含目標基因組dna片段植株的選育方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及遺傳學、基因組學和分子育種領(lǐng)域，具體地說，涉及全基因組選擇育種 技術(shù)以及利用該技術(shù)快速精確選育含目標基因組DNA片段的植株的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 長期以來，傳統(tǒng)育種的選擇方法主要依賴于田間表現(xiàn)型的評價，根據(jù)育種家個人 經(jīng)驗進行取舍，其最大的缺點在于耗時長。近年來，育種家開始應(yīng)用分子標記輔助選擇方 法改良個別目標性狀，雖然該方法的運用能顯著的縮短育種年限，但仍然存在如下的缺點。 (1)非目標基因組DNA片段的導入。現(xiàn)有分子標記輔助選擇方法的應(yīng)用大多局限于單個基 因位點的選擇，僅確保包含目標基因組DNA片段的導入而忽略導入片段的大小。因無法確 定導入片段大小，導致與目標基因組DNA片段連鎖的非目標基因組DNA片段也被轉(zhuǎn)移到待 改良材料中，即產(chǎn)生遺傳累贅。（2)優(yōu)良性狀的喪失。由于無法在全基因組水平判斷所選育 植株的遺傳背景，存在受體親本某些優(yōu)良性狀喪失的風險。（3)缺乏穩(wěn)定性。選育的植株可 能因基因型不純導致后代表型的分離。
[0003] 稻瘟病是水稻最嚴重的病害之一，全球每年由稻瘟病引起的水稻產(chǎn)量損失占 11 %~30 %，因此稻瘟病及其抗性的研究顯得尤為重要。隨著對稻瘟病研究的逐步深入，許 多水稻抗稻瘟病基因 DNA片段相繼被定位和克隆。其中，水稻第6染色體的Pi2區(qū)間被定 位和克隆了很多稻瘟病抗性基因，如Pi2、Piz-t、Pi9、Pigm、Pi50,該區(qū)間包含一個稻瘟病 抗性基因的基因簇（Dai 等，2010 ;Qu 等，2006 ;Wang 等，2012 ;Zhou 等，2006 ;Xiao 等，2012 ; Liu 等，2002 ;Liu 等，2011 Jiang 等，2012 ;Zhu 等，2012 ;Deng 等，2006)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種快速精確選育含目標基因組DNA片段的植株的方法。
[0005] 本發(fā)明的另一目的是提供含抗稻瘟病基因重組DNA片段的水稻植株的選育方法。
[0006] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的含目標基因組DNA片段的植株選育方法，其是基 于全基因組選擇育種技術(shù)，在育種過程中，通過精確的前景選擇和高密度分子標記全基因 組背景選擇，獲得將目標基因組DNA片段導入受體植物親本的重組植株。所述方法包括以 下步驟：
[0007] (1)以不含目標基因組DNA片段的受體植物親本作為輪回親本，與含有所述目標 基因組DNA片段的供體植物親本，進行雜交、回交和自交；
[0008] (2)在育種過程中利用前景選擇標記進行前景選擇；
[0009] (3)在育種過程中利用高密度分子標記檢測方法進行全基因組背景選擇；
[0010] ⑷利用上述步驟直至獲得目標基因組DNA片段兩側(cè)同源重組，目標基因組DNA片 段純合，且背景完全回復(fù)的目標植株。
[0011] 具體地，含目標基因組DNA片段的植株選育方法包括：以不含目標基因組DNA片段 的受體植物親本作為輪回親本，與含有所述目標基因組DNA片段的供體植物親本，進行雜 交和回交，獲得BC^代；利用前景選擇標記對BC^代進行目標基因組DNA片段單側(cè)同源重 組片段篩選及全基因組背景選擇，選擇背景回復(fù)好的重組單株與受體親本進行回交，獲得 BCR代；利用正向選擇標記篩選含有目標基因組DNA片段的BC2Fi代，并進行全基因組背景 選擇，選擇背景回復(fù)好的重組單株再次與受體親本進行回交，獲得BC^代；利用前景選擇 標記對BCA代進行目標基因組DNA片段另一側(cè)同源重組片段篩選及全基因組背景選擇，選 擇目標基因組DNA片段導入片段小，且背景回復(fù)好的重組單株；選中的重組單株自交一次， 獲得BC 3F2代；利用正向選擇標記對BC3F2代進行檢測，并進行全基因組背景選擇，最終獲得 目標基因組DNA片段純合，且背景完全回復(fù)的目標植株。
[0012] 前述的方法，前景選擇標記包括正向選擇標記和負向選擇標記，其中，正向選擇標 記與目標基因組DNA片段的物理距離彡50kb或遺傳距離彡0. 2cM，負向選擇標記與目標基 因組DNA片段的物理距離彡500kb或遺傳距離彡2cM。
[0013] 本發(fā)明中涉及的植物包括但不限于飼料作物、油料種子作物、谷類作物、水果作 物、蔬菜作物、纖維作物、香料作物、堅果作物、草坪作物、糖類作物、飲料作物和森林作物等 農(nóng)作物植物。
[0014] 本發(fā)明還提供含抗稻瘟病基因重組DNA片段的水稻植株的選育方法，包括以下步 驟：
[0015] (a)以水稻'空育13Γ為輪回親本，含抗稻瘟病基因 DNA片段的'K22'為供體 親本進行雜交和回交，獲得BC^代；利用正向選擇標記Pi2-4和負向選擇標記RM19814、 RM19835對BC^代進行抗稻瘟病基因 DNA片段單側(cè)同源重組片段篩選，并用水稻全基因組 育種芯片RICE6K對其進行背景選擇；
[0016] (b)選擇背景回復(fù)較好的重組單株與受體親本'空育13Γ進行回交，獲得BC2Fi代， 利用正向選擇標記Pi2_4對其進行檢測，選擇含有抗稻瘟病基因 DNA片段的重組單株，然后 用水稻全基因組育種芯片RICE6K對其進行背景選擇；
[0017] (C)選擇背景回復(fù)好的重組單株再次與受體親本'空育13Γ進行回交，獲得BC3Fi 代，利用正向選擇標記Pi2_4和負向標記RM19814、RM19835對BCR代進行抗稻瘟病基因 DNA片段另一側(cè)同源重組片段篩選，并利用水稻全基因組育種芯片RICE60K對其進行背景 選擇，篩選到導入目標片段小，且背景回復(fù)好的重組單株；
[0018] ⑷選中的重組單株自交一次，獲得BC3F2代；利用正向選擇標記Pi2_4對BC 3F2代 進行檢測，并利用水稻全基因組育種芯片RICE60K對其進行背景選擇，最終獲得目標基因 組DNA片段純合，且背景完全回復(fù)的含抗稻瘟病基因重組DNA片段的水稻植株。
[0019] 采用上述方法獲得一個抗稻瘟病基因重組DNA片段，該片段兩側(cè)的同源重組片段 的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示。
[0020] 本發(fā)明還提供用于檢測上述抗稻瘟病基因重組DNA片段的方法。根據(jù)該片段兩側(cè) 的同源重組片段的核苷酸序列，分別設(shè)計特異性PCR擴增引物，以待測水稻基因組為模板， 進行PCR反應(yīng)，并分析PCR擴增產(chǎn)物。
[0021 ] 優(yōu)選地，采用Sanger測序法分析PCR擴增產(chǎn)物。
[0022] 用于擴增及檢測SEQ ID No. 1所示同源重組片段的引物組合為：
[0023] 組合 I
[0024] 擴增引物：A08X2 IF: 5，-AGCCCTGTCATTCTCGTGT-3，
[0025] A08X21R: 5 ' -AAAGGACAGGTGGAGATGG-3 '
[0026] 測序引物：A08X21F:5' -AGCCCTGTCATTCTCGTGT-3'
[0027] 組合 II
[0028] 擴增引物：A08X3 IF: 5 ' -ACAAGCCCAGTTGGAGAATC-3 '
[0029] A08X31R: 5 ' -AAGGGCATACTGGAGAAGATG-3 '
[0030] 測序引物：A08X31F:5, -ACAAGCCCAGTTGGAGAATC-3'
[0031] A08X31F2:5 ' -GCTCGATGCTACTCATATGC-3 '
[0032] 組合 III
[0033] 擴增引物：A08X22F: 5 ' -ACCCGTGGAAGCTGAAGGT-3 '
[0034] A08X22R: 5，-AAACCGATCCGAAACCACC-3 '
[0035] 測序引物：A08X22F2:5，-GCCTGTGTGTGTCAGATGAGC-3，。
[0036] 以待測樣品基因組DNA為模板，利用上述擴增引物進行PCR擴增，然后利用上述測 序引物對獲得的擴增產(chǎn)物進行測序，若測序結(jié)果與SEQ ID No. 1序列一致或互補，則待測樣 品中含有SEQ ID No. 1所示同源重組片段。
[0037] 用于擴增及檢測SEQ ID No. 2所示同源重組片段的引物組合為：
[0038] 組合 IV
[0039] 擴增引物：A08X35F