專利名稱：酶發(fā)光測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測酶活性的方法，特別涉及檢測生物來源的樣品中酶活性水平的測定方法。
有許多種測定方法可用于檢測具有生物學(xué)重要性(無論是顯示正常狀態(tài)還是表現(xiàn)為病態(tài))的特定分子的濃度和活性。在這些待測分子中包括酶，酶是典型的生物催化劑。雖然酶可通過僅檢測該分子是否存在的傳統(tǒng)方法測定，但這樣的測定不能用于測定酶活性水平。例如，一種依賴于酶上某一特定抗原決定簇存在的檢測該酶的免疫測定法，只要該抗原決定簇不改變，即表明有一定量的酶存在。如果該酶存在，但酶活性，例如由于與修飾過的底物的不可逆結(jié)合或存在于酶的活性中心的金屬離子所產(chǎn)生的抑制作用而改變，則即使可正確地示出所存在的酶量，所示出的酶活性水平也是不準(zhǔn)確的。
相對于酶量測定，目前已有測定酶活性的技術(shù)，由于酶是使底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的催化分子，所以這樣的測定一般包括測定底物的量隨時間的變化。其中一種方法是使用一種無色，但當(dāng)與酶作用時可形成有色產(chǎn)物的底物。已發(fā)展了許多這樣的反應(yīng)，在分析反應(yīng)如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)中酶本身用作標(biāo)記物。過氧化物酶常常用作這種類型的標(biāo)記物，因此便于用相同的底物和反應(yīng)產(chǎn)物測定過氧化物酶的活性。然而，這樣的測定方法只有在可經(jīng)歷顏色變化的適宜底物可得到的情況下才能使用，因而不是通常適用的方法。
對于大多數(shù)類型的酶來說，不能使用顯色測定法。動物細(xì)胞糖基轉(zhuǎn)移酶就是這類酶的實(shí)例。這些酶通過使一種糖核苷酸供體的糖部分轉(zhuǎn)移到一條待增長的多糖或寡糖鏈的特定羥基上而在糖結(jié)合物上催化形成糖苷鍵。動物細(xì)胞中代表性糖結(jié)合物包括糖蛋白，糖脂和葡糖氨基聚糖。
不同于核酸和蛋白質(zhì)，在糖結(jié)合物的合成中不涉及模板，因此，其合成的控制及其結(jié)構(gòu)的確限度取決于糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)和高度特異性。動物細(xì)胞中不同的糖基轉(zhuǎn)移酶的總數(shù)是未知的，然而，基于所觀察到的糖結(jié)合物結(jié)構(gòu)的變化，看來存在著數(shù)百種這樣的酶。此外，不同的糖基轉(zhuǎn)移酶可利用相同的糖核苷酸和相似的受體生成不同的產(chǎn)物。如下所述，糖基轉(zhuǎn)移酶的這些特征當(dāng)有一種以上的酶存在于組織樣品中時，在檢測它們的比活性時出現(xiàn)一些獨(dú)有的問題。
目前，大多數(shù)測定糖基轉(zhuǎn)移酶的方法都采用放射性同位素并包括從糖核苷酸摻加到產(chǎn)物糖苷中的放射性的測定。各種非放射性同位素糖苷轉(zhuǎn)移酶測定法已得到發(fā)展，但這些測定法的靈敏度并非明顯高于使用現(xiàn)存的放射性同位素測定法所獲得的靈敏度。雖然已知測定法的靈敏度相對于許多其它類型的酶測定法來說可能是高的，但對于許多糖基轉(zhuǎn)移酶來說它又低得無法接受，糖基轉(zhuǎn)移酶的活性可低至1pmol/小時/mg細(xì)胞蛋白質(zhì)。
本發(fā)明人之一的實(shí)驗(yàn)室已報(bào)導(dǎo)了一種測定糖基轉(zhuǎn)移酶的方法。在cummings等人，J.Biol.Chem.(1988)5511-519中報(bào)導(dǎo)了一種用外源凝集素俘獲UDP-半乳糖;β-D-半乳糖基-α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的特異酶產(chǎn)物的測定法。將放射性標(biāo)記的半乳糖從供體分子UDP-GlcNAc(尿苷-5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺)轉(zhuǎn)移到一種糖蛋白受體分子的末端，并用外源凝集素衍生的親合柱(柱上結(jié)合酶反應(yīng)產(chǎn)物而不是反應(yīng)物)從溶液中分離出該產(chǎn)物。然而，這種測定法嚴(yán)格地受測定放射性標(biāo)記所需時間和難度限制。
幾年來，為了在免疫測定中不再使用放射性同位素而代之以其它類型的可檢測標(biāo)記物，已做過多種嘗試。某些酶已被成功地用作許多免疫測定的標(biāo)記物，即使這些酶的靈敏度一般低于同位素標(biāo)記物的靈敏度。這類測定法的典型實(shí)例是其中用酶標(biāo)記免疫球蛋白的測定法，通常稱之為酶免疫測定法(EIA)。在這類測定法中也可用酶標(biāo)記分析物。有關(guān)EIA的詳細(xì)描述見WilfrldR.Butt編輯的“PracticalImmunoassay”第3章，“ClinicalandBiochemicalAssays”14卷(MarcelDekker，Inc.，1984)。
除酶之外，化學(xué)發(fā)光化合物和生物發(fā)光化合物也已被用作免疫測定的非放射性標(biāo)記物，代替同位素。這類測定法被稱為發(fā)光免疫測定法(LIA)或免疫化學(xué)發(fā)光計(jì)量測定法(ICMA)。這些標(biāo)記物通常已證明在靈敏度方面是與同位素等同的，但經(jīng)常受到與標(biāo)示物的蛋白組分(典型的是熒光素酶)的非特異性結(jié)合相關(guān)的問題的阻礙。有關(guān)這些測定法的更詳盡的描述見“PracticalImmunoassay”第5章，op.cit.和PatelandCormier，AnalyticalApplicationsofBioluminescenceandChemiluminescence，273-276頁，AcademicPress，Inc.，1984。
然而，以前采用的測定法沒有一種能提供適于酶活性測定的通用性，高靈敏度，并消除本底干擾。因此，尚需要可在樣品中直接測定相對于酶濃度的酶活性的測定法和普遍適用于各種酶的直接方法。
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種特異地，快速地和簡便地測定尤其是生物來源的樣品的酶活性的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種測定酶活性的方法，該方法可用于各種酶而不需技術(shù)上的較大變化。
通過提供一種檢測樣品中酶活性的存在或水平的方法已達(dá)到了本發(fā)明的這些和其它目的，這些目的通過下述將會更加明顯，所述方法包括在反應(yīng)介質(zhì)中將(1)懷疑含有所述酶的樣品和(2)能與所述酶反應(yīng)生成標(biāo)記產(chǎn)物的所述酶的標(biāo)記底物合并，其中所述標(biāo)記物包括一種生物發(fā)光蛋白或能被轉(zhuǎn)化為生物發(fā)光蛋白的標(biāo)記物;使所述酶和所述底物在一定時間內(nèi)發(fā)生反應(yīng)，從而在所述酶存在下生成所述產(chǎn)物;將能與所述標(biāo)記產(chǎn)物或所述標(biāo)記底物(但不是兩種同時)特異性結(jié)合以形成復(fù)合物的受體與反應(yīng)介質(zhì)合并;和通過在所述生物發(fā)光蛋白的控制下引發(fā)光發(fā)射來檢測在所述復(fù)合物中或在不與受體反應(yīng)的非復(fù)合、標(biāo)記組分中標(biāo)記物的存在或量。
參照下面具體實(shí)施方案的詳述，并結(jié)合考慮構(gòu)成本說明書一部分的附圖，可更好地理解本發(fā)明。


圖1是本發(fā)明第一個實(shí)施方案的圖解。
圖2是本發(fā)明第二個實(shí)施方案的圖解。
圖3是本發(fā)明第3個實(shí)施方案的圖解。
圖4是本發(fā)明第4個實(shí)施方案的圖解。
圖5是用于一種特殊測定的本發(fā)明實(shí)施方案的圖解。
本發(fā)明提供一種檢測酶活性的方法，該方法適用于任何經(jīng)與一種結(jié)合物(受體)結(jié)合而產(chǎn)生一種能與酶的底物區(qū)分開的產(chǎn)物的酶。使用一種能俘獲產(chǎn)物而不與底物適度結(jié)合(反之亦然)的受體，可容易地區(qū)分并定量所形成的產(chǎn)物或參加反應(yīng)的底物的量。本發(fā)明的方法也需要一種生物發(fā)光蛋白，特別是能結(jié)合熒光素酶分子并通過一種外加引發(fā)物所引發(fā)的光蛋白，作為底物和/或產(chǎn)物的可檢測標(biāo)記物。另外，該標(biāo)記物可被轉(zhuǎn)化為生物發(fā)光蛋白標(biāo)記物，例如通過俘獲蛋白標(biāo)記物與連接于底物或產(chǎn)物上的生物素分子的抗生物素蛋白復(fù)合物轉(zhuǎn)化。通過使用生物發(fā)光蛋白作為標(biāo)記物，可產(chǎn)生各種優(yōu)點(diǎn)，如下文詳述。
設(shè)計(jì)的方法最初是使用外源凝集素作為受體，碳水化合物作為底物和產(chǎn)物用于測定糖基轉(zhuǎn)移酶，因?yàn)檫@些酶的天然存在量低，活性很低，給酶的測定帶來困難。由于證明了本測定法可用于這種困難的測定，所以它可被應(yīng)用于其它體系。其它天然特異結(jié)合化合物如激素受體可使得本發(fā)明能廣泛用于各種酶。另外，通過雜交瘤生產(chǎn)的具有高度特異性的單克隆抗體也可使得這些技術(shù)能應(yīng)用于許多不同的沒有天然受體可供的酶產(chǎn)物。
該方法的范圍相當(dāng)寬，如下所示。按標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)收集懷疑含有酶的樣品，與具有可檢測標(biāo)記的酶的底物或能在測定的后一步驟被標(biāo)記的底物合并。該底物也能與酶反應(yīng)提供具有可檢測標(biāo)記的產(chǎn)物(或以后能被標(biāo)記的產(chǎn)物)。其中加有這些主要成分的反應(yīng)介質(zhì)還含有其它酶催化反應(yīng)所必需的成分。例如，如果酶催化的反應(yīng)是另一成分與底物的共價(jià)連接，則該種成分應(yīng)加到反應(yīng)介質(zhì)中。在待測樣品中若有酶存在，要產(chǎn)生可檢測量的產(chǎn)物需足夠的時間。將一種與產(chǎn)物特異性結(jié)合而基本上對底物無特異結(jié)合親合力(反之亦然)的受體在酶催化反應(yīng)得以發(fā)生之前或之后與反應(yīng)介質(zhì)合并。根據(jù)所進(jìn)行反應(yīng)的類型，從反應(yīng)介質(zhì)中分離出產(chǎn)物-受體復(fù)合物或底物-受體復(fù)合物(多相測定)或?qū)锌扇軕B(tài)產(chǎn)物-受體或底物-受體復(fù)合物的反應(yīng)介質(zhì)進(jìn)行測定(均相測定)。然后測定可檢測標(biāo)記物在復(fù)合成分或非復(fù)合，可溶性成分中的存在(定性測定)或量(定量測定)。
測定的各個步驟可依用于進(jìn)行多相和均相測定的不同技術(shù)而廣泛地變化。由于可用中間標(biāo)記物標(biāo)記底物，該中間標(biāo)記物在底物與酶反應(yīng)之前或之后被轉(zhuǎn)化為一種包含生物發(fā)光蛋白的標(biāo)記物，所以具體測定步驟還可有其他不同。圖1-4示出四種變化。在圖1中，用生物發(fā)光蛋白(L)標(biāo)記的底物(S)與酶(E)反應(yīng)產(chǎn)生標(biāo)記產(chǎn)物(P)，然后P被第一種受體(R1)結(jié)合。在多相測定中將受體/標(biāo)記產(chǎn)物復(fù)合物與非復(fù)合標(biāo)記底物分離或不經(jīng)分離即可進(jìn)行均相測定。如圖2所示，用一種不同的受體(R2)與底物而不是產(chǎn)物形成復(fù)合物。對這種變化同樣適用均相和多相測定。在圖3和圖4中，用生物素標(biāo)記的底物(S-O)被酶轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物(P-O)。然后加入與抗生物素蛋白連接的生物發(fā)光蛋白(
-L)形成最終標(biāo)記物。然后或者用第一種受體與產(chǎn)物形成復(fù)合物(圖3)或者用第二種受體與底物形成復(fù)合物(圖4)。這些步驟的每一步以及其它變化詳見下述。
可用本方法測定任何能產(chǎn)生充分不同于其底物的產(chǎn)物以便與受體相互結(jié)合的作用能夠發(fā)生而區(qū)分底物和產(chǎn)物的酶的活性水平。由于生物受體所具有的高度特異性，實(shí)際上任何酶都能產(chǎn)生通過與受體結(jié)合而與原始底物區(qū)分開的產(chǎn)物。下表1按照國際分類系統(tǒng)列出了酶的類別。這一分類系統(tǒng)也用于本說明書的其它地方。
表1酶的國際分類(類名，代號，和所催化的反應(yīng)類型)1.氧化-還原酶(氧化-還原反應(yīng))1.1.作用于-CH-OH1.2.作用于-C＝O1.3.作用于-CH＝CH-1.4 作用于-CH-NH21.5作用于-CH-NH-1.6作用于NADH;NADPH2.轉(zhuǎn)移酶(官能團(tuán)的轉(zhuǎn)移)2.1單碳基團(tuán)2.2醛基或酮基2.3?；?.4糖基2.7磷酸根2.8含硫基團(tuán)3.水解酶(水解反應(yīng))3.1酯3.2糖苷鍵3.4肽鍵3.5其它C-N鍵3.6酸酐4.裂合酶(加成到雙鍵上)
4.1-C＝C-4.2-C＝O4.3-C＝N-5.異構(gòu)酶(異構(gòu)反應(yīng))5.1外消旋酶6.連接酶(經(jīng)ATP裂解形成鍵)6.1C-O6.2C-S6.3C-N6.4C-C本發(fā)明的方法可適用選自任何所列類別或其它未列出的酶。從說明書的進(jìn)一步討論可明顯看出，酶的底物，酶，酶的產(chǎn)物，和受體都是可變的，根據(jù)本說明書的描述，生化分析領(lǐng)域的專業(yè)人員可對其進(jìn)行變更，從而獲得一種可用于測定的各組分的組合。
當(dāng)存在待分析酶的底物或產(chǎn)物的天然受體時，最易實(shí)施本發(fā)明。例如，有許多特異的外源凝集素，它們可識別具有高度特異性的碳水化合物鏈的末端部分。選擇一種例如在由外源凝集素識別的特定序列中只缺少末端碳水化合物的底物，當(dāng)通過糖基轉(zhuǎn)移酶將適宜的末端碳水化合物加到底物碳水化合物鏈上時，可用外源凝集素結(jié)合所生成的產(chǎn)物。天然受體-酶成對物的其它實(shí)例包括激素受體和產(chǎn)生激素過程中所涉及的酶，以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)(例如甲狀腺素結(jié)合球蛋白)和合成該轉(zhuǎn)運(yùn)物的酶。
混合物的產(chǎn)物組分并非必須是由待分析的酶直接產(chǎn)生的產(chǎn)物。例如，從類脂角鯊烯生物合成膽甾醇受一系列酶的控制。角鯊烯2，3-環(huán)氧化物可通過角鯊烯氧化環(huán)化酶環(huán)化為羊毛甾醇。使羊毛甾醇轉(zhuǎn)化為膽甾醇還需要幾個步驟。然而，可制備一種反應(yīng)介質(zhì)，使得能通過測定所產(chǎn)生的膽甾醇的量來測定角鯊烯氧化環(huán)化酶。這種反應(yīng)介質(zhì)應(yīng)含有標(biāo)記的角鯊烯(或角鯊烯2，3-環(huán)氧化物的其它標(biāo)記前體，即酶的真正底物)，在正常情況下羊毛甾醇轉(zhuǎn)化為膽甾醇所需的過量的酶，以使受角鯊烯氧化環(huán)化酶控制的步驟成為該反應(yīng)的限制步驟，和產(chǎn)生膽甾醇所需的任何輔助因素或任何中間體。其它的酶體系可按類似的方法操作，以提供一種可接受的產(chǎn)物，底物，和受體組合，便于測定代謝或其它類型酶控制途徑中任何酶的活性。因此，本文所用的術(shù)語“底物”和“產(chǎn)物”不一定是指待分析酶的直接底物或其直接產(chǎn)物，而可以是涉及待分析的途徑中的另一種底物或產(chǎn)物。
如果底物或產(chǎn)物沒有天然受體，則可用免疫學(xué)技術(shù)制備適宜的受體。單克隆抗體具有高度特異性，因而是優(yōu)選的，盡管抗血清可在適當(dāng)?shù)那闆r下使用。在制備單克隆抗體和特異的抗血清時，用需要與之結(jié)合的反應(yīng)成分(底物或產(chǎn)物)刺激B細(xì)胞(體內(nèi)或體外)。一般使用未標(biāo)記的成分以避免抗體產(chǎn)生對標(biāo)記物的刺激作用，該標(biāo)記物通常存在于產(chǎn)物和底物中。然后，通過檢測抗體與需結(jié)合的成分的結(jié)合能力選擇抗血清，或在單克隆方法中產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。也可用第二種篩選反應(yīng)消除抗體與非選擇成分(例如，若欲使受體與產(chǎn)物結(jié)合，則為底物)之間的結(jié)合反應(yīng)。例如，底物可附著在親合柱上，如果這些抗體對底物具有結(jié)合親合力它可從流經(jīng)柱的溶液中除去抗體。如果用標(biāo)記成分作為免疫原，則這種第二種選擇方法也可用來消除與分子的標(biāo)記部分結(jié)合的抗體。通過制備雜交瘤生產(chǎn)單克隆抗體是一種完全發(fā)展起來的方法，不需在此詳細(xì)描述。
在其中發(fā)生酶與底物之間的反應(yīng)的反應(yīng)介質(zhì)一般為pH適合于待分析酶的緩沖水溶液。反應(yīng)介質(zhì)還含有發(fā)生反應(yīng)所需的其它成分。例如，如果酶為轉(zhuǎn)移酶，則反應(yīng)介質(zhì)還可含有底物將被轉(zhuǎn)移其中的成分。如果酶為氧化-還原酶，則也可供給氫離子源或氫離子受體(例如，NADH)。反應(yīng)介質(zhì)的其它成分從待分析的酶反應(yīng)的性質(zhì)看將是顯而易見的。
樣品可以是任何懷疑含有待分析酶的樣品并可按照與所收集樣品的類型有關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)方法處理。典型的實(shí)例包括血(血清，血漿或全血)，尿，唾液，糞便，組織樣品等。樣品可以其最初獲得的形式使用，也可經(jīng)各種加工步驟提供以適于測定形式存在的酶。例如，如果是正常情況下的細(xì)胞質(zhì)中的酶，則可破壞細(xì)胞壁使酶釋放到反應(yīng)介質(zhì)中。
酶所作用的底物可根據(jù)設(shè)想的兩個主要特征來選擇。第一個特征是酶通過與受體的特異結(jié)合反應(yīng)由底物生成可區(qū)別于底物的產(chǎn)物的能力。由于生物結(jié)合系統(tǒng)的高度特異性，這在正常情況下不會成問題。通過測定所選受體對底物和酶反應(yīng)產(chǎn)物的結(jié)合親合力可容易地確定是否任一特定的底物適于測定方法。若有必要，放射性標(biāo)記物，例如非特異性氚標(biāo)記物，可滿足這種類型的篩選。
底物的第二個主要要求是其以不干擾底物與酶之間的結(jié)合的方式被生物發(fā)光蛋白標(biāo)上可檢測標(biāo)記的能力。用許多類型的可檢測標(biāo)示物標(biāo)記生物物質(zhì)是一個完全發(fā)展起來的臨床化學(xué)領(lǐng)域。生物發(fā)光標(biāo)示物是眾所周知的，將這樣的標(biāo)記物連接到其它分子上的技術(shù)也是眾所周知的，許多出版物和專利都描述了標(biāo)記許多不同種類化合物的技術(shù)。描述生物發(fā)光標(biāo)記物與分析物連接的例子包括1987年6月5日提交的題目為“利用得自腔腸動物的熒光素酶和光蛋白的生物發(fā)光免疫測定法”的059，137號美國申請，題目為“用標(biāo)記技術(shù)檢測或定量測定物質(zhì)”的4，478，817號美國專利，和題目為“生物發(fā)光示蹤組合物和用于免疫測定的方法”的4，604，364號美國專利。
用于本發(fā)明方法的特定生物發(fā)光標(biāo)記物包括一種能夠與熒光素酶或其它發(fā)光分子結(jié)合并在適當(dāng)條件下誘導(dǎo)發(fā)光的蛋白質(zhì)或有關(guān)分子(例如糖蛋白)。已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)生物發(fā)光蛋白可附著于酶的底物上而不會對底物與酶的反應(yīng)能力或生物發(fā)光蛋白有效地發(fā)光能力產(chǎn)生不利影響。此外，發(fā)現(xiàn)生物發(fā)光蛋白經(jīng)誘導(dǎo)和用作標(biāo)記物時具有高于化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的量子產(chǎn)量。雖然生物發(fā)光蛋白看來似乎與其它標(biāo)記物如放射性標(biāo)記物，和化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物相同，但實(shí)際上許多具有生物學(xué)意義的化合物在不用生物發(fā)光蛋白作為標(biāo)記物的情況下都無法檢測。
可得到各種生物發(fā)光蛋白。4，478，817號美國專利，4，604，364號美國專利，和1987年6月5日提交的059，137號美國申請(詳見上文)都描述了可用于實(shí)施本發(fā)明的生物發(fā)光蛋白標(biāo)記物。此外，Serio和Pazzagli編輯的《發(fā)光測定法》(LuminescentAssays)第1卷(RavenPress，1982)第115和125頁給出了用螢火蟲熒光素酶作為多相免疫測定的標(biāo)記物檢測微微克分子量的氨甲蝶呤和三硝基甲苯的實(shí)例。
最好使用通過重組技術(shù)制備的蛋白質(zhì)作為本發(fā)明的生物發(fā)光標(biāo)記物。1988年2月29日提交的165，422號和1988年3月7日提交的173，045號美國專利申請描述了許多能夠表達(dá)脫輔基水母發(fā)光蛋白，即一種得自腔腸動物的光蛋白的重組DNA載體。
特別優(yōu)選作為蛋白標(biāo)記物的是光蛋白(相對于以酶促方式作用的熒光素酶和其它生物發(fā)光蛋白)。本發(fā)明的光蛋白易于與控制發(fā)光反應(yīng)的酶如熒光素酶區(qū)分，因?yàn)楣獾鞍拙哂性谟醒跚闆r下結(jié)合真正的發(fā)光分子(例如熒光素)而不直接發(fā)光的能力。
得自腔腸動物的光蛋白特別適用于實(shí)施本發(fā)明。得自腔腸動物的光蛋白的實(shí)例為水母發(fā)光蛋白，obelin，mnemiopsin，和berovin。在許多科技出版物中都描述了這些分子，見Wardetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1975)722530-2534。這種得自腔腸動物的蛋白質(zhì)在無游離鈣離子的情況下是穩(wěn)定的并含有腔腸動物熒光素和與蛋白質(zhì)結(jié)合的氧。本文所用術(shù)語“發(fā)光分子”是指熒光素和與光蛋白結(jié)合(或受熒光素酶作用)的類似的有機(jī)小分子，它們是所發(fā)出的光的真正來源。當(dāng)將鈣離子(它是得自腔腸動物的光蛋白的生物發(fā)光引發(fā)劑)加到用光蛋白標(biāo)記的溶液中時，由熒光素分子發(fā)射出藍(lán)色的光，發(fā)射光最大值在波長約469nm處。有關(guān)這種標(biāo)記物的描述詳見1987年6月5日提交的059，137號美國申請(列為本文參考文獻(xiàn))。用遺傳工程技術(shù)制備的一種光蛋白見1988年2月29日提交的165，422號和1988年3月17日提交的173，045號美國申請(這兩個申請的題目為“能夠表達(dá)脫輔基水母發(fā)光蛋白的重組DNA載體)。
本文所述的光蛋白所具有的一個特殊優(yōu)點(diǎn)是它們能夠在無結(jié)合的發(fā)光分子情況下用于減弱本底發(fā)光的技術(shù)。與使用直接與發(fā)光分子反應(yīng)而發(fā)出光的熒光素酶和其它酶促分子相關(guān)的問題之一是該體系的蛋白組分將優(yōu)先與存在于反應(yīng)介質(zhì)中的各種表面和分子非特異性地結(jié)合。當(dāng)將熒光素或另一種發(fā)光分子加到介質(zhì)中以產(chǎn)生光時，則發(fā)生本底發(fā)光。由于光蛋白需要一種單獨(dú)的引發(fā)劑分子，所以可使用不含發(fā)光分子的光蛋白預(yù)先涂覆反應(yīng)介質(zhì)的表面。這種蛋白稱為脫輔基光蛋白。然后用載有發(fā)光分子的光蛋白作為標(biāo)記物。由于可以控制發(fā)光分子在脫輔基光蛋白上裝載和卸載的條件，所以有可能選擇反應(yīng)介質(zhì)的條件以便不發(fā)光蛋白之間的發(fā)光分子的交換。在這些情況下，只有用作標(biāo)記物的光蛋白受到外加引發(fā)劑(用于腔腸動物的光蛋白的鈣離子)引發(fā)時即發(fā)射出光，因?yàn)橛糜谙镜装l(fā)光的脫輔基光蛋白不含有發(fā)光分子?？捎糜诒景l(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案(及其許多其它實(shí)施方案)的這一優(yōu)越的技術(shù)可參見與本申請同日遞交的，題目為“提高發(fā)光測定法的靈敏度的方法”的共同未決申請。
制備出含有酶和可檢測的標(biāo)記底物的反應(yīng)介質(zhì)后，使其有足夠的時間在酶和底物之間發(fā)生反應(yīng)。由于酶具有不同的轉(zhuǎn)換率，這一時間隨所分析的具體的酶會有不同。典型的轉(zhuǎn)換率可在幾秒至幾分的范圍內(nèi)變化，而緩慢作用酶保溫時間要更長一些。
由于酶的活性一般是通過測定在給定的時間內(nèi)發(fā)生反應(yīng)的量來測量的。因此需要有精確的開始和結(jié)束的時間計(jì)時。在多數(shù)情況下，反應(yīng)是通過將樣品與標(biāo)記或未標(biāo)記底物混合引發(fā)的。反應(yīng)結(jié)束可采用若干種方式，取決于特定的酶和/或所采用的分析方法的類型。例如，可改變反應(yīng)介質(zhì)的pH(如加酸)，使在所提供的pH下酶的活性大大降低。其它終止反應(yīng)的技術(shù)包括加入大量過量抑制劑，加熱反應(yīng)介質(zhì)使酶變性，冷卻反應(yīng)介質(zhì)以降低反應(yīng)率和加入表面活性劑或其它Caotropic劑以打亂酶的結(jié)構(gòu)。如果在反應(yīng)中產(chǎn)物是用附著在固相表面的固相受體俘獲的，可通過使反應(yīng)介質(zhì)與固相受體脫離接觸終止反應(yīng)。例如，如果受體附著于微量滴定板孔壁上，可迅速將反應(yīng)介質(zhì)抽出，然后用人工或在自動微量滴定板處理器中洗滌。如果使用的受體與酶底物結(jié)合，而不是與產(chǎn)物結(jié)合，向反應(yīng)介質(zhì)中加入受體將導(dǎo)致底物與受體結(jié)合，從而防止底物與酶繼續(xù)反應(yīng)。然而，在此種和類似的酶并未失活的情況下，必須注意防止平衡被破壞，因?yàn)槊赣袝r能夠催化逆反應(yīng)(此時，由產(chǎn)物形成底物)，若持續(xù)使酶與反應(yīng)中未俘獲的組分接觸，會產(chǎn)生不正常的結(jié)果。由于在反應(yīng)介質(zhì)中還可能發(fā)生其它反應(yīng)脫除潛在的反應(yīng)物，例如產(chǎn)物水解或轉(zhuǎn)化為不能進(jìn)行逆反應(yīng)的形式，因此上述問題在許多反應(yīng)中不成為問題。其它終止反應(yīng)的方式對專業(yè)領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。
在適當(dāng)?shù)臅r機(jī)，這取決于所采用的分析方法，將能與可檢測標(biāo)記產(chǎn)物特異結(jié)合形成產(chǎn)物-受體復(fù)合物的受體或能與可檢測標(biāo)記底物特異結(jié)合形成底物-受體復(fù)合物的受體并入反應(yīng)介質(zhì)。如前所述，受體的選擇應(yīng)該是對兩組分中的一個基本沒有特異結(jié)合親合力，對另一個有特異結(jié)合親合力。結(jié)合親合力的絕對值并不重要。然而，較高結(jié)合親和力增加分析的靈敏度，并可允許待測酶的數(shù)量少和活性低。特異結(jié)合親合力(與非特異結(jié)合親合力相對)是指受體在天然結(jié)合部位與天然結(jié)合靶分子相互作用的能力。在R+T→C的反應(yīng)中，受體R和靶分子T相互作用形成復(fù)合物(R-T，此處用C表示)的締合常數(shù)(KA，用M-′為單位表示)對于抗體靶(配位體)相互作用一般至少為107。已知抗體結(jié)合反應(yīng)締合常數(shù)高到1012。其它類型的配位體-受體相互作用和締合常數(shù)可更高。例如，生物素-抗生物素蛋白相互作用的締合常數(shù)大約為1015，激素-受體相互作用通常接近甚至超過此值。
比締合常數(shù)的絕對值更重要的是目的靶的締合常數(shù)與另一不希望結(jié)合的組分的締合常數(shù)之比。例如，如欲結(jié)合產(chǎn)物，可取的是，這一結(jié)合反應(yīng)的締合常數(shù)至少是受體和底物間相互作用締合常數(shù)的103倍。該比值以至少為105為好，以至少107為更好。通過產(chǎn)物和底物對有限數(shù)量的受體結(jié)合位點(diǎn)競爭(不存在酶)，可以確定相對結(jié)合親合力。
如果需要，可在用酶形成產(chǎn)物后，使生物發(fā)光蛋白與產(chǎn)物連接。盡管這種連接在必要時可以用與標(biāo)記物在酶反應(yīng)前和底物相連的相同方式進(jìn)行，可取的是使用非共價(jià)連接基，在發(fā)生酶反應(yīng)時反應(yīng)介質(zhì)所處的條件下完成。例如，可采用生物素和抗生物素蛋白之間的強(qiáng)結(jié)合反應(yīng)在產(chǎn)物形成后在溶液中將標(biāo)記物連接于產(chǎn)物。抗生物素蛋白，較好是抗生蛋白鏈菌素，可直接與底物結(jié)合，或間接與底物結(jié)合，這時生物素直接與底物結(jié)合，抗生物素蛋白與底物上的生物素結(jié)合。然后，可將生物素化的發(fā)光劑，例如生物素化水母發(fā)光蛋白，加到溶液中，使底物變?yōu)橛霉獾鞍讟?biāo)記。Hsu等人在“ImmunoperioxidaseTechniques;AComparisonBetweenABC&Unlabeled(PAP)Procedures”(1981，J.Histochem.Cytochem.29;577)中描述了幾種使用生物素-抗生物素蛋白復(fù)合物將標(biāo)記物連接于有機(jī)分子的技術(shù)。
受體和反應(yīng)介質(zhì)中適當(dāng)組分一旦發(fā)生相互結(jié)合反應(yīng)，即采取步驟檢測待測的兩種可檢測形式之一中可檢測標(biāo)記物的存在或量。由于適用于本發(fā)明分析方法的測定類型多種多樣，上述技術(shù)也是多變的。例如，如果是均相分析，可采用驟冷或能量轉(zhuǎn)移來區(qū)分與驟冷標(biāo)記(或能量接收標(biāo)記)的受體形成復(fù)合物的標(biāo)記物和僅與可溶的底物或產(chǎn)物分子結(jié)合的標(biāo)記物。如果反應(yīng)是多相分析，其中固相和液相要分離，受體結(jié)合的靶是標(biāo)記產(chǎn)物，那么將反應(yīng)介質(zhì)與固相受體復(fù)合物分離，可測定固相受體復(fù)合物或液相未復(fù)合的可檢測標(biāo)記底物的標(biāo)記物。測定可檢測標(biāo)記物和兩組分之一的存在或其量所必需的具體步驟，根據(jù)所用標(biāo)記物的類型和具體分析方法(如均相或多相，測試產(chǎn)物或未反應(yīng)的底物)，對醫(yī)藥化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。當(dāng)采用光蛋白作標(biāo)記物時，向被測定的介質(zhì)中加入適宜的引發(fā)物誘導(dǎo)發(fā)光之后測定發(fā)生度。
作為一種可能的分析方法，這里詳細(xì)論述用本發(fā)明的方法測定糖基轉(zhuǎn)移酶。在此除了提供分析如何進(jìn)行的細(xì)節(jié)以外，還介紹了采用本發(fā)明的酶俘獲分析方法測定用以前的測定技術(shù)不易達(dá)到的酶活性測定。
在此例中，被分析的酶是UDPGalβ-D-GlcNAc(β14)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶。這一分析中涉及的主要組分示于圖5。如圖所示，分析中兩種基本試劑是重組水母發(fā)光蛋白和抗生蛋白鏈菌素。天然水母發(fā)光蛋白是取自水母Aequorea victoria的20，000道爾頓生物發(fā)光蛋白。每摩爾該蛋白含有大約1摩爾腔腸動物發(fā)色熒光素。該蛋白在鈣離子存在下產(chǎn)生藍(lán)光(λ最大469nm)，其量子產(chǎn)率可使水母發(fā)光蛋白在10-19至10-20摩爾范圍內(nèi)被檢測到。水母發(fā)光蛋白的這一數(shù)量相當(dāng)于大約每升1，000-10，000個分子?；蚓幋a脫輔基水母發(fā)光蛋白(沒有熒光素分子的蛋白)已進(jìn)行了克隆，所得蛋白是上述“重組”脫輔基水母發(fā)光蛋白。經(jīng)與合成腔腸動物熒光素、溶解氧和2-巰基乙醇一起保溫，可將重組脫輔基水母發(fā)光蛋白高產(chǎn)率地轉(zhuǎn)變成重組水母發(fā)光蛋白。使用市場可供的反應(yīng)物使重組發(fā)光蛋白生物素化。第二種試劑，即抗生蛋白鏈菌素是取自阿維丁鏈霉菌的60，000道爾頓的生物素結(jié)合蛋白。每一分子該蛋白結(jié)合4分子具有高度親合力的生物素(KD約為10-5M)?？股鞍祖溇厥鞘袌隹晒┑摹?br> 在圖5所示的示意性分析中，含有末端GlcNAc殘基的糖肽以共價(jià)鍵連接于抗生蛋白鏈菌素，作為UDPGalβ-D-GlcNAc(β1，4)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的受體。酶反應(yīng)產(chǎn)物含有Galβ1-4GlcNAc鍵。保溫后，將生物素化的重組水母發(fā)光蛋白加到反應(yīng)混合物中，在此，它與產(chǎn)物和底物中抗生蛋白鏈菌素上所有可利用的生物素結(jié)合位點(diǎn)形成復(fù)合物。為將酶反應(yīng)產(chǎn)物與底物和分析中的其它組分分離，使反應(yīng)混合物通過固定化外源凝集素RicinusCommunis凝集素-I柱。這一植物外源凝集素以高親合力與含有末端序列Galβ1-4GlcNAc-糖肽的糖結(jié)合物結(jié)合，但不與這一結(jié)構(gòu)的異構(gòu)體，例如Galβl，3GlcNAc-糖肽或Galα1，4GlcNAc-糖肽結(jié)合。通過用含有乳糖(它是一種與外源凝集素有競爭力的配位體)的緩沖液洗脫柱，由外源凝集素柱釋放出由外源凝集素結(jié)合的糖肽-抗生蛋白鏈菌素產(chǎn)物。然后向洗脫液中加入鈣離子，測定水母發(fā)光蛋白產(chǎn)生的光子數(shù)，由此測定產(chǎn)物的總量。在這一體系中，光子放射在10秒內(nèi)出現(xiàn)，產(chǎn)生的光子總量與原始樣品中酶的活性直接有關(guān)。
糖基轉(zhuǎn)移酶的糖肽受體(底物)可由纖維蛋白原制備。簡言之，是用經(jīng)鏈霉蛋白酶消化纖維蛋白原制備的纖維蛋白原糖肽作為初始原料。在ConA柱上用親合層析分離纖維蛋白原糖肽中的雙觸角鏈。洗出來結(jié)合的物質(zhì)，結(jié)合的糖肽用α-甲基甘露糖苷溶液洗脫。在經(jīng)過本文下面實(shí)驗(yàn)部分詳述的一系列操作后，得到無唾液酸，無半乳糖纖維蛋白原糖肽。這一物質(zhì)作為反應(yīng)中的底物，如下面實(shí)施例所詳述，采用市場可供的試劑，與抗生蛋白鏈菌素共價(jià)偶聯(lián)。
在所述酶分析中，反應(yīng)混合物含有抗生蛋白鏈菌素-糖肽結(jié)合物(SGP)，UDP-Gal，氯化錳和緩沖劑。反應(yīng)在37℃進(jìn)行，然后在如上述加入生物素化水母發(fā)光蛋白前將混合物冷卻至4℃抑制酶活性終止反應(yīng)。如下面實(shí)施例所示，分析結(jié)果表明，與經(jīng)典放射性同位素分析方法相比，采用上述技術(shù)，半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性測定的靈敏度至少提高三個數(shù)量級。
這種技術(shù)同樣可用于其它糖基轉(zhuǎn)移酶，例如UDPGalβ1，4Glc(NAc)-(β1，3)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和CMPNeuAcGalβ1，3(4)Glc-NAc(α1，3)唾液酸轉(zhuǎn)移酶。UDPGalβ1，4Glc(NAc)(β1，3)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在含有Galβ1，4Glc(NAc)-糖序列的低聚糖中末端半乳糖殘基連接的α1，3鍵與半乳糖相連。該酶負(fù)責(zé)糖結(jié)合物上末端Galαl-3Gal序列的合成。所有人的血清含有大量(約為循環(huán)IgG的1%)抗這一抗原決定簇的天然存在的抗體。已有指出，人的這種糖基轉(zhuǎn)移酶的異常表達(dá)可能導(dǎo)致抗原決定簇的合成和引發(fā)自身免疫過程。對這一半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的測定與上述對UDPGalβ-D-GlcNAc(β1，4)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的測定相同。例外之處包括受體的結(jié)構(gòu)，分離受體和產(chǎn)物用的固定化外源凝集素親合柱的特異性和糖核苷酸。糖核苷酸(UDPGal)是相同的，但受體糖肽將是與抗生蛋白鏈菌素偶聯(lián)的纖維蛋白原糖肽的無唾液酸衍生物，外源凝集素柱將由得自GriffoniaSimplicifoliaⅠ的外源凝集素制備。該外源凝集素與具有末端序列Galα1，3Gal-糖的低聚糖結(jié)合。結(jié)合的糖肽-抗生蛋白鏈菌素產(chǎn)物用甲基-α-半乳糖苷或末端為α-連接的半乳糖的低聚糖如棉子糖洗脫。
可采用相同的方法(其中變動不大)測定CMPNeuAcGalβ1，3(4)GlcNAc(α1，3)唾液酸轉(zhuǎn)移酶，該酶將NeuAc由CMPNeuAc轉(zhuǎn)移到含有末端序列Galβ1，3(4)GlcNAc-糖的低聚糖中。CMPNeuAcGalβ1，3(4)GlcNAc(α1，3)唾液酸轉(zhuǎn)移酶是生物合成動物細(xì)胞糖結(jié)合物過程中鏈終止反應(yīng)的重要的酶。反應(yīng)產(chǎn)物NeuAcα2-3Gal-糖是由人細(xì)胞分離的流感病毒(H3血清型)的細(xì)胞表面受體。測定中與上述UDPGalβ-D-GlcNAc(β1，4)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的測定不同之處包括使用CMPNeuAc作為糖核苷酸，用纖維蛋白原糖肽的無唾液酸衍生物作為受體分子。外源凝集素柱用得自Maackiaamurensis的白細(xì)胞外源凝集素制備，該外源凝集素與酶的產(chǎn)物，即具有末端序列NeuAcα2，3Galβ1，3GlcNAc-糖的低聚糖結(jié)合。采用這種固定化外源凝集素結(jié)合無唾液酸糖肽-抗生蛋白鏈菌素-水母發(fā)光蛋白產(chǎn)物可使產(chǎn)物與原始底物和其它例如由相關(guān)但不同的酶形成的產(chǎn)物分離。
盡管上述實(shí)例涉及的是糖基轉(zhuǎn)移酶，但根據(jù)本說明書和下述的實(shí)施例將本技術(shù)用于其它酶對本專業(yè)領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。如本文所述，只要能用受體由酶底物區(qū)分出酶產(chǎn)物，則沒有理由使反應(yīng)不包括表Ⅰ所列各種類型或任何已知的酶。
用下面實(shí)施例對本發(fā)明加以說明，而不是對其加以限制。
實(shí)施例測定UDPGalβ-D-GlcNAc(β1，4)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性用市場可供的UDPGalβ-D-GlcNAc(β1，4)半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶(SigmaChemicalCo.，St.Louis)做證明檢測可行性的研究。測定原理示于圖5。
測定中，含有末端GlcNAc殘基的糖肽共價(jià)連接于抗生蛋白鏈菌素，作為UDPGalβ-D-GlcNAc(β1，4)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的受體。酶反應(yīng)的產(chǎn)物在其末端含有Galβ1-4GlcNAc鍵。保溫后，加入生物素化水母發(fā)光蛋白與產(chǎn)物中和反應(yīng)物中抗生蛋白鏈菌素上所有可利用的生物素結(jié)合位點(diǎn)形成復(fù)合物。為將酶反應(yīng)產(chǎn)物與測定中的其它反應(yīng)物分離，使反應(yīng)混合物通過固定化外源凝集素RicinusCommunis凝集素-Ⅰ柱。該植物外源凝集素以高親合力與含有末端序列Galβ1，4GlcNAc的糖結(jié)合物結(jié)合，但不與該結(jié)構(gòu)的異構(gòu)體，例如Galβ1，3GlcNAc糖結(jié)合物或Galαl，4GlcNAc糖結(jié)合物結(jié)合(MerkleandCummings，MethodsinEnzymol(1987)138232-259)。用含有100nM乳糖的緩沖液(是與外源凝集素有競爭力的配位體)洗脫該柱，由外源凝集素柱釋放由其結(jié)合的糖肽-抗生蛋白鏈菌素產(chǎn)物。然后加入Ca++，通過測定水母發(fā)光蛋白產(chǎn)生的光子量測定產(chǎn)物總量。10秒鐘內(nèi)出現(xiàn)光子放射，產(chǎn)生的光子總量與樣品中存在的酶量直接有關(guān)。
半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的糖肽受體是如前所述由纖維蛋白原制備的(Cummings and Kornfeld，J.Biol.Chem.(1982)25711235-11240)。簡言之，使用經(jīng)鏈霉蛋白酶消化1g纖維蛋白原(Sigma Chem.Co.)制備的纖維蛋白原糖肽作為初始原料。通過在100ml Con A-瓊脂糖柱上層析分離纖維蛋白原糖肽中存在的雙觸角鏈。未結(jié)合的物質(zhì)用TBS(10mM Tris，1mM CaCl2，1mM MnCl2和0.02%NaN2，PH8.0)洗滌。結(jié)合的糖肽用10mM α-甲基甘露糖苷的TBS溶液洗滌，收集，用交聯(lián)葡聚糖G25柱層析脫鹽，以除去鹽類和半抗原糖。收集用酚-硫酸法檢測到的空隙中的糖肽并干燥。它攜帶著含有末端唾液酸和缺少墨角藻糖殘基的典型雙觸角N-連接的低聚糖，如下所示
用溫和酸水解脫除糖肽的唾液酸，所得無唾液酸衍生物用刀豆6-半乳糖苷酶完全消化，得到脫唾液酸、脫半乳糖的纖維蛋白原糖肽，如下所示
無唾液酸、無半乳糖的纖維蛋白原糖肽共價(jià)偶聯(lián)于抗生蛋白鏈菌素。簡言之，糖肽在eppendorf管中干燥，使之在乙酸鈉緩沖液(pH6.0)中與40μl 50μmol/ml茚三酮溶液反應(yīng)。將產(chǎn)物加到Bio Gel PlO柱(1×20ml)上，將活化糖肽與Rheumann′s紫和未反應(yīng)的茚三酮分離。柱的空隙中冷凍干燥的樣品干燥后立即取出，懸浮于20μl 0.17M KH2PO4(pH7.5)。將抗生蛋白鏈菌素(5mg)溶于25μl 0.17M KH2PO4(pH7.5)和5μl NaCNBH3的KH2PO4溶液(0.082g NaCNBH3/ml 0.17M KH2PO4，pH7.5)，將其加到活化的糖肽中。混合物在室溫下保溫過夜，抗生蛋白鏈菌素-糖肽結(jié)合物(SGP)在Con A柱上進(jìn)行親合層析，在100mM二甲砷酸緩沖液(pH6.5)溶液中冷凍保存。
在酶測定中，反應(yīng)混合物(35μl)在二甲砷酸緩沖液中含有2μg SGp，50nmol UDP-Gal和1μmol MnCl2，pH6.5。測定中所用酶的單位數(shù)為1-10μU。反應(yīng)混合物在37℃保溫最長2小時，通過加入20μl 200mMEDTA(pH8.0)中止反應(yīng)。保溫結(jié)束時，將反應(yīng)混合物冷卻至4℃，加入1μg生物素化水母發(fā)光蛋白(BAEQ)。將該混合物于冰上冷卻30分鐘。將樣品加到固定化Ricinus Communis凝集素Ⅰ柱上，用乳糖洗脫自柱上收集結(jié)合的半乳糖化SGP-BAEQ產(chǎn)物。將結(jié)合部分分份(500μl)裝入小瓶，通過注入100μl含鈣的檢測緩沖液(0.1M Tris，0.1M CaCl2，0.004%NaN3，pH7.5)，用Berthold光度計(jì)以光子的釋放測定產(chǎn)物。
實(shí)驗(yàn)表明，所產(chǎn)生的光子總數(shù)為酶活性的函數(shù)。將光子換算成所產(chǎn)生的生物素化水母發(fā)光蛋白締合產(chǎn)物的毫微微摩爾數(shù)。采用已知濃度的光蛋白測定建立的絕對光標(biāo)準(zhǔn)完成這一換算。結(jié)果表明，采用這一測定技術(shù)，與經(jīng)典的放射性同位素方法相比，糖基轉(zhuǎn)移酶活性測定的靈敏度至少提高三個數(shù)量級，同時不需要昂貴的放射性標(biāo)記試劑以及沒有相關(guān)的放射性污染問題。
本說明書中所提到的所有公開出版物和專利文獻(xiàn)都列為本文的參考文獻(xiàn)，這里一并指出。
雖然本發(fā)明通過說明和實(shí)例以使人能夠理解的方式進(jìn)行了清楚的描述，但根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，很明顯，專業(yè)領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和權(quán)利要求范圍情況下還可對其做出某些變更和改進(jìn)。
權(quán)利要求
1.測定樣品中酶活性的方法，其特征在于該方法包括a.在反應(yīng)介質(zhì)中合并(1)可能含有所述酶的樣品和(2)能與所述酶反應(yīng)提供標(biāo)記產(chǎn)物的酶的標(biāo)記底物；b.使反應(yīng)在所述反應(yīng)介質(zhì)中在所述酶和所述底物間進(jìn)行，在所述酶的存在下生成所述產(chǎn)物；c.在使所述反應(yīng)發(fā)生前或發(fā)生后，使所述反應(yīng)介質(zhì)與一種能與所述產(chǎn)物或所述底物，但不是兩者，特異結(jié)合的受體合并，形成復(fù)合物；d.測定在所述復(fù)合物中或反應(yīng)介質(zhì)中未配合的標(biāo)記物的存在或量，其中所述標(biāo)記物含有生物發(fā)光蛋白。
2.權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述受體附著在固體物表面，所述受體和所述可檢測標(biāo)記產(chǎn)物或底物形成固相復(fù)合物。
3.權(quán)利要求2的方法，其特征在于所述標(biāo)記底物存在于液相反應(yīng)介質(zhì)中，在測定前將所述固相復(fù)合物與所述液相反應(yīng)介質(zhì)分離。
4.權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述受體是其結(jié)合所述產(chǎn)物的親合力至少是其結(jié)合所述底物的105倍的單克隆抗體。
5.測定樣品中酶的活性水平的方法，其中將可能含有酶的樣品在反應(yīng)介質(zhì)中與能與所述酶反應(yīng)形成產(chǎn)物的底物合并，通過產(chǎn)物的形成量或底物的反應(yīng)量測定酶活性，其特征在于對該方法的改進(jìn)包括使所述產(chǎn)物或所述產(chǎn)物與對該產(chǎn)物或底物有特異結(jié)合親合力的受體結(jié)合，形成可與未復(fù)合的底物和產(chǎn)物區(qū)分的復(fù)合物，以使產(chǎn)物與未反應(yīng)的底物分開，和用所述產(chǎn)物或所述底物的生物發(fā)光蛋白標(biāo)記物檢測所述復(fù)合物中或所述反應(yīng)介質(zhì)中未復(fù)合的產(chǎn)物或底物。
6.權(quán)利要求5的方法，其特征在于所述生物發(fā)光蛋白是光蛋白。
7.權(quán)利要求6的方法，其特征在于所述光蛋白是水母發(fā)光蛋白。
8.權(quán)利要求5的方法，其特征在于所述復(fù)合物含有產(chǎn)物和受體，基本不含所述底物。
9.權(quán)利要求8的方法，其特征在于所述的底物用含有生物素-抗生物素蛋白或生物素-抗生蛋白鏈菌素復(fù)合物的連接基連接在所述標(biāo)記物上。
10.權(quán)利要求9的方法，其特征在于所述受體是外源凝集素。
11.權(quán)利要求10的方法，其特征在于所述產(chǎn)物和所述底物是生物素標(biāo)記的碳水化合物，所述生物發(fā)光蛋白標(biāo)記物在將所述生物素結(jié)合到含有所述生物發(fā)光蛋白和抗生物素蛋白的反應(yīng)之后與所述產(chǎn)物或底物連接。
全文摘要
測定樣品中酶活性的方法，包括在反應(yīng)介質(zhì)中將可能含有酶的樣品和能與酶反應(yīng)形成產(chǎn)物的標(biāo)記底物合并；使酶與底物間發(fā)生反應(yīng)，在酶的存在下形成產(chǎn)物；在使反應(yīng)發(fā)生前或發(fā)生后，將能與標(biāo)記產(chǎn)物或標(biāo)記底物，但不是兩者，特異結(jié)合的受體并入反應(yīng)介質(zhì)，形成復(fù)合物；和測定復(fù)合物中或反應(yīng)介質(zhì)中未復(fù)合的可檢測標(biāo)記物的存在或量，其中可檢測標(biāo)記物是生物發(fā)光蛋白。
文檔編號G01N33/533GK1046560SQ9010198
公開日1990年10月31日 申請日期1990年4月10日 優(yōu)先權(quán)日1989年4月10日
發(fā)明者理查德·D·庫明司, 米爾頓·J·考米爾 申請人:佐治亞州大學(xué)研究基金會