一種高效安全提取動物肌肉組織dna的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種簡便、安全、快速提取動物肌肉組織DNA的方法，它是將豬肉、羊肉、牛肉和雞肉等，清水洗凈后，剔去動物組織中的結締組織和脂肪，剪成約200mg的小塊，放入液氮，迅速研磨，直至粉末狀，取100mg放入2mL離心管，通過SDS裂解、異丙醇沉淀、吸附柱純化提取得到DNA，可直接用于PCR擴增。本發(fā)明采用的DNA提取方法，2小時內即可完成樣品DNA提取的全過程。所提取的DNA質量標準滿足了后續(xù)PCR擴增的要求，同時避免了傳統(tǒng)SDS法或異硫酸氰胍法提取過程中各種有機試劑對實驗人員的危害，而且時間上也得到了很大的提升，更適合于動物源性成分鑒定過程中高效快速提取樣品DNA的目的，具有高效、快速、低成本、操作簡便、無毒安全等優(yōu)勢。
【專利說明】
一種高效安全提取動物肌肉組織DNA的方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學技術領域，涉及模板DNA的制備方法，是一種高效、快速、 低成本、操作簡便、無毒安全的動物肌肉組織DNA提取方法。
【背景技術】
[0002] 近年來，隨著瘋牛病、羊瘙癢病、口蹄疫、禽流感等一些疾病在歐洲及世界各國的 流行，以及一些動物源食品摻假造假現(xiàn)象的普遍產(chǎn)生，對食品、藥品，以及飼料產(chǎn)品成分進 行動物源性鑒定，已經(jīng)成為一個備受關注的問題。隨著生物技術的發(fā)展，以DNA為基礎的 PCR技術廣泛被用來鑒定食品中的動物源性，由于PCR方法比較簡便，特異性和靈敏度都很 高，國內外已經(jīng)運用該技術和其他技術結合建立了多種鑒定食品動物源性成分的方法.如 常規(guī)PCR、多重PCR、實時熒光定量PCR、定量競爭PCR、RAPD-PCR和AFLP-PCR等，而高質量、 高純度的基因組DNA的獲得則是開展該方面研究工作的前提。長期以來，動物肌肉組織樣 本中DNA的提取一直是耗時、繁瑣的過程，消解過程長達數(shù)小時甚至過夜，嚴重減慢了檢測 速度，同時在提取過程中還反復使用多種有機溶劑，對實驗人員的健康造成損傷。因此，許 多學者一直在探索動物肌肉組織DNA的高效安全提取方法。
[0003] 目前國內外研究發(fā)現(xiàn)并使用的動物肌肉組織DNA提取方法有很多，其中使用最 頻繁主要為傳統(tǒng)SDS-蛋白酶K消化法、異硫氰酸胍法、CTAB法、試劑盒方法，以及一些以 SDS-蛋白酶K消化法為基礎的改良方法。
[0004] (1)傳統(tǒng)SDS-蛋白酶K消化法通過SDS (十二烷基硫酸鈉）破碎細胞，酚/氯仿等 有機溶劑抽提蛋白變性，能夠有效地去除多糖及酚類物質的沉淀，因而適用于從含酚類及 糖類物質較高的動物材料中提取DNA，獲得的DNA純度高，含量多。但比較費時，往往消化過 程需要數(shù)小時甚至過夜，且蛋白酶K的消化成本過高，流程繁瑣，操作復雜。而且提取過程 中使用了大量的有機溶劑，有損實驗人員的健康。
[0005] (2)異硫氰酸胍法靠異硫氰酸胍主要試劑破壞細胞結構，使核酸從核蛋白中解離 出來，起到解偶劑的作用，裂解液經(jīng)酚氯仿抽提，異丙醇沉淀后獲得DNA，操作相對簡單、快 速雖可以得到較純的DNA，但仍不可避免酚氯仿等有機溶劑對實驗人員的損傷。
[0006] (3) CTAB法是通過一種陽離子去污劑（十六烷基三甲基溴化銨），溶解細胞膜，并 與核酸形成復合物，該復合物在高鹽溶液中（>〇. 7mol/LNaCl)是可溶的，通過有機溶劑抽 提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。
[0007] 為方便研究者提出更高質量的DNA，國內外很多試劑公司依據(jù)各種方法的原理和 試劑特性，開發(fā)出便于提取DNA的試劑盒。硅膠柱型試劑盒是目前較常用的提取試劑盒，本 發(fā)明將SDS(十二烷基硫酸鈉）與吸附性硅膠柱相結合，既達到了有效的細胞裂解，又通過 硅膠柱實現(xiàn)了安全無污染的分離純化，同時操作簡單、快速、且成本低廉，有效地避免使用 酚氯仿等有機溶劑，對操作人員沒有損害。

【發(fā)明內容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于克服傳統(tǒng)樣本DNA提取步驟多、復雜、費時以及大量使用有機 溶劑對實驗人員造成損傷等缺點，公開了一種高效安全提取動物肌肉組織DNA的方法。本 發(fā)明的DNA提取方法具有高效、快速、低成本、操作簡便、無毒安全等優(yōu)勢。
[0009] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下的技術方案：
[0010] 一種高效安全提取動物肌肉組織DNA的方法，其特征在于它按如下步驟進行：
[0011] (1)取待測動物肌肉組織樣本清水洗凈后，剔去動物組織中的結締組織和脂肪，剪 成約200mg的小塊，放入用液氮預冷的研缽中，然后緩緩的向研缽中加入液氮，迅速研磨， 直到樣品成細微的粉末狀為止，取l〇〇mg加入2mL滅菌離心管中；
[0012] (2)加入500 μ L SDS裂解液和6 μ L蛋白酶K，65°C水浴60min，期間不停顛倒混 勻；
[0013] (3)水浴后13200rpm/min，離心5min ;小心地將上層水相轉入一個新的離心管中， 加入0. 8倍異丙醇；將混勻的液體轉入吸附柱中，13200rpm/min，離心30s，棄掉廢液；
[0014] (4)向吸附柱中加入70%乙醇，13200rpm/min，離心30s，棄掉廢液，重復此步驟一 次；
[0015] (5)將吸附柱放回收集管中，13200rpm/min，離心2min，倒掉廢液；將吸附柱置于 室溫數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的乙醇；將吸附柱轉入一個干凈的離心管中，向吸 附膜的中間位置懸空滴加100 μ L的洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5min，13200rpm/min，離心 2min，所得溶液即為DNA。
[0016] 本發(fā)明所述的待測樣本為植物樣品為動物肌肉組織樣品包括豬肉、羊肉、牛肉和 雞肉等各類動物樣品。
[0017] 本發(fā)明所述的SDS裂解液濃度為10 %，加入量為500 μ L ;恒溫水浴溫度為65°C， 時間為lh。本發(fā)明所述的與水相結合的異丙醇體積為吸取水相體積的0. 8倍。
[0018] 為了能更加清楚的說明本發(fā)明的提取方法，下面以羊肉為樣本實例，對本發(fā)明的 提取方法與傳統(tǒng)的SDS-蛋白酶K消化法分別加以比較對照說明。
[0019] -、材料和方法
[0020] (1)樣品：生鮮羊肉，由農(nóng)貿(mào)市場購置。
[0021] (2)主要儀器：高速冷凍離心機，實時熒光定量PCR擴增儀，恒溫水浴鍋。
[0022] (3)主要試劑：
[0023] PCR引物、探針由上海生工公司合成，引物序列見表1。
[0024] 2 XPremix Ex Taq (Probe qPCR)試劑購自 TaKaRa 公司。
[0025] 異丙醇購自天津化學試劑三廠公司。
[0026] CTAB(十六烷基三甲基溴化銨）提取緩沖液：1000mL水中溶解CTAB20g，Tris 12. llg，NaCl 81. 82g，Na2EDTA 7. 44g，高壓滅菌。
[0027] SDS-蛋白酶K消化液：10mmoL/L Tris-HCl(pH 8· 0) ;25mmol/L EDTA(pH8. 0) ;5g/ L SDS ;0· lg/L 蛋白酶 K。
[0028] 表1羊源性成分鑒定定量PCR引物序列
[0030] 二、生鮮羊肉DNA的兩種提取方法的比較
[0031] 1、SDS-蛋白酶K消化法提取DNA
[0032] (1)取待測動物肌肉組織樣本清水洗凈后，剔去動物組織中的結締組織和脂肪，剪 成約200mg的小塊，放入用液氮預冷的研缽中，然后緩緩的向研缽中加入液氮，迅速研磨， 直到樣品成細微的粉末狀為止，取l〇〇mg加入2mL滅菌離心管中；
[0033] (2)加入500 μ L SDS裂解液和20 μ L蛋白酶K，混勻，55°C水浴消化數(shù)小時至過夜， 期間不停顛倒混勻，直至溶液透明；
[0034] (3)將消化后的組織裂解液加入等體積的Tris飽和酸，緩慢顛倒混勻，12000rpm/ min離心10min，轉移上清至一新離心管，重復1次；
[0035] (4)加入0. 5倍體積的Tris飽和酚和0. 5倍體積的氯仿/異戊醇（24:1)，緩慢顛 倒混勾，12000rpm/min離心10min，轉移上清至一新離心管；
[0036] (5)加入0. 1倍體積的乙酸鈉溶液和2. 5倍體積4°C預冷的無水乙醇，緩慢顛倒混 勻，可見白色DNA絮狀沉淀析出，-20 °C沉淀2h ;
[0037] (6) 12000rpm/min 離心 5min，加入 500 μ L70% 乙醇洗滌沉淀；
[0038] (7)室溫下放置使殘余乙醇完全揮發(fā)，加入100 μ LTE緩沖液溶解DNA沉淀。
[0039] 2、本發(fā)明方法提取DNA
[0040] (1)取待測動物肌肉組織樣本清水洗凈后，剔去動物組織中的結締組織和脂肪，剪 成約200mg的小塊，放入用液氮預冷的研缽中，然后緩緩的向研缽中加入液氮，迅速研磨， 直到樣品成細微的粉末狀為止，取l〇〇mg加入2mL滅菌離心管中；
[0041] (2)加入500 μ L SDS裂解液和6 μ L蛋白酶K，65°C水浴60min，期間不停顛倒混 勻；
[0042] (3)水浴后13200rpm/min，離心5min ;小心地將上層水相轉入一個新的離心管中， 加入0. 8倍異丙醇；將混勻的液體轉入吸附柱中，13200rpm/min，離心30s，棄掉廢液；
[0043] (4)向吸附柱中加入70%乙醇，13200rpm/min，離心30s，棄掉廢液，重復此步驟一 次；
[0044] (5)將吸附柱放回收集管中，13200rpm/min，離心2min，倒掉廢液；將吸附柱置于 室溫數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的乙醇；將吸附柱轉入一個干凈的離心管中，向吸 附膜的中間位置懸空滴加100 μ L的洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5min，13200rpm/min，離心 2min，所得溶液即為DNA。
[0045] 三、兩種方法提取DNA的實時熒光PCR擴增檢測試驗：
[0046] 1、PCR反應體系組成：
[0047] 2XPremix Ex Taq(Probe qPCR)10yL，上游和下游引物 ΙΟμ mol/L 各 lyL，探 針10 μ mol/L，0· 4 μ L，供試生鮮羊肉基因組DNA模板，濃度50ng/ μ L，2 μ L，雙蒸水補足 20 μ L ；
[0048] 2、PCR反應程序：
[0049] 95°C預變性 15min ;45 個擴增循環(huán)（95°C，20sec ;62°C，30sec);
[0050] 3、PCR擴增結果：
[0051] 對兩種方法提取的DNA，分別進行羊源性成分鑒定引物0A-PRLP、AF041979的實時 熒光PCR擴增，結果見附圖1，2。結果顯示，兩種方法提取DNA的擴增結果是基本一致的。
[0052] 本發(fā)明與傳統(tǒng)技術相比具有的積極效果在于：
[0053] (1)傳統(tǒng)DNA提取操作步驟多、復雜、費時。需要經(jīng)過裂解、抽提等多個步驟，同時 需要在多個離心管之間相互轉移樣本，增加了對樣本間交叉污染的可能性。另外，氯仿等有 機溶劑對人體有害。而本發(fā)明的DNA提取方法過程簡便，同時無需使用有毒有機溶劑，對人 體和環(huán)境都不會造成危害。
[0054] (2)本方法最大的優(yōu)點在于其過程快速，簡便，安全無毒，充分提高了動物源性成 分鑒定的檢測效率。與傳統(tǒng)的提取過程需要數(shù)小時至過夜相比，采用本方法，2小時就可以 完成樣本DNA提取的全過程。
[0055] (3)采用本發(fā)明的快速提取樣本DNA的方法所得到的DNA經(jīng)實時熒光PCR檢測實 驗，證實與傳統(tǒng)方法得到的DNA基本一致，完全可以采用此方法替代復雜、費時的傳統(tǒng)SDS 法，從而大大節(jié)省了時間。
【附圖說明】：
[0056] 圖1為羊源性成分鑒定引物0A-PRLP的實時熒光PCR擴增圖譜；如圖標注分別為 生鮮羊肉（傳統(tǒng) SDS法）；生鮮羊肉（本發(fā)明方法）；對照樣本；
[0057] 圖2為羊源性成分鑒定引物AF041979的實時熒光PCR擴增圖譜；如圖標注分別為 生鮮羊肉（傳統(tǒng) SDS法）；生鮮羊肉（本發(fā)明方法）；對照樣本；
[0058] 圖3為牛源性成分鑒定引物Rdl的實時熒光PCR擴增圖譜；如圖標注分別為生鮮 牛肉（傳統(tǒng)SDS法）；生鮮牛肉（本發(fā)明方法）；；
[0059] 圖4為豬源性成分鑒定引物Sus-ACTB的實時熒光PCR擴增圖譜；如圖標注分別為 生鮮豬肉（傳統(tǒng)SDS法）；生鮮豬肉（本發(fā)明方法）；對照樣本；
[0060] 圖5為雞源性成分鑒定引物Chick的實時熒光PCR擴增圖譜；如圖標注分別為生 鮮雞肉（傳統(tǒng)SDS法）；生鮮雞肉（本發(fā)明方法）；對照樣本；
[0061] 圖6為羊源性成分鑒定引物Duck的實時熒光PCR擴增圖譜；如圖標注分別為生鮮 鴨肉（傳統(tǒng)SDS法）；生鮮鴨肉（本發(fā)明方法）；對照樣本。
【具體實施方式】
[0062] 為了能更加清楚的說明本發(fā)明的方法，下面結合實施例對本發(fā)明做進一步的描 述。
[0063] 實施例1
[0064] 以生鮮牛肉為樣本，采用本發(fā)明方法快速提取DNA。制備方法如下：
[0065] (1)取待測動物肌肉組織樣本清水洗凈后，剔去動物組織中的結締組織和脂肪，剪 成約200mg的小塊，放入用液氮預冷的研缽中，然后緩緩的向研缽中加入液氮，迅速研磨， 直到樣品成細微的粉末狀為止，取l〇〇mg加入2mL滅菌離心管中；
[0066] (2)加入500 μ L SDS裂解液和6 μ L蛋白酶K，65°C水浴60min，期間不停顛倒混 勻；
[0067] (3)水浴后13200rpm/min，離心5min ;小心地將上層水相轉入一個新的離心管中， 加入0. 8倍異丙醇；將混勻的液體轉入吸附柱中，13200rpm/min，離心30s，棄掉廢液；
[0068] (4)向吸附柱中加入70%乙醇，13200rpm/min，離心30s，棄掉廢液，重復此步驟一 次；
[0069] (5)將吸附柱放回收集管中，13200rpm/min，離心2min，倒掉廢液；將吸附柱置于 室溫數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的乙醇；將吸附柱轉入一個干凈的離心管中，向吸 附膜的中間位置懸空滴加100 μ L的洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5min，13200rpm/min，離心 2min，所得溶液即為DNA。
[0070] 實時熒光PCR檢測：
[0071] 1、對牛源性成分鑒定引物Rdl進行實時熒光PCR擴增，引物序列為：
[0072] Rdl-F :5'-GTAGGTGCACAGTACGTTCTGAAG-3'
[0073] Rdl-R :5'-GGCCAGACTGGGCACATG-3'
[0074] Rdl-P :5'-R0X-CGGCACACTCGGCTGTGTTCCTTGC-BHQ1-3'
[0075] 2、反應體系：
[0076] 2XPremix Ex Taq(Probe qPCR)10yL，上游和下游引物 ΙΟμ mol/L 各 lyL，探 針10 μ mol/L，0· 4 μ L，供試生鮮牛肉基因組DNA模板，濃度50ng/ μ L，2 μ L，雙蒸水補足 20 μ L〇
[0077] 3、反應程序：
[0078] 95°C預變性 15min ;45 個擴增循環(huán)（95°C，20sec ;62°C，30sec);
[0079] 4、結果：生鮮牛肉實時熒光PCR擴增結果見圖3。
[0080] 實施例2
[0081] 以生鮮豬肉為樣本，采用本發(fā)明方法快速提取DNA。制備方法如下：
[0082] (1)取待測動物肌肉組織樣本清水洗凈后，剔去動物組織中的結締組織和脂肪，剪 成約200mg的小塊，放入用液氮預冷的研缽中，然后緩緩的向研缽中加入液氮，迅速研磨， 直到樣品成細微的粉末狀為止，取l〇〇mg加入2mL滅菌離心管中；
[0083] (2)加入500 μ L SDS裂解液和6 μ L蛋白酶K，65°C水浴60min，期間不停顛倒混 勻；
[0084] (3)水浴后13200rpm/min，離心5min ;小心地將上層水相轉入一個新的離心管中， 加入0. 8倍異丙醇；將混勻的液體轉入吸附柱中，13200rpm/min，離心30s，棄掉廢液；
[0085] (4)向吸附柱中加入70%乙醇，13200rpm/min，離心30s，棄掉廢液，重復此步驟一 次；
[0086] (5)將吸附柱放回收集管中，13200rpm/min，離心2min，倒掉廢液；將吸附柱置于 室溫數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的乙醇；將吸附柱轉入一個干凈的離心管中，向吸 附膜的中間位置懸空滴加100 μ L的洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5min，13200rpm/min，離心 2min，所得溶液即為DNA。
[0087] 實時熒光PCR檢測：
[0088] 1、對豬源性成分鑒定引物Sus-ACTB進行實時熒光PCR擴增，引物序列為：
[0089] Sus-ACTB-F :5'-GGAGTGTGTATCCCGTAGGTG-3'
[0090] Sus-ACTB-R :5'-CTGGGGACATGCAGAGAGTG-3'
[0091] Sus-ACTB-P :5'-J0E-TCTGACGTGACTCCCCGACCTGG-BHQ1-3'
[0092] 2、反應體系：
[0093] 2XPremix Ex Taq(Probe qPCR)10yL，上游和下游引物 ΙΟμ mol/L 各 lyL，探 針10 μ mol/L，0. 4 μ L，供試生鮮豬肉基因組DNA模板，濃度50ng/ μ L，2 μ L，雙蒸水補足 20 μ L〇
[0094] 3、反應程序：
[0095] 95°C預變性 15min ;45 個擴增循環(huán)（95°C，20sec ;62°C，30sec);
[0096] 4、結果：生鮮豬肉實時熒光PCR擴增結果見圖4。
[0097] 實施例3
[0098] 以生鮮雞肉為樣本，采用本發(fā)明方法快速提取DNA。制備方法如下：
[0099] (1)取待測動物肌肉組織樣本清水洗凈后，剔去動物組織中的結締組織和脂肪，剪 成約200mg的小塊，放入用液氮預冷的研缽中，然后緩緩的向研缽中加入液氮，迅速研磨， 直到樣品成細微的粉末狀為止，取l〇〇mg加入2mL滅菌離心管中；
[0100] (2)加入500 μ L SDS裂解液和6 μ L蛋白酶K，65°C水浴60min，期間不停顛倒混 勻；
[0101] (3)水浴后13200rpm/min，離心5min ;小心地將上層水相轉入一個新的離心管中， 加入0. 8倍異丙醇；將混勻的液體轉入吸附柱中，13200rpm/min，離心30s，棄掉廢液；
[0102] (4)向吸附柱中加入70%乙醇，13200rpm/min，離心30s，棄掉廢液，重復此步驟一 次；
[0103] (5)將吸附柱放回收集管中，13200rpm/min，離心2min，倒掉廢液；將吸附柱置于 室溫數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的乙醇；將吸附柱轉入一個干凈的離心管中，向吸 附膜的中間位置懸空滴加100 μ L的洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5min，13200rpm/min，離心 2min，所得溶液即為DNA。
[0104] 實時熒光PCR檢測：
[0105] 1、對雞源性成分鑒定引物Chiken進行實時熒光PCR擴增，引物序列為：
[0106] Chiken-F :5' -CCCTCCTCCTTTCATCCTCAT-3'
[0107] Chiken-R :5'-GTCATAGCGGAACCGTGGATA-3'
[0108] Chiken-P :5'-FAM-CTATGAATCCGGGCCTC-TAMRA-3'
[0109] 2、反應體系：
[0110] 2XPremix Ex Taq(Probe qPCR)10yL，上游和下游引物 lOymol/L 各 lyL，探 針10 μ mol/L，0. 4 μ L，供試生鮮雞肉基因組DNA模板，濃度50ng/ μ L，2 μ L，雙蒸水補足 20 μ L〇
[0111] 3、反應程序：
[0112] 95°C預變性 15min ;45 個擴增循環(huán)（95°C，20sec ;62°C，30sec);
[0113] 4、結果：生鮮雞肉實時熒光PCR擴增結果見圖5。
[0114] 實施例4
[0115] 以生鮮鴨肉為樣本，采用本發(fā)明方法快速提取DNA。制備方法如下：
[0116] (1)取待測動物肌肉組織樣本清水洗凈后，剔去動物組織中的結締組織和脂肪，剪 成約200mg的小塊，放入用液氮預冷的研缽中，然后緩緩的向研缽中加入液氮，迅速研磨， 直到樣品成細微的粉末狀為止，取l〇〇mg加入2mL滅菌離心管中；
[0117] (2)加入500 μ L SDS裂解液和6 μ L蛋白酶K，65°C水浴60min，期間不停顛倒混 勻；
[0118] (3)水浴后13200rpm/min，離心5min ;小心地將上層水相轉入一個新的離心管中， 加入0. 8倍異丙醇；將混勻的液體轉入吸附柱中，13200rpm/min，離心30s，棄掉廢液；
[0119] (4)向吸附柱中加入70%乙醇，13200rpm/min，離心30s，棄掉廢液，重復此步驟一 次；
[0120] (5)將吸附柱放回收集管中，13200rpm/min，離心2min，倒掉廢液；將吸附柱置于 室溫數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的乙醇；將吸附柱轉入一個干凈的離心管中，向吸 附膜的中間位置懸空滴加100 μ L的洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5min，13200rpm/min，離心 2min，所得溶液即為DNA。
[0121] 實時熒光PCR檢測：
[0122] 1、對鴨源性成分鑒定引物Duck進行實時熒光PCR擴增，引物序列為：
[0123] Duck-F : 5'-AAGCCTTCCTCTAGCTCAGC-3'
[0124] Duck-R : 5'-AGAAAATGCTTTAGTTAAGTC-3'
[0125] Duck-P : 5' -FAM-CTCAGCCGCTTAAACAACGC-TAMRA-3'
[0126] 2、反應體系：
[0127] 2XPremix Ex Taq(Probe qPCR)10yL，上游和下游引物 ΙΟμ mol/L 各 lyL，探 針10 μ mol/L，0· 4 μ L，供試生鮮鴨肉基因組DNA模板，濃度50ng/ μ L，2 μ L，雙蒸水補足 20 μ L〇
[0128] 3、反應程序：
[0129] 95°C預變性 15min ;45 個擴增循環(huán)（95°C，20sec ;62°C，30sec);
[0130] 4、結果：生鮮鴨肉實時熒光PCR擴增結果見圖6。擴增結果。
【主權項】
1. 一種高效安全提取動物肌肉組織DNA的方法，其特征在于它按如下步驟進行： (1) 取待測動物肌肉組織樣本清水洗凈后，剔去動物組織中的結締組織和脂肪，剪成約 200mg的小塊，放入用液氮預冷的研缽中，然后緩緩的向研缽中加入液氮，迅速研磨，直到樣 品成細微的粉末狀為止，取lOOmg加入2mL滅菌離心管中； (2) 加入500 μ L SDS裂解液和6 μ L蛋白酶K，65°C水浴60min，期間不停顛倒混勻； (3) 水浴后13200rpm/min，離心5min ;小心地將上層水相轉入一個新的離心管中，加入 〇. 8倍異丙醇；將混勻的液體轉入吸附柱中，13200rpm/min，離心30s，棄掉廢液； (4) 向吸附柱中加入70%乙醇，13200rpm/min，離心30s，棄掉廢液，重復此步驟一次； (5) 將吸附柱放回收集管中，13200rpm/min，離心2min，倒掉廢液；將吸附柱置于室溫 數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的乙醇；將吸附柱轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜 的中間位置懸空滴加100 μ L的洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5min，13200rpm/min，離心2min， 所得溶液即為DNA。2. 如權利要求1所述的提取方法，其中所述的待測樣本為動物肌肉組織樣品包括豬 肉、羊肉、牛肉和雞肉等各類動物樣品。3. 如權利要求1所述的提取方法，其中所述的SDS裂解液濃度為10%，加入量為 500 μ L ;恒溫水浴溫度為65°C，時間為lh。4. 如權利要求1所述的方法，其中所述的與水相結合的異丙醇體積為吸取水相體積的 0. 8 倍。
【文檔編號】C12N15/10GK105985948SQ201510090584
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月28日
【發(fā)明人】趙新, 王永, 蘭青闊, 陳銳, 朱珠
【申請人】天津市農(nóng)業(yè)質量標準與檢測技術研究所