或2所述的體外酶法鉀測定試劑的使用方法，其特征在于：每160 μ 1第 一試劑與160 μ 1第二試劑混合后對血清樣本進行測定。
【文檔編號】C12Q1/34GK104152535SQ201410425391
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月26日 優(yōu)先權日:2014年8月26日
【發(fā)明者】朱以桂, 朱小暉 申請人:北京瑞正善達生物工程技術有限公司