專利名稱：一種檢測腫瘤型m2丙酮酸激酶的試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物醫(yī)藥和醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，涉及免疫化學(xué)檢測技術(shù)，具體涉及一種 檢測腫瘤型M2丙酮酸激酶的試劑盒，更具體涉及一種檢測腫瘤型M2丙酮酸激酶的有 色微粒標(biāo)記的免疫層析試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
據(jù)報(bào)道，惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢。降低惡性腫瘤死亡率的主要 途徑是早期診斷和早期治療。目前，腫瘤診斷主要依賴影像學(xué)檢査，細(xì)胞學(xué)、生化學(xué) 和免疫學(xué)檢驗(yàn)。后者為主要檢查血清腫瘤標(biāo)志物(tumor marker, TM)，由于TM的敏 感性和特異性相對較高，較為經(jīng)濟(jì)，檢查時(shí)痛苦少，且適合大批量標(biāo)本檢測，TM的臨 床應(yīng)用受到了廣泛的關(guān)注。丙酮酸激酶(PK)是糖酵解中的三大關(guān)鍵酶之一。它有四種同工酶，分別為L型、R 型、M1型和M2型，它們的分布具有相對的組織特異性，通常均以酶的活性四聚體形式 存在。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)惡性腫瘤發(fā)生時(shí)，在癌基因編碼的激酶作用下，M2-PK可在腫瘤細(xì) 胞中大量表達(dá)并且其Ser和Tyr位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，原先具有高度活性的四聚體解離為無活 性的二聚體形式，即形成了腫瘤型M2丙酮酸激酶(tumor type M2 pyruvate kinase, TUM2-PK)。它與磷酸烯醇式丙酮酸的親和力低得多，因此導(dǎo)致磷酸烯醇類物質(zhì)的堆積， 有利于腫瘤細(xì)胞進(jìn)行有氧糖酵解。TU M2-PK是上世紀(jì)末始廣受關(guān)注的一種新型腫瘤標(biāo) 志物，在腎癌、肺癌、胃腸道腫瘤等的臨床診療中已顯現(xiàn)出較好的應(yīng)用價(jià)值和前景。常用的測定腫瘤標(biāo)志物的方法有酶免疫法、放射免疫法、化學(xué)發(fā)光免疫法等所述 的定量測定法需用特殊的儀器和試劑，且出報(bào)告時(shí)間長，不適合廣泛的推廣篩查使用。 目前臨床上應(yīng)用的腫瘤型M2丙酮酸激酶檢測基本為酶免疫測定法，Quantification of tumor type M2 pyruvate kinase (TU M2—PK ) in human carcinomas (人類月中瘤 中的腫瘤型M2丙酮酸激酶測定，Anticancer Res(抗癌研究)1997, 17(4B) ， 3153-3156)。 但該方法尚存在操作相對繁瑣、需要反復(fù)多次洗滌，需要借助酶標(biāo)儀讀數(shù)，不能達(dá)到 單個(gè)快速檢測的目的。免疫層析技術(shù)(Immunochromatogmph Assay)是上世紀(jì)九十年代初發(fā)展起來的一 門生物技術(shù)，因其快速、操作簡便、試劑穩(wěn)定、不易污染等特點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用?？?以實(shí)現(xiàn)真正意義上的一步快速檢測，特別適用于人群普查。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，同時(shí)滿足快速報(bào)告的需求，提供一種 檢測腫瘤型M2丙酮酸激酶的試劑盒，更具體的涉及一種檢測腫瘤型M2丙酮酸激酶的 有色微粒標(biāo)記的免疫層析試劑盒。本發(fā)明不需要測試儀器，能在固相膜介質(zhì)上簡便、 快速的檢測腫瘤標(biāo)志物-腫瘤型M2丙酮酸激酶。本發(fā)明的另一目的是提供上述試劑盒的制備方法。本發(fā)明試劑盒由底板(1)、有色微粒結(jié)合物墊(3)、測試樣品墊(4)、吸水墊(5) 和用于反應(yīng)的微孔濾膜(2)所構(gòu)成；其中所述的有色微粒結(jié)合物墊上固定有有色微粒 標(biāo)記的抗人腫瘤型M2丙酮酸激酶抗體，所述的微孔濾膜上設(shè)測定區(qū)(a)和參比區(qū)(b)， 所述的測定區(qū)(a)包被有抗人腫瘤型M2丙酮酸激酶抗體，所述的參比區(qū)(b)包被 抗鼠IgG或抗原液；所述的測定區(qū)(a)和參比區(qū)(b)均呈線形加樣，其中，兩者加 樣的距離間隔為5mm，參比區(qū)(b)加樣位置為距吸水墊3mm處。本發(fā)明所述的底板采用塑料、薄膜或膠片材料制備。本發(fā)明所述的有色微粒選自膠體金、膠體硒或彩色膠乳；所述的抗體為單克隆抗體或多克隆抗體；所述的抗原液是從離體的人腫瘤組織中提取的腫瘤型M2丙酮酸激酶抗原；所述的測定區(qū)包被的抗腫瘤型M2丙酮酸激酶抗體濃度為2. 0 2. 5mg/ml，所述的 參比區(qū)包被的抗鼠IgG或抗原液與測定區(qū)的抗體濃度匹配，分別為1.5mg/ml或 1. 0mg/ml;所述的反應(yīng)的微孔濾膜選自硝酸纖維素膜、醋酸纖維素膜、硝酸/醋酸纖維素混合膜、 聚酯膜或尼龍膜。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)，以鹽析法和層析法從離體的人腫瘤組織中提取出腫瘤型M2丙酮酸激酶抗原，通過 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，制備得到一對特異性的高效價(jià)的抗體，獲得的抗體經(jīng)分離純化后，將有色微粒標(biāo)記于該對抗體中的一株，然后將其固化在所述的結(jié)合物墊上，將另一株加樣到 微孔濾膜測定區(qū)(a)內(nèi)；同時(shí)將抗鼠IgG (市購)或上述抗原加樣到參比區(qū)(b)內(nèi)，根據(jù)雙抗體夾心法的原理，對腫瘤型M2丙酮酸激酶進(jìn)行半定量分析測定。本發(fā)明所述的試劑盒通過下述方法和步驟制備① 提取腫瘤型M2丙酮酸激酶以鹽析法和層析法從離體的人肝癌組織中提取出 腫瘤型M2丙酮酸激酶抗原并進(jìn)行活化；② 抗腫瘤型M2丙酮酸激酶抗體的制備及純化用上述純化得到的抗原通過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，制備特異的高效價(jià)的抗腫瘤型M2丙酮 酸激酶的抗體并進(jìn)行純化；③ 制備有色微粒；④ 有色微粒標(biāo)記抗體調(diào)整獲得的抗腫瘤型M2丙酮酸激酶抗體pH值，將有色微粒標(biāo)記于該抗體；⑤ 微孔濾膜的抗體包被和結(jié)合物墊上有色微粒結(jié)合物的固定 在微孔濾膜上包被抗腫瘤型M2丙酮酸激酶抗體和抗鼠IgG或抗原液；在結(jié)合物墊上進(jìn)行有色微粒標(biāo)記的抗腫瘤型M2丙酮酸激酶抗體固化干燥；⑥ 制備成免疫層析試劑盒；⑦ 樣品測試根據(jù)雙抗體夾心的免疫層析原理，對腫瘤型M2丙酮酸激酶進(jìn)行測定分析，得到半定量結(jié)果，整個(gè)測試過程在io分鐘內(nèi)完成。所建立的試劑盒的檢測結(jié)果顯示，對腫瘤型M2丙酮酸激酶濃度分三個(gè)水平區(qū)段 小于15U/ml， 15 100U/ml之間，大于100U/ml，檢測結(jié)果可反映腫瘤型M2丙酮酸激 酶的變化范圍和發(fā)展趨勢，能滿足臨床診斷和治療監(jiān)測需求，且可在10分鐘內(nèi)完成測試o本試劑盒便于攜帶和保存；操作簡便，方法穩(wěn)定、且可單個(gè)測試，具有可半定量 測定的特點(diǎn)，能反映腫瘤型M2型丙酮酸激酶的濃度范圍和變化趨勢，明顯方便臨床診 斷和治療監(jiān)測的使用。本發(fā)明不需要測試儀器，不需要酶、無需繁瑣的洗滌步驟；能 在固相膜介質(zhì)上簡便、快速的檢測腫瘤標(biāo)志物-腫瘤型M2丙酮酸激酶。


圖1為檢測腫瘤型M2丙酮酸激酶的有色微粒標(biāo)記的免疫層析試劑盒正面觀圖； 圖2為檢測腫瘤型M2丙酮酸激酶的有色微粒標(biāo)記的免疫層析試劑盒側(cè)面觀圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1采用鹽析粗提和層析法純化抗原取切除離體的人肝癌組織塊，去除脂肪和結(jié)締組織，加入含0.5mmol/Ll,6-二磷酸 果糖和10mmol/L P-巰基乙醇的勻槳緩沖液(20mmol/Ltris-HCl pH7.5緩沖液， 10Ommol/LKC1， 5mmol/LMgS04 ， lmmol/LEDTA)，低溫條件下進(jìn)行勻漿，15000rpm 離心20min，取上清，采用分段鹽析法作預(yù)處理用45-75%的硫酸銨分段沉淀，獲得 粗提物，用生理鹽水和磷酸緩沖液分別透析平衡后，用磷酸纖維素柱(經(jīng)酸堿處理并 經(jīng)10mmol/L磷酸緩沖液平衡)加樣結(jié)合，用含0.5mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸的洗脫緩 沖液(10-140mmol/L磷酸緩沖液)線性濃度梯度洗脫解離，并經(jīng)濃縮后用10mmol/L pH7. 2的PBS充分透析活化，用BCA (Bicinchoninic Acid)法測定蛋白質(zhì)的濃度，再 經(jīng)冷凍干燥成凍干粉，分裝-20'C保存；取上述腫瘤型M2丙酮酸激酶抗原凍干粉，復(fù)溫，取0.3mg，溶解于lml生理鹽水， 免疫8周齡，體重20克左右的BALB/c小鼠3只。首次將抗原100y g/只加福氏完全 佐劑(抗原/佐劑比例為1:1)腹腔注射，間隔兩周，第二次同樣抗原劑量加不完全佐劑 腹腔注射，間隔三周，第三次抗原100iig/只，不加佐劑直接溶解于生理鹽水(N.S)中腹 腔注射， 一周后，取小鼠眼睚血以間接ELISA法測定抗體效價(jià)。經(jīng)三次免疫后一個(gè)月， 取抗體效價(jià)高的小鼠，細(xì)胞融合前三天，腹腔注射50ug、尾靜脈注射50yg腫瘤型 M2丙酮酸激酶抗原加強(qiáng)免疫，于加強(qiáng)免疫后三天，無菌取免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨 髓瘤細(xì)胞(細(xì)胞比例為5:1)在50。/。PEG4000 (pH7.8-8.0)的作用下，按常規(guī)方法進(jìn)行 細(xì)胞融合。融合細(xì)胞以RPMI1640液洗滌一次去除PEG4000后，重新懸浮于HAT選擇 性培養(yǎng)液中。接種于預(yù)置飼養(yǎng)細(xì)胞層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1 X 105個(gè)細(xì)胞，置37°C、 5%C02，培養(yǎng)箱培養(yǎng)10-13天，觀察雜交瘤細(xì)胞生長情況，當(dāng)細(xì)胞克隆長至一個(gè)中倍 鏡視野時(shí)，取其培養(yǎng)上清液采用間接ELISA法對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，篩選出的陽性 孔，用有限稀釋法進(jìn)行克隆化培養(yǎng)3-5次，獲得穩(wěn)定分泌抗人腫瘤型M2丙酮酸激酶單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。將已建株的單克隆雜交瘤細(xì)胞注入預(yù)先用硅膠H處理過的 BALB/c小鼠腹腔，待腹部膨大時(shí)抽取腹水。3000rpm離心30min，取上清液加入1/1000 (w/v) Na&后，4。C保存、純化鑒定。單克隆抗體腹水的純化采用辛酸法。lml腹水加2ml 0. 06mol/LpH4. 0的醋酸緩沖液， 用lmol/LHCl調(diào)至pH4.8。加33ul辛酸，搖勻。于室溫繼續(xù)攪拌30min，再4。C 10000rpra 離心30min，取上清用50倍體積的0.02mol/L PBS pH7.4透析液，4。C透析24小時(shí)，換透 析液兩次。上清用BCA法測定蛋白質(zhì)的濃度即為免疫球蛋白的含量，分裝，-2(TC凍存?zhèn)溆胦制備有色微粒膠體硒溶液取4'C蒸餾水于269ml玻璃燒瓶，加入碳?xì)錁渲牧?攪拌珠，轉(zhuǎn)速580rpm，加入5. 6ml 1. 6M抗壞血酸鈉，5. 6ml的0. 58M亞硒酸，振蕩、 混勻8 10秒，澄清溶液變色，變渾，15分鐘后加溫至42'C，維持反應(yīng)至l小時(shí)，得 膠體硒溶液，4'C保存?zhèn)溆?。上述制得的有色微粒膠體硒溶液100ml用0. lmol/L的碳酸鉀調(diào)節(jié)pH至中性，加 入1/10(v/v) 3-3. 5 mg的抗腫瘤型M2丙酮酸激酶單克隆抗體溶液，室溫反應(yīng)15分 鐘后，加入聚乙二醇(PEG)至終濃度為1%，繼續(xù)攪拌15分鐘。12000r/min離心30min， 棄去上清，所得沉淀即為純化的微粒標(biāo)記的抗體，將其復(fù)懸于相當(dāng)于原體積1/5的1 XBSA溶液中，4匸保存。在纖維素的微孔膜上，測定區(qū)(a)和參比區(qū)(b)分別平行包被2. Omg/ml的抗腫 瘤型M2丙酮酸激酶單克隆抗體和1.0mg/ml抗原液，均呈線狀加樣，干燥備用；取有 色膠體硒微粒標(biāo)記的抗體溶液與1XBSA溶液按1: 1比例混勻，噴涂于結(jié)合物墊(玻 璃纖維)上，干燥固定，備用。制備試劑盒在66mmx250mra的單面膠PVC底板上，依次粘貼上已平行包被抗腫瘤 型M2丙酮酸激酶抗體和抗原液的微孔濾膜、固定有色微粒標(biāo)記抗體的結(jié)合物墊、加 樣的玻璃纖維墊以及吸水材料；微孔濾膜與吸水材料重疊2mm，與結(jié)合物墊重疊lram， 橫向切割PVC底板為5mm x 66mm的試劑條。測試樣品與判斷:在試劑盒的加樣玻璃纖維上，加待測血清80nl，在虹吸作用下, 所述待測血清溶解結(jié)合物墊上的有色微粒標(biāo)記的結(jié)合物并與之反應(yīng)，經(jīng)過包被有抗腫 瘤型M2丙酮酸激酶抗體處時(shí)，若樣品中含待測的腫瘤型M2丙酮酸激酶，則在測定區(qū)(a)形成"抗腫瘤型M2丙酮酸激酶一腫瘤型丙酮酸激酶一有色微粒標(biāo)記抗腫瘤型 M2丙酮酸激酶抗體"的復(fù)合物而顯色，表明此時(shí)樣品中的腫瘤型M2丙酮酸激酶濃度 大于15U/ml;同時(shí)將顯色線條顏色的深淺與包被抗原液的參比區(qū)(b)顯色相對比，若 深于參比區(qū)(b)顯色，則為腫瘤型M2丙酮酸激酶濃度大于100U/ml，若有顯色但淺 于參比區(qū)(b)顯色，則腫瘤型M2丙酮酸激酶濃度介于15U/ml和100U/ml之間；若 測定區(qū)無顯色，則表示腫瘤型M2丙酮酸激酶濃度小于15U/ml;若參比區(qū)無顯色表明 試劑盒失效。 實(shí)施例2采用鹽析粗提和層析法純化抗原:制備同實(shí)施例1。將上述腫瘤型M2丙酮酸激酶抗原自冰箱中取出0.3mg，復(fù)溫，用生理鹽水稀釋至 lml。免疫實(shí)驗(yàn)用新西蘭雄性兔，體重2.5kg左右，先于家兔雙后足掌皮下注射弗氏完 全佐劑與融合蛋白抗原的混合物lmg/ml/只，初次免疫用福氏完全佐劑與抗原充分混勻 至呈"油包水"狀抗原乳化液。于2周后于雙側(cè)后肢腫大的胭窩淋巴結(jié)內(nèi)各注入0. 5ml 弗氏不完全佐劑抗原混合物，于第6、 8周背部多點(diǎn)注射總量lmg的弗氏不完全佐劑抗 原混合物，注射后兩周于皮下直接用lmg抗原加強(qiáng)免疫一次，心臟采血，采用間接ELISA 法檢測抗血清效價(jià)。即獲得含多克隆抗體的抗血清，進(jìn)一步使用辛酸一飽和硫酸銨法 純化?？寡宓募兓捎眯了嵋伙柡土蛩徜@法。抗腫瘤型M2丙酮酸激酶的抗血清lml， 加上4ral 0.06mol/LpH4.0的醋酸緩沖液，力口120ul辛酸，4。C攪拌30min， 10000rpm離 心30min，取上清用50倍體積0. 02mol/L PBS pH7. 4的透析液，4。C透析過夜。取出，加 等體積的pH8.0飽和(NH4)2S04，輕輕攪拌30min，于4。C 10000rpm離心20rain，去上清。 沉淀溶于較小體積的O. 02 mol/LPBS pH7.4中，然后對50倍體積的上述的透析液于4'C 透析36小時(shí)，換透析液三次。再4。C8000卬m離心15min，去除不溶物。在紫外分光光度 計(jì)上測定A28。和A沈。，根據(jù)公式(1.45XA28。-0.74XA26。) X稀釋倍數(shù)，計(jì)算蛋白濃度即 為免疫球蛋白的含量，分裝，-2(TC凍存?zhèn)溆?。抗腫瘤型M2丙酮酸激酶的單克隆抗體的制備及純化與實(shí)施例1相同。有色微粒膠體金溶液制備在100ml蒸餾水中加入lmll^氯金酸(V/V)，加熱至 沸騰，再加入l^檸檬酸三鈉溶液lml，繼續(xù)煮沸10分鐘，冷卻后，4'C保存?zhèn)溆?。取樣用分光光度?jì)掃描測定最大吸收峰，并進(jìn)行透射電鏡觀察粒子大小。上述制得的有色微粒膠體金溶液100ml用0. lmol/L的碳酸鉀調(diào)節(jié)pH至中性，加 入1/10 (v/v) 3-3. 5 mg的抗腫瘤型M2丙酮酸激酶的單克隆抗體溶液，室溫反應(yīng)15分 鐘后，加入聚乙二醇(PEG)至終濃度為1%，繼續(xù)攪拌15分鐘。12000r/min離心30min， 棄去上清，所得沉淀即為純化的膠體金微粒標(biāo)記的抗體，并將其復(fù)懸于相當(dāng)于原體積 1/5的1XBSA溶液中，4'C保存。在纖維素的微孔膜上測定區(qū)(a)和參比區(qū)(b)分別平行包被2. 2mg/ml的兔抗 腫瘤型M2丙酮酸激酶抗體和1.5mg/ml的抗鼠IgG，均呈線狀加樣，干燥備用；取有 色膠體金微粒標(biāo)記抗體溶液與1XBSA溶液按1: 1比例混勻，用定量噴頭噴涂于結(jié)合 物墊(玻璃纖維)上，進(jìn)行干燥固定，備用。制備試劑盒，測試樣品與判斷:方法和步驟同實(shí)施例1。所建立的試劑盒的檢測結(jié)果顯示出對腫瘤型M2丙酮酸激酶濃度分小于15U/ml, 15 100U/ml之間，大于100U/ml三個(gè)水平區(qū)段，檢測結(jié)果能反映腫瘤型M2丙酮酸激 酶的變化范圍和發(fā)展趨勢，可滿足臨床診斷和治療監(jiān)測需求，測試在10分鐘內(nèi)完成。本發(fā)明不限于上述實(shí)施方式，還可以將檢測裝置放入塑料盒中組成試劑板，因此 利用上述發(fā)明原理制成試劑板也應(yīng)落在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種檢測腫瘤型M2丙酮酸激酶的試劑盒，包括底板(1)、有色微粒結(jié)合物墊(3)、測試樣品墊(4)、吸水墊(5)和用于反應(yīng)的微孔濾膜(2)；其特征是所述的有色微粒結(jié)合物墊上固定有有色微粒標(biāo)記的抗人腫瘤型M2丙酮酸激酶抗體，所述的微孔濾膜上設(shè)測定區(qū)(a)和參比區(qū)(b)，所述的測定區(qū)包被有抗人腫瘤型M2丙酮酸激酶抗體，參比區(qū)包被抗鼠IgG或腫瘤型M2丙酮酸激酶抗原液；所述的測定區(qū)和參比區(qū)的間距為5mm，參比區(qū)加樣位置為距吸水墊3mm處。
2. 按權(quán)利要求1所述的檢測腫瘤型M2丙酮酸激酶的試劑盒，其特征是所述的測定區(qū) 包被的抗腫瘤型M2丙酮酸激酶抗體濃度為2.0 2.5mg/ml，所述的參比區(qū)包被的 抗鼠IgG或抗原液與測定區(qū)的抗體濃度匹配，分別為1. 5mg/ml或1. Omg/ml。
3. 按權(quán)利要求1所述的檢測腫瘤型M2丙酮酸激酶的試劑盒，其特征是所述的抗體為 單克隆抗體或多克隆抗體。
4. 按權(quán)利要求1所述的檢測腫瘤型M2丙酮酸激酶的試劑盒，其特征是所述的有色微 粒選自膠體金、膠體硒或彩色膠乳。
5. 按權(quán)利要求1所述的檢測腫瘤型M2丙酮酸激酶的試劑盒，其特征是所述的反應(yīng)的 微孔濾膜選自硝酸纖維素膜、醋酸纖維素膜、硝酸/醋酸纖維素混合膜、聚酯膜或尼 龍膜。
6. 權(quán)利要求1所述的檢測腫瘤型M2丙酮酸激酶的試劑盒的制備方法，其特征是通過 下述步驟① 提取腫瘤型M2丙酮酸激酶 用鹽析法和層析法提取離體肝癌組織的腫瘤型M2丙酮酸激酶抗原并進(jìn)行活化；② 制備及純化抗腫瘤型M2丙酮酸激酶抗體 所得的抗原制備抗腫瘤型M2丙酮酸激酶的抗體并進(jìn)行純化， 所述的抗體為單克隆抗體或多克隆抗體；③ 制備有色微粒；④有色微粒標(biāo)記抗體調(diào)整獲得的抗腫瘤型M2丙酮酸激酶抗體pH值至中性，標(biāo)記有色微粒于該抗體； 微孔濾膜的抗體包被和結(jié)合物墊上有色微粒結(jié)合物的固定-在微孔濾膜上包被抗腫瘤型M2丙酮酸激酶抗體和抗鼠IgG或抗原液；在結(jié)合物 墊上進(jìn)行有色微粒標(biāo)記的抗腫瘤型M2丙酮酸激酶抗體固化干燥；◎制備免疫層析試劑盒。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征是所述的步驟①的鹽析法為分段鹽析，用 45-75%的硫酸銨分別沉淀，獲得粗提物；磷酸纖維素柱層析進(jìn)一步純化，用含 0.5mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸的洗脫緩沖液解離，濃縮后用pH7. 2 PBS透析活化， 冷凍干燥成凍干粉-2(TC保存。
8. 據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征是，所述的步驟②的單克隆抗體通過下述方 法制備用獲得的腫瘤型M2丙酮酸激酶抗原用雜交瘤技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞融合、間接 ELISA法篩選陽性孔、克隆培養(yǎng)獲得單抗；多克隆抗體通過下述方法制備用獲得 的腫瘤型M2丙酮酸激酶抗原與福氏佐劑混勻，通過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，獲得含多克隆抗體 的抗血清后，用辛酸法和/或飽和硫酸銨純化。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征是，其中步驟③的有色微粒通過下述方法 制備在100ml蒸餾水中加入lmll^氯金酸V/V，加熱至沸騰，加入1%檸檬酸三 鈉溶液lml，煮沸10分鐘，冷卻后得膠體金，4。C保存；在4。C 269ml蒸餾水中加 入5.6ml 0.58M亞硒酸，5.6ml 1.6M抗壞血酸鈉，振蕩混勻，15分鐘后加溫至42°C， 反應(yīng)1小時(shí)，得膠體硒，4'C保存。
10. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征是，其中步驟④的有色微粒標(biāo)記抗體通過 下述步驟制備取權(quán)利要求8制得的有色微粒膠體溶液100ml用0. lmol/L的碳酸鉀 調(diào)節(jié)pH至中性，加入1/10 v/v的抗體溶液，室溫反應(yīng)15分鐘后，加入聚乙二醇 至終濃度為1%，攪拌15分鐘，12000r/min離心30min，棄上清，所得沉淀為純化 的微粒標(biāo)記的抗體，將其復(fù)懸于相當(dāng)于原體積1/5的1XBSA溶液中，4r保存。
11. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的的制備方法，其特征是，所述的步驟⑤的微孔濾膜的抗體包 被和結(jié)合物墊上有色微粒結(jié)合物的固定通過下述步驟在纖維素的微孔膜上平行包被所需濃度的抗腫瘤型M2丙酮酸激酶抗體以及抗鼠IgG或抗原液；干燥備用；取 有色微粒標(biāo)記的抗體溶液與1^BSA溶液按1: l比例混勻，用定量噴涂于結(jié)合物墊 或玻璃纖維上，干燥固定，備用。
12.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征是，所述的步驟⑥的免疫層析試劑盒通過 下述方法制備在單面膠PVC底板上，依次粘貼已平行包被抗體的微孔濾膜、固定 有色微粒標(biāo)記抗體的結(jié)合物墊、加樣的玻璃纖維墊和吸水材料，橫向切割所述PVC 底板成條。
全文摘要
本發(fā)明屬生物醫(yī)藥和醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，涉及檢測腫瘤型M2丙酮酸激酶的試劑盒及制備方法。本試劑盒包括底板(1)、有色微粒結(jié)合物墊(3)、測試樣品墊(4)、吸水墊(5)和用于反應(yīng)的微孔濾膜(2)，所述的有色微粒結(jié)合物墊上固定有色微粒標(biāo)記的抗人腫瘤型M2丙酮酸激酶抗體，微孔濾膜上設(shè)測定區(qū)(a)和參比區(qū)(b)，測定區(qū)包被抗人腫瘤型M2丙酮酸激酶抗體，參比區(qū)包被抗鼠IgG或抗原液；對腫瘤型M2丙酮酸激酶進(jìn)行半定量分析測定，10分鐘內(nèi)完成測試。本試劑盒便于攜帶和保存，操作簡便，方法穩(wěn)定，不需測試儀器和酶、能在固相膜介質(zhì)上簡便、快速檢測腫瘤型M2丙酮酸激酶。
文檔編號G01N33/574GK101226195SQ20081003350
公開日2008年7月23日 申請日期2008年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月3日
發(fā)明者盧仁泉, 林 郭 申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院