專利名稱：間變性淋巴瘤激酶測(cè)定法、試劑和它們的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了測(cè)定間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase)(ALK)的激酶活性的測(cè)定法。更具體地，本發(fā)明針對(duì)用于檢測(cè)ALK酪氨酸磷酸化活性的方法、試劑和組合物。該測(cè)定法對(duì)于體外篩選和鑒定潛在的ALK抑制劑特別有用。
背景技術(shù)：
間變性淋巴瘤激酶(ALK)是一種受體酪氨酸激酶，被認(rèn)為在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能方面起著重要的作用。ALK通常表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而在新生兒期有較弱的表達(dá)。然而由于染色體易位，在一些癌癥中ALK也可以以致癌性融合蛋白的形式異常表達(dá)或激活。在所有的非何杰金(Hodgkin)淋巴瘤中，大約5-10％是由于ALK融合蛋白引起的。ALK陽(yáng)性的淋巴瘤的年發(fā)病率在全世界為大約100 000，在歐盟(EU)國(guó)家每年的新發(fā)病例為2000-3000。因?yàn)锳LK在致癌性中起著根本的作用并且正常的表達(dá)基本上局限在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，它成為用于治療介入的極好的候選。因此，特異的ALK抑制劑會(huì)有效的治療ALK陽(yáng)性淋巴瘤，且?guī)缀醪粠в信R床副作用。對(duì)于鑒定潛在的ALK抑制劑，極其需要研發(fā)出直接評(píng)估化合物對(duì)酶活性抑制效果的適宜測(cè)定法。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)發(fā)明，提供了對(duì)ALK特異的并且用于篩選調(diào)節(jié)ALK活性的化合物的體外激酶測(cè)定法。本測(cè)定法基于使用容易被ALK磷酸化的肽底物和隨后的對(duì)所得到的磷酸化產(chǎn)物的檢測(cè)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，測(cè)定法是ELISA，其中通過(guò)免疫化學(xué)反應(yīng)檢測(cè)磷酸化產(chǎn)物。
為了產(chǎn)生選擇性的ALK底物，合成并測(cè)試了再現(xiàn)ALK激活環(huán)(氨基酸1274-1294ALK_HUMAN，Q9UM73，swiss-PROT)的序列的肽。肽ARDIYRASFFRKGGCAMLPVK(SEQ ID N.1)和ARDIYRASYYRKGGCAMLPVK(SEQ ID N.2)作為ALK底物特別有效，表現(xiàn)出高于多聚Glu/Tyr的磷酸化程度，多聚Glu/Tyr是一種隨機(jī)多聚物，已知它對(duì)于多數(shù)酪氨酸激酶是優(yōu)良的底物。因此本發(fā)明的第一個(gè)目標(biāo)是具有選自SEQ ID N.1和SEQ ID N.2的氨基酸序列的肽。
本發(fā)明還有的的目標(biāo)是檢測(cè)ALK酪氨酸激酶活性的方法，其大致包括步驟i)將ALK蛋白質(zhì)或其功能衍生物與選自SEQ ID N.1及2的肽在適于肽磷酸化的條件下孵育；ii)檢測(cè)所形成的磷酸化的肽。
如此處所使用“ALK功能衍生物”指ALK蛋白質(zhì)的任何修飾形式，例如其保持著未修飾ALK的催化活性的截短或綴合的形式或其片段。功能衍生物應(yīng)優(yōu)選含有跨越ALK序列(Q9UM73)中1116-1392殘基的ALK完整的催化結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選使用從殘基Leu1073延伸到Ala1459的ALK蛋白質(zhì)的部分。當(dāng)通過(guò)重組基因技術(shù)使用基于桿狀病毒的表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生時(shí)，ALK片段表現(xiàn)出正確的折疊(通過(guò)圓二色性譜證實(shí))和有效的催化活性。
此外，可以使用含有ALK組成性活性形式的制品代替純化的蛋白質(zhì)或其功能性衍生物。此種制品優(yōu)選地是細(xì)胞裂解液，通過(guò)用不同的化合物處理表達(dá)ALK的細(xì)胞進(jìn)而評(píng)估細(xì)胞胞裂解液中ALK激酶的活性，細(xì)胞裂解液可用于a)評(píng)估表達(dá)ALK或者ALK融合蛋白的全細(xì)胞中的ALK活性和b)評(píng)估潛在抑制劑對(duì)細(xì)胞內(nèi)ALK的效果。
為了檢測(cè)步驟ii)中的磷酸化的肽，步驟i)中的磷酸化反應(yīng)可以在放射性試劑(例如[γ32P]ATP或者[γ33P]ATP)存在的情況下進(jìn)行，從而形成了通過(guò)放射分析技術(shù)容易檢測(cè)的放射性產(chǎn)物。另外，可以實(shí)施免疫反應(yīng)，該反應(yīng)括形成磷酸化肽和抗磷酸化酪氨酸抗體之間的免疫復(fù)合物。該抗磷酸化酪氨酸的抗體可以是放射性標(biāo)記的或者與諸如辣根過(guò)氧化物酶、β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶或者葡萄糖氧化酶之類的報(bào)告酶綴合，因此能夠通過(guò)測(cè)定特異的放射性或者酶活性直接檢測(cè)抗體并由此檢測(cè)磷酸化肽。還可另選的是，通過(guò)識(shí)別抗磷酸化酪氨酸抗體并且?guī)в蟹派湫詷?biāo)記或者報(bào)告酶的次級(jí)抗體，或者通過(guò)識(shí)別生物素標(biāo)記的抗磷酸化酪氨酸抗體的鏈霉親和素綴合酶，間接檢測(cè)抗磷酸化酪氨酸的抗體。
在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了檢測(cè)ALK酪氨酸激酶活性的方法，其包含步驟a)使SEQ ID N.1或者2中的肽附著于固相上；b)將固相和從Leu1073至Ala1459的ALK片段在適宜酪氨酸磷酸化的條件下孵育；c)洗滌固相；d)將固相和抗磷酸化酪氨酸的抗體(初級(jí)抗體)在適宜抗原-抗體結(jié)合的條件下孵育；e)洗滌固相；f)將固相與能夠識(shí)別抗磷酸化酪氨酸初級(jí)抗體的酶綴合抗體(次級(jí)抗體)在適于初級(jí)抗體與次級(jí)抗體結(jié)合的條件下孵育，以致形成三元免疫復(fù)合物；g)洗滌固相；h)測(cè)定免疫復(fù)合物的酶活性，其中測(cè)定的活性與酪氨酸磷酸化的數(shù)量成比例。
該測(cè)定法是完全基于ELISA的激酶測(cè)定法，它利用了酶-抗體綴合物。綴合的酶裂解底物以產(chǎn)生有色反應(yīng)產(chǎn)物，該產(chǎn)物可通過(guò)測(cè)定有色溶液的吸收來(lái)進(jìn)行分光光度法檢測(cè)，其與磷酸化酪氨酸的數(shù)量成比例。
根據(jù)本發(fā)明，能夠使用的固相或支持物包括塑料材料(反應(yīng)板、孔、瓶)、聚苯乙烯、橡膠和磁珠、膠體金屬顆粒、玻璃和/或硅表面等。
基于ELISA的ALK測(cè)定法優(yōu)選用于篩選能夠調(diào)節(jié)ALK酪氨酸磷酸化活性的化合物，特別是用于篩選ALK抑制劑。
因此本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及用于鑒定能夠調(diào)節(jié)ALK酪氨酸激酶活性的化合物的方法，其中在存在候選化合物或者已知刺激或者抑制ALK酪氨酸激酶活性的化合物(對(duì)照)的條件下進(jìn)行上述的ALK測(cè)定法。具體而言，用于鑒定能夠調(diào)節(jié)ALK酪氨酸激酶活性的化合物的方法包含步驟i)將ALK蛋白質(zhì)或者它們的功能衍生物與選自SEQ ID N.1或者2，(優(yōu)選SEQ ID N.1)、的肽在候選化合物存在并在適于肽磷酸化的條件下孵育；ii)定量所形成的磷酸化的肽。
抑制ALK活性的化合物選作潛在的治療劑，用于治療ALK相關(guān)腫瘤，例如間變性大細(xì)胞淋巴瘤和非何杰金淋巴瘤?？杀容^候選化合物和同候選化合物相同的條件下進(jìn)行測(cè)定的參考化合物(對(duì)照)的ALK調(diào)節(jié)活性。
當(dāng)篩選其它化合物的ALK抑制活性時(shí)，證明在0.2-0.3μM濃度下是有效的ALK抑制劑的星形孢菌素(Meggio F.等，Eyr.J.Biochem.(1995)234，317-322)，可用作陽(yáng)性對(duì)照。
分子建模研究就改進(jìn)星形孢菌素對(duì)ALK蛋白質(zhì)的親和性和特異性所需的取代模式提供了重要的指示。最有效的結(jié)構(gòu)表示為下面的通式(I) 其中R1和R2相互獨(dú)立地選擇于鹵素(優(yōu)選為氯)、苯基或者C1-C3烷基(任選被一個(gè)或多個(gè)鹵素取代)；R3為羥基；R4為羥基或者羥甲基；R5為C1-C3烷基(任選地鹵代)或者苯甲基。
式(I)中的化合物能夠拮抗ATP與致癌融合蛋白的ALK酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的結(jié)合，致癌融合蛋白例如有NPM-ALK、ATIC-ALK、CTLC-ALK、TFG-ALK或者其它個(gè)別的與原肌球蛋白融合的蛋白。因此，它們可以用于制備治療ALK相關(guān)腫瘤(特別是間變性大細(xì)胞淋巴瘤和非何杰金淋巴瘤)的藥物。
如此處所公開的，在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，化合物(I)用于篩選ALK抑制劑的ALK測(cè)定法中。使用本發(fā)明的ALK測(cè)定法還可以進(jìn)行高通量篩選。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及用于進(jìn)行上述ALK測(cè)定的試劑盒。試劑盒由預(yù)定比例的試劑組合包裝而成。通常，試劑盒含有SEQ ID N1或2的肽(任選固定于固相)，抗磷酸化酪氨酸的抗體和用酶或者放射性標(biāo)記的抗體(如果需要的話)。此外，試劑盒可以含有用于顯色或放射性反應(yīng)的試劑、緩沖液、諸如星形孢菌素或其衍生物之類的對(duì)照、稀釋劑、去污劑、穩(wěn)定劑和任何對(duì)于建立和開展測(cè)定法有用的其它組分。為了最優(yōu)化測(cè)定的靈敏度，可以改變各種試劑的相對(duì)量。具體而言，可以以固體或者液體制品提供試劑，例如溶液、懸浮液、分散液、干粉、凍干制品。試劑盒組分以單個(gè)或分開的容器提供。試劑盒還可以包含開展測(cè)定的說(shuō)明書。


圖1帶有His標(biāo)簽的重組ALK的純化和活性A)10％SDS-PAGE凝膠的銀染色顯示標(biāo)準(zhǔn)(M)、欲上樣到HiTrap柱的已透析并合并的DEAE柱級(jí)分(上樣)、HiTrap柱級(jí)分(數(shù)字表示級(jí)分編號(hào))。B)純化的ALK的放射性自磷酸化分析。泳道132P標(biāo)記的rALK的放射自顯影。泳道2與泳道1同一樣品的銀染色。
圖2ALK激酶對(duì)肽的動(dòng)力學(xué)圖3使用基于ELISA的激酶測(cè)定法檢測(cè)rALK活性A)肽SEQ ID N.2被純化的rALK的磷酸化。在含有或不含有0.5μg純化rALK，含有或不含有15μg SEQ.ID N.2肽，30℃反應(yīng)30分鐘的條件下進(jìn)行ELISA激酶反應(yīng)。圖顯示450nm的吸光度。B)ALK肽底物磷酸化的動(dòng)力學(xué)。使用206μM肽SEQ.ID N.2或者42μM肽SEQ.ID N.1與0.1μg純化rALK進(jìn)行ELISA激酶反應(yīng)。在0、0.5、2、5、10和15分鐘后加入EDTA終止反應(yīng)。
圖4肽底物濃度對(duì)磷酸化水平的影響在0.2μg純化rALK和0-105μM肽SEQ ID N.1(A)或者0-315μM肽SEQ ID N.2(B)存在的條件下進(jìn)行ELISA測(cè)定，反應(yīng)在30℃持續(xù)15分鐘。
圖5rALK濃度對(duì)底物磷酸化的影響使用206μM肽SEQ ID N.2或者42μM肽SEQ ID N.1和0-225ng范圍內(nèi)的rALK進(jìn)行ELISA測(cè)定，反應(yīng)在30℃持續(xù)15分鐘。
圖6星形孢菌素對(duì)rALK活性的抑制在0-5μM星形孢菌素或者相等體積的溶劑(DMSO)存在的條件下，使用42μM肽SEQ ID N.1、20ng rALK，在30℃反應(yīng)15分鐘進(jìn)行ELISA測(cè)定。圖示按未處理對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)化的A450。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果肽的合成使用Applied Biosystems Model 431A合成儀，通過(guò)利用9-芴甲氧羰基(Fmoc)化學(xué)的自動(dòng)固相合成，在4-羥甲基-共聚苯乙烯(copolystirene)-1％二乙烯基苯樹脂(0.95mmol/g，0.05mmol)上合成肽。
Fmoc氨基酸(0.5mmol)被2-(1H-苯并三唑-1-yl)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸(HBTU)(1當(dāng)量)和1-羥基苯并三唑(HOBt)(1當(dāng)量)在DIPEA(2當(dāng)量)存在的條件下激活。
在含有5ml三氟乙酸、0.375克苯酚、0.125μl 1，2-二巰基乙烷、0.250μl苯甲硫醚和0.25μl水的混合物中裂解和脫保護(hù)肽酰樹脂(100mg)，反應(yīng)進(jìn)行2小時(shí)。將反應(yīng)混合物過(guò)濾到含有預(yù)冷至0℃的乙醚的管中。離心分離沉淀的肽并用新鮮乙醚洗滌。
將粗制的肽(50-100mg于10ml水中)泵入制備型RP-柱上(prepNova-Pak HR C18，6μm，25×10mm，Waters)并用10％-45％線性梯度的乙腈以12ml/分鐘的流速進(jìn)行洗脫。
通過(guò)在5μm，C18Symmetry 300柱，4.6×250mm(Waters)，使用在0.1％三氟乙酸中的線性梯度的乙腈以1ml/分鐘的流速進(jìn)行分析型RP-HPLC，判定肽的純度為＞90％。通過(guò)使用基質(zhì)輔助的激光解吸離子化飛行時(shí)間(matrix-assisted laser-desorption ionization time-of-flight)質(zhì)譜儀(MALDI-Tof)(Maldi-1；Kratos-Schimadzu，Mancester，UK)的質(zhì)譜證實(shí)肽的分子量。
重組ALK的產(chǎn)生和純化將從氨基酸Leu1073到Ala1459的ALK的一部分克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體、pBlueBacHis2C(Invitrogen)中。使用該載體和MaxBac2.0桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen)，產(chǎn)生了重組桿狀病毒并且在Sf9(草地夜蛾(Spodoptera frugiperda))昆蟲細(xì)胞中表達(dá)了重組ALK(rALK)蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)具有一個(gè)49kDa的理論分子量并且含有融合6個(gè)組氨酸-標(biāo)簽(His標(biāo)簽)的預(yù)測(cè)的ALK(Ile1116-Val1392)催化結(jié)構(gòu)域。通過(guò)對(duì)全細(xì)胞裂解液進(jìn)行抗磷酸化酪氨酸的免疫印跡和體外放射性激酶分析證實(shí)了帶有His標(biāo)簽的rALK的自磷酸化活性，該活性是正確折疊的指示。
為了產(chǎn)生用于純化的蛋白質(zhì)，用重組的病毒以5的感染復(fù)數(shù)(MOI)感染Sf9細(xì)胞。將培養(yǎng)物在27℃下培養(yǎng)3天然后通過(guò)在4℃下400g離心10分鐘進(jìn)行收獲。將細(xì)胞沉淀貯存于-80℃?zhèn)溆?。為了裂解?xì)胞，將細(xì)胞沉淀重新懸浮于含有50mM Tris-HCl pH 8、20mM NaCl和蛋白酶抑制劑(抑胃酶肽、苯甲脒、亮抑酶肽和抑酶肽)的低滲緩沖液(緩沖液A)中。在冰上孵育30分鐘后，將細(xì)胞懸浮液在4℃下1500g離心15分鐘并且將上清液用0.45μm的濾器過(guò)濾。然后使用AKTK FPLC系統(tǒng)(Amersham-Pharmacia Biotech)在緩沖液A存在的條件下，以1.5ml/分鐘的流速將濾液上樣到80ml陰離子交換Fast Flow DEAE-sephorose(Sigma)柱上。用從20-200mM的NaCl梯度將結(jié)合的蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)。通過(guò)免疫印跡分析級(jí)分中是否存在ALK蛋白質(zhì)。合并陽(yáng)性級(jí)分并在1升天然結(jié)合緩沖液(20mM磷酸鈉pH7.8、500mM NaCl和PI)中于4℃下透析3小時(shí)，每小時(shí)換一次緩沖液。然后將透析后的級(jí)分上樣到HiTrapTM鎳親和層析柱(Amersham-Pharmacia Biotech)上，該柱預(yù)先用添加50mM咪唑和20mM β-巰基乙醇的天然結(jié)合緩沖液平衡。對(duì)于柱子使用0.5-1ml/分鐘的流速。當(dāng)用天然結(jié)合緩沖液洗滌柱子后，用50-200mM的線性梯度的咪唑?qū)⒔Y(jié)合蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)。然后通過(guò)SDS-PAGE和銀染色分析級(jí)分中是否存在rALK及其純度。圖1A顯示的是rALK純化的實(shí)例。
最后，將陽(yáng)性級(jí)分用50mM Tris pH 7.4、100mM NaCl、10％甘油、20mM β-巰基乙醇和蛋白酶抑制劑透析并貯存于-80℃?zhèn)溆?。為了證實(shí)純化的rALK是有活性的，我們進(jìn)行了放射性自磷酸化分析。含有20μl rALK陽(yáng)性級(jí)分、6μM冷的ATP、1.2mM DTT、10μCi[γ-32P]ATP、25mM HepespH 7.5、10mM MgCl2和10mM MnCl2的反應(yīng)混合物在30℃孵育30分鐘。通過(guò)加入Laemmli緩沖液并在95℃加熱5分鐘終止反應(yīng)。樣品在10％SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行分離并將其轉(zhuǎn)移到ImmobilonTM-P膜上。如圖1B所示，通過(guò)放射自顯影顯示出放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)。
肽磷酸化(放射性分析)在30μl含有50mM Tris/HCl pH 7.5、5mM MnCl2、10μμM釩酸鈉，30μM[γ32P]ATP或者[γ33P]ATP(比活性1000cpm/pmol)和10單位rALK[定義每分鐘轉(zhuǎn)移1pmol磷酸至多聚GluTyr(0.1mg/ml)的酶量為1個(gè)單位]的介質(zhì)中磷酸化肽和隨機(jī)多聚體多聚Glu/Tyr(1∶4)。在30℃孵育10分鐘后將25μl混合物點(diǎn)到P81磷酸纖維素紙上以終止反應(yīng)，其操作如別處所述(1)。通過(guò)GraphPad Prism軟件使用非線性回歸將數(shù)據(jù)直接擬合米曼(Michaelis-Menten)方程來(lái)決定動(dòng)力學(xué)常數(shù)。
結(jié)果來(lái)源于ALK參考序列的、含有Tyr-1278的肽是rALK的優(yōu)選底物，而含有Tyr-1282或者Tyr-1283的肽受酶的影響較弱(見圖2)。Tyr-1278衍生物的磷酸化效率甚至比具有三個(gè)Tyr殘基的肽表現(xiàn)的更高(表I)。為了證實(shí)Tyr-1278衍生物是ALK催化結(jié)構(gòu)域最佳的肽底物，我們比較了它與多聚Glu/Tyr(1∶4)的磷酸化程度，多聚Glu/Tyr(1∶4)是一種隨機(jī)多聚體并且對(duì)于大多數(shù)酪氨酸激酶而言為非常好的底物。表II顯示Tyr-1278衍生物是一個(gè)比多聚Glu/Tyr更好的ALK底物。
表I

表II模型底物被ALK催化結(jié)構(gòu)域磷酸化的速率多聚(Glu/Tyr)和肽的濃度分別為0.1mg/ml和400μM。酶濃度為10單位。報(bào)導(dǎo)的數(shù)值為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。S.E.M.數(shù)值始終小于14％。

用含有以不同濃度存在于PBS中的ALK肽底物(SEQ ID N.1或者SEQ ID N.2)的包被溶液于37℃過(guò)液孵育Nunc Immuno 96孔板(125μl/孔)。然后用200μl洗滌緩沖液(PBS-Tween 0.05％)進(jìn)行洗滌并且在37℃放置至少2小時(shí)使其干燥。通過(guò)將激酶緩沖液(25mM Hepes pH 7.5、5mM MnCl2、5mM MgCl2)，0.3mM ATP和不同濃度的純化的rALK以100μl/孔的總體積在30℃下孵育15分鐘來(lái)進(jìn)行激酶反應(yīng)。然后將反應(yīng)混合物去除并用200μl洗滌緩沖液將孔洗滌5次。使用100μl/孔的用PBS+4％BSA進(jìn)行1∶500稀釋的鼠單克隆抗磷酸化酪氨酸的抗體(克隆4G10UpstateBiotech Ltd)來(lái)檢測(cè)磷酸化的肽。當(dāng)在室溫孵育30分鐘后將抗體去除并且如上所述將孔進(jìn)行洗滌。每孔加入100μl用PBS+4％BSA 1∶1000稀釋的次級(jí)抗體(抗鼠IgG，辣根過(guò)氧化物酶耦聯(lián)的完整抗體，來(lái)源于綿羊，Amersham Pharmacia Biotech)，并且將板在室溫下再次孵育30分鐘，然后如上進(jìn)行洗滌。將板子用100μl/孔的TMB底物溶液(Endogen)進(jìn)行顯色并且通過(guò)加入等體積的0.18M H2SO4終止反應(yīng)。最后，使用Ultrospec300分光光度計(jì)(Amersham-Pharmacia Biotech)讀取450或者490nm下的吸光度。
結(jié)果我們已經(jīng)證明基于ELISA的激酶測(cè)定法能夠用來(lái)檢測(cè)磷酸化的ALK肽底物(SEQ ID N.1和N.2)并且因此能夠檢測(cè)純化的rALK的活性。在起始的實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)诩兓膔ALK和底物SEQ ID N.2都存在或都缺乏的條件下進(jìn)行測(cè)定以便決定是否能觀察到450nm吸光度(A450)特異的增加(圖3A)。在rALK和底物都存在時(shí)確實(shí)觀察到A450急劇增加。相反，缺乏肽或者rALK或者兩者時(shí)，A450是低的，表明有低水平的背景吸光度。為了確定底物磷酸化的動(dòng)力學(xué)，我們?cè)诟鞣N不同的孵育時(shí)間之后測(cè)定了A450值(圖3B)。兩個(gè)肽的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)相似，都在10分鐘后達(dá)到最大的磷酸化。
為了比較在ELISA激酶測(cè)定中兩個(gè)肽的效率和確定所使用肽的最佳濃度，我們制作了兩個(gè)肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明隨著肽底物量的增加A450增加了并且因此rALK激酶活性增加了。對(duì)于肽底物SEQ ID N.2，A450最大值因而也是磷酸化的最大值出現(xiàn)在大約200μM處，與此相比較對(duì)于肽底物SEQ ID N.1只在25μM時(shí)就達(dá)到最大值(圖4A和B)。這表明肽底物SEQ ID N.1是一個(gè)更有效的rALK底物。
為了觀察激酶活性的抑制，有必要使用恰當(dāng)濃度的酶，即標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)的濃度。使用206μM SEQ ID N.2或者42μM SEQ ID N.1和0-220ng范圍內(nèi)的rALK進(jìn)行ELISA反應(yīng)。對(duì)于兩個(gè)底物的線性范圍大約介于0-15ng之間的rALK，在這之后曲線達(dá)到了平臺(tái)(圖5)。
使用42μM肽底物SEQ ID N.2評(píng)估了抑制劑星形孢菌素對(duì)rALK活性的影響。同時(shí)進(jìn)行了含有相應(yīng)濃度的DMSO的溶劑對(duì)照實(shí)驗(yàn)。星形孢菌素顯著抑制rALK活性，在1μM時(shí)達(dá)到了最大抑制，并且估計(jì)的IC50為300nM(圖6)。單獨(dú)的溶劑(DMSO)對(duì)rALK活性沒(méi)有顯著的影響。
參考文獻(xiàn)[1]Glass，D.B.，Masaracchia，R.A.，F(xiàn)eramisco，J.R.和Kemp，D.E.(1978)Anal.Biochem.87，566-575. Till，J.H.，Ablooglu，A.J.，F(xiàn)rankel，M.，Bishop，S.M.，Kohanski，R.A.和Hubbard S.R.(2001)J.Biol.Chem.276，10049-10055.
序列表<110>國(guó)家腫瘤治療研究中心<120>間變性淋巴瘤激酶測(cè)定法、試劑和它們的組合物<130>1206EUR<160>2<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>21<212>PRT<213>未知<220>
<223>合成肽<400>1Ala Arg Asp Ile Tyr Arg Ala Ser Phe Phe Arg Lys Gly Gly Cys Ala15 10 15
Met Leu Pro Val Lys20<210>2<211>21<212>PRT<213>未知<220>
<223>合成肽<400>2Ala Arg Asp Ile Tyr Arg Ala Ser Tyr Tyr Arg Lys Gly Gly Cys Ala15 10 15Met Leu Pro Val Lys20
權(quán)利要求
1.檢測(cè)ALK酪氨酸激酶活性的方法，其包含以下步驟i)將ALK蛋白質(zhì)或者它們的功能衍生物與選自SEQ ID N.1或者2的肽底物在適于肽磷酸化的條件下孵育；ii)檢測(cè)磷酸化的肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中肽具有SEQ ID N.1的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中使用純化的ALK蛋白質(zhì)或者含有ALK的制品。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述制品是細(xì)胞裂解液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述功能衍生物含有跨越ALK序列1116-1392殘基的完整ALK催化結(jié)構(gòu)域。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述功能衍生物是從殘基Leu1073到Ala1459的ALK蛋白質(zhì)片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其包含步驟a)將SEQ ID N.1或者2的肽附著于固相；b)將固相與所述ALK片段在適宜酪氨酸磷酸化的條件下孵育；c)洗滌固相；d)將固相與抗磷酸化酪氨酸的抗體(初級(jí)抗體)在適宜抗原-抗體結(jié)合的條件下孵育；e)洗滌固相；f)將固相與能夠識(shí)別初級(jí)抗體的酶綴合抗體(次級(jí)抗體)在適于初級(jí)抗體與次級(jí)抗體結(jié)合的條件下孵育，以致形成三元免疫復(fù)合物；g)洗滌固相；h)測(cè)定免疫復(fù)合物的酶活性，其中測(cè)定的活性與酪氨酸磷酸化的數(shù)量成比例。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中與抗體綴合的酶是辣根過(guò)氧化物酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中酶活性是通過(guò)比色反應(yīng)檢測(cè)的。
10.根據(jù)先前任一項(xiàng)的權(quán)利要求的方法，用于鑒定調(diào)節(jié)ALK酪氨酸激酶活性的化合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其包含步驟i)在存在候選化合物(a)時(shí)，將ALK蛋白質(zhì)或其功能衍生物與選自SEQ ID N.1或者2的肽在適于肽磷酸化的條件下孵育；ii)檢測(cè)因此而形成的磷酸化的肽。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11的方法，其中比較候選化合物的ALK調(diào)節(jié)活性與同候選化合物相同的條件下進(jìn)行測(cè)定的參考化合物的ALK調(diào)節(jié)活性。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中參考化合物是星形孢菌素。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中參考化合物是具有通式(I)的星形孢菌素衍生物 其中R1和R2相互獨(dú)立地選自優(yōu)選為氯的鹵素、苯基或者任選被一個(gè)或多個(gè)鹵素取代的C1-C3烷基；R3為羥基；R4為羥基或者羥甲基；R5為任選被鹵素取代的C1-C3烷基或者苯甲基。
15.選自SEQ ID N.1或2的用作ALK底物的肽。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的肽，它是SEQ ID N.1。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或者16的肽用于測(cè)定ALK酪氨酸激酶活性的用途。
18.根據(jù)權(quán)利要求14式(I)的化合物的用途，用于制備治療ALK相關(guān)腫瘤，特別是間變性大細(xì)胞淋巴瘤和非何杰金淋巴瘤的藥物。
19.用于檢測(cè)根據(jù)權(quán)利要求1-14的ALK酪氨酸激酶活性的試劑盒，其中含有SEQ ID N1或者2的肽和抗磷酸化酪氨酸的抗體。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的試劑盒，其含有選自比色反應(yīng)試劑、緩沖液、稀釋劑、去污劑、穩(wěn)定劑、根據(jù)權(quán)利要求14的星形孢菌素或其衍生物的額外組分。
全文摘要
公開了用于檢測(cè)ALK酪氨酸激酶活性并且用于鑒定調(diào)節(jié)ALK活性的化合物的方法、肽底物、試劑和它們的組合物。
文檔編號(hào)A61K31/00GK1756850SQ200480006018
公開日2006年4月5日 申請(qǐng)日期2004年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月7日
發(fā)明者L·A·平納, A·多內(nèi)拉－德亞納, O·馬林, L·莫洛格尼, R·古恩比, C·甘巴科爾蒂帕瑟里尼, L·斯卡波扎 申請(qǐng)人:國(guó)家腫瘤治療研究中心