運動發(fā)酵單胞菌的易錯全基因組改組方法及耐受糠醛運動發(fā)酵單胞菌的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種運用易錯全基因組改組技術(shù)提高運動發(fā)酵單胞菌的糠醛耐受性的方法及耐受糠醛運動發(fā)酵單胞菌。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著化石能源的日益枯竭，溫室效應的逐步顯現(xiàn)，清潔可替代能源已成為全球的研究熱點，以木質(zhì)纖維素為原料發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的研發(fā)工作更是備受關(guān)注。自然界中可再生的木質(zhì)纖維素資源極為豐富，其主要成份是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。釀酒酵母和運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)作為生產(chǎn)乙醇的菌株而備受關(guān)注。運動發(fā)酵單胞菌是目前唯一一種通過ED途徑厭氧發(fā)酵葡萄糖的微生物，與釀酒酵母相比具有糖吸收比速率快、乙醇得率高、生物量形成少等產(chǎn)醇優(yōu)勢[1]，可作為工業(yè)化生產(chǎn)乙醇的優(yōu)勢菌株。木質(zhì)纖維素難于降解，需要物理、化學等預處理手段打破纖維素微纖維之間的交聯(lián)耦合。在預處理過程中，會產(chǎn)生三類抑制酶解和發(fā)酵的抑制物:1.弱酸(乙酸、甲酸和乙酰丙酸)等；
2.木質(zhì)素降解產(chǎn)物(酚醛樹脂、香草醛和木質(zhì)素單體等)；3.糖的熱降解過程中，由于焦糖化作用和美拉德反應而產(chǎn)生的糠醛和5-羥甲基糠醛等熱降解產(chǎn)物[2]?？啡?-羥甲基糠醛等發(fā)酵抑制物，抑制菌體生長和微生物發(fā)酵，從而降低乙醇效率M。構(gòu)建能耐受木質(zhì)纖維素水解液中抑制物的工程菌株可以使菌株在水解液中高效發(fā)酵，降低預處理過程中工藝水洗抑制物的用量，節(jié)約生產(chǎn)成本，對纖維素乙醇的工業(yè)化具有重要意義。
[0003]目前發(fā)現(xiàn)運動發(fā)酵單胞菌的hfq(ZM00347)基因在抵抗多種木質(zhì)纖維素預處理抑制劑(乙酸甲酯，香草醛，糠醛和羥甲基糠醛)中發(fā)揮作用，在hfq的突變株中過表達該基因能恢復運動發(fā)酵單胞菌的糠醛耐受性M。但是轉(zhuǎn)錄組的研究也表明細菌呈現(xiàn)環(huán)境脅迫，酸、酚和糠醛等水解抑制物脅迫時，多基因表達發(fā)生改變。即多基因表達水平同時改變更有利于細菌獲得耐受性能[5]。然而，目前對細菌的耐受脅迫機制研究尚不清楚。一些學者也利用基因工程、適應性培養(yǎng)、誘變等手段實現(xiàn)多基因同時改變以有效的提高細菌的耐脅迫性[6]，但獲得的耐受水解液抑制物的運動發(fā)酵單胞菌較少。傳統(tǒng)的易錯PCR技術(shù)只能對特定的基因進行有效突變，而全基因組改組技術(shù)需要結(jié)合理化誘變獲得優(yōu)良菌株進而通過原生質(zhì)體融合而實現(xiàn)各菌株全基因的洗牌，從而篩選出耐受性狀提高的菌[7]。理化誘變篩選菌的方法對操作人員有一定的危害、適應進化也費時費力；運用分子生物學手段對某一或某幾個特定基因過表達或敲除難以多方位改造菌的特性、大幅度提高其耐受性，運用合成生物學手段系統(tǒng)的實現(xiàn)多基因改造以改善菌的耐受性需要對機制有充分的理解。因而，目前急需建立快速有效的手段獲得具有耐受性的運動發(fā)酵單胞菌，以提高其在木質(zhì)纖維素水解液中的應用能力。
[0004]參考文獻:
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[0011]7.羅劍，楊民和，施巧琴.微生物菌種選育中的基因組改組技術(shù)及其應用進展生物技術(shù) 2008, 81-83.

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種運動發(fā)酵單胞菌的易錯全基因組改組方法。
[0013]本發(fā)明的第二個目的是提供耐受糠醛運動發(fā)酵單胞菌。
[0014]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
[0015]運動發(fā)酵單胞菌的易錯全基因組改組方法，包括如下步驟:
[0016](I)基因組DNA提取:提取出發(fā)菌株運動發(fā)酵單胞菌的基因組DNA ;
[0017](2)易錯PCR擴增全基因組:
[0018]取5 μ L的dNTPS母液、16.6 μ L的100uM10-17個堿基的隨機引物、3 μ L的15mM的MnCl2、5yL 的 1X 突變 buffer、20ng 步驟(I)獲得的基因組 DNA、2.5 μ L 的 2U/μ L TaqDNA聚合酶、補充無菌水至50 μ L ;所述dNTPS母液含1mM dCTP和dTTP、2mM dATP和dGTP ；所述 1X 突變 buffer 含 ImM ρΗ8.3 的 Tris-HCl，0.7mM MgCl2、5mM KC1、lg/100mL 甘油；
[0019]易錯PCR反應條件:94°C預變性5分鐘；92°C lmin，再在37°C的條件下退火lmin，再由37°C以每秒變化0.1°(:的速度升至55°(:，55°(:延伸4min，進行50個循環(huán)，55°C補充延伸 1min ；
[0020](3)全基因組改組:將步驟⑵獲得的PCR產(chǎn)物通過乙醇沉淀濃縮10倍；制備出發(fā)菌株運動發(fā)酵單胞菌的感受態(tài)細胞；取濃縮后的PCR產(chǎn)物3-5 μ L至50ul所述運動發(fā)酵單胞菌的感受態(tài)細胞，1800V電擊后加入RM液體培養(yǎng)基，混勻后轉(zhuǎn)移到無菌離心管中于30°C靜置培養(yǎng)12-17小時，涂布于糠醛濃度為l_3g/L的RM固體培養(yǎng)基篩選平板，倒置放于培養(yǎng)箱30°C培養(yǎng)2-5天，得到單克隆，即轉(zhuǎn)化子；
[0021](4)評價:挑取步驟(3)所述單克隆至RM液體培養(yǎng)基中于靜置培養(yǎng)至對數(shù)晚期，保存菌液；分別接種上述單克隆的菌液和出發(fā)菌株運動發(fā)酵單胞菌至RM液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD6。。為1.2-1.6 ;再分別轉(zhuǎn)接至糠醛濃度為3g/L的含糠醛的RM液體培養(yǎng)基使各個菌株的初始接種濃度一致，測定生長曲線，篩選出耐糠醛的轉(zhuǎn)化子。
[0022]耐受糠醛運動發(fā)酵單胞菌，其分類命名為運動發(fā)酵單胞菌F2.5-4 (Zymomonasmobilis)F2.5-4，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號CCTCC NO:M2015366。
[0023]本發(fā)明的方法獲得的耐受糠醛的運動發(fā)酵單胞菌，能在3g/L糠醛的RM培養(yǎng)基中高效的生長。與傳統(tǒng)的全基因組改組技術(shù)相比，本發(fā)明有效地運用易錯PCR技術(shù)實現(xiàn)無需理化誘變和原生質(zhì)體融合即能快速有效獲得耐受糠醛的運動發(fā)酵單胞菌。在糠醛濃度為3g/L的培養(yǎng)基中出發(fā)菌株運動發(fā)酵單胞菌的生長受到嚴重抑制，而本發(fā)明的方法獲得的耐受糠醛的運動發(fā)酵單胞菌比出發(fā)菌株運動發(fā)酵單胞菌耐受糠醛能力強。
[0024]本發(fā)明采用全基因組改組技術(shù)能高效地獲得耐受糠醛的運動發(fā)酵單胞菌，比適應性馴化的方法效率高，時間短；與傳統(tǒng)的基因組改組的方法比，無需原生質(zhì)體融合和誘變、所使用的試劑安全環(huán)保，操作快捷高效。因此本發(fā)明的菌株和方法對有效的利用廢棄的木質(zhì)纖維素生產(chǎn)清潔能源、解決當前能源危機具有重要意義。
【附圖說明】
[0025]圖1為運動發(fā)酵單胞菌CP4的基因組DNA及易錯PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖，泳道I和2分別為純化和粗提的運動發(fā)酵單胞菌CP4的基因組DNA，M為marker，泳道3_8為實施例2中用12-17bp的隨機引物獲得的5 μ I的易錯PCR產(chǎn)物電泳圖。
[0026]圖2為運動發(fā)酵單胞菌CP4和實施例3獲得的單克隆在糠醛濃度為3g/L的RM液體培養(yǎng)基中的生長發(fā)酵比較。
[0027]圖3為運動發(fā)酵單胞菌CP4和實施例4篩選出的耐受糠醛的運動發(fā)酵單胞菌F2.5-4在糠醛濃度為lg/L RM固體培養(yǎng)基上的生長狀況。
[0028]圖4是實施例4篩選出的耐受糠醛的運動發(fā)酵單胞菌F2.5-4和運動發(fā)酵單胞菌CP4在葡萄糖質(zhì)量濃度為2%和4%、糠醛濃度為3g/L的RM液體培養(yǎng)基中的生長曲線。
[0029]生物材料樣品保藏
[0030]本發(fā)明涉及的耐受糠醛運動發(fā)酵單胞菌，其分類命名為運動發(fā)酵單胞菌F2.5-4 (Zymomonas mobilis) F2.5_4，該菌株已于2015年6月12日保藏于地址為中國.武漢.武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號CCTCC NO:M2015366o
【具體實施方式】
[0031]本發(fā)明以保藏號為CICC 10232的運動發(fā)酵單胞菌CP4為出發(fā)菌株，是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明，但并不對出發(fā)菌株進行限制，采用其它的運動發(fā)酵單胞菌為出發(fā)菌株，也可以用于本發(fā)明。
[0032]保藏號為CICC 10232的運動發(fā)酵單胞菌CP4購自于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(簡稱運動發(fā)酵單胞菌CP4)。
[0033]下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明。
[0034]實施例1基因組DNA提取:
[0035]提取出發(fā)菌株運動發(fā)酵單胞菌CP4的基因組DNA，(圖1)，具體操作如下:甘油管中的上述菌液轉(zhuǎn)接至含有5mL的RM液體培養(yǎng)基的試管中，30 °C培養(yǎng)過夜，使0D600 = 2?4。將培養(yǎng)物移至離心管中，4°C 13000rpm離心I分鐘后棄上清，沉淀用30yL無菌水重懸后，離心棄上清。在離心管內(nèi)加入120 μ L破菌緩沖液、60 μ L Tris飽和酸、60 μ L氯仿、120 μ LTE緩沖液，120 μ L體積石英砂，充分震蕩4min后，4°C 13000rpm/5min離心取上清液。在上清液中加入ImL無水乙醇，顛倒混勾，于-20°C放置30min后，于4°C，13000rpm/25min離心，棄上清液，沉淀晾干，取50 μ L無菌水重懸得到基因組DNA。
[0036]RM液體培養(yǎng)基為:20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物和KH2P042g/L，余量為水；