本發(fā)明涉及分子生物學技術領域，是一種柞蠶血液DNA提取方法。

背景技術：

DNA（Deoxyribonucleic acid）又稱脫氧核糖核酸，是生物體的重要組成部分，是生命科學研究的物質(zhì)基礎。高質(zhì)量的基因組DNA是進行分子標記、基因克隆及基因表達研究等下游技術的必要前提。因此DNA的分離純化成為分子生物學研究中的一個重要環(huán)節(jié)。

柞蠶（Antheraea pernyi）屬于鱗翅目大蠶蛾科的泌絲昆蟲，是我國特有的一種具有重要經(jīng)濟價值的昆蟲資源。近年來，分子生物學技術在柞蠶等昆蟲研究中得到迅猛發(fā)展，其中基因組DNA提取是分子生物學實驗的基礎，而開展這些研究的基礎工作之一就是基因組的提取。

現(xiàn)有的研究中大多從中腸、絲腺、蠶蛹組織中提取DNA。這些樣本材料的DNA提取或是需要液氮進行研磨或是需要長時間的消化處理，整個DNA提取耗時耗力。且這些樣品中含有大量的脂肪和蛋白質(zhì)類物質(zhì)等雜質(zhì)，這些物質(zhì)易與DNA結合形成粘稠的膠狀物，影響基因組DNA的提取。又易抑制Tag酶活性，從而影響PCR等實驗反應，進而影響實驗結果。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種科學合理，實用性強，方便、省時、省力、效果好、簡便易行、高效的柞蠶血液DNA提取方法。

解決其技術問題采用的技術方案是：一種柞蠶血液DNA提取方法，其特征在于，它包括以下步驟：

1）柞蠶血液處理：將1.3 ml柞蠶血液置入離心機中，在12000rpm條件下，離心8min，棄去上清液，得到白色沉淀物；

2）向所述白色沉淀物中加入提取緩沖液，白色沉淀物與提取緩沖液的體積比例為1:25~30，得到混合液I；

3）向所述混合液I中加入蛋白酶K和核糖核酸酶A，經(jīng)50~60℃條件下恒溫振蕩1~2h，使所述混合液I中蛋白酶K終濃度為0.38mg/ml、核糖核酸酶A終濃度為0.038mg/ml，得到裂解混合液Ⅱ；

4）向所述裂解混合液Ⅱ中加入氯仿-異戊醇混合液，氯仿-異戊醇混合液與裂解混合液Ⅱ的體積比例為1:1，使用離心機，在12000rpm條件下離心8min，得到第一上清液；

5）向所述第一上清液中加入無水乙醇，第一上清液與無水乙醇的體積比例為1:2.5，-20~-25℃靜止30min，使用離心機，在12000rpm條件下離心8min，得到無色透明、膠狀柞蠶DNA；

6）無色透明、膠狀柞蠶DNA經(jīng)0.5ml，70%濃度的乙醇洗滌，棄去上清后，晾干；

7）將晾干的無色、透明膠狀柞蠶DNA完全溶解于0.05ml 的TE緩沖液，得到無色透明柞蠶DNA溶液。

每1L所述提取緩沖液中，含有10 mmol的Tris-HCl、10 mmol的EDTA、100 mmol的NaCl、2% 的SDS、0.039 mol的DTT，余量為水，水采用DNase/RNase-Free去離子水，提取緩沖液的pH=8.0。

所述氯仿-異戊醇混合液中，氯仿與異戊醇的體積比為24:1。

每1L所述TE緩沖液中，含有10 mmol的Tris-HCl、1mmol的EDTA，余量為水，水采用DNase/RNase-Free去離子水，TE緩沖液的pH=8.0。

向所述無色透明、膠狀柞蠶DNA溶液中加入70%乙醇洗滌，棄去上清后，在12000rpm條件下離心0.5~1min，吸除70%乙醇后，晾干，得到無透明、膠狀柞蠶DNA。

本發(fā)明的一種柞蠶血液DNA提取方法，由于采用柞蠶血液提取DNA，且提取步驟科學合理，實用性強，方便、省時、省力、簡便易行、高效、成本低，提取的DNA效果佳、質(zhì)量好。尤其適合野外DNA提取、現(xiàn)場應急以及生產(chǎn)樣本的檢測的迫切需要和實驗室進行小型規(guī)模的DNA提取或商業(yè)公司試劑盒生產(chǎn)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實驗例中柞蠶基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖。

具體實施方式

下面結合實施例對本發(fā)明的一種柞蠶血液DNA提取方法進行詳細的描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

本發(fā)明的一種柞蠶血液DNA提取方法，包括以下步驟：

1）柞蠶血液處理：將1.3 ml柞蠶血液置入離心機中，在12000rpm條件下，離心8min，棄去上清液，得到白色沉淀物；

2）向所述白色沉淀物中加入提取緩沖液，白色沉淀物與提取緩沖液的體積比例為1:25~30，得到混合液I；

3）向所述混合液I中加入蛋白酶K和核糖核酸酶A，經(jīng)50~60℃條件下恒溫振蕩1~2h，使所述混合液I中蛋白酶K終濃度為0.38mg/ml、核糖核酸酶A終濃度為0.038mg/ml，得到裂解混合液Ⅱ；

4）向所述裂解混合液Ⅱ中加入氯仿-異戊醇混合液，氯仿-異戊醇混合液與裂解混合液Ⅱ的體積比例為1:1，使用離心機，在12000rpm條件下離心8min，得到第一上清液；

5）向所述第一上清液中加入無水乙醇，第一上清液與無水乙醇的體積比例為1:2.5，-20~-25℃靜止30min，使用離心機，在12000rpm條件下離心8min，得到無色透明、膠狀柞蠶DNA；

6）無色透明、膠狀柞蠶DNA經(jīng)0.5ml，70%濃度的乙醇洗滌，棄去上清后，晾干；

7）將晾干的無色、透明膠狀柞蠶DNA完全溶解于0.05ml 的TE緩沖液，得到無色透明柞蠶DNA溶液。

每1L所述提取緩沖液中，含有10 mmol的Tris-HCl、10 mmol的EDTA、100 mmol的NaCl、2% 的SDS、0.039 mol的DTT，余量為水，水采用DNase/RNase-Free去離子水，提取緩沖液的pH=8.0。

所述氯仿-異戊醇混合液中，氯仿與異戊醇的體積比為24:1。

每1L所述TE緩沖液中，含有10 mmol的Tris-HCl、1mmol的EDTA，余量為水，水采用DNase/RNase-Free去離子水，TE緩沖液的pH=8.0。

向所述無色透明、膠狀柞蠶DNA溶液中加入70%乙醇洗滌，棄去上清后，在12000rpm條件下離心0.5min，吸除70%乙醇后，晾干，得到無透明、膠狀柞蠶DNA。

實施例1：實施例1的一種柞蠶血液DNA提取方法，包括：

一、溶液配置

（1）提取緩沖液：每1L提取緩沖液中，含有10 mmol的Tris-HCl、10 mmol的EDTA、100 mmol的NaCl、2% 的SDS、0.039 mol的DTT，余量為水，水采用DNase/RNase-Free去離子水，提取緩沖液的pH=8.0；

（2）氯仿-異戊醇：體積比為24:1的氯仿異戊醇混合溶液；

（3）70%乙醇溶液：體積比7:3的乙醇、DNase/RNase-Free去離子水混合溶液；

（4）TE緩沖液：每1L所述TE緩沖液中，含有10 mmol的Tris-HCl、1mmol的EDTA，余量為水，水采用DNase/RNase-Free去離子水，TE緩沖液的pH=8.0；

二、柞蠶DNA的提取

1）柞蠶血液處理：取柞蠶4~5齡幼蟲血液1.3ml置入離心機中，在12000rpm條件下，離心8min，棄去上清液，得到白色沉淀物；

2）向白色沉淀物中加入1.3ml提取緩沖液，充分振蕩、混勻，將沉淀溶解于提取緩沖液，得到混合液I；

3）向混合液I中加入蛋白酶K 0.5mg、核糖核酸酶A 0.05mg，置于50℃條件下恒溫振蕩1h，使蛋白酶K終濃度為0.38mg/ml、核糖核酸酶A終濃度為0.038mg/ml，得到裂解混合液Ⅱ；

4）取0.6ml裂解混合液Ⅱ移入新的1.5ml離心管中，加入等體積的氯仿-異戊醇混合液，混勻，靜置5min，于12000rpm條件下離心8min；

5）取0.3ml上清液移入新的1.5ml離心管中，加入2.5倍體積的無水乙醇，置于-20℃條件下放置30min，于12000rpm條件下離心8min，棄去上清液，得到無色透明、膠狀柞蠶DNA；

6）向上述裝有無色透明、膠狀柞蠶DNA的1.5ml離心管中加入0.5ml 的70%乙醇溶液，平置離心管輕微旋轉(zhuǎn)后，棄去上清，于12000rpm條件下離心0.5min，吸取上清液并棄去，晾干柞蠶DNA；

7）向上述裝有干燥的柞蠶DNA的1.5ml離心管中加入0.05ml 的TE緩沖液，輕微震蕩， 使柞蠶DNA完全溶解于TE溶液，置于-20℃條件下保存。

實施例2：實施例2的一種柞蠶血液DNA提取方法，包括：

一、溶液配置與實施例1相同；

二、柞蠶DNA的提取

1）柞蠶血液處理：取柞蠶4~5齡幼蟲血液1.3ml置入離心機中，在12000rpm條件下，離心8min，棄去上清液，得到白色沉淀物；

2）向白色沉淀物中加入1.3ml提取緩沖液，充分振蕩、混勻，將沉淀溶解于提取緩沖液，得到混合液I；

3）向混合液I中加入蛋白酶K 0.5mg、核糖核酸酶A 0.05mg，置于55℃條件下恒溫振蕩1.5h，使蛋白酶K終濃度為0.38mg/ml、核糖核酸酶A終濃度為0.038mg/ml，得到裂解混合液Ⅱ；

4）取0.6ml裂解混合液Ⅱ移入新的1.5ml離心管中，加入等體積的氯仿-異戊醇混合液，混勻，靜置5min，于12000rpm條件下離心8min；

5）取0.3ml上清液移入新的1.5ml離心管中，加入2.5倍體積的無水乙醇，置于-22.5℃條件下放置30min，于12000rpm條件下離心8min，棄去上清液，得到無色透明、膠狀柞蠶DNA；

6）向上述裝有無色透明、膠狀柞蠶DNA的1.5ml離心管中加入0.5ml 的70%乙醇溶液，平置離心管輕微旋轉(zhuǎn)后，棄去上清，于12000rpm條件下離心0.5min，吸取上清液并棄去，晾干柞蠶DNA；

7）向上述裝有干燥的柞蠶DNA的1.5ml離心管中加入0.05ml 的TE緩沖液，輕微震蕩， 使柞蠶DNA完全溶解于TE溶液，置于-20℃條件下保存。

實施例3：實施例3的一種柞蠶血液DNA提取方法，包括：

一、溶液配置與實施例1相同；

二、柞蠶DNA的提取

1）柞蠶血液處理：取柞蠶4~5齡幼蟲血液1.3ml置入離心機中，在12000rpm條件下，離心8min，棄去上清液，得到白色沉淀物；

2）向白色沉淀物中加入1.3ml提取緩沖液，充分振蕩、混勻，將沉淀溶解于提取緩沖液，得到混合液I；

3）向混合液I中加入蛋白酶K 0.5mg、核糖核酸酶A 0.05mg，置于60℃條件下恒溫振蕩2h，使蛋白酶K終濃度為0.38mg/ml、核糖核酸酶A終濃度為0.038mg/ml，得到裂解混合液Ⅱ；

4）取0.6ml裂解混合液Ⅱ移入新的1.5ml離心管中，加入等體積的氯仿-異戊醇混合液，混勻，靜置5min，于12000rpm條件下離心8min；

5）取0.3ml上清液移入新的1.5ml離心管中，加入2.5倍體積的無水乙醇，置于-25℃條件下放置30min，于12000rpm條件下離心8min，棄去上清液，得到無色透明、膠狀柞蠶DNA；

6）向上述裝有無色透明、膠狀柞蠶DNA的1.5ml離心管中加入0.5ml 的70%乙醇溶液，平置離心管輕微旋轉(zhuǎn)后，棄去上清，于12000rpm條件下離心0.5min，吸取上清液并棄去，晾干柞蠶DNA；

7）向上述裝有干燥的柞蠶DNA的1.5ml離心管中加入0.05ml 的TE緩沖液，輕微震蕩， 使柞蠶DNA完全溶解于TE溶液，置于-20℃條件下保存。

實施例4：實施例4的一種柞蠶血液DNA提取方法，包括：

一、溶液配置與實施例1相同；

二、柞蠶DNA的提取

1）柞蠶血液處理：取柞蠶4~5齡幼蟲血液1.3ml置入離心機中，在12000rpm條件下，離心8min，棄去上清液，得到白色沉淀物；

2）向白色沉淀物中加入1.3ml提取緩沖液，充分振蕩、混勻，將沉淀溶解于提取緩沖液，得到混合液I；

3）向混合液I中加入蛋白酶K 0.5mg、核糖核酸酶A 0.05mg，置于50℃條件下恒溫振蕩1h，使蛋白酶K終濃度為0.38mg/ml、核糖核酸酶A終濃度為0.038mg/ml，得到裂解混合液Ⅱ；

4）取0.6ml裂解混合液Ⅱ移入新的1.5ml離心管中，加入等體積的氯仿-異戊醇混合液，混勻，靜置5min，于12000rpm條件下離心8min；

5）取0.3ml上清液移入新的1.5ml離心管中，加入2.5倍體積的無水乙醇，置于-20℃條件下放置30min，于12000rpm條件下離心8min，棄去上清液，得到無色透明、膠狀柞蠶DNA；

6）向上述裝有無色透明、膠狀柞蠶DNA的1.5ml離心管中加入0.5ml 的70%乙醇溶液，平置離心管輕微旋轉(zhuǎn)后，棄去上清，于12000rpm條件下離心0.5min，吸取上清液并棄去，晾干柞蠶DNA；

7）向上述裝有干燥的柞蠶DNA的1.5ml離心管中加入0.05ml 的TE緩沖液，輕微震蕩， 使柞蠶DNA完全溶解于TE溶液，置于-20℃條件下保存。

實施例5：實施例5的一種柞蠶血液DNA提取方法，包括：

一、溶液配置與實施例1相同；

二、柞蠶DNA的提取

1）柞蠶血液處理：取柞蠶4~5齡幼蟲血液1.3ml置入離心機中，在12000rpm條件下，離心8min，棄去上清液，得到白色沉淀物；

2）向白色沉淀物中加入1.3ml提取緩沖液，充分振蕩、混勻，將沉淀溶解于提取緩沖液，得到混合液I；

3）向混合液I中加入蛋白酶K 0.5mg、核糖核酸酶A 0.05mg，置于55℃條件下恒溫振蕩1.5h，使蛋白酶K終濃度為0.38mg/ml、核糖核酸酶A終濃度為0.038mg/ml，得到裂解混合液Ⅱ；

4）取0.6ml裂解混合液Ⅱ移入新的1.5ml離心管中，加入等體積的氯仿-異戊醇混合液，混勻，靜置5min，于12000rpm條件下離心8min；

5）取0.3ml上清液移入新的1.5ml離心管中，加入2.5倍體積的無水乙醇，置于-22.5℃條件下放置30min，于12000rpm條件下離心8min，棄去上清液，得到無色透明、膠狀柞蠶DNA；

6）向上述裝有無色透明、膠狀柞蠶DNA的1.5ml離心管中加入0.5ml 的70%乙醇溶液，平置離心管輕微旋轉(zhuǎn)后，棄去上清，于12000rpm條件下離心0.5min，吸取上清液并棄去，晾干柞蠶DNA；

7）向上述裝有干燥的柞蠶DNA的1.5ml離心管中加入0.05ml 的TE緩沖液，輕微震蕩， 使柞蠶DNA完全溶解于TE溶液，置于-20℃條件下保存。

實施例6：實施例6的一種柞蠶血液DNA提取方法，包括：

一、溶液配置與實施例1相同；

二、柞蠶DNA的提取

1）柞蠶血液處理：取柞蠶4~5齡幼蟲血液1.3ml置入離心機中，在12000rpm條件下，離心8min，棄去上清液，得到白色沉淀物；

2）向白色沉淀物中加入1.3ml提取緩沖液，充分振蕩、混勻，將沉淀溶解于提取緩沖液，得到混合液I；

3）向混合液I中加入蛋白酶K 0.5mg、核糖核酸酶A 0.05mg，置于60℃條件下恒溫振蕩2h，使蛋白酶K終濃度為0.38mg/ml、核糖核酸酶A終濃度為0.038mg/ml，得到裂解混合液Ⅱ；

4）取0.6ml裂解混合液Ⅱ移入新的1.5ml離心管中，加入等體積的氯仿-異戊醇混合液，混勻，靜置5min，于12000rpm條件下離心8min；

5）取0.3ml上清液移入新的1.5ml離心管中，加入2.5倍體積的無水乙醇，置于-25℃條件下放置30min，于12000rpm條件下離心8min，棄去上清液，得到無色透明、膠狀柞蠶DNA；

6）向上述裝有無色透明、膠狀柞蠶DNA的1.5ml離心管中加入0.5ml 的70%乙醇溶液，平置離心管輕微旋轉(zhuǎn)后，棄去上清，于12000rpm條件下離心0.5min，吸取上清液并棄去，晾干柞蠶DNA；

7）向上述裝有干燥的柞蠶DNA的1.5ml離心管中加入0.05ml 的TE緩沖液，輕微震蕩， 使柞蠶DNA完全溶解于TE溶液，置于-20℃條件下保存。

圖1為本發(fā)明實驗例中柞蠶基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖，其中1號泳道是15000標準分子量（天根生化科技有限公司），2號泳道是本發(fā)明實施例1中提取的柞蠶4~5齡幼蟲血液，3號泳道是本發(fā)明實施例4中提取的柞蠶蛹期血液，4號泳道是未實施本發(fā)明例1-3中提取的柞蠶4~5齡幼蟲血液，5號泳道是未實施本發(fā)明例4-6中提取的柞蠶蛹期血液。

本發(fā)明的具體實施方式僅為有限的實施例，并非窮舉，本領域技術人員不經(jīng)過創(chuàng)造性勞動的簡單復制和改進仍屬于本發(fā)明權利要求所保護的范圍。