魚類總基因組dna的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種提取基因組DNA的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]魚類是最古老的脊椎動(dòng)物。它們幾乎棲居于地球上所有的水生環(huán)境中。從淡水的湖泊、河流到咸水的大海和大洋。魚類是一種終年生活在水中，用鰓呼吸，用鰭輔助身體平衡與運(yùn)動(dòng)的變溫脊椎動(dòng)物。目前全球已命名的魚種約在32100種。是脊椎動(dòng)物亞門中最原始最低級(jí)的一群。魚肉富含蛋白質(zhì)、鈣、磷、鐵、維生素B1、卵磷脂等多種營養(yǎng)物質(zhì)，可增強(qiáng)記憶、思維和分析能力，延緩腦力衰退，因此對(duì)人類體力和智力的發(fā)展具有重大作用。魚肉適合多種烹飪手法，不僅滋味鮮美，而且易被人體消化吸收。除魚肉外魚的其他部分還可制成魚肝油、魚膠、魚粉等滋補(bǔ)品。獲取魚類總基因組DNA進(jìn)行科學(xué)研究，對(duì)于進(jìn)行魚類遺傳育種、資源評(píng)估等方面都具有重大的意義。獲取魚類總基因組DNA首先必須對(duì)魚類的DNA進(jìn)行提取。
[0003]酚氯仿法是一種常用的DNA提取方法，通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白，多糖，酚類等雜質(zhì)，通常是將處理好的樣本，分別加入細(xì)胞裂解液，蛋白酶K，苯酚，以及氯仿和異戊醇的混合液逐步進(jìn)行處理，再加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。苯酚可以使蛋白質(zhì)變性，同時(shí)抑制DNase的降解作用。加入苯酚后，由于蛋白與DNA聯(lián)結(jié)鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。氯仿可以除去核酸溶液中的苯酚，加速有機(jī)相與液相分層。異戊醇可以降低表面張力，減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡，同時(shí)異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相和下層的有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。
[0004]目前，提取魚類總基因組DNA所用材料主要用的是魚類的血液，肌肉或魚鰭。這些提取材料在從魚類身上獲得時(shí)對(duì)魚類本身的傷害較大，很有可能會(huì)導(dǎo)致魚類死亡，從而使得一些后續(xù)的實(shí)驗(yàn)特別是要將樣品魚進(jìn)行繁殖的實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行。
[0005]魚鱗作為魚身體的一部分根據(jù)其外形，構(gòu)造和發(fā)生特點(diǎn)，可分為楣鱗、硬鱗、圓鱗、櫛鱗四種類型。魚鱗的存在對(duì)于魚類的生存而言具有重要作用。第一，在魚類腹部的鱗片可以反射和折射亮光，如同鏡子一般，使水底下的兇猛水生動(dòng)物眩目，產(chǎn)生水天一色之感，從而無法分辨魚類的存在，而魚類背部的魚鱗顏色較深，這與水底顏色相似，從而使水上的天敵無法分辨魚類的存在。第二，魚鱗為魚體提供了一道保護(hù)屏障，使魚類的身體與周圍含有無數(shù)微生物的環(huán)境隔離，從而有效地避免魚類感染疾病的幾率及提高了魚類抵抗疾病的能力。第三，魚鱗作為一層外部骨架，既可以使魚體保持一定的外型，此外，生物學(xué)家還可根據(jù)鱗片上環(huán)生的年輪，判斷魚的年齡，從而可以較為正確地掌握其生長、死亡率及健康狀況。第四、魚鱗上的粘液可以使魚體減少阻力，使天敵在捕捉時(shí)滑手，從而得以逃生。有些魚類如金魚、熱帶魚等，其體態(tài)多姿且鱗片色彩艷麗，因此具有較高的觀賞價(jià)值，深受人們喜愛。以魚鱗作為原料提取魚類總基因組DNA不會(huì)對(duì)魚類造成較大傷害，但因?yàn)轸~鱗含有的細(xì)胞較少，基因組DNA含量較少，雜質(zhì)較多一般不用做提取基因組DNA的實(shí)驗(yàn)材料。如圖2所示，如果以魚鱗為原材料，采用酚氯仿法進(jìn)行DNA的提取，提取的DNA含有雜質(zhì)，且有非常嚴(yán)重的拖帶現(xiàn)象，無法滿足實(shí)驗(yàn)的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種試劑方便易取，提取DNA效果好，DNA完整度高的魚類總基因組DNA的提取方法。尤其可以以魚鱗為原材料進(jìn)行提取，不受樣品量的限制。
[0007]本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題提出的一種技術(shù)方案是:一種魚類總基因組DNA的提取方法，包括以下具體步驟:
A.取適量含有DNA的魚類組織，清凈粉碎后放入離心管中；
B.向離心管中加入適量的Chelex-1OO溶液，沸水浴15?20min;再加入適量的蛋白酶K溶液，50?60°C水浴3h以上；
C.吸取離心管中的液體置于另一個(gè)離心管中進(jìn)行離心分離；
D.取上清液置于另一個(gè)離心管中，加入適量的RNase溶液，37°C水浴45min以上；
E.向離心管中加入適量的Tris飽和酚溶液，混勻后進(jìn)行離心分離，并取上清液置于另一個(gè)離心管中；此步驟進(jìn)行I?3次；
F.向離心管中加入適量的氯仿和異戊醇混合液，混勻后進(jìn)行離心分離，并取上層溶液置于另一個(gè)離心管中；此步驟進(jìn)行I?3次；氯仿和異戊醇混合液是氯仿與異戊醇按體積比為24:1混合而成;
G.向離心管中加入適量的乙醇溶液，4°C放置Ih以上，使得DNA沉淀；
H.對(duì)離心管進(jìn)行離心分離，棄上清液；
1.向離心管中加入適量的乙醇溶液，進(jìn)行離心分離，棄上清液；此步驟進(jìn)行I?3次； J.去除乙醇后，加入適量的無菌水將DNA溶解，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0008]為了保證魚鱗的細(xì)胞破碎，蛋白質(zhì)、多糖、脂質(zhì)等雜質(zhì)的去除更加徹底，一種優(yōu)選的技術(shù)方案是:上述Chelex-1OO溶液的濃度為5%，所述蛋白酶K溶液的濃度為20mg/mL，所述RNase溶液的濃度為5mg/mL。
[0009]為了保證DNA提取的效果好，一種優(yōu)選的技術(shù)方案是:上述每0.2g魚鱗使用Chelex-1OO溶液的體積為300?700 μ L，蛋白酶K溶液的體積為20?40 μ L，RNase溶液的體積為5?8 μ L ;每次加入離心管中Tris飽和酚溶液的體積與該離心管中液體體積相同，每次加入離心管中氯仿和異戊醇混合液的體積與該離心管中液體體積相同。
[0010]為了保證DNA的沉淀效果好，一種優(yōu)選的技術(shù)方案是:上述步驟G向離心管中加入的乙醇溶液是預(yù)冷的濃度為95%以上的乙醇溶液，加入量是該離心管中液體體積的2?3倍。
[0011]—種優(yōu)選的技術(shù)方案是:上述將離心管中的液體混勻是將離心管顛倒混勻5?1min0
[0012]為了更好地去除乙醇，一種優(yōu)選的技術(shù)方案是:上述步驟J中去除乙醇是將離心管進(jìn)行離心分離后，抽出底部的乙醇，放在濾紙上置于無菌工作臺(tái)上吹風(fēng)，直至將乙醇除盡。
[0013]為了更好地溶解DNA，一種優(yōu)選的技術(shù)方案是:上述J中加入的無菌水溫度為650C ;所述步驟I中加入的乙醇溶液是濃度為70%的乙醇溶液。
[0014]一種優(yōu)選的技術(shù)方案是:上述含有DNA的魚類組織是魚鱗；所述魚鱗是取自活魚的新鮮魚鱗，或者是浸泡于濃度為70%以上的乙醇中的魚鱗，從而使得取樣更加方便。本發(fā)明魚類總基因組DNA的提取方法以魚鱗為原材料時(shí)與現(xiàn)有技術(shù)相比優(yōu)勢(shì)極其明顯。
[0015]另一種優(yōu)選的技術(shù)方案是:所述含有DNA的魚類組織是肌肉組織、血液或魚鰭。本發(fā)明魚類總基因組DNA的提取方法以肌肉組織、血液或魚鰭為原材料時(shí)與現(xiàn)有技術(shù)相比具有一定的優(yōu)勢(shì)。
[0016]為了保證離心分離的效果，一種優(yōu)選的技術(shù)方案是:上述離心分離時(shí)的溫度為4°C，離心轉(zhuǎn)速為12000rpm，離心時(shí)間為5?15min。
[0017]本發(fā)明具有積極的效果:本發(fā)明的魚類總基因組DNA提取方法是對(duì)經(jīng)典酚氯仿法進(jìn)行了改進(jìn)。先用煮沸的Chelex-1OO溶液使得樣品細(xì)胞破裂并吸附一定量蛋白質(zhì)，然后加入蛋白酶K降解大部分蛋白質(zhì)，離心取上清再加入RNase對(duì)RNA進(jìn)行降解，使得細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、多糖、脂質(zhì)等雜質(zhì)去除更加徹底，從而大幅地改善了 DNA提取的效果，可以提取到較好的完整的魚類總基因組DNA。
[0018]Chelex-1OO是一種化學(xué)螯合樹脂，由苯乙烯和二乙烯苯共聚體組成，故又名聚苯乙烯二乙烯基苯，為一種不溶于酸、堿溶液及有機(jī)溶劑的高分子化合物，外形呈白色顆粒狀，無味，在PH值為4至14的環(huán)境中仍可保持其自身的穩(wěn)定性。成對(duì)的亞氨基二乙酸離子[R-CH2N(CH2COO-) 2】作為Chelex-1OO的兩性基團(tuán)連接在Chelex-1OO的骨架上，成對(duì)的亞氨基二乙酸離子具有螯合多價(jià)離子的作用，特別是對(duì)高價(jià)金屬離子具有很強(qiáng)的親和力和螯合作用。一般情況下生物檢材中的金屬離子在高溫和低離子強(qiáng)度溶液條件下能催化D