用于高gc含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng)試劑及其應(yīng)用、試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于高GC含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng)試劑和其應(yīng)用以及一種試劑盒。本發(fā)明用于高GC含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng)試劑包含的組分有：Tris?HCl 20~50 mmol/L、乙酸鉀 3~5 mmol/L、乙酸鎂 2~4 mmol/L、二甲基亞砜 5~10V/V %、牛血清白蛋白 30~80 mg/L、NP?40 0.003~0.01V/V %、Tween20 0.003~0.01V/V %、甜菜堿1.0~1.5 mol/L。本發(fā)明試劑盒包括根據(jù)靶基因設(shè)計(jì)的引物和本發(fā)明用于高GC含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng)試劑。本發(fā)明反應(yīng)試劑和試劑盒對高GC含量的基因組擴(kuò)增產(chǎn)物特異性高、條帶單一。
【專利說明】用于高GC含量的基因組擴(kuò)増反應(yīng)試劑及其應(yīng)用、試劑盒
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體的涉及一種用于高GC含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng) 試劑、含有所述高GC含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng)試劑的試劑盒及用于高GC含量的基因組擴(kuò)增反 應(yīng)試劑的應(yīng)用。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004] 聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)是由K.Mullis在 1985年發(fā)明 的，是一種體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。PCR能夠模擬DNA體內(nèi)復(fù)制的過程，以原始的DNA為模板，在聚 合酶和特異性引物、dNTPs及緩沖體系的協(xié)同作用下，通過變性、退火、延伸3個(gè)步驟，數(shù)小時(shí) 內(nèi)將微量的目的基因片段進(jìn)行富集放大，在合適的條件下能夠放大到百萬倍。極大的方便 了人類獲取微量DNA進(jìn)行研究，提高了效率。PCR應(yīng)用已經(jīng)深入多個(gè)研究領(lǐng)域，例如基因克隆 與表達(dá)、DNA測序、基因檢測、基因改造等。隨著PCR技術(shù)的進(jìn)步、應(yīng)用的推廣，也面臨著一些 新的問題。例如針對一些高GC含量的靶基因，PCR擴(kuò)增多數(shù)情況下得不到理想的結(jié)果，不是 特異性差而導(dǎo)致得到的不是目的基因，就是靈敏度差導(dǎo)致得到的量很少。相對于A、T之間形 成的2對氫鍵而言，G、C之間能夠形成三對氫鍵，解鏈所需的能值較高，DNA雙鏈比較難以打 開，并且模板中容易形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)阻止DNA聚合酶在模板DNA鏈上的延伸，從而導(dǎo)致 擴(kuò)增失敗。
[0005] 有研究報(bào)道一些PCR添加劑能夠不同程度的改善高GC含量的基因組PCR擴(kuò)增，例如 甜菜堿、甘油、DMS0、甲酰胺等，還有一些有機(jī)溶劑，例如1、2丙二醇、乙二醇等。自從1993年， Rees.W.A.等首次報(bào)道甜菜堿能夠降低DNA的Tm值之后，甜菜堿就被廣泛應(yīng)用于各種PCR中， 主要起兩個(gè)方面的作用：一是能夠與雙螺旋DNA中的大小溝結(jié)合，便于二級(jí)結(jié)構(gòu)的打開，保 證擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行;二是作為一種中性物質(zhì)，對DNA聚合酶具有保護(hù)作用，且能夠減少PCR擴(kuò) 增過程中的彌撒問題。DMS0作為一種PCR添加劑，很早就用于改善優(yōu)化PCR條件，其本質(zhì)是破 壞DNA的氫鍵結(jié)構(gòu)，促使DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)能夠很好的打開，提高PCR的特異性。同時(shí)研究表明 過高的DMS0濃度能夠影響DNA聚合酶的活性，進(jìn)而抑制PCR反應(yīng)。有機(jī)溶劑也在不同程度上 影響PCR的反應(yīng)過程，具有一定的改善作用，但鑒于有機(jī)溶劑需要單獨(dú)添加，由于其本身的 粘性，會(huì)出現(xiàn)最終的用量不是特別精準(zhǔn)，同時(shí)絕大多數(shù)有機(jī)溶劑都對人體有害，使用起來有 所不便。因此，現(xiàn)有用于改善高GC含量的基因組PCR擴(kuò)增添加劑存在抑制PCR反應(yīng)，用量難控 制和特異性與靈敏性不理想的問題。
[0006]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種用于高GC含量的基因組擴(kuò) 增反應(yīng)試劑，旨在解決現(xiàn)有用于高GC含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng)試劑在抑制PCR反應(yīng)，用量難控 制和特異性與靈敏性不理想的技術(shù)問題。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供一種用于高GC含量的基因組擴(kuò)增的試劑盒和高GC含量 的基因組擴(kuò)增方法，旨在解決現(xiàn)有高GC含量的基因組PCR擴(kuò)增效果不理想的技術(shù)問題。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，作為本發(fā)明的一方面，提供了一種用于高GC含量的基因 組擴(kuò)增反應(yīng)試劑。所述用于高GC含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng)試劑含有如下組分： Tris-HCl 20-50 mmol/L 乙酸鐘 3~5 mmol/L 乙酸儀 2~4 mmol/L 二甲基亞砜 5~10V/V % 牛血清白蛋白30~80 mg/L NP-40 0.003-0.01V/V % Tween20 0.003-0.01V/V % 甜菜喊 1·0~1·5 mol/L。
[0010] 作為本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于高GC含量的基因組擴(kuò)增的試劑盒。所述 試劑盒包括根據(jù)靶基因設(shè)計(jì)的引物，還包括本發(fā)明所述的用于高GC含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng) 試劑。
[0011] 作為本發(fā)明的又一方面，提供了一種高GC含量的基因組擴(kuò)增方法，包括如下步驟： 將模板DNA在PCR反應(yīng)試劑中進(jìn)行PCR反應(yīng);其中，所述PCR反應(yīng)試劑中含有根據(jù)靶基因 設(shè)計(jì)的引物和權(quán)利要求1所述的用于高GC含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng)試劑。
[0012] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明用于高GC含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng)試劑通過所含的 組分之間的協(xié)效作用，具有以下有益技術(shù)效果： (1) 本發(fā)明用于高GC含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng)試劑能夠擴(kuò)增模板GC含量高達(dá)82%，甚至更 尚，可用于臨床基因檢測中尚GC位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增； (2) 適應(yīng)范圍廣，針對市場上不同的商業(yè)化PCR試劑盒，可以直接協(xié)同反應(yīng)； (3) 可以采用統(tǒng)一的PCR擴(kuò)增條件能夠?qū)Σ煌珿C含量、不同長度大小、不同引物對進(jìn)行 擴(kuò)增； (4) 用于高GC含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng)試劑擴(kuò)增的產(chǎn)物特異性高、條帶單一，可以直接用 于后續(xù)的測序反應(yīng)及其他分子實(shí)驗(yàn)或者臨床檢測。
[0013] 本發(fā)明用于高GC含量的基因組擴(kuò)增的試劑盒由于含有本發(fā)明用于高GC含量的基 因組擴(kuò)增反應(yīng)試劑，因此，其能夠擴(kuò)增模板GC含量高達(dá)82%，甚至更高，可用于臨床基因檢測 中高GC位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增;能夠針對不同GC含量、不同長度大小、不同引物對采用統(tǒng)一的PCR擴(kuò) 增條件進(jìn)行擴(kuò)增;本發(fā)明試劑盒擴(kuò)增的產(chǎn)物特異性高、條帶單一，可以直接用于后續(xù)的測序 反應(yīng)及其他分子實(shí)驗(yàn)或者臨床檢測。
[0014] 本發(fā)明高GC含量的基因組擴(kuò)增方法采用含有本發(fā)明用于高GC含量的基因組擴(kuò)增 反應(yīng)試劑的PCR反應(yīng)試劑進(jìn)行PCR反應(yīng)，能夠?qū)C含量高達(dá)82%，甚至更高的擴(kuò)增模板進(jìn)行擴(kuò) 增，并使得擴(kuò)增的產(chǎn)物特異性高、條帶單一;而且能夠針對不同GC含量、不同長度大小、不同 引物對采用統(tǒng)一的PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增，使得本發(fā)明方法工藝相對簡單，提高擴(kuò)增的效 率。
[0015]
【附圖說明】
[0016] 圖1為本發(fā)明實(shí)施案例31中按照程序1進(jìn)行的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；其中Marker的 大小為200(^?、100(^?、80(^?、60(^?、40(^?、20(^? ;膠孔從左到右依次為^?(^、？1^(：、 rsl99726272、PLCB3、Marker、notch3-33FlRl、rs45470261、rs572346021、notch3-33FR、 notch3-10FlRl； 圖2為本發(fā)明實(shí)施案例31中按照程序2進(jìn)行的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；其中Marker的大小 為200(^口、100(^口、80(^口、60(^口、40(^口、20(^口；膠孔從左到右依次為：4?(^、？1^(：、 rsl99726272、PLCB3、Marker、notch3-33F2R2、rs572346021、notch3-33FlRl、rs45470261、 notch3-10FlRl； 圖3為本發(fā)明實(shí)施案例31-33中相應(yīng)的序列測序結(jié)果； 圖4為本發(fā)明實(shí)施案例31-33中相應(yīng)的序列測序結(jié)果。
[0017]
【具體實(shí)施方式】
[0018] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對 本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不 用于限定本發(fā)明。
[0019] 本發(fā)明實(shí)施例說明書中所提到的體積份數(shù)不僅僅可以指代各組分的體積比例關(guān) 系，也可以表示各組具體體積含量，因此，只要是按照本發(fā)明實(shí)施例說明書組合物各組分的 體積份數(shù)按比例放大或縮小均在本發(fā)明實(shí)施例說明書公開的范圍之內(nèi)。具體地，本發(fā)明實(shí) 施例說明書中所述的體積份數(shù)可以是μ 1、L等生化領(lǐng)域公知的體積單位。
[0020]與本發(fā)明相關(guān)關(guān)鍵詞的解釋： Tris-HCl: Tr is (hydroxymethyl )ami nomethane，三（輕甲基）氨基甲燒，分子式為 C4HiiN03 DMSO:Dimethyl sulfoxide，二甲基亞砜，一種含硫有機(jī)化合物，分子式為(CH3)2S0 Betaine:甜菜堿 NP-40:裂解液（NP-40 Lysis Buffer) Tween20:吐溫 20 BSA:牛血清白蛋白 dNTP:deoxy_ribonucleoside triphosphate,脫氧核糖核苷三磷酸。
[0021] -方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種用于高GC含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng)試劑。所述用 于高GC含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng)試劑包含如下組分： Tris-HCl 20-50 mmol/L 乙酸鉀(K0AC) 3~5 mmol/L 乙酸儀(Mg(0AC)2) 2~4 mmol/L 二甲基亞砜(DMSO) 5-10V/V % 牛血清白蛋白（BSA) 30~80 mg/L NP-40 0.003-0.01V/V % Tween20 0.003-0.01V/V % 甜菜喊（Betaine) 1.0~1.5 mol/L〇
[0022]這樣，本發(fā)明實(shí)施例用于高GC含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng)試劑通過所含的組分之間的 協(xié)效作用，使得其能夠擴(kuò)增模板GC含量高達(dá)82%，甚至更高;能夠針對不同GC含量、不同長度 大小、不同引物對采用統(tǒng)一的PCR擴(kuò)增條件擴(kuò)增，且使得擴(kuò)增產(chǎn)物特異性高、條帶單一，可以 直接用于后續(xù)的測序反應(yīng)及其他分子實(shí)驗(yàn)或者臨床檢測。具體地，一定濃度的DMS0可以破 壞DNA的氫鍵，促使DNA雙鏈進(jìn)行解鏈，配合使用一定濃度的甜菜堿能夠有效保護(hù)DNA聚合酶 的活性，最大程度的減少由于DMS0帶來的DNA聚合酶活性的降低。從而達(dá)到成功擴(kuò)增的效 果。
[0023] 在一具體實(shí)施例中，該Tris-HCl可以選用pH為9.0的Tris-HCl。在一些具體實(shí)施例 中，在含量可以是 20mmol/L、22mmol/L、25mmol/L、26mmol/L、28mmol/L、33mmol/L、36mmol/ T,.38mmo1 /T,.40mmo1 /T,.42mmo1 /T,.44mmo1 /T,.46mmo1 /T,.48mmo1 /1,.50 mmol/L等濃度。
[0024] 在一些具體實(shí)施例中，乙酸鉀的含量可以是3mmol/L、4mmol/L、5 mmol/L等濃 度。
[0025] 在一些具體實(shí)施例中，乙酸鎂的含量可以是2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L等濃度。
[0026] 在一些具體實(shí)施例中，二甲基亞砜的含量可以是5V/V%、6V/V %、7V/V %、8V/V %、 9V/V %、10V/V %等體積百分比含量。
[0027] 在一些具體實(shí)施例中，牛血清白蛋白的含量可以是30mg/L、35mg/L、40mg/L、45mg/ L、50mg/L、55mg/L、60mg/L、65mg/L、70mg/L、75mg/L、80mg/L 等濃度。
[0028] 在一些具體實(shí)施例中，NP-40和Tween20的含量可以相同的不相同是0.003V/V%、 0.004V/V %、0.005V/V %、0.006V/V %、0.007V/V %、0.008V/V %、0.009V/V %、0.01V/V %等 體積百分比含量。
[0029] 在一些具體實(shí)施例中，甜菜堿的含量可以是1 mol/L、l.lmol/L、1.2mol/L、 1 · 3mol/L、1 · 4mol/L、1 · 5mol/L 等濃度。
[0030] 通過對上述各成分的濃度進(jìn)行調(diào)節(jié)，能夠優(yōu)化組分之間的協(xié)效作用，從而提高本 發(fā)明實(shí)施例用于高GC含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng)試劑對高GC含量的基因組進(jìn)行擴(kuò)增，并擴(kuò)增產(chǎn) 物特異性高、條帶單一。
[0031] 另一方面，在上文用于高GC含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng)試劑的基礎(chǔ)上，本發(fā)明實(shí)施例 還提供了一種用于高GC含量的基因組擴(kuò)增的試劑盒。所述試劑盒除了可以包含現(xiàn)有PCR所 有的試劑，還必須包含有上文所述的本發(fā)明實(shí)施例用于高GC含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng)試劑。 在一實(shí)施例中，該用于高GC含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng)試劑可以與試劑盒中的其他試劑分開保 存放置，待擴(kuò)增時(shí)在按照比例要求進(jìn)行混合處理;也可以與試劑盒中的其他試劑按照一定 的比例進(jìn)行混合，形成混合試劑，在擴(kuò)增時(shí)直接使用。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明實(shí)施例用于 高GC含量的基因組擴(kuò)增的試劑盒中所含量的上文本發(fā)明實(shí)施例用于高GC含量的基因組擴(kuò) 增反應(yīng)試劑的量可以根據(jù)擴(kuò)增的次數(shù)以及每次擴(kuò)增所需要的用量靈活控制 在進(jìn)一步實(shí)施例中，本發(fā)明實(shí)施例試劑盒所含的還包括PCR buffer、dNTPs、DNA聚合酶 和滅菌超純水試劑中的至少一種等PCR試劑。該些PCR試劑也可以分開保存放置，待擴(kuò)增時(shí) 在按照比例要求進(jìn)行混合處理;也可以按照一定的比例進(jìn)行混合，形成混合試劑，在擴(kuò)增時(shí) 直接使用。在具體實(shí)施例中，所述DNA聚合酶為Taq酶。
[0032] 由于本發(fā)明實(shí)施例用于高GC含量的基因組擴(kuò)增的試劑盒含有上文本發(fā)明實(shí)施例 用于高GC含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng)試劑，因此，其能夠擴(kuò)增模板GC含量高達(dá)82%，甚至更高，可 用于臨床基因檢測中高GC位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增;能夠針對不同GC含量、不同長度大小、不同引物 對采用統(tǒng)一的PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增;本發(fā)明試劑盒擴(kuò)增的產(chǎn)物特異性高、條帶單一，可以 直接用于后續(xù)的測序反應(yīng)及其他分子實(shí)驗(yàn)或者臨床檢測。
[0033] 又一方面，在上文用于高GC含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng)試劑的基礎(chǔ)上，本發(fā)明實(shí)施例 還提供了一種高GC含量的基因組擴(kuò)增方法。該擴(kuò)增方法包括如下步驟： 將模板DNA在PCR反應(yīng)試劑中進(jìn)行PCR反應(yīng);其中，所述PCR反應(yīng)試劑中含有根據(jù)靶基因 設(shè)計(jì)的引物和權(quán)利要求1所述的用于高GC含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng)試劑。
[0034]其中，模板DNA可以根據(jù)待擴(kuò)增的目的DNA進(jìn)行臨時(shí)提取，如采用美國OMEGA公司的 試劑盒D3392-01從含有目標(biāo)DNA原材中進(jìn)行提取。另外，該模板DNA可以是任何希望擴(kuò)增的 目的DNA，尤其是高GC含量的DNA。在具體實(shí)施例中，該模板DNA可以是含有rs545470261; rs572346201兩個(gè)SNP位點(diǎn)的人F0XC1基因、含有外顯子33、外顯子10的人notch3基因片段、 含有rs7412、rs429358 SNP位點(diǎn)的ΑΡ0Ε基因、PLEC基因中的部分序列、PLCB3基因組的部分 序列、含有rs 199726272 SNP位點(diǎn)的0BSCN基因等。
[0035] 由于是進(jìn)行PCR反應(yīng)，因此，本發(fā)明實(shí)施例方法中所用的PCR反應(yīng)試劑應(yīng)當(dāng)理解成 必須包含有能夠?qū)崿F(xiàn)PCR反應(yīng)的常規(guī)試劑，如根據(jù)靶基因設(shè)計(jì)的引物、PCR buffer、dNTPs、 DNA聚合酶和滅菌超純水試劑中的至少一種。除了PCR反應(yīng)試劑必須包含有能夠?qū)崿F(xiàn)PCR反 應(yīng)的常規(guī)試劑之外，在本發(fā)明實(shí)施例中，該P(yáng)CR反應(yīng)試劑還必須包含有上文所述的本發(fā)明實(shí) 施例用于高GC含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng)試劑。由于該用于高GC含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng)試劑的 存在，該用于高GC含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng)試劑與PCR反應(yīng)的其他試劑作用，從而使得本發(fā) 明實(shí)施例方法能夠?qū)C含量高達(dá)82%，甚至更高的擴(kuò)增模板進(jìn)行擴(kuò)增，并使得擴(kuò)增的產(chǎn)物特 異性高、條帶單一;而且能夠針對不同GC含量、不同長度大小、不同引物對采用統(tǒng)一的PCR擴(kuò) 增條件進(jìn)行擴(kuò)增，使得本發(fā)明方法工藝相對簡單，提高擴(kuò)增的效率。
[0036] 在一實(shí)施例中，本發(fā)明實(shí)施例方法中的PCR反應(yīng)試劑與所述模板DNA構(gòu)成PCR擴(kuò)增 體系，以所述PCR擴(kuò)增體系總體積為20體積份數(shù)計(jì)，所述PCR擴(kuò)增體系如下： 10XPCR buffer 2.0體積份數(shù) 10mM dNTPs 0.2體積份數(shù) 5 μ mol/L上引物 1.0體積份數(shù) 5 μ mol/L下引物 1.0體積份數(shù) 模板DNA 1.0體積份數(shù) DNA聚合酶 0.2體積份數(shù) 本發(fā)明實(shí)施例用于高GC含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng)試劑10體積份數(shù) 滅菌超純水 補(bǔ)足至20體積份數(shù)。
[0037]在進(jìn)一步具體實(shí)施例中，PCR擴(kuò)增體系所含的所述DNA聚合酶為Taq酶。
[0038]通過控制PCR擴(kuò)增體系各組分的濃度，從而能夠優(yōu)化組分之間的協(xié)效作用，從而提 高本發(fā)明實(shí)施例用于高GC含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng)試劑對高GC含量的基因組進(jìn)行擴(kuò)增，并擴(kuò) 增產(chǎn)物特異性高、條帶單一，且能夠針對不同GC含量、不同長度大小、不同引物對采用統(tǒng)一 的PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增，使得本發(fā)明方法工藝相對簡單，提高擴(kuò)增的效率。
[0039] 在一實(shí)施例中，所述PCR反應(yīng)的反應(yīng)程序?yàn)橄率龇磻?yīng)程序一： 95°C熱啟動(dòng)5min，l個(gè)循環(huán)； 94°C變性30s s，63~65°C退火30~45s s，72°C延伸60s，10個(gè)循環(huán)； 94°C變性30s s，58~60°C退火30~45s s，72°C延伸60s，10個(gè)循環(huán)； 94°C變性30s，55°C退火30~45s s，72°C延伸60s，10個(gè)循環(huán)； 94°C變性30s，52°C退火30~45s s，72°C延伸60，10個(gè)循環(huán)； 72°C延伸7min，16°C結(jié)束PCR反應(yīng)； 在一具體實(shí)施例中，上述PCR反應(yīng)的反應(yīng)程序一如下： 95°C熱啟動(dòng)5min，l個(gè)循環(huán)； 94°C變性30s，65 °C退火30s，72 °C延伸60s，10個(gè)循環(huán)； 94 °C變性30s，60 °C退火30s，72 °C延伸60s，10個(gè)循環(huán)； 94°(：變性3〇8,55°(：退火3〇8,72°(：延伸6〇8，10個(gè)循環(huán)； 94 °C變性30s，52 °C退火30s，72 °C延伸60s，9個(gè)循環(huán)； 72°C延伸7 min，16°C結(jié)束PCR反應(yīng)； 在另一實(shí)施例中，上述PCR反應(yīng)的反應(yīng)程序?yàn)橄率龇磻?yīng)程序二進(jìn)行擴(kuò)增： 95°C熱啟動(dòng)5min，l個(gè)循環(huán)； 94 °C變性30s，69~70 °C退火30~45s，72 °C延伸60s，5個(gè)循環(huán)； 94 °C變性30s，66~68 °C退火30~45s，72 °C延伸60s，5個(gè)循環(huán)； 94°C 變性 3〇8,63~65°(：退火30~458,72°(：延伸6〇8，10個(gè)循環(huán)； 94°C 變性 308,58~60°(：退火30~458,72°(：延伸608，10個(gè)循環(huán)； 94 °C變性30s，50~55 °C退火30~45s，72 °C延伸60s，9個(gè)循環(huán)； 72°C延伸7 min，16°C結(jié)束PCR反應(yīng)。
[0040] 在一具體實(shí)施例中，上述PCR反應(yīng)的反應(yīng)程序二如下： 95°C熱啟動(dòng)5min，l個(gè)循環(huán)； 94°C變性30s，°C退火30s，72°C延伸60s，5個(gè)循環(huán)； 94 °C變性30s，68 °C退火30s，72 °C延伸60s，5個(gè)循環(huán)； 94°(：變性3〇8,65°(：退火3〇8,72°(：延伸6〇8，10個(gè)循環(huán)； 94 °C變性30s，60 °C退火30s，72 °C延伸60s，10個(gè)循環(huán)； 94 °C變性30s，55 °C退火30s，72 °C延伸60s，9個(gè)循環(huán)； 72°C延伸7 min，16°C結(jié)束PCR反應(yīng)。
[0041 ]在本發(fā)明實(shí)施例方法的PCR擴(kuò)增體系含有用于高GC含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng)試劑的 基礎(chǔ)上，通過對擴(kuò)增程序的優(yōu)化控制，提高用于高GC含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng)試劑所發(fā)揮的 作用，提高對GC含量高達(dá)82%，甚至更高的擴(kuò)增模板進(jìn)行擴(kuò)增的效果，提高擴(kuò)增的產(chǎn)物特異 性高、條帶單一。
[0042] 以下結(jié)合具體實(shí)施例對上述用于高GC含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng)試劑、含有用于高GC 含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng)試劑的試劑盒及高GC含量的基因組擴(kuò)增方法進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0043] 用于高GC含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng)試劑實(shí)施例： 實(shí)施例11 本實(shí)施例提供了一種用于高GC含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng)試劑。所述用于高GC含量的基因 組擴(kuò)增反應(yīng)試劑包含如下組分： Tris-HCl 20-50 mmol/L PH 9.0 乙酸鐘 3~5 mmol/L 乙酸儀 2~4 mmol/L 二甲基亞砜 5-10% V/V % 牛血清白蛋白30~80 mg/L NP-40 0.003-0.01% V/V % Tween20 0.003-0.01%V/V % 甜菜喊 1.0-1.5 mol/L。
[0044] 用于高GC含量的基因組擴(kuò)增的試劑盒實(shí)施例： 實(shí)施例21 在現(xiàn)有的PCR試劑盒中分別增加上述實(shí)施例11的用于高GC含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng)試 劑，形成用于高GC含量的基因組擴(kuò)增的試劑盒。
[0045] 高GC含量的基因組擴(kuò)增方法盒實(shí)施例： 實(shí)施例31 本實(shí)施例31提供一種擴(kuò)增人F0XC1基因中的rs545470261;rs572346201兩個(gè)SNP位點(diǎn)的 方法。
[0046] 1.DNA模板制備 用美國OMEGA公司的試劑盒D3392-01提取人的200μ1血液DNA，得到濃度為55.1ngAil 的DNA，共計(jì) 65μ1 WD260/280 比值為 1.94，0D260/230 的比值為2.1。
[0047] 2.引物設(shè)計(jì) 用rs545470261;rs572346201兩個(gè)SNP上下游各200bp序列為模板，以01igo7.0軟件設(shè) 計(jì)引物，產(chǎn)物擴(kuò)增大小及其GC含量具體如下表1: 表1
3.PCR反應(yīng) PCR擴(kuò)增體系見下表2: 表2
4. PCR擴(kuò)增程序 使用ABI9700 PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序分別按照下述程序1和程序2的程序進(jìn)行擴(kuò) 增： (1) 程序1: 95°C熱啟動(dòng)5min，l個(gè)循環(huán)； 94°C變性30s，65°C退火30s，72°C延伸60s，，10個(gè)循環(huán)； 94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸60s，，10個(gè)循環(huán)； 94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸60s，，10個(gè)循環(huán)； 94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸60s，，9個(gè)循環(huán)； 72°C延伸7 min，16°C結(jié)束PCR反應(yīng)； (2) 程序2: 95°C熱啟動(dòng)5min，l個(gè)循環(huán)； 94°C變性30s，70°C退火 30s，72°c延伸60s，，5個(gè)循環(huán)； 94°C變性30s，68°C退火30s，72°C延伸60s，，5個(gè)循環(huán)； 94°C變性30s，65°C退火30s，72°C延伸60s，，10個(gè)循環(huán)； 94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸60s，，10個(gè)循環(huán)； 94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸60s，，9個(gè)循環(huán)； 72°C延伸7 min，16°C結(jié)束PCR反應(yīng)； 5. 結(jié)果檢測 反應(yīng)結(jié)束后，取5yL反應(yīng)產(chǎn)物，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳結(jié)果如圖1、2所示。其中， 圖1是按照程序1的擴(kuò)增電泳圖。具體在圖1中的Marker的大小為2000bp、1000bp、800bp、 60(^?、40(^?、20(^?;膠孔從左到右依次為^?(^、？1^(：、18199726272、？^83、]\^46『、 notch3_33FlRl、rs45470261、rs572346021、notch3-33FR、notch3_10FlRl。
[0048] 圖2是按照程序2的擴(kuò)增電泳圖。具體在圖1中的Marker的大小為2000bp、1000bp、 800bp、600bp、400bp、200bp。
[0049] 膠孔從左到右依次為：AP0E、PLEC、rsl99726272、PLCB3、Marker、notch3-33F2R2、 rs572346021、notch3-33FlRl、rs45470261、notch3-10FlRl。
[0050] 6.測序結(jié)果 剩余反應(yīng)產(chǎn)物直接送奧美德諾(北京)基因科技有限公司測序部測序，測序結(jié)果位點(diǎn)附 件序列如圖3、圖4所示。
[0051 ] 實(shí)施案例32: 本實(shí)施例提供一種擴(kuò)增人notch3基因中的外顯子33、外顯子10部分片段。
[0052] 1.DNA模板制備 用美國OMEGA公司的試劑盒D3392-01提取人的200μ1血液DNA，得到濃度為55.1ngAil 的DNA，共計(jì) 65μ1 WD260/280 比值為 1.94，0D260/230 的比值為2.1。
[0053] 2.引物設(shè)計(jì) 用notch3基因的全序列為模板，以01 ig〇7.0軟件設(shè)計(jì)引物，產(chǎn)物擴(kuò)增大小及其GC含量 具體如下表3: 表3
3.PCR反應(yīng) PCR擴(kuò)增體系見下表4: 表4
4. PCR擴(kuò)增程序 使用ABI9700 PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序分別按照下述程序1和程序2的程序進(jìn)行擴(kuò) 增： (1) 程序1: 95°C熱啟動(dòng)5min，l個(gè)循環(huán)； 94°C變性30s，65°C退火30s，72°C延伸60s，，10個(gè)循環(huán)； 94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸60s，，10個(gè)循環(huán)； 94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸60s，，10個(gè)循環(huán)； 94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸60s，，9個(gè)循環(huán)； 72°C延伸7 min，16°C結(jié)束PCR反應(yīng)； (2) 程序2: 95°C熱啟動(dòng)5min，l個(gè)循環(huán)； 94°C變性30s，70°C退火 30s，72°c延伸60s，，5個(gè)循環(huán)； 94°C變性30s，68°C退火30s，72°C延伸60s，，5個(gè)循環(huán)； 94°C變性30s，65°C退火30s，72°C延伸60s，，10個(gè)循環(huán)； 94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸60s，，10個(gè)循環(huán)； 94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸60s，，9個(gè)循環(huán)； 72°C延伸7 min，16°C結(jié)束PCR反應(yīng)； 5. 結(jié)果檢測 反應(yīng)結(jié)束后，取5yL反應(yīng)產(chǎn)物，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，見圖1、2。
[0054] 實(shí)施案例33 本實(shí)施例提供一種檢測人ΑΡ0Ε基因中的rs7412、rs429358 SNP位點(diǎn)；PLEC基因中的部 分序列、PLCB3基因組的部分序列、0BSCN基因中的rsl99726272 SNP位點(diǎn)。
[0055] 1.DNA模板制備 用美國OMEGA公司的試劑盒D3392-01提取人的200μ1血液DNA，得到濃度為55.1ngAil 的DNA，共計(jì) 65μ1 WD260/280 比值為 1.94，0D260/230 的比值為2.1。
[0056] 2.引物設(shè)計(jì) 根據(jù)本實(shí)施例1提供的DNA模板的基因全序列模板，以01 ig〇7.0軟件設(shè)計(jì)引物，產(chǎn)物擴(kuò) 增大小及其GC含量具體如下表5: 表5
3. PCR反應(yīng) PCR擴(kuò)增體系見下表6: 表6
4. PCR擴(kuò)增程序 使用ABI9700 PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序分別按照下述程序1和程序2的程序進(jìn)行擴(kuò) 增： (1) 程序1: 95°C熱啟動(dòng)5min，l個(gè)循環(huán)； 94°C變性30s，65°C退火30s，72°C延伸60s，，10個(gè)循環(huán)； 94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸60s，，10個(gè)循環(huán)； 94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸60s，，10個(gè)循環(huán)； 94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸60s，，9個(gè)循環(huán)； 72°C延伸7 min，16°C結(jié)束PCR反應(yīng)； (2) 程序2: 95°C熱啟動(dòng)5min，l個(gè)循環(huán)； 94°C變性30s，70°C退火 30s，72°c延伸60s，，5個(gè)循環(huán)； 94°C變性30s，68°C退火30s，72°C延伸60s，，5個(gè)循環(huán)； 94°C變性30s，65°C退火30s，72°C延伸60s，，10個(gè)循環(huán)； 94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸60s，，10個(gè)循環(huán)； 94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸60s，，9個(gè)循環(huán)； 72°C延伸7 min，16°C結(jié)束PCR反應(yīng)； 5、結(jié)果檢測 反應(yīng)結(jié)束后，取5yL反應(yīng)產(chǎn)物，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，見圖1、2。需要說明的是，經(jīng)測 試結(jié)果顯示，選取實(shí)施例11小幅范圍中的點(diǎn)值分別做下述實(shí)驗(yàn)，最終的凝膠電泳圖基本一 致，也即是實(shí)施例11中小幅范圍的含量對最終的擴(kuò)增影響不大，都能獲得高特異性產(chǎn)物，且 凝膠電泳條帶單一。
[0057]由上述實(shí)施例31-33的測試結(jié)果可知，本發(fā)明實(shí)施例高GC含量的基因組擴(kuò)增方法 由于采用了含有本發(fā)明實(shí)施例提供的用于高GC含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng)試劑，因此，能夠?qū)?GC含量高達(dá)82%甚至更高的擴(kuò)增模板進(jìn)行擴(kuò)增，并使得擴(kuò)增的產(chǎn)物特異性高、條帶單一;而 且能夠針對不同GC含量、不同長度大小、不同引物對采用統(tǒng)一的PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增，使 得本發(fā)明實(shí)施例方法工藝相對簡單，提高擴(kuò)增的效率。
[0058] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和 原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于高GC含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng)試劑，其特征在于，包含如下組分： Tris-HCl 20-50 mmol/L 乙酸鐘 3~5 mmol/L 乙酸儀 2~4 mmol/L 二甲基亞砜 5~10V/V % 牛血清白蛋白30~80 mg/L NP-40 0.003-0.01V/V % Tween20 0.003-0.01V/V % 甜菜喊 1 ·0~1.5 mol/L。2. -種用于高GC含量的基因組擴(kuò)增的試劑盒，其特征在于，包括根據(jù)靶基因設(shè)計(jì)的引 物，還包括權(quán)利要求1所述的用于高GC含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng)試劑。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于:還包括PCR buffer、dNTPs、DNA聚合酶和 滅菌超純水試劑中的至少一種。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于:所述DNA聚合酶為Taq酶。5. -種高GC含量的基因組擴(kuò)增方法，包括如下步驟： 將模板DNA在PCR反應(yīng)試劑中進(jìn)行PCR反應(yīng);其中，所述PCR反應(yīng)試劑中含有根據(jù)靶基因 設(shè)計(jì)的引物和權(quán)利要求1所述的用于高GC含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng)試劑。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于:所述PCR反應(yīng)的反應(yīng)程序?yàn)橄率龇磻?yīng)程 序一或反應(yīng)程序二： 反應(yīng)程序一： 95°C熱啟動(dòng)5min，l個(gè)循環(huán)； 94°(：變性3〇8,63~65°(：退火30~458,72°(：延伸6〇8，10個(gè)循環(huán)； 94°(：變性308,58~60°(：退火30~458,72°(：延伸608，10個(gè)循環(huán)； 94°C變性30s，55°C退火30~45s，72°C延伸60s，10個(gè)循環(huán)； 94°C變性30s，52°C退火30~45s，72°C延伸60s，9個(gè)循環(huán)； 72°C延伸7 min，16°C結(jié)束PCR反應(yīng)； 反應(yīng)程序二： 95°C熱啟動(dòng)5min，l個(gè)循環(huán)； 94°C 變性 30s，69~70°C 退火 30~45s，72°c 延伸 60s，5 個(gè)循環(huán)； 94 °C變性30 s，66~68 °C退火30~45 s，72 °C延伸60s，5個(gè)循環(huán)； 94°C 變性 3〇8,63~65°(：退火30~458,72°(：延伸6〇8，10個(gè)循環(huán)； 94°C變性30s，58~60°C退火30~45s，72°C延伸60s，10個(gè)循環(huán)； 94°C變性30s，50~55° C退火30~45s，72°c延伸60s，9個(gè)循環(huán)； 72°C延伸7 min，16°C結(jié)束PCR反應(yīng)。7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的試劑盒，其特征在于：所述PCR反應(yīng)試劑還包括10 XPCR 1311打6廣(1階?8、0嫩聚合酶和滅菌超純水，所述?0?反應(yīng)試劑與所述模板0嫩構(gòu)成?0財(cái)廣增體 系，以所述PCR擴(kuò)增體系總體積為20體積份數(shù)計(jì)，所述PCR擴(kuò)增體系如下： 10XPCR buffer 2.0體積份數(shù) 10mM dNTPs 0.2體積份數(shù) 5. mol/L上引物 1.0體積份數(shù) 5. mol/L下引物 1.0體積份數(shù) 模板DNA 1.0體積份數(shù) DNA聚合酶 0.2體積份數(shù) 所述用于高GC含量的基因組擴(kuò)增反應(yīng)試劑10體積份數(shù) 滅菌超純水 補(bǔ)足至20體積份數(shù)。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于:所述DNA聚合酶為Taq酶。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK105969762SQ201610249847
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年4月21日
【發(fā)明人】呂榮軍
【申請人】奧美德諾（北京）基因科技有限公司