一種口腔咽拭子細(xì)菌宏基因組dna提取方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種口腔咽拭子細(xì)菌宏基因組DNA提取方法，包括口腔咽拭子的前處理、細(xì)菌裂解、DNA的分離和雜蛋白的去除，硅膠膜純化柱吸附DNA以及雜質(zhì)的去除，DNA洗脫這五個步驟提取口腔咽拭子細(xì)菌基因組DNA。本發(fā)明特殊的樣本處理方式，可以大大提高得率。同時，使用超聲波破碎裂解結(jié)合酶裂解，利用恰當(dāng)?shù)钠票跁r間和溫和的條件，使革蘭氏陰性菌和陽性菌及其他細(xì)菌適當(dāng)破壁，又能使基因組DNA不受過強的物理因素導(dǎo)致斷裂。本發(fā)明僅用1.5 h就可以提取口腔咽拭子細(xì)菌宏基因組DNA，且細(xì)菌宏基因組得率更高。
【專利說明】
-種口腔咽拭子細(xì)菌宏基因組DNA提取方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種口腔咽拭子細(xì)菌宏基因組DNA提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 宏基因組是指生境中全部微生物基因的總和，它包含了可培養(yǎng)的和未培養(yǎng)的微生 物的基因總和。人類生活在一個微生物的世界，作為一個完整的人體，真核細(xì)胞僅占細(xì)胞總 數(shù)的10 %，而90 %是原核細(xì)胞，因此諾貝爾獎獲得者Lederberg提出人體是由真核細(xì)胞與 體內(nèi)共生的原核細(xì)胞共同組成的"超級生物體(Super organism)"。
[0003] 人體口腔咽部為細(xì)菌提供了良好的棲息環(huán)境，菌群一旦失衡，會影響全身健康。學(xué) 者們提出，一些慢性疾病的病因可能是細(xì)菌群落。細(xì)菌宏基因組研究的對象是特定環(huán)境中 的總DNA，所W，DNA的提取是細(xì)菌宏基因組研究成功關(guān)鍵步驟?？谇谎适米蛹?xì)菌宏基因組 DNA的提取，不僅要盡可能地提取所有細(xì)菌的基因組，還要保持片段的純度和完整度。
[0004] 目前所開發(fā)的口腔咽拭子提取方法，往往只能針對革蘭氏陽性細(xì)菌或革蘭氏陰性 細(xì)菌的一類，缺乏通用性，因此提取出來的宏基因組DNA豐度不好。另外，有些方法雖然能夠 更好地提取口腔咽拭子細(xì)菌的基因組DNA，但卻存在成本高、得率低、操作繁瑣的弊端。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種口腔咽拭子細(xì)菌宏基因組DNA的提取方法，本發(fā)明提 供的方法能夠提高豐度、片段完整性、得率和純度，且操作簡單，成本較低。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 本發(fā)明所采用的操作步驟為： (1)用超聲波細(xì)胞破碎儀對口腔咽拭子及其保存液中的細(xì)菌進(jìn)行初步裂解； (2 )向拭子樣品中加入裂解液和酶液進(jìn)行裂解； (3)向步驟(2)的樣品中加入酪-氯仿-異戊醇混合液，震蕩離屯、取上清液； (4)將步驟(3)中的上清液中加入等體積的氯仿-異戊醇混合液混勻，離屯、取上清液。
[0007] 巧）向步驟(4)的上清液中加入乙醇； (6) 將步驟巧）的上清液移入硅膠膜純化柱，離屯、棄濾過液； (7) 在步驟(6)的硅膠膜純化柱中加入去蛋白液，離屯、棄濾過液； (8) 在步驟(7)的硅膠膜純化柱中加入漂洗液，離屯、棄濾過液； (9) 用洗脫液將步驟(8)硅膠膜上的DNA洗脫下來。
[0008] 步驟（1)是指口腔咽拭子采集后應(yīng)立即操作或于-80°C冰箱中冷凍保存后進(jìn)行提 取?？谇谎适米映浞终鹗?，W使口腔咽拭子上的細(xì)菌充分脫落到拭子保存液中（IxPBS)。并 且，拭子保存液和口腔咽拭子均進(jìn)行裂解，W便將口腔咽拭子上余下的細(xì)菌裂解，釋放出 DNA，從而提高細(xì)菌宏基因組DNA得率。
[0009] 步驟(2)中的裂解液的用量為500 yl，包含濃度為100 ml的化is,濃度為20 mM的 EDTA，質(zhì)量濃度3%的SDS，pH=8.0;酶液包含50 mg/ml溶菌酶和25 mg/ml蛋白酶K，用量為 5041。
[0010] 步驟(3)中的酪-氯仿-異戊醇混合液的用量為500 yl，其成分酪-氯仿-異戊醇體 積比為25:24:1。
[0011] 步驟(4)中的氯仿-異戊醇混合液的體積比為24:1。
[0012] 步驟巧）中的乙醇質(zhì)量濃度為82%，用量為步驟(4)中上清液體積的兩倍。
[0013] 步驟(6)的硅膠膜純化膜購自上海捷瑞生物工程有限公司。
[0014] 步驟(7)的去蛋白液包含濃度9 mM Tris，濃度8 mM鹽酸脈，pH=7.0,使用前需要 加乙醇，使得最終去蛋白液中無水乙醇質(zhì)量濃度為35%。
[001引步驟（8)的漂洗液包含濃度8 ml lYis，濃度17 mM化C1，抑=8.0,調(diào)整抑之后加 入無水乙醇，使漂洗液中乙醇質(zhì)量濃度為90%。最終去蛋白液用量為500 iil。
[0016] 步驟(9)的洗脫液用量為40-80iil，包含濃度8 mM Tris，濃度2 mM EDTA，pH= 8 ? 0 D
[0017] 本發(fā)明的優(yōu)點在于：本發(fā)明采用W上的方法，包括口腔咽拭子的前處理、細(xì)菌裂 解、DNA的分離和雜蛋白的去除，硅膠膜純化柱吸附DNAW及雜質(zhì)的去除，DNA洗脫運五個步 驟提取口腔咽拭子細(xì)菌基因組DNA。本發(fā)明特殊的樣本處理方式，可W大大提高得率。同時， 使用超聲波破碎裂解結(jié)合酶裂解，利用恰當(dāng)?shù)钠票跁r間和溫和的條件，使革蘭氏陰性菌和 陽性菌及其他細(xì)菌適當(dāng)破壁，又能使基因組DNA不受過強的物理因素導(dǎo)致斷裂。與傳統(tǒng)的口 腔咽拭子細(xì)菌宏基因組DNA提取方法相比，本發(fā)明僅用1.5 h就可W提取口腔咽拭子細(xì)菌 宏基因組DNA，且細(xì)菌宏基因組得率更高。不僅節(jié)約了大量的提取時間，同時試劑耗材易獲 得且簡化了步驟，能夠高效、快速、經(jīng)濟地提取口腔咽拭子細(xì)菌宏基因組DNA。
【附圖說明】
[001引圖1本專利方法提取的DNA PCR產(chǎn)物電泳圖。
[0019] 圖2常規(guī)方法提取的DNA PCR產(chǎn)物電泳圖。
【具體實施方式】
[0020] 實施例1 一種口腔咽拭子細(xì)菌宏基因組DNA提取方法，需用到所述硅膠膜純化柱及W下試劑組 成： 裂解液:濃度為100 ml的Tris，終濃度為20 ml的邸TA，質(zhì)量濃度3%的SDS，PH=8.0; 酶液:50 mg/ml溶菌酶和25 mg/ml蛋白酶K; 酪-氯仿-異戊醇混合液:酪-氯仿-異戊醇體積比為25:24:1; 氯仿-異戊醇混合液:氯仿-異戊醇體積比為24:1; 乙醇:質(zhì)量濃度為82%; 硅膠膜純化柱:購自上海捷瑞生物工程有限公司； 去蛋白液:濃度9 mM Tris，8 mM鹽酸脈，pH=7.0,使用前需要加乙醇，使得最終去蛋白 液中乙醇質(zhì)量濃度為35%; 漂洗液:8 mM Tris，17 mM化Cl，pH=8.0,調(diào)整PH之后加入乙醇，使漂洗液中乙醇質(zhì)量 濃度為90%; 洗脫液：8 ml Tris，2 ml 邸TA，pH=8.0。
[0021 ]所述提取方法，包括W下步驟： 1) 口腔咽拭子的前處理:取新鮮采集的或者儲存于-80°C的口腔咽拭子，溶解后在高頻 率震蕩器上，充分震蕩10 min，使拭子上的細(xì)菌脫落到拭子保存液(IxPBS)中。
[0022] 2)細(xì)菌細(xì)胞的初裂解:取上述口腔咽拭子保存液及口腔咽拭子，置于裝有冰塊的 燒杯中，用清洗過的超聲波細(xì)胞破碎儀變幅桿，插入保存液中。在135 W條件下，超聲5 S， 間隔3 S，循環(huán)40次。
[0023] 3)細(xì)菌細(xì)胞的裂解:取上述口腔咽拭子保存液40化1及口腔咽拭子于干凈的2ml離 屯、管中，加入50化1裂解液及50iil酶液，混勻后36°C干浴20 min。之后震蕩10sec，56°C干浴 10 min。
[0024] 4)DNA的分離與雜蛋白的去除：在上述溶液中加入500 yl酪-氯仿-異戊醇混合 液，震蕩器震蕩15 S后，14000 rpm離屯、5 min。將上清液轉(zhuǎn)移到新的無菌離屯、管中，并加 入等體積的氯仿-異戊醇混合液，震蕩混勻離屯、，取上清液。
[0025] 5)硅膠膜純化柱吸附DNA及雜質(zhì)的去除:往上述的上清液中，加入2倍體積的82%的 乙醇，震蕩混勻后，加入硅膠膜純化柱的硅膠膜上，14000 rpm離屯、1 min，丟棄濾過液，加 入500 iil去蛋白液，14000巧m離屯、1 min，丟棄濾過液，然后加入500 iil漂洗液，14000 巧m離屯、3 min，丟棄濾過液。將硅膠膜純化柱的蓋子打開，置于干浴器上，56 °C干浴2 min。
[00%] 6)DNA洗脫:往吸附柱加入60iil的洗脫液，14000巧m離屯、1 min。
[0027] 7)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增:PCR擴增細(xì)菌16S rDNA V3-V4區(qū)，得到的產(chǎn)物用1%的瓊 脂糖凝膠電泳檢測，W此確定細(xì)菌總DNA的質(zhì)量;其中的引物為： 319F:5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3 ' 806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3' 反應(yīng)條件如下：
結(jié)果如表1和圖1，從中可W看出，實例樣得到的濃度較高，且純度也較高。實例樣目的 條帶清晰，提取出的細(xì)菌宏基因組DNA的量較多。
[002引 表1
采用常規(guī)方法提取口腔咽拭子細(xì)菌宏基因組DNA，采用相同方法檢測DM濃度，結(jié)果如 下：
W上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修 飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種口腔咽拭子細(xì)菌宏基因組DNA提取方法，其特征在于:所述方法包括如下： (1)用超聲波細(xì)胞破碎儀對口腔咽拭子及其保存液中的細(xì)菌進(jìn)行初步裂解； (2 )向拭子樣品中加入裂解液和酶液進(jìn)行裂解； (3)向步驟(2)的樣品中加入酚-氯仿-異戊醇混合液，震蕩離心取上清液； (4)將上述步驟(3)中的上清液中加入等體積的氯仿-異戊醇混合液混勻，離心取上清 液； (5 )向步驟(4 )的上清液中加入乙醇； (6)將上述步驟(5)的上清液移入硅膠膜純化柱，離心棄濾過液； (7 )在上述步驟(6 )的硅膠膜純化柱中加入去蛋白液，離心棄濾過液； (8) 在上述步驟(7)的硅膠膜純化柱中加入漂洗液，離心棄濾過液； (9) 用洗脫液將上述步驟(8)硅膠膜上的DNA洗脫下來。2. 根據(jù)權(quán)利要求所述1所述的一種口腔咽拭子細(xì)菌宏基因組DNA提取方法，其特征在 于:步驟（1)中的樣品為400 μL 口腔咽試子保存液及口腔咽拭子;步驟(2)中的裂解液的用 量為500 μL，包含濃度為100 mM的Tris，濃度為20 mM的EDTA，質(zhì)量濃度3%的SDS，pH=8.0;酶 液包含50 mg/ml溶菌酶和25 mg/ml蛋白酶K，用量50μ1。3. 根據(jù)權(quán)利要求所述1所述的一種口腔咽拭子細(xì)菌宏基因組DNA提取方法，其特征在 于:步驟(3)中的酚-氯仿-異戊醇混合液的用量為500 μL，其成分酚-氯仿-異戊醇體積比為 25：24：1〇4. 根據(jù)權(quán)利要求所述1所述的一種口腔咽拭子細(xì)菌宏基因組DNA提取方法，其特征在 于:步驟(4)中的氯仿-異戊醇混合液的體積比為24:1。5. 根據(jù)權(quán)利要求所述1所述的一種口腔咽拭子細(xì)菌宏基因組DNA提取方法，其特征在 于:步驟(5)中的乙醇質(zhì)量濃度為82%，用量為步驟(4)中上清液體積的兩倍。6. 根據(jù)權(quán)利要求所述1所述的一種口腔咽拭子細(xì)菌宏基因組DNA提取方法，其特征在 于:步驟(7)的去蛋白液包含濃度9 mM Tris，濃度8 mM、pH=7.0鹽酸胍，使用前需要加乙醇， 使得最終去蛋白液中無水乙醇質(zhì)量濃度為35%;最終去蛋白液用量為500 μL。7. 根據(jù)權(quán)利要求所述1所述的一種口腔咽拭子細(xì)菌宏基因組DNA提取方法，其特征在 于:步驟(8)的漂洗液包含濃度8 mM Tris，濃度17 mM NaCl，pH=8.0,加入無水乙醇使漂 洗液中乙醇質(zhì)量濃度為90%;漂洗液用量為500 μL。8. 根據(jù)權(quán)利要求所述1所述的一種口腔咽拭子細(xì)菌宏基因組DNA提取方法，其特征在 于:步驟(9)的洗脫液用量為40-80 μL，包含濃度8 mM Tris，濃度2 mM EDTA，pH=8.0。
【文檔編號】C12N15/10GK106047868SQ201610700904
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月23日
【發(fā)明人】王松林, 謝文龍, 劉青青, 李珊, 陳榮山, 肖辛野, 李奇淵, 姚迅
【申請人】廈門基源醫(yī)療科技有限公司