基于磁珠法提取血液基因組dna的試劑盒及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種基于磁珠法提取血液基因組DNA的試 劑盒及其使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來分子生物學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展，基因組水平上的研究已成為廣大研究者們研究 的熱點。分子生物學(xué)的很多常規(guī)實驗都需要以提取基因組DNA為前提，無論是基因測序、PCR 擴(kuò)增、還是構(gòu)建BCA文庫等，而且提取到的基因組DNA濃度、純度、分子量范圍和一級結(jié)構(gòu)的 完整性都會影響到下游分子生物學(xué)實驗。近年來精準(zhǔn)醫(yī)療和體外診斷技術(shù)蓬勃發(fā)展，需要 處理的樣品量日益龐大，因此高效、方便、可靠、高通量的DNA提取方法成為相關(guān)研究領(lǐng)域的 迫切需求。
[0003] DNA的提取方法很多，如酚/氯仿抽提法、高鹽沉淀法等傳統(tǒng)提取方法，由于其提取 效率低下，難以實現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用，僅在科研領(lǐng)域尚有少量應(yīng)用。目前市場上商品化的血液基 因組DNA提取方法主要是離心柱法，其原理是根據(jù)DNA與離心柱上所修飾化學(xué)基團(tuán)之間的氫 鍵、靜電等作用力，在高鹽溶液中離心柱特異性吸附DNA，漂洗蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì)后，用低鹽 溶液洗脫得到基因組DNA。離心柱型試劑盒較傳統(tǒng)的DNA提取方法操作簡單，缺點為需要在 離心管中操作，需要反復(fù)的離心清洗后方可獲得DNA產(chǎn)物，操作過程需要將離心柱頻繁轉(zhuǎn)出 和轉(zhuǎn)入離心管、并配合大量離心工作，導(dǎo)致操作時間隨之增加并且需要大量人工，針對一個 或幾個樣品其操作效率可以接受，但針對大規(guī)模高通量DNA提取工作依然不理想。當(dāng)前，基 因測序、精準(zhǔn)醫(yī)療等研究領(lǐng)域單個項目需要處理的DNA樣品數(shù)量就可以達(dá)到幾萬、幾十萬甚 至上百萬個，研究者們迫切需要開發(fā)一種更加高效、方便的血液基因組DNA提取方法。
[0004] 近幾年來磁珠法開始應(yīng)用于不同體系DNA的提純工作中。磁珠表面修飾有特殊化 學(xué)基團(tuán)，在不同條件下可以對DNA分子形成特異性吸附或者解吸附作用，再加上其本身擁有 順磁性的特性，富集DNA后與母液分離操作非常方便。但現(xiàn)有技術(shù)中的方法是需要在對紅細(xì) 胞進(jìn)行預(yù)處理后，對大體積的血液DNA樣本進(jìn)行提取。該方法雖可對大體積的血液樣本進(jìn)行 快速提取，可隨著樣本增多，由于紅細(xì)胞的預(yù)處理步驟，則提取時間明顯增加，實驗人員的 工作量也相應(yīng)增加。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供了一種基于磁珠法提取血液基 因組DNA的試劑盒及其使用方法。該試劑盒可以從200yL新鮮或冷凍抗凝血中提取高純度基 因組DNA，提取量可達(dá)到8-12yg，所得基因組DNA產(chǎn)物可直接應(yīng)用于臨床體外檢測使用;且提 取步驟簡便快捷，提取效率高。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0007] -種基于磁珠法提取血液基因組DNA的試劑盒，包括有分別獨立分裝的細(xì)胞裂解 液、蛋白酶k溶液、磁珠分散液、第一清洗液、第二清洗液和洗脫液；
[0008] 其中，所述細(xì)胞裂解液包括有胍類化合物、氯化鈉和吐溫20;所述胍類化合物選自 鹽酸胍、異硫酸氰胍或其組合；
[0009] 所述磁珠分散液中的磁珠采用內(nèi)核為超順磁性四氧化三鐵，表面包覆有硅羥基， 粒徑為200-800nm的磁珠；
[0010] 所述第一清洗液包括有Tris堿、EDTA、異丙醇和水；
[0011]所述第二清洗液為乙醇溶液；
[0012]所述洗脫液為Tris堿或去離子水。
[0013]優(yōu)選的是，所述的基于磁珠法提取血液基因組DNA的試劑盒，其中，所述細(xì)胞裂解 液中胍類化合物的濃度為5-7mol/L，氯化鈉的濃度為0.2-0.5mol/L，吐溫20的體積分?jǐn)?shù)為 0.5%-2%〇
[0014] 優(yōu)選的是，所述的基于磁珠法提取血液基因組DNA的試劑盒，其中，所述磁珠分散 液為磁珠濃度為20-40yg/yL的去離子水溶液。
[0015] 優(yōu)選的是，所述的基于磁珠法提取血液基因組DNA的試劑盒，其中，所述第一清洗 液中Tris堿的濃度為30-100mmol/L，EDTA的濃度為6-20mmol/L，異丙醇的體積分?jǐn)?shù)為45%-65%〇
[0016] 優(yōu)選的是，所述的基于磁珠法提取血液基因組DNA的試劑盒，其中，當(dāng)所述洗脫液 為Tris堿時，Tris堿的濃度為0.9-1. lmmol/L。
[0017] 一種使用如上述方案中任一項所述的基于磁珠法提取血液基因組DNA的試劑盒的 提取方法，包括：
[0018] 步驟一：向反應(yīng)杯中依次加入待測血樣、蛋白酶k溶液和細(xì)胞裂解液，置于渦旋振 蕩器上混合充分，隨后在55_60°C下裂解8-10分鐘；
[0019] 步驟二：向反應(yīng)杯中依次加入磁珠分散液和異丙醇，置于渦旋振蕩器上混合充分， 隨后將反應(yīng)杯置于磁板架上靜置直至磁珠吸附完全，除去清液；
[0020] 步驟三:依次使用第一清洗液和第二清洗液對磁珠進(jìn)行清洗；
[0021 ]步驟四：將磁珠置于45°C真空烘箱中真空干燥3-5分鐘，取出，加入洗脫液，置于渦 旋振蕩器上充分混合，隨后置于55-60°C中靜置5min;
[0022]步驟五:將磁珠與洗脫液分離，即獲得含目標(biāo)DNA的洗脫液。
[0023]優(yōu)選的是，所述的基于磁珠法提取血液基因組DNA的試劑盒的提取方法，其中，所 述反應(yīng)容器為48孔板。
[0024]本發(fā)明的有益效果是：
[0025] 1、操作簡潔，可使血液基因組DNA提取工作效率得到大幅度提升。本案配合48孔板 與磁板架的使用，使得血液中全基因組DNA提取工作無需在離心管中進(jìn)行，直接在48孔板中 進(jìn)行操作，可使用自動移液器完成自動加液，不需要頻繁使用離心機(jī)。2塊48孔板可同時處 理96個樣品，僅需要用時約40-60min，對比當(dāng)前離心柱法DNA提取實驗，后者需配合甩板離 心機(jī)等昂貴設(shè)備，依然需要大于lh方可完成;并且使用離心柱法，操作人員進(jìn)行較大數(shù)量樣 品操作時，需花費大量精力用于離心柱轉(zhuǎn)入和轉(zhuǎn)出離心管的操作，工序繁忙、容易產(chǎn)生操作 失誤。
[0026] 2、無需對紅細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，直接采用細(xì)胞裂解液裂解血液細(xì)胞后，即可加入磁 珠分散液結(jié)合基因組DNA。
[0027] 3、DNA提取產(chǎn)量高達(dá)8-12yg。該方法基于磁珠法開發(fā)，磁珠表面修飾有可以對DNA 進(jìn)行特異性吸附的化學(xué)基團(tuán)，在高鹽、低pH值下可以實現(xiàn)快速吸附，在低鹽、高pH值下又可 以快速解離，DNA提取產(chǎn)量高。
[0028] 4、無需使用苯酚、氯仿等有機(jī)溶劑，對操作人員安全無毒副作用。
[0029] 5、工作效率得到了大幅度提升，適用于高通量實驗。
【附圖說明】
[0030] 圖1為本案實施例1中從血液中抽提基因組DNA產(chǎn)物的電泳膠圖（孔道1-2 : 2份 Omega離心柱法平行實驗;孔道3-5:3份采用本案試劑盒提取法的平行實驗）。
[0031] 圖2為本案實施例2中從血液中高通量提取全基因組DNA產(chǎn)物的的電泳膠圖。
【具體實施方式】
[0032] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文 字能夠據(jù)以實施。
[0033] 實施例1
[0034] 一種基于磁珠法提取血液基因組DNA的試劑盒，包括獨立分裝的：
[0035]細(xì)胞裂解液:6M的鹽酸胍、0.5M的氯化鈉與體積分?jǐn)?shù)1 %的吐溫20混合溶液。具體 配制方法:稱取573g鹽酸胍和29g氯化鈉，加入800mL去離子水?dāng)嚢枞芙?，加?0mL吐溫20， 繼續(xù)加入去離子水定容到1L。
[0036]蛋白酶k溶液:蛋白酶k溶液是一種成熟的市售商品，它是一種切割活性較廣的絲 氨酸蛋白酶，從林伯氏白色念球菌中純化得到。蛋白酶k溶液就是將蛋白酶k溶于水中所得 到的溶液。
[0037]磁珠分散液:濃度為20mg/mL的磁珠混懸液，磁珠內(nèi)核為四氧化三鐵(Fe3〇4)，表面 包覆了Si02層。具體配制方法:稱取2g磁珠，加入到100mL去離子水中，超聲分散均勻。
[0038] 第一清洗液:40mM的Tris-HCl、10mM的EDTA的50%(v/v)的異丙醇水溶液。具體配 制方法:稱取〇.63g Tris-HCl和0.29g EDTA，加入80mL 50%(v/v)的異丙醇水溶液進(jìn)行充 分溶解，繼續(xù)加入50 % (v/v)的異丙醇水溶液定容到100mL。
[0039] 第二清洗液:80% (v/v)的乙醇溶液。
[0040] 洗脫液：ImM的Tris堿水溶液，pH值為8.0。具體配制方法:稱取12mg Tris堿，加入8 去離子水進(jìn)行充分溶解，繼續(xù)加入去離子水定容到l〇〇mL，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至8.0。
[0041 ] 使用上述