一種高效提取酥瓜基因組dna的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種使用改良的CTAB法提取酥瓜基因組DNA 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 總DNA的提取是分子生物學(xué)的基本內(nèi)容之一，高質(zhì)量的DNA是進行基因克隆、基因 表達、基因功能分析等研究的必要前提。酥瓜，屬于甜瓜中的一種，為安徽省淮南市潘集區(qū) 的特產(chǎn)，該作物性情溫潤、喜光，適宜生長溫度15-35度，最佳生長溫度25-30度，忌連作。因 果實酥脆而得名，味甜、皮薄品質(zhì)好，富含多種維生素。潘集酥瓜是特色農(nóng)產(chǎn)品，全區(qū)酥瓜種 植面積2012年已達10000畝，建立了無公害標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)基地，還制定出臺了淮南市無公害酥 瓜栽培技術(shù)規(guī)程，酥瓜種植已成為潘集區(qū)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整的新亮點。潘集酥瓜在為市民 帶來口福的同時，也成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民增收的重要途徑。酥瓜體內(nèi)含有大量的單寧、多糖、酸類 等物質(zhì)，運增加了從酥瓜組織中提取總DNA的難度。
[0003] 雖然目前商品化DNA提取試劑盒較多，具有操作簡便、用時短等優(yōu)點，但提取的基 因組DNA產(chǎn)率低、純度不高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明旨在提供一種從酥瓜中提取基因組DNA的方法，W解決現(xiàn)有技術(shù)中從酥瓜 中提取的DNA產(chǎn)率低、純度不高的技術(shù)問題。
[0005] 為了實現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種使用改良的CTAB法高效 的從酥瓜中提取基因組DNA的方法。該方法包括W下步驟：
[0006] 1)取材料，用液氮研磨成粉末，直接向研鉢內(nèi)加入2%CTAB提取液，解凍后轉(zhuǎn)移至 離屯、管，搖勻后水浴，冷卻；
[0007] 2)加入氯仿/異戊醇，搖勻后離屯、；
[000引3)取上清液加入到已預(yù)冷的裝有乙醇的離屯、管中，先放入-80°C環(huán)境中靜置，再放 入-20°C環(huán)境中靜置；
[0009] 4)倒出乙醇，先用75%乙醇沖洗，再用無水乙醇沖洗，離屯、后吸出殘余乙醇，自然 干燥后溶解DNA;
[0010] 5)加入核糖核酸酶，在一定條件下將RNA充分消化，加入氯仿/異戊醇，混勻后離 屯、；
[0011] 6)取上清液，加入到含有無水乙醇和醋酸鋼的離屯、管中，-80°C靜置沉淀；
[0012] 7)倒出乙醇，先用75 %乙醇沖洗，再用無水乙醇沖洗，干燥后溶解DNA，低溫保存。
[0013] 本發(fā)明一個優(yōu)選的方面，步驟1)可優(yōu)化為:取0.2mg酥瓜新鮮嫩葉，用液氮研磨充 分后，向研鉢中加入50化1 2 % CTAB提取液，解凍后呈糊狀，倒入離屯、管，再用10化1 CTAB沖 洗研鉢。輕輕搖晃均勻，置65°C水浴30min，期間每隔5min輕輕倒轉(zhuǎn)離屯、管數(shù)次，后拿出冷卻 至室溫。
[0014] 上述步驟2)可優(yōu)化為：加入60化1體積比為24:1的氯仿/異戊醇，輕緩搖至均勻，4 °C、12000巧m 離屯、1 Omin。
[0015] 上述步驟3)可優(yōu)化為：小屯、吸取上清液到已加入80化1-20°C的預(yù)冷無水乙醇的 2ml離屯、管中，放入-80°C環(huán)境中充分靜置化，后轉(zhuǎn)入-20°C環(huán)境中靜置化，充分出現(xiàn)白色沉 淀。
[0016] 上述步驟4)可優(yōu)化為:小屯、倒出無水乙醇后，加入75%乙醇沖洗兩次，再用無水乙 醇沖洗一次，瞬時離屯、后倒出殘余乙醇，自然干燥數(shù)分鐘，加入50化1無菌水或0.1 X TE緩沖 液溶解DNA。
[0017] 上述步驟5)可優(yōu)化為:加入扣1 lOng/ml的核糖核酸酶，37°C烘箱中保溫化后冷卻 至室溫，使核糖核酸充分降解，加入500μ1氯仿/異戊醇，輕緩倒轉(zhuǎn)數(shù)分鐘混勻后，4°C， 12000巧m 離屯、1 Omin。
[0018] 上述步驟6)可優(yōu)化為:小屯、吸取上清液，加入到含有2倍體積的無水乙醇和十分之 一體積的3m〇Vl的醋酸鋼的離屯、管中，-80°C靜置沉淀。
[0019] 上述步驟7)可優(yōu)化為：小屯、倒去無水乙醇，用70%乙醇沖洗兩次后再用無水乙醇 沖洗一次，倒置自然干燥后加入1〇化1無菌水或TE緩沖液溶解DNA，-20°c保存?zhèn)溆谩?br>[0020] 本發(fā)明的另一個優(yōu)選方面，上述方法還包括如下步驟:取化1步驟7)中獲得的DNA 溶液，用0.8 %瓊脂糖凝膠和核酸定量儀分別檢測DNA純度和濃度。
[0021] 本發(fā)明的有益效果為:在本發(fā)明中使用改良的CTAB法的提取過程中，是將提取液 加入研鉢內(nèi)，使其與材料充分融合，提取更高效;DNA沉淀是置于-80°C環(huán)境下，沉淀更充分 更快速;DNA沉淀用75%乙醇清洗后再用無水乙醇清洗，離屯、后吸出殘留乙醇，加快DNA沉淀 干燥，縮短時間。
[0022] 本發(fā)明使用改良的CTAB法提取酥瓜中的基因組DNA，克服了原CTAB法存在操作繁 瑣、耗時長、有毒化學(xué)藥品使用較多等缺點，并且改良后的CTAB法提取含有多糖多酪的酥 瓜，可有效避免提取的DNA被污染。
【附圖說明】
[0023] 圖1是4種方法提取的DNA凝膠電泳圖。
【具體實施方式】
[0024] 下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明進行詳細的說明，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的 限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的前提下，對本發(fā)明所作的修飾或者替換，均屬于本發(fā)明 的范疇：
[0025] 實施例1
[00%]取4份0.2g酥瓜幼嫩葉片，分別使用改良CTAB法、原CTAB法、SDS法、試劑盒Γ天根" 植物基因組DNA提取試劑盒DP305-02)四種方法提取DNA，每種方法Ξ次重復(fù)。
[0027] 使用改良CTAB法提取酥瓜基因組DNA的具體操作步驟為：
[0028] 1)取0.2mg酥瓜新鮮嫩葉，用液氮研磨充分后，向研鉢中加入50化1 2 % CTAB提取 液，解凍后呈糊狀，倒入離屯、管，再用100μΙ CTAB沖洗研鉢。輕輕搖晃均勻，置65°C水浴 30min(期間每隔5min輕輕倒轉(zhuǎn)離屯、管數(shù)次)后拿出，冷卻至室溫。
[00巧]2)加入600μ1氯仿:異戊醇（24:1)，輕緩搖至均勻，4°C、12000巧m離屯、lOmin。
[0030] 3)小屯、吸取上清液到已加入80化1預(yù)冷無水乙醇(-20°C)的2ml離屯、管中，放入-80 °C環(huán)境中充分靜置化，后轉(zhuǎn)入-20°C環(huán)境中靜置化，充分出現(xiàn)白色沉淀。
[0031] 4)小屯、倒出無水乙醇后，加入75%乙醇沖洗兩次，再用無水乙醇沖洗一次，瞬時離 屯、后吸出殘余乙醇，自然干燥數(shù)分鐘，加入50化1無菌水或0.1 X TE緩沖液溶解DNA。
[0032] 5)加入扣1 lOng/ml的RNase，37°C烘箱中保溫化后冷卻至室溫。加入50化1氯仿/ 異戊醇，輕緩倒轉(zhuǎn)數(shù)分鐘混勻后，4°C，12000巧m離屯、lOmin。
[0033] 6)小屯、吸取上清液，加入到含有2倍體積的無水乙醇和十分之一體積的3mol/l的 醋酸鋼的離屯、管中，-80°C靜置沉淀。
[0034] 7)小屯、倒去無水乙醇，用70%乙醇沖洗兩次后再用無水乙醇沖洗一次，倒置自然 干燥后加入10化1無菌水或TE緩沖液溶解DNA，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0035] 8)取化1 DNA溶液，0.8%瓊脂糖凝膠和核酸定量儀檢測DNA濃度和純度。
[0036] 原CTAB法W及SDS法的具體操作步驟參見一般教科書、SDS法;試劑盒法提取酥瓜 的DNA具體操作參見試劑盒的說明書。
[0037] 使用核酸定量儀檢測上述4種提取方法提取的DNA濃度結(jié)果見表1:
[0038] 表1四種方法提取的DNA濃度
[0039]
[0040] 從表1中可見，使用本發(fā)明提供的改良的CTAB法提取酥瓜的DNA的濃度要顯著高于 其他Ξ種方法，差異達到極顯著，且無蛋白W及RNA的污染。
[0041] 使用瓊脂糖凝膠電泳檢測上述4種提取方法提取的DNA的純度結(jié)果見圖1，圖1的結(jié) 果表明，改良的CTAB法較其他Ξ種方法提取的酥瓜葉片基因組DNA產(chǎn)率和純度遠遠高于其 他Ξ種方法、并且無降解。
【主權(quán)項】
1. 一種高效提取酥瓜基因組DNA的方法，其特征在于，使用改良的CTAB法。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述改良的CTAB法包括如下步驟： 1) 取材料，用液氮研磨成粉末，直接向研缽內(nèi)加入2 % CTAB提取液，解凍后轉(zhuǎn)移至離心 管，搖勻后水浴，冷卻； 2) 加入氯仿/異戊醇，搖勻后離心； 3) 取上清液加入到已預(yù)冷的裝有乙醇的離心管中，先放入_80°C環(huán)境中靜置，再放入-20°C環(huán)境中靜置； 4) 倒出乙醇，先用7 5 %乙醇沖洗，再用無水乙醇沖洗，離心后吸出殘余乙醇，自然干燥 后溶解DNA; 5) 加入核糖核酸酶，在一定條件下將RNA充分消化，加入氯仿/異戊醇，混勻后離心； 6) 取上清液，加入到含有無水乙醇和醋酸鈉的離心管中，_80°C靜置沉淀； 7) 倒出乙醇，先用75 %乙醇沖洗，再用無水乙醇沖洗，干燥后溶解DNA，低溫保存。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟1)可為:取0.2mg酥瓜新鮮嫩葉，用液 氮研磨充分后，向研缽中加入500μ1 2 % CTAB提取液，解凍后呈糊狀，倒入離心管，再用100μ 1 CTAB沖洗研缽。輕輕搖晃均勻，置于65°C水浴30min，期間每隔5min輕輕倒轉(zhuǎn)離心管數(shù)次， 后拿出冷卻至室溫。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟2)可為:加入600μ1體積比為24:1的氯 仿/異戊醇，輕緩搖至均勻，4°C、12000rpm離心10min。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟3)可為：小心吸取上清液到已加入800 yl-20°C的預(yù)冷無水乙醇的2ml離心管中，放入-80°C環(huán)境中充分靜置3h，后轉(zhuǎn)入-20°C環(huán)境 中靜置lh，充分出現(xiàn)白色沉淀。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟4)可為：小心倒出無水乙醇后，加入 75%乙醇沖洗兩次，再用無水乙醇沖洗一次，瞬時離心后吸出殘余乙醇，自然干燥數(shù)分鐘， 加入500μ1無菌水或0.1 X TE緩沖液溶解DNA。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟5)可為：加入5μ110ng/ml的核糖核酸 酶，37°C烘箱中保溫lh后冷卻至室溫，使核糖核酸充分降解，加入500μ1氯仿/異戊醇，輕緩 倒轉(zhuǎn)數(shù)分鐘混勻后，4°C，12000rpm離心10min。8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟6)可為:小心吸取上清液，加入到含有 2倍體積的無水乙醇和十分之一體積的3mol/l的醋酸鈉的離心管中，-80°C靜置沉淀。9. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟7)可為：小心倒去無水乙醇，用70%乙 醇沖洗兩次后再用無水乙醇沖洗一次，倒置自然干燥后加入?〇〇μ1無菌水或TE緩沖液溶解 DNA，-20°C保存?zhèn)溆谩?0. 根據(jù)權(quán)利要求2~9任一項所述的方法，其特征在于，上述方法還包括如下步驟:取1 μL步驟7)中獲得的DNA溶液，用0.8%瓊脂糖凝膠和核酸定量儀分別檢測DNA純度和濃度。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種高效提取酥瓜基因組DNA的方法。該方法包括如下步驟：取材料，用液氮研磨成粉末，直接向研缽內(nèi)加入2％CTAB提取液，解凍后轉(zhuǎn)移至離心管，搖勻后水浴，冷卻；加入氯仿和異戊醇，搖勻后離心；取上清液加入到已預(yù)冷的裝有乙醇的離心管中，先放入-80℃環(huán)境中靜置，再放入-20℃環(huán)境中靜置；倒出乙醇，先用75％乙醇沖洗，再用無水乙醇沖洗，離心后吸出殘余乙醇，自然干燥后溶解DNA；加入核糖核酸酶，將RNA充分消化，加入氯仿/異戊醇，混勻后離心；取上清液，加入到含有無水乙醇和醋酸鈉的離心管中，-80℃靜置沉淀；倒出乙醇，先用75％乙醇沖洗，再用無水乙醇沖洗，干燥后溶解DNA，低溫保存。
【IPC分類】C12N15/10
【公開號】CN105505919
【申請?zhí)枴緾N201610052253
【發(fā)明人】汪承剛, 葛繼濤, 陳國戶, 袁凌云, 朱世東, 劉姍, 方柔, 劉思嘉, 張盛云
【申請人】安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2016年1月25日