一種植物基因組dna提取方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學實驗技術領域，具體而言，涉及一種植物基因組DNA提取方法，包括：破碎植物樣本得到植物粉末；所述植物粉末依次經分離液、裂解液和活性劑溶液、CTAB提取緩沖液、氯仿?異戊醇溶液處理后，得到含有DNA的提取液，除去該提取液中的雜質既得基因組DNA。所述的DNA提取方法可有效地去除纖維素、多糖或蠟質、酚類等雜質，且省時、操作容易、成本低，尤其適合于龍膽科植物的干枯革質葉片的DNA提取。
【專利說明】
-種植物基因組DNA提取方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明設及分子生物學實驗技術領域，具體而言，設及一種植物基因組DNA提取方 法。
【背景技術】
[0002] 植物分子生物學研究很多時候是從基因組DNA分離提取開始的。為獲得高質量 DNA，研究人員通常情況下選用幼苗嫩葉、各種幼嫩的器官組織、新鮮的成熟葉片或培養(yǎng)的 植物愈傷組織、細胞等材料，通過CTAB法或SDS堿裂解法、或基于堿裂解法原理的各種植物 基因組DNA提取試劑盒，可W獲得高質量的DNA產物。
[0003] 但是，在某些研究課題我們也要用老齡葉片、干枯葉片，或者富含多糖、酪類化合 物的革質葉片等材料提取基因組DNA，運些材料用上述方法進行提取不能獲得令人滿意的 結果。DNA產物即便經過純化，也經常有纖維素、多糖或蠟質、酪類化合物殘留，對后續(xù)的各 種PCR反應、限制性內切酶反應、核酸分子雜交W及W基因組DNA為起始材料的實驗產生不 良影響，有時甚至不能得到PCR擴增產物、酶切產物或分子雜交結果。
[0004] 有鑒于此，特提出本發(fā)明。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種植物基因組DNA提取方法，所述的DNA提取方法可有效 地去除纖維素、多糖或蠟質、酪類等雜質，且省時、操作容易、成本低。
[0006] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用W下技術方案：
[0007] -種植物基因組DNA提取方法，包括W下步驟：
[000引1 )、破碎植物樣本得到植物粉末；
[0009] 2)、取所述植物粉末加入到分離液中，混勻后離屯、，棄上清得到第一沉淀；
[0010] 3)、向所述第一沉淀中加入裂解液并混勻后加入所述活性劑溶液得到混合液1，將 混合液1靜置8min~15min;
[0011] 4)、加入CTAB提取緩沖液得到混合液2，將所述混合液2于63°C~67°C解育50min~ 70min；
[0012] 5)、加入與所述混合液2等量的氯仿-異戊醇溶液并攬拌、離屯、，將離屯、后所得上層 水相稱為提取液1，除去所述提取液1中的雜質，得到基因組DNA;
[0013] 所述分離液含有濃度為140g/L~160g/L的PEG4000、0.3M~0.4M山梨醇、濃度為 2g/L~8g/L的亞精胺、濃度為2g/L~8g/L的精胺、體積百分數(shù)為0.4%~0.6%的0-琉基乙 醇，所述分離液的溶劑為0.09M~0.11M pH=7.8~8.2的化is-HCl溶液；
[0014] 所述裂解液含有0.3M~0.4M山梨醇、濃度為2g/L~8g/L的亞精胺、濃度為2g/L~ 8g/L的精胺、體積百分數(shù)為0.5%的0-琉基乙醇，所述裂解液的溶劑為0.09M~0.11M抑= 7.8~8.2的化13-肥1溶液；
[0015] 所述活性劑溶液為質量百分數(shù)為5%~10%的心肌氨酸。
[0016]本發(fā)明提取DNA的方法基于CTAB法，CTAB(cetyltrimethylammonium bromide)即 十六烷基=甲基漠化錠，是一種陽離子去污劑，可溶解細胞膜，它能與核酸形成復合物，在 高鹽溶液中（>0.7mol/L化C1)是可溶的，當降低溶液鹽濃度到一定程度(0.3mol/L NaCl) 時，從溶液中沉淀，通過離屯、就可將CTAB與核酸的復合物同蛋白質、多糖類物質分開，然后 將CTAB與核酸的復合物沉淀溶解于高鹽溶液，再加入乙醇或異丙醇使核酸沉淀，CTAB能溶 解于乙醇或異丙醇隨之被除去。
[0017]在本發(fā)明中，所用的CTAB提取緩沖液為常規(guī)配方:抑=9.5的0.1M lYis-肥l、pH = 8.0的20mM EDTA、1.4M NaCl、2g/100mL的CTAB、4OmM0-琉基乙醇。
[0018] 其中，所述分離液和所述裂解液中均添加了亞精胺和精胺。運二者是一類小分子 陽離子，在本發(fā)明中，可與DNA結合后導致DNA溶解性下降，可重復沉淀DNA，利于后續(xù)DNA的 純化；
[0019] 活性劑溶液的主要成分為k肌氨酸，它是一種氨基酸表面活性劑，可W改變膜蛋 白結構，破壞細胞膜，利于充分釋放DNA分子；
[0020] 氯仿可加速有機相與液相分層，而異戊醇則可W減少蛋白質變性操作過程中產生 的氣泡。異戊醇可W降低表面張力，從而減少氣泡產生。另外，異戊醇有助于分相，使離屯、后 的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。
[0021] 氯仿-異戊醇溶液也可替換為苯酪、氯仿和異戊醇的混合溶液，其體積比為25:24: 1，但在本發(fā)明的反應體系中，氯仿-異戊醇溶液提取得到的DNA純度更高。
[0022] 在本發(fā)明中，若無特別強調，各試劑所用溶劑均為水。
[0023] 優(yōu)選的，如上所述的植物基因組DNA提取方法：
[0024] 在步驟2)中，所述分離液的體積為所述植物粉末體積的8~15倍；
[0025] 在步驟3)中，所述裂解液的加入量為所述分離液體積的1/2,所述活性劑溶液的體 積為所述裂解液體積的1/10;
[0026] 在步驟4)中，所述CTAB提取緩沖液的加入量與所述混合液1等體積；
[0027] 在步驟5)中，所述氯仿-異戊醇溶液的加入量與與所述混合液2等體積;所述氯仿- 異戊醇溶液為體積比為24:1的氯仿與異戊醇混合溶液。
[0028] 優(yōu)選的，如上所述的植物基因組DNA提取方法，所述植物樣本為干枯革質葉片。
[0029] 進一步優(yōu)選的，所述植物樣本為龍膽科植物的干枯革質葉片。
[0030] 更優(yōu)選的，所述龍膽科植物包括龍膽草、=花龍膽、東北龍膽中的一種。
[0031] 干枯革質葉片中細胞的細胞壁很厚，多糖成分比重大，提取其中的DNA非常困難。 本發(fā)明提供的植物基因組DNA提取方法可很好地克服上述問題，且尤其適用于龍膽科植物。
[0032] 優(yōu)選的，如上所述的植物基因組DNA提取方法，在步驟2)中，所述離屯、為140(K)rpm ~16000巧m 離屯、8min ~12min;
[0033] 在步驟5)中，所述離屯、為9000巧m~11000巧m離屯、8min~12min。
[0034] 本發(fā)明中離屯、的速度經過優(yōu)選，尤其適合龍膽科植物DM的提取，且與本發(fā)明優(yōu)選 的分離液、裂解液及活性劑溶液相適應。
[0035] 在步驟2)中，若離屯、速度過大，則雜質也會離屯、至所述第一沉淀中，若離屯、速度過 小，則不利于DNA的沉淀。
[0036] 同理，在步驟5)中，若離屯、速度過小，則分層效果不好，離屯、速度過大，貝化NA可能 部分下沉到中間層的蛋白相中造成DM的損耗。
[0037] 優(yōu)選的，如上所述的植物基因組DNA提取方法，在步驟5)中，除去所述提取液1中的 雜質的方法為:用異丙醇、TE飽和酪、酪-氯仿液、乙醇的水溶液中的多種洗涂所述沉淀；
[0038] 所述酪-氯仿液按照Ig固體苯酪:1ml氯仿的固液比配置而成。
[0039] 優(yōu)選的，如上所述的植物基因組DNA提取方法，所述除去所述提取液1中的雜質的 操作具體包括W下步驟：
[0040] A)、將所述提取液1中加入等體積的異丙醇并混勻，棄去上清得到第二沉淀；
[0041 ] B)、用TE緩沖液溶解所述第二沉淀，加入與所述TE緩沖液等體積的TE飽和酪并混 勻、離屯、；
[0042] C)、取上步離屯、后得到的上層水相并加入所示上層水相一半體積的酪-氯仿液，攬 拌并離屯、；
[0043] 0)、重復1次步驟〇;
[0044] E)、取上步離屯、后得到的上層水相并加入等體積的異丙醇，混勻后離屯、，棄去上清 得到第=沉淀；
[0045] F)、用乙醇的水溶液清洗所述第=沉淀并離屯、，棄去上清得到第四沉淀；
[0046] G)、用乙醇的水溶液清洗所述第四沉淀并離屯、，棄去上清得到第五沉淀；
[0047] H)、待所述第五沉淀干燥后，加入TE緩沖液溶解得到基因組DNA。
[0048] 其中，在步驟B)中，因為酪與水有一定的互溶，苯酪用TE緩沖液飽和的目的是使其 抽提DNA過程中，不致吸收樣品中含有DNA的水分，減少DNA的損失。用lYis調節(jié)至pH為8，是 因為DNA在此條件下比較穩(wěn)定。在中性或堿性條件下（P冊~7)，RNA比DNA更容易游離到水 相，所W可獲得RNA含量較少的DNA樣品。
[0049] 在步驟A)、E)、F)中，乙醇溶液和異丙醇的作用都是沉淀DNA分子W利于清洗DNA， 異戊醇還可增加分相后的各相的穩(wěn)定性。
[0050] 優(yōu)選的，如上所述的植物基因組DNA提取方法，在步驟B)~步驟C)中，所述離屯、為 7000巧m ~9000巧m 離屯、8min ~12min;
[0051 ] 在步驟E)~步驟G)中，所述離屯、為11000巧m~13000巧m離屯、4min~6min。
[0052] 在本發(fā)明中，所用離屯、機有效半徑長度為8.4cm。
[0053] 優(yōu)選的，所述TE飽和酪是WTE緩沖液為溶劑制成的飽和重蒸酪，且其中含有濃度 為Ig/L的8-徑基哇嘟的混合液；
[0化4] 其中，所述TE緩沖液含有l(wèi)OmM Tris-肥巧PlmM邸TA，抑=8.0;
[0055] 所述乙醇的水溶液為體積百分數(shù)為65%~75%的乙醇溶液。
[0056] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0057] 1)、本發(fā)明提供的各溶液及基因組DNA提取方法各步驟，可W有效提取干枯革質葉 片中基因組DNA，省時、高純度、低成本。
[0058] 2)、本發(fā)明提供的分離液、裂解液中所含的亞精胺、精胺廣泛分布于生物體內，無 毒，二者與DNA分子相互作用，可W使DNA分子凝聚并沉淀，并且精胺還能增加 DNA分子的穩(wěn) 定性。
[0059] 3)、本發(fā)明提供的活性劑溶液k肌氨酸是一種氨基酸表面活性劑，可W改變膜蛋 白結構，破壞細胞膜，釋放DNA分子。
[0060] 4)、本發(fā)明提供的各溶液及植物干枯革質葉片基因組DM提取方法步驟，可W有效 去除革質葉片中所含纖維素、多糖、多酪類物質及蠟質，獲得高質量的基因組DNA。
[0061] 5)、本發(fā)明提供的各溶液及植物干枯革質葉片基因組DNA提取方法步驟，所獲得的 基因組DNA純度高，有利于后續(xù)的各類PCR反應。
【附圖說明】
[0062] 為了更清楚地說明本發(fā)明【具體實施方式】或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對具體 實施方式或現(xiàn)有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的 附圖是本發(fā)明的一些實施方式，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前 提下，還可W根據運些附圖獲得其他的附圖。
[0063] 圖1本發(fā)明實驗例中基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，1~3泳道是Plant DNA Isolation Reagent(TAKARA BIO INC.)提取的龍膽草、S花龍膽、東北龍膽干枯葉片基因 組DNA;4~6泳道是采用SDS堿裂解法提取的龍膽草、S花龍膽、東北龍膽干枯葉片基因組 DNA;7~9泳道是本發(fā)明實施例提取的龍膽草、S花龍膽、東北龍膽干枯葉片基因組DNA; 10 ~12是CTAB法提取的龍膽草、S花龍膽、東北龍膽干枯葉片基因組DNA;M是DNA標準分子量入 hind虹(TAKARA);
[0064] 圖2為本發(fā)明實驗例隨機引物PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，1~3泳道是Plant DNA Isolation Reagent(TAKARA BIO INC.)提取的龍膽草、S花龍膽、東北龍膽干枯葉片 基因組DNA為模板的隨機引物PCR產物;4~6泳道是SDS堿裂解法提取的龍膽草、S花龍膽、 東北龍膽干枯葉片基因組DNA的隨機引物PCR產物；7~9泳道是CTAB法提取的龍膽草、S花 龍膽、東北龍膽干枯葉片基因組DNA的隨機引物PCR產物；10~12泳道是本發(fā)明實施例提取 的龍膽草、S花龍膽、東北龍膽干枯葉片基因組DNA的隨機引物PCR產物;M是DNA標準分子量 DL2000(TAKARA BI0 INC.)。
【具體實施方式】
[0065] 下面將結合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會 理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體 條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為 可W通過市售購買獲得的常規(guī)產品。
[0066] 實施例1
[0067] 本發(fā)明實施例提供了一種龍膽草干枯革質葉片基因組DNA提取方法，包括：
[006引一、溶液配置：
[0069] l)、160g/L的PEG4000、0.3M山梨醇、濃度為2g/L的亞精胺、濃度為8g/L的精胺、體 積百分數(shù)為0.4%的0-琉基乙醇，所述分離液的溶劑為0.09M pH=7.8的化is-HCl溶液；
[0070] 2)、裂解液:0.3M山梨醇、濃度為2g/L的亞精胺、濃度為2g/L的精胺、體積百分數(shù)為 0.5%的0-琉基乙醇，所述裂解液的溶劑為0.11M抑=8.2的化is-肥1溶液；
[0071 ] 3)、活性劑溶液:質量百分數(shù)為5%的心肌氨酸；
[0072] 4)、CTAB提取緩沖液：pH = 9.5的0.1M Tris-HCl、pH = 8.0的20mM EDTA、1.4M NaCl、20g/L 的 CTAB、4OmM0-琉基乙醇；
[0073] 5)、TE緩沖液:pH=8.0的lOmM Tris-肥 1、抑=8.0的ImM EDTA;
[0074] 6)、TE飽和酪：WpH = 8.0的TE緩沖液為溶劑的飽和重蒸酪、所述飽和重蒸酪中還 加入了 Ig/L的8-徑基哇嘟；
[0075] 7)、氯仿-異戊醇液:體積比為24:1的氯仿與異戊醇混合溶液；
[0076] 8)、酪-氯仿液:取于-20CM呆存的固體苯酪Ig，加 1ml氯仿充分混勻；
[0077] 上述1)~8)中各溶液按組成成分和溶液濃度配制后，保存于4C°冰箱，使用前取 出。
[007引二、DNA的提取
[0079] 1)、取龍膽草干枯葉片40~50mg，在研鉢中用液氮研磨成細粉末。將冰凍狀態(tài)的粉 末15~20mg，放入1.5ml離屯、管中，加入樣品量8~15倍體積的冰浴預冷的分離液約40化L， 在冰上輕輕攬拌，充分混勻后，在1400化pm、4°C、離屯、12min;離屯、后棄去上清；
[0080] 2)、向沉淀中加200化裂解液，充分攬拌、混勻，隨后加入20化活性劑溶液，室溫放 置15min;
[0081 ] 3)、加入等量的CTAB提取緩沖液，63°C解育70min;再加入等量的氯仿-異戊醇液， 緩慢攬勻約20min，在室溫下9000巧m，離屯、12min;
[0082] S、DNA 的純化
[0083] 4)、取上層水相，加等體積異丙醇，充分顛倒混勻，使DNA分子沉淀；用細玻璃棒卷 取回收沉淀；
[0084] 5)、在離屯、管中加入30~50化TE緩沖液溶解沉淀，然后加入與所述TE緩沖液等體 積的TE飽和酪，混勻。于室溫下7000巧m離屯、12min;
[00財 6)、取上層水相，加入1/2體積酪-氯仿液攬拌，室溫下7000巧m離屯、12min;
[00化]7)、重復一次步驟6);
[0087] 8)、取上層水相，加等體積異丙醇沉淀DNA分子，4°C、11000巧m離屯、6min，去掉上 清；
[0088] 9)、加30~50化體積百分數(shù)為65%的乙醇溶液，輕彈管壁3~4次，4°C、1 lOOOrpm離 屯、6min，去掉上清；
[0089] 10)、重復一次步驟9);
[0090] 11)、沉淀干燥后，加適量TE緩沖液溶解DNA沉淀。
[0091] 實施例2
[0092] 本發(fā)明實施例提供了一種東北龍膽干枯革質葉片基因組DNA提取方法，包括：
[0093] -、溶液配置：
[0094] l)、140g/L的PEG4000、0.4M山梨醇、濃度為8g/L的亞精胺、濃度為2g/L的精胺、體 積百分數(shù)為0.6%的0-琉基乙醇，所述分離液的溶劑為0.11M pH=8.2的化is-HCl溶液； [00M] 2)、裂解液:0.4M山梨醇、濃度為8g/L的亞精胺、濃度為8g/L的精胺、體積百分數(shù)為 0.5%的0-琉基乙醇，所述裂解液的溶劑為0.09M抑=7.8的化is-肥1溶液；
[0096] 3)、活性劑溶液:質量百分數(shù)為5%的心肌氨酸；
[0097] 4)、CTAB提取緩沖液：pH = 9.5的0.1M Tris-HCl、pH = 8.0的20mM EDTA、1.4M NaCl、20g/L 的 CTAB、4OmM0-琉基乙醇；
[009引 5)、TE緩沖液:pH=8.0的lOmM Tris-肥 1、抑=8.0的ImM EDTA;
[0099] 6)、TE飽和酪：WpH = 8.0的TE緩沖液為溶劑的飽和重蒸酪、所述飽和重蒸酪中還 加入了 Ig/L的8-徑基哇嘟；
[0100] 7)、氯仿-異戊醇液:體積比為24:1的氯仿與異戊醇混合溶液；
[0101] 8)、酪-氯仿液:取于-20CM呆存的固體苯酪Ig，加1ml氯仿充分混勻；
[0102] 上述1)~8)中各溶液按組成成分和溶液濃度配制后，保存于4C°冰箱，使用前取 出。
[0103] 二、DNA 的提取
[0104] 1)、取東北龍膽干枯葉片40~50mg，在研鉢中用液氮研磨成細粉末。將冰凍狀態(tài)的 粉末15~20mg，放入1.5ml離屯、管中，加入樣品量8~15倍體積的冰浴預冷的分離液約40化 L，在冰上輕輕攬拌，充分混勻后，在1600化pm、4°C、離屯、8min;離屯、后棄去上清；
[010引2)、向沉淀中加200化裂解液，充分攬拌、混勻，隨后加入20化活性劑溶液，室溫放 置8min;
[0106] 3)、加入等量的CTAB提取緩沖液，67°C解育50min;再加入等量的氯仿-異戊醇液， 緩慢攬勻約20min，在室溫下11000巧m，離屯、8min;
[0107] S、DNA 的純化
[0108] 4)、取上層水相，加等體積異丙醇，充分顛倒混勻，使DNA分子沉淀；用細玻璃棒卷 取回收沉淀；
[0109] 5)、在離屯、管中加入30~50化TE緩沖液溶解沉淀，然后加入與所述TE緩沖液等體 積的TE飽和酪，混勻。于室溫下9000巧m離屯、8min;
[0110] 6)、取上層水相，加入1/2體積酪-氯仿液攬拌，室溫下9000巧m離屯、8min;
[0111] 7)、重復一次步驟6);
[0112] 8)、取上層水相，加等體積異丙醇沉淀DNA分子，4°C、13000巧m離屯、4min，去掉上 清；
[0113] 9)、加 30~50化體積百分數(shù)為75%的乙醇溶液，輕彈管壁3~4次，4°C、13000rpm離 屯、4min，去掉上清；
[0114] 10)、重復一次步驟9);
[0115] 11)、沉淀干燥后，加適量TE緩沖液溶解DNA沉淀。
[0116] 實施例3
[0117] 本發(fā)明實施例提供了一種S花龍膽干枯革質葉片基因組DNA提取方法，包括：
[011引一、溶液配置：
[0119] 1)、150g/L的陽G4000、0.35M山梨醇、濃度為6g/L的亞精胺、濃度為6g/L的精胺、體 積百分數(shù)為0.5%的0-琉基乙醇，所述分離液的溶劑為0.10M pH=8.0的化is-HCl溶液；
[0120] 2)、裂解液:0.35M山梨醇、濃度為6g/L的亞精胺、濃度為6g/L的精胺、體積百分數(shù) 為0.5%的0-琉基乙醇，所述裂解液的溶劑為0.10M抑=8.0的化is-肥1溶液；
[0121 ] 3)、活性劑溶液:質量百分數(shù)為5%的心肌氨酸；
[0122] 4)、CTAB提取緩沖液：pH = 9.5的0.1M Tris-HCl、pH = 8.0的20mM EDTA、1.4M NaCl、20g/L 的 CTAB、4OmM0-琉基乙醇；
[0123] 5)、TE緩沖液:pH=8.0的lOmM Tris-肥 1、抑=8.0的ImM EDTA;
[0124] 6)、TE飽和酪：WpH = 8.0的TE緩沖液為溶劑的飽和重蒸酪、所述飽和重蒸酪中還 加入了 Ig/L的8-?基哇嘟；
[0125] 7)、氯仿-異戊醇液:體積比為24:1的氯仿與異戊醇混合溶液；
[01%] 8)、酪-氯仿液:取于-20CM呆存的固體苯酪Ig，加1ml氯仿充分混勻；
[0127]上述1)~8)中各溶液按組成成分和溶液濃度配制后，保存于4C°冰箱，使用前取 出。
[012引二、DNA的提取
[0129] 1)、取S花龍膽干枯葉片40~50mg，在研鉢中用液氮研磨成細粉末。將冰凍狀態(tài)的 粉末15~20mg，放入1.5ml離屯、管中，加入樣品量8~15倍體積的冰浴預冷的分離液約40化 L，在冰上輕輕攬拌，充分混勻后，在1500化pm、4°C、離屯、lOmin。離屯、后棄去上清；
[0130] 2)、向沉淀中加200化裂解液，充分攬拌、混勻，隨后加入20化活性劑溶液，室溫放 置lOmin;
[0131] 3)、加入等量的CTAB提取緩沖液，65°C解育60min;再加入等量的氯仿-異戊醇液， 緩慢攬勻約20min，在室溫下10000巧m，離屯、lOmin;
[0132] S、DNA 的純化
[0133] 4)、取上層水相，加等體積異丙醇，充分顛倒混勻，使DNA分子沉淀；用細玻璃棒卷 取回收沉淀；
[0134] 5)、在離屯、管中加入30~50化TE緩沖液溶解沉淀，然后加入與所述TE緩沖液等體 積的TE飽和酪，混勻。于室溫下800化pm離屯、lOmin;
[0135] 6)、取上層水相，加入1/2體積酪-氯仿液攬拌，室溫下8000巧m離屯、lOmin;
[0136] 7)、重復一次步驟6);
[0137] 8)、取上層水相，加等體積異丙醇沉淀DNA分子，4°C、12000巧m離屯、5min，去掉上 清；
[0138] 9)、加30~50化體積百分數(shù)為70%的乙醇溶液，輕彈管壁3~4次，4°C、12000rpm離 屯、5min，去掉上清；
[0139] 10)、重復一次步驟9);
[0140] 11)、沉淀干燥后，加適量TE緩沖液溶解DNA沉淀。
[0141] 實驗例
[0142] 將本發(fā)明方法與 Plant DNA Isolation Reagent(TAKARA BIO INC.)(對比例1)、 SDS堿裂解法(對比例2)、CTAB法(對比例3)提取的龍膽草、東北龍膽、S花龍膽的干枯葉片 基因組DNA進行DNA質量對比。
[0143] 具體的，對比例1~3的設置方法為：
[0144] 對比例1:分別取干枯的龍膽草、東北龍膽、S花龍膽葉片40~50mg，在研鉢中用液 氮研磨成細粉末。將冰凍狀態(tài)的粉末15~20mg，放入1.5ml離屯、管中。按照Plant DNA Isolation Reagent(TAKARA BIO INC.)試劑盒說明書所述步驟提取基因組DNA。該DNA樣品 作為對比例1-1、1-2、1-3備用。
[0145] 對比例2:分別取干枯的龍膽草、東北龍膽、S花龍膽葉片40~50mg，在研鉢中用液 氮研磨成細粉末。將冰凍狀態(tài)的粉末15~20mg，放入1.5ml離屯、管中。按照SDS堿裂解法提取 基因組DNA。該DNA樣品作為對比例2-1、2-2、2-3樣品備用。
[0146] 對比例3:分別取干枯的龍膽草、東北龍膽、S花龍膽葉片40~50mg，在研鉢中用液 氮研磨成細粉末。將冰凍狀態(tài)的粉末15~20mg，放入1.5ml離屯、管中。按照CTAB法提取基因 組DNA。該DNA樣品作為對比例3-1、3-2、3-3備用。
[0147] DNA質量檢測
[0148] 將對比例1~3及本發(fā)明提供的實施例1~3提取的基因組DNA溶液用核酸蛋白微量 分析儀(ScanD;rop250，analytikjena)做質量檢測，檢測結果如表1所示。
[0149] 表1 DNA質量檢測結果
[0150]
[0151] 表1中，DNA溶液濃度檢測行數(shù)據顯示，在樣品量相同情況下，對照方法1提取的DNA 溶液濃度，即對比例1-1~1-3列數(shù)據最小值為99.06ngAiL，最大值132.3ng/化;對比例2提 取的DNA溶液濃度，即對比例2-1~2-3列的最小值100. lng/化，最大值122.化g/化;對比例3 提取的DNA溶液濃度，即對比例3-1~3-3列最小值65.4ngAiL，最大值92.06ngAiL。本發(fā)明方 法提取的DNA溶液濃度，即實施例1~3列最小值84.1化g/化，最大值245.5ngAiL。數(shù)據提示 本法提取各種龍膽的干枯葉片基因組DNA的得率較高。
[0152] DNA得率行數(shù)據是DNA/RNA在26化m處的吸收值乘W10后得到的DNA溶液濃度。數(shù)據 顯示，實施例1~3列數(shù)值大于對比例1-1~1-3列和對比例2-1~2-3列、對比例3-1~3-3列 數(shù)值，說明在樣品量相同的情況下，本發(fā)明方法提取的基因組DNA得率高于前巧中方法。
[0153] 0D260/0D280是根據樣品在260皿和280nm處的吸收值比值判斷樣品純度。該比值 為1.8~2.0范圍內表明DNA樣品較純，大于2.0表明樣品含有較多量的RNA，低于1.8表明樣 品中含有較多的蛋白質。表中數(shù)據顯示，本發(fā)明方法提取的DNA樣品，即實施例1~3列數(shù)值 分別為2.0、2.0、2.02，提示樣品中不含(或極少含有)RNA和蛋白質污染。對比例1-1~1-3列 數(shù)值分別為2.16、2.16、2.25，對比例2-1~2-3列數(shù)值分別為2.18、2.11、2.19，對比例3-1~ 3-3列數(shù)值分別是2.16、2.03、2.1，提示含有較多的RNA污染。W上實驗過程中均未加 RNAase 處理。顯示本方法提取的DM純度較高。
[0154] 0D230/0D260行數(shù)據提示DNA溶液中的鹽分殘留，其比值應在0.4~0.5之間，比值 高于0.5則提示溶液有較多的鹽分殘留。表中對比例1-1~1-3列數(shù)據比值分別為1. %、 1.27、1.31，對比例2-1~2-3列數(shù)據比值分別為0.86、0.82、0.83;對比例3-1~3-3列數(shù)據比 值分別為1.36、1.29、1.46，提示0魁溶液中殘留較多的鹽分，對后續(xù)?〇?反應體系會產生不 良影響。表中實施例1~3列數(shù)據為本發(fā)明方法提取的DNA溶液，其比值分別為0.6、0.74、 0.6，提示含有較少量鹽分殘留。
[0155] PCR實驗檢測
[0156] 將對比例1~3和實施例1~3提取的基因組DM溶液分為兩份。一份直接進行DNA瓊 脂糖凝膠電泳，電泳結果如圖1所示；
[0157] 從圖1中可直觀的看出，本發(fā)明實施例1~3提取的DNA質量最好。
[015引另一份均稀釋成20ngAiL，配制成50化PCR反應體系進行DNA擴增。
[0159] PCR反應體系：20ng/iiL DNA 扣U10XPCR buffer 扣L，4mM dNTP3 化，20yM randem primerl 0.75jiL,20iiM randem primer2 0.75jiL，EXT過q唆師/化 TAKARA)luL, dd出0 34.扣L。
[0160] PCR反應程序：
[0161] ① 94°C 5min
[0162] ② 94°C 50s
[0163] ③ 37°C 30s
[0164] ④ 72°C lmin30s
[0165] ⑤重復②③④進行35個循環(huán)
[0166] ⑥ 72°C 7min
[0167] ⑦ 4°C 保存。
[016引分別將各實施例和對比例提取的DNA作為模板，在完全相同的反應體系和反應條 件下分別進行隨機引物PCR反應，比較各方法所得的DNA質量對PCR反應的影響及PCR反應效 果。
[0169] 其中，所用引物為：
[0170] randem primerl序列：5，AGCGCCATTG 3;
[0171] randemprimer2序列：5，CACCGTATCC3。
[0172] PCR反應產物做1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，結果如圖2所示。
[0173] 從圖2可見，本發(fā)明方法提取的基因組DNA為模板，PCR產物條帶清晰，反應的重復 性好，長片段在2000bpW上，說明反應體系穩(wěn)定無雜質干擾、有利于片段延伸。短片段在300 ~40化P間，條帶清晰。
[0174] 對比例1和對比例2提取的DNA，PCR反應產物分別是1~3道和4~6道，6個PCR反應 產物在2000bpW上都沒有條帶，說明反應體系中有多糖成分干擾，不利于延伸反應進行和 長片段合成。在小片段區(qū)域，條帶較多但同一模板的PCR產物重復性較差。對比例3提取的 DNA，同一模板的PCR產物的重復性好于對比例1和對比例2,但與本發(fā)明方法相比仍不能令 人細眉、。
[0175] 因此，本法的有益之處在于對含糖類和酪類成分較多的革質葉片，本發(fā)明方法更 為適用，能得到高質量的DNA溶液，并且對后續(xù)PCR反應體系沒有不良影響。
[0176] 最后應說明的是：W上各實施例僅用W說明本發(fā)明的技術方案，而非對其限制;盡 管參照前述各實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，但本領域的普通技術人員應當理解:其 依然可W對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特征 進行等同替換；而運些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發(fā)明各實施例技 術方案的范圍。
【主權項】
1. 一種植物基因組DNA提取方法，其特征在于，包括以下步驟： 1 )、破碎植物樣本得到植物粉末； 2) 、取所述植物粉末加入到分離液中，混勻后離心，棄上清得到第一沉淀； 3) 、向所述第一沉淀中加入裂解液并混勻后加入所述活性劑溶液得到混合液1，將混合 液1靜置8min~15min; 4) 、加入C T A B提取緩沖液得到混合液2，將所述混合液2于6 3 °C~6 7 °C孵育5 0 m i η~ 70min； 5) 、加入與所述混合液2等量的氯仿-異戊醇溶液并攪拌、離心，將離心后所得上層水相 稱為提取液1，除去所述提取液1中的雜質，得到基因組DNA; 所述分離液含有濃度為140g/L~160g/L的PEG4000、0.3M~0.4M山梨醇、濃度為2g/L~ 8g/L的亞精胺、濃度為2g/L~8g/L的精胺、體積百分數(shù)為0.4%~0.6 %的β-巰基乙醇，所述 分離液的溶劑為〇. 09Μ~0.11Μ ρΗ=7.8~8.2的Tris-HCl溶液； 所述裂解液含有0.3M~0.4M山梨醇、濃度為2g/L~8g/L的亞精胺、濃度為2g/L~8g/L 的精胺、體積百分數(shù)為〇. 5%的β-巰基乙醇，所述裂解液的溶劑為0.09M~0.11M pH=7.8~ 8.2 的 Tris-HCl 溶液； 所述活性劑溶液為質量百分數(shù)為5 %~10 %的L-肌氨酸。2. 根據權利要求1所述的植物基因組DNA提取方法，其特征在于，在步驟2)中，所述分離 液的體積為所述植物粉末體積的8~15倍； 在步驟3)中，所述裂解液的加入量為所述分離液體積的1/2,所述活性劑溶液的體積為 所述裂解液體積的1 /1 〇; 在步驟4)中，所述CTAB提取緩沖液的加入量與所述混合液1等體積； 在步驟5)中，所述氯仿-異戊醇溶液的加入量與與所述混合液2等體積;所述氯仿-異戊 醇溶液為體積比為24:1的氯仿與異戊醇混合溶液。3. 根據權利要求1所述的植物基因組DNA提取方法，其特征在于，所述植物樣本為干枯 革質葉片。4. 根據權利要求3所述的植物基因組DNA提取方法，其特征在于，所述植物樣本為龍膽 科植物的干枯革質葉片。5. 根據權利要求4所述的植物基因組DNA提取方法，其特征在于，所述龍膽科植物包括 龍膽草、三花龍膽、東北龍膽中的一種。6. 根據權利要求3~5任一項所述的植物基因組DNA提取方法，其特征在于，在步驟2) 中，所述離心為14000rpm~16000rpm離心8min~12min; 在步驟5)中，所述離心為9000rpm~llOOOrpm離心8min~12min。7. 根據權利要求6所述的植物基因組DNA提取方法，其特征在于，在步驟5)中，除去所述 提取液1中的雜質的方法為：用異丙醇、TE飽和酚、酚-氯仿液、乙醇的水溶液中的多種洗滌 所述沉淀； 所述酚-氯仿液按照lg固體苯酚:1ml氯仿的固液比配置而成。8. 根據權利要求7所述的植物基因組DNA提取方法，其特征在于，所述除去所述提取液1 中的雜質的操作具體包括以下步驟： A)、將所述提取液1中加入等體積的異丙醇并混勻，棄去上清得到第二沉淀； B) 、用TE緩沖液溶解所述第二沉淀，加入與所述TE緩沖液等體積的TE飽和酚并混勻、離 心； C) 、取上步離心后得到的上層水相并加入所示上層水相一半體積的酚-氯仿液，攪拌并 離心； 0)、重復1次步驟〇; E) 、取上步離心后得到的上層水相并加入等體積的異丙醇，混勻后離心，棄去上清得到 第三沉淀； F) 、用乙醇的水溶液清洗所述第三沉淀并離心，棄去上清得到第四沉淀； G) 、用乙醇的水溶液清洗所述第四沉淀并離心，棄去上清得到第五沉淀； Η)、待所述第五沉淀干燥后，加入TE緩沖液溶解得到基因組DNA。9. 根據權利要求8所述的植物基因組DNA提取方法，其特征在于，在步驟Β)~步驟C)中， 所述離心為7000rpm~9000rpm離心8min~12min; 在步驟E)~步驟G)中，所述離心為1 lOOOrpm~13000rpm離心4min~6min。10. 根據權利要求9所述的DNA提取方法，其特征在于，所述TE飽和酚是以TE緩沖液為溶 劑制成的飽和重蒸酚，且其中含有濃度為1 g/L的8-羥基喹啉的混合液； 其中，所述TE緩沖液含有10mM Tris-HCl和ImM EDTA，pH=8.0; 所述乙醇的水溶液為體積百分數(shù)為65 %~75 %的乙醇溶液。
【文檔編號】C12N15/10GK106047860SQ201610388823
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月3日
【發(fā)明人】魏云潔, 張亞玉, 張舒娜, 關鳴, 關一鳴, 孫海, 王秋霞
【申請人】中國農業(yè)科學院特產研究所