檢測非綜合癥型耳聾基因多態(tài)性的試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種焦磷酸測序法檢測非綜合癥型耳聾 基因多態(tài)性的試劑盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 耳聾是一組臨床異質(zhì)性很高的疾病，發(fā)病年齡、嚴(yán)重程度及損害部位各不相同， 60%以上的耳聾與遺傳因素有關(guān)，其中80%為無其他臨床癥狀的非綜合性耳聾(NSHI)。人 類基因組計(jì)劃極大地推動了遺傳性耳聾病因?qū)W研究，近年來國內(nèi)外科學(xué)家通過大量研究發(fā) 現(xiàn)，大多數(shù)遺傳性耳聾屬于單基因病。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)400多個伴有聽覺障礙的綜合征，鑒 定出與之相關(guān)的遺傳缺陷30多個，而在非綜合性遺傳性耳聾中，已定位了 100多個致病位 點(diǎn)，克隆了70多個耳聾基因。國內(nèi)自2004年起進(jìn)行了全國范圍的聾病分子流行病學(xué)調(diào)查，結(jié) 果發(fā)現(xiàn)21 %的聾人帶有GJB2基因突變、14.5%的聾人帶有SLC26A4基因突變、3.8%和0.6% 的聾人分別帶有線粒體DNA A1555G和C1494T突變，另有6%的正常人群攜帶致聾突變。其中 GJB2基因的突變與NSHI密切相關(guān)，該基因主要功能是編碼縫隙連接蛋白C〇nnexin26，與常 染色體顯性遺傳性耳聾DFNA3和常染色體隱性遺傳性耳聾DFNB1也有關(guān)，其突變是非綜合征 型常染色體隱性遺傳性語前聾的主要原因，故稱其為耳聾易感基因。GJB3基因也是間隙連 接蛋白基因家族中的一種，該基因突變不僅能導(dǎo)致常染色體顯性非綜合征型聾，也能導(dǎo)致 常染色體隱性非綜合征型聾。臨床多表現(xiàn)為高頻聽力受損的進(jìn)行性語后聾。SLC26A4基因 (PDS gene)是Pendred綜合征（又稱耳聾-甲狀腺腫綜合征）的致病基因，SLC26A4基因與 GJB2基因是常染色體隱性遺傳耳聾家庭產(chǎn)前診斷的主要對象。由其突變導(dǎo)致的前庭水管擴(kuò) 大是內(nèi)耳最常見的畸形，表現(xiàn)為波動性或進(jìn)行性感音神經(jīng)性聽力損失，程度達(dá)重度到極重 度;發(fā)病多在兒童時期，發(fā)病前常有顱內(nèi)壓增高的誘發(fā)因素。12SrRNA基因與兒科臨床聯(lián)系 較密切，該基因突變的攜帶者在使用了氨基糖苷類抗生素后極易致聾。12SrRNA基因的遺傳 方式為線粒體遺傳，特點(diǎn)是女性能將突變的基因傳給兒子和女兒，但只有女兒能傳給下一 代。故線粒體遺傳也稱母系遺傳。
[0003] 以上這幾個基因是我國聾病分子流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果，是導(dǎo)致中國大部分非綜合征 性遺傳性耳聾（NSHI)的幾個最常見的致病基因，通過對以上基因進(jìn)行檢測，可以診斷近 60%的遺傳性耳聾。檢測出耳聾患者及其家屬是否攜帶目前研究的耳聾熱點(diǎn)基因，有助于 提高新生兒聾病和高危聾兒的檢出率，擴(kuò)大耳聾的防治與干預(yù)范圍。對于語前聾患者可以 做到早發(fā)現(xiàn)早治療，盡早利用殘余聽力配戴助聽器或植入電子耳蝸，使患兒聾而不啞;對于 語后聾患者，可以部分預(yù)測以后發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)和發(fā)病的年齡階段，從而盡早預(yù)防，并對患者的 婚配、生育提供遺傳信息;對于有線粒體基因突變的患者，可以避免使用氨基糖苷類等耳毒 性藥物，防止藥物性耳聾?？傊?，通過基因檢測，有利于優(yōu)生優(yōu)育，提高人口素質(zhì)。
[0004] 目前，國內(nèi)已運(yùn)用基因芯片技術(shù)開展了耳聾基因檢測，但其昂貴的檢測成本不能 為廣大民眾所接受。一代測序方法Sanger測序亦可對耳聾基因進(jìn)行檢測，但其也存在著檢 測時間長，檢測費(fèi)用昂貴的缺點(diǎn)。
[0005]焦磷酸測序(Pyrosequencing)技術(shù)是新一代DNA序列分析技術(shù)，被廣泛用于基因 型分析領(lǐng)域。該技術(shù)無須進(jìn)行電泳，DNA片段也無須特殊的熒光標(biāo)記，操作極為簡便。本發(fā)明 旨在建立一種基于焦磷酸測序技術(shù)的快速、準(zhǔn)確和高通量的非綜合性耳聾相關(guān)基因多態(tài)性 檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是，提供一種操作簡便、成本低廉、快捷、準(zhǔn)確的檢測 非綜合癥型耳聾基因多態(tài)性的試劑盒。
[0007] 本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述試劑盒的應(yīng)用。
[0008] 為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0009] 一種檢測非綜合癥型耳聾基因多態(tài)性的引物，包括如下引物：
[0010] 擴(kuò)增GJB2基因的引物對:其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，其下游引 物的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示；
[0011] 擴(kuò)增GJB3基因的引物對:其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示，其下游引 物的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示；
[0012] 擴(kuò)增SLC26A4-1基因的引物對:其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示，其 下游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示；
[0013] 擴(kuò)增SLC26A4-2基因的引物對:其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示，其 下游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示；
[0014] 擴(kuò)增12SrRNA基因的引物對:其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示，其下 游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示；
[0015] 其中，SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:10的5' 端進(jìn)行生物素標(biāo)記；
[0016] GJB2 35 DELG測序引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示；
[0017] GJB2 176-191DEL16測序引物，其核苷酸序列如SEQIDN0:12所示；
[0018] GJB2 235 DEL C測序引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 13所示；
[0019] GJB2 299-300 DEL AT測序引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 14所示；
[0020] GJB3 538 C>T/547G>A測序引物，其核苷酸序列如SEQIDN0:15所示；
[0021 ] SLC26A4 2168A>G測序引物，其核苷酸序列如SEQIDN0:16所示；
[0022] SLC26A4IVS7A>G測序引物，其核苷酸序列如SEQIDN0:17所示；
[0023] 12SrRNA 1494C>T測序引物，其核苷酸序列如SEQIDN0:18所示；
[0024] 12SrRNA 1555A>G測序引物，其核苷酸序列如SEQIDN0:19所示。
[0025] 上述檢測非綜合癥型耳聾基因多態(tài)性的引物在制備檢測非綜合癥型耳聾基因多 態(tài)性試劑中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0026] -種檢測非綜合癥型耳聾基因多態(tài)性的試劑盒，該試劑盒還包括如下試劑：
[0027] (l)DNA 提取試劑；
[0028] (2)PCR反應(yīng)液：PCR Buffer，MgCl225mmol/L，dNTPs 10mmol/L，Taq DNA聚合酶5U/ yL，甘油，SEQ ID N0:1~10所示的引物lOymol/L;
[0029] (3)單鏈純化試劑：體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇水溶液，0.2mol/L Na0H，10mmol/L pH 7.6TriS-Acetate水溶液，結(jié)合緩沖液，退火緩沖液；
[0030] (4)測序試劑：DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶，三磷酸腺苷雙磷酸酶，底物 APS，熒光素，dNTP，測序引物SEQIDN0:ll~19 10μmol/L。
[0031] 上述檢測非綜合癥型耳聾基因多態(tài)性的試劑盒在檢測非綜合癥型耳聾基因多態(tài) 性中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0032] -種利用焦磷酸測序技術(shù)檢測非綜合癥型耳聾基因多態(tài)性的方法，該方法包括如 下步驟：
[0033] (1)提取標(biāo)本組織中的基因組DNA;
[0034] (2)以步驟(1)中所得基因組DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物，PCR擴(kuò)增得到 基因片段；
[0035] (3)將步驟(2)得到的基因片段與親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合進(jìn)行單鏈純化；
[0036] (4)將步驟(3)得到的單鏈純化產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測序；
[0037] (5)測序結(jié)果分析。
[0038]步驟(2)中，所述的PCR擴(kuò)增體系為：
[0039] PCR擴(kuò)增采用50μ1 體系，其中基因組DNA模板2yL，10XPCR buffer 5yL，MgCl24yL， dNTP 3yL，上下游引物各取0.15yL，Taq酶0.3yL，甘油2.5yL，加水補(bǔ)充至50yL;
[0040] PCR 反應(yīng)條件為：94°C5min; 94°C30s，60°C30s，72°C30s，35 個循環(huán)；72°C10min。
[0041] 有益效果:應(yīng)用焦磷酸測序技術(shù)可以快速準(zhǔn)確檢測耳聾基因的多態(tài)性，可廣泛應(yīng) 用于臨床上耳聾患者個體化醫(yī)療方案制定及預(yù)防。與現(xiàn)有技術(shù)相比，其應(yīng)用焦磷酸測序技 術(shù)可以快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行短DNA序列分析，便于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化操作流程;具有高通量、低成本等 特點(diǎn);PCR產(chǎn)物即可直接用于測序，不需進(jìn)行產(chǎn)物純化等二次處理，操作極為簡便，所需樣品 量小。
【附圖說明】
[0042]圖1為本發(fā)明GJB2野生型純合子(35delG)焦磷酸測序結(jié)果；
[0043]圖2為本發(fā)明GJB2野生型純合子(176-191dell6)焦磷酸測序結(jié)果；
[0044]圖3為本發(fā)明GJB2野生型純合子(235delC)焦磷酸測序結(jié)果；
[0045] 圖4為本發(fā)明GJB2野生型純合子(299-300de 1AT)焦磷酸測序結(jié)果；
[0046]圖5為本發(fā)明GJB3野生型純合子(538C>T)焦磷酸測序結(jié)果；
[0047]圖6為本發(fā)明GJB3野生型純合子(547G>A)焦磷酸測序結(jié)果；
[0048] 圖7為本發(fā)明SLC26A4野生型純合子(2168A>G)焦磷酸測序結(jié)果；
[0049] 圖8為本發(fā)明SLC26A4野生型純合子(IVS7-2A>G)焦磷酸測序結(jié)果；
[0050] 圖9為本發(fā)明12SrRNA野生型純合子(1555A>G)焦磷酸測序結(jié)果；
[0051 ] 圖10為本發(fā)明12SrRNA野生型純合子(14940T)焦磷酸測序結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0052]根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本 發(fā)明。
[0053] 實(shí)施例1:試劑。
[0054] (l)DNA 提取試劑：
[0055] 購自 QIAGEN公司。
[0056] (2)PCR 反應(yīng)液：
[0057]擴(kuò)增引物SEQ ID NO: 1~10,由上海英俊生物科技有限公司合成；
[0058] PCR Buffer:購自美國Fermentas公司；
[0059] MgCl2:購自美國Fermentas 公司；
[0060] dNTPs:購自美國Fermentas 公司；
[0061 ] Taq DNA聚合酶：購自美國Fermentas公司。
[0062] (3)單鏈純化試劑：
[0063] 75% (v/v)乙醇溶液:購于杭州長征化學(xué)試劑有限公司；
[0064] 0.2mol/L NaOH:購于上海試四赫維化工有限公司；
[0065] 10mM Tris_Acetate(pH 7 · 6) :Tris_base購于美國Sigma公司，無水乙酸購于杭州 化學(xué)試劑有限公司；
[0066] 結(jié)合緩沖液：由10mM Tris-HCl(Tris_base購于美國Sigma公司，鹽酸購于杭州化 學(xué)試劑有限公司），2M NaCl(購于上海試四赫維化工有限公司），lmM EDTA(購于杭州化學(xué)試 劑有限公司），〇· l%(v/v)Tween 20(購于美國Sigma公司）組成；
[0067] 退火緩沖液：由20mM Tris_Acetate(pH 7.6) (Tris-base購于美國Sigma公司，無 水乙酸購于杭州化學(xué)試劑有限公司），2mM醋酸鎂(購于上海試四赫維化工有限公司)組成；
[0068] 親和素標(biāo)記的磁珠（購于GE healthcare Bioscience AB)〇
[0069] (4)測序試劑：
[0070] 測序引物SEQ ID N0:11~19,由上海英俊生物科技有限公司合成；
[0071] DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三