一種高通量提取園藝植物葉片基因組dna的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種高通量提取園藝植物葉片基因組 DNA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 足量的高品質(zhì)DNA是展開植物分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，但是，目前，園藝植物細(xì)胞 中常含有大量的色素、多糖、酚類等次生代謝產(chǎn)物，特別是多糖在DNA提取過程中的共沉淀， 使提取的DNA呈膠狀難以溶解，純度顯著下降。
[0003] 常規(guī)使用的CTAB法、SDS法、尿素提取法和高鹽低pH法在提取園藝植物DNA時或耗 時長、操作復(fù)雜，或提取效果差，易降解，或提取成本非常昂貴，具體為： 常規(guī)的CTAB法需要用液氮研磨材料，提取過程中需要使用酚/氯仿抽提2-3輪，且需要 低溫長時間離心，耗時長，操作繁瑣，提取通量低，每人每天只能提取5-10份，耗時長，并且 效率非常低下。
[0004] 使用常規(guī)CTAB法及其它方法提取的基因組DNA中一般都有大量的RNA污染，需要加 入RNA酶消化去除RNA。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)中通常所采用的高通量制備DNA的方法，或需要使用組織研磨儀在96孔 板或普通EP管中進(jìn)行高通量研磨，設(shè)備昂貴(5-10萬元/臺），常規(guī)實(shí)驗(yàn)室無法使用，或直接 將材料在稀堿溶液中煮沸裂解，效果不穩(wěn)定易降解。
[0006] 并且，目前市場上的商業(yè)試劑盒在提取植物DNA時一般都需要液氮研磨材料，其質(zhì) 量和效果因生產(chǎn)批次不同而不穩(wěn)定，且價格比較昂貴，難以進(jìn)行高通量提取。
[0007] 一些改進(jìn)的CTAB法、SDS法、酶解法雖能進(jìn)行高通量制備，但提取的DNA純度不高， 且一般需要組織研磨儀等特殊設(shè)備，難以滿足常規(guī)實(shí)驗(yàn)室的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對于現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種經(jīng)濟(jì)、快速、去糖效 果良好、高通量的園藝植物葉片基因組DNA提取方法，該方法采用改良的提取液和制備工 藝，能夠從少量植物葉片提取高質(zhì)量的DNA，具有巨大的應(yīng)用價值。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為： 提供一種高通量提取園藝植物葉片基因組DNA的方法，包括以下步驟： (1) 取10-30mg植物葉片置于1.5ml離心管中，再加入200-300ul研磨液，l〇-15mg石英砂 和維生素 C的混合物，用電動研磨儀研磨至勻漿狀，補(bǔ)加 lml所述研磨液，渦旋混勻； (2) 在8000rpm，室溫離心1分鐘，去除離心所得上清液，向沉淀中加入500-700ul 65°C 預(yù)熱的裂解液和l〇ul 2-巰基乙醇，渦旋混勻，60-65°C保溫10-15分鐘； (3) 待步驟(2)中的混合液冷卻至室溫后，加入與步驟(2)中的裂解液等體積的氯仿，劇 烈震蕩30s，室溫下，放置2分鐘;再于13000rpm，室溫下，離心5-10分鐘； (4) 取300-400ul上清，轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入1/4所述上清體積的5M氯化鈉，顛倒混 勻，再加入2倍混合液體積的無水乙醇，顛倒混勻，室溫放置10-15分鐘;再于13000rpm，室溫 下，離心5-10分鐘，棄上清，得沉淀； (5)向步驟(4)中得到的沉淀加入400u 1TE，用移液器吹打，溶解，再加入1 /10所述TE體 積的3M醋酸鈉，pH5.2，顛倒混勻，再加入2倍混合液體積的無水乙醇，顛倒混勻，室溫放置 10-15分鐘;再于13000rpm，室溫下，離心5-10分鐘，棄上清，得沉淀。
[0010] (6)將步驟(5)所得沉淀用70-75%乙醇洗滌后，室溫下風(fēng)干6-10分鐘，加入50ul TE 溶液，得到基因組DNA。
[0011] 所述步驟(1)、（2)和(3)替代為： (1) 取10-30mg植物葉片置于1.5ml離心管中，再加入200-300ul裂解液，10-15mg石英砂 和維生素 C的混合物，用電動研磨儀研磨至勻漿狀，補(bǔ)加300-400ul裂解液和10ul 2-巰基乙 醇，渦旋混勻，60-65°(3保溫10-15分鐘； (2) 待步驟（1)中的混合液冷卻至室溫后，加入與步驟(2)中的第一次和第二次加入的 裂解液體積之和等體積的氯仿，劇烈震蕩30s，室溫下，放置2分鐘;再于13000rpm，室溫下， 尚心5-10分鐘。
[0012] 所述步驟(5)、（6)替代為： (5)將步驟(4)所得沉淀用70-75%乙醇洗滌后，室溫下風(fēng)干6-10分鐘，加入50ul TE溶 液，得到基因組DNA。
[0013]步驟⑴中，所述石英砂和維生素 C的質(zhì)量比為1:1 · 所述研磨液的配方組成為： 200mM三羥甲基氨基甲烷·鹽酸、50mM乙二胺四乙酸二鈉、0.2M的氯化鈉和0.2g/L交聯(lián) 聚乙烯吡咯烷酮，PH8.0; 所述裂解液的配方組成為:體積比為1:1的A液和B液； 所述A液的配方為:0.4g/L的十六烷基三甲基溴化銨、200mM的三羥甲基氨基甲烷·鹽 酸、50mM的乙二胺四乙酸二鈉和0.4g/L的聚乙烯吡咯烷酮，平均分子量10000，pH8.0; 所述B液的配方為:8M氯化鋰； 所述TE配方為： 10mM三羥甲基氨基甲烷.鹽酸和ImM乙二胺四乙酸二鈉。
[0014] 所述電動研磨儀由小型電鉆和設(shè)置于所述電鉆上的金屬研磨棒組成。
[0015] 所述植物葉片為植物新鮮葉片或室溫干燥保存的葉片;所述植物為草莓、桃、梨、 柑橘、李子、甘藍(lán)或南瓜。
[0016] 本發(fā)明的方法具有以下有益效果： 1)簡單快速，高通量;本方法無需液氮研磨，提取過程中僅需要用氯仿進(jìn)行1輪抽提，室 溫短時間離心，耗時短，配合簡單組裝的電動研磨儀便可以實(shí)現(xiàn)高通量提取，每人每天能提 取80-120份，提取效率得到大大提尚。
[0017 ] 2 )無 RNA污染;本方法提取的基因組DNA幾乎不含RNA，純度高。
[0018] 3)成本低，效果穩(wěn)定，常規(guī)實(shí)驗(yàn)室即可使用;本方法在高通量制備時，只需將常規(guī) 的電鉆和金屬研磨棒組合成電動研磨儀，在1.5毫升離心管中僅需10秒即可將材料研磨至 勻漿狀，研磨完一個樣品后，只需用滅菌蒸餾水沖洗干凈即可用于下一組材料的研磨，樣品 少時也可以用研缽進(jìn)行研磨，效果穩(wěn)定，重復(fù)性好，成本低，使用方便。
[0019] 4)本發(fā)明的方法操作簡單快捷，無需液氮研磨，制備通量高，耗費(fèi)時間短，DNA得率 和純度比較高;并且在裂解液中使用高濃度的氯化鋰替代了氯化鈉，使得到的DNA基本不含 RNA污染，純度高，本發(fā)明得到的DNA可用于園藝植物群體遺傳學(xué)、系統(tǒng)進(jìn)化、分子標(biāo)記、和常 規(guī)PCR等實(shí)驗(yàn)，適用于普通生物實(shí)驗(yàn)室研究。
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1-8提取的不同植物葉片基因組DNA的凝膠電泳圖。
[0021 ]圖2為以本發(fā)明實(shí)施例1 -8提取的不同植物葉片基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增的ISSR 凝膠電泳圖。
[0022]圖3為以限制性內(nèi)切酶EC0R頂每切消化本發(fā)明實(shí)施例1-8提取的不同植物葉片基 因組DNA的示意圖。
[0023]圖4為以本發(fā)明實(shí)施例1 -8提取的不同植物葉片基因組DNA為模板擴(kuò)增葉綠體rbc 1 基因的PCR凝膠電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明具體實(shí)施例及 相應(yīng)的附圖對本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。
[0025] 實(shí)施例1 (1) 取20mg新鮮的草莓葉片置于1.5ml離心管中，再向離心管中加入200ul研磨液，以及 10 mg石英砂和維生素 C的混合物，用電動研磨儀將上述混合物研磨至勻漿狀，補(bǔ)加 lml研磨 液，渦旋混勻；其中，石英砂和維生素 C的加入量均為5mg;電動研磨儀由常規(guī)的小型電鉆和 設(shè)置于電鉆上的金屬研磨棒組成，成本低，組裝簡單，使用方便； (2) 將步驟(1)得到的研磨液在8000 rpm，室溫下，離心1分鐘，去除離心所得上清液，向 沉淀中加入600ul 65°C預(yù)熱的裂解液以及10 ul 2-巰基乙醇，渦旋混勻，65°C保溫10分 鐘，期間顛倒混勻1 -2次； (3) 將步驟(2)得到的混合液冷卻至室溫后，加入600 ul氯仿，劇烈震蕩30秒，室溫放置 2分鐘;再于13000rpm，室溫下，離心5-10分鐘； (4) 取400 ul上清轉(zhuǎn)入另一個離心管中，加入100 ul的5M氯化鈉，顛倒混勾，加入lml無 水乙醇，顛倒混勻，室溫放置10分鐘;再于13000rpm，室溫下，離心5-10分鐘，徹底棄上清，保 留沉淀。
[0026] (5)在步驟(4)的沉淀中加入400ul TE，用移液器吹打加速溶解，再加入40ul 3M的 醋酸鈉，PH5.2，顛倒混勻，加入800ul無水乙醇，顛倒混勻，室溫放置10分鐘;再于13000rpm， 室溫下，離心5-10分鐘，徹底棄上清，保留沉淀； (6)將步驟(5)所得沉淀用75%乙醇洗滌后，室溫風(fēng)干10分鐘，加入50ulTE溶解，得到基 因組DNA，-20°C保存。
[0027] 上述方法中，研磨液的配方組成為:200mM三羥甲基氨基甲烷·鹽酸、50mM乙二胺四 乙酸二鈉、〇. 2M的氯化鈉和0.2g/L交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(pH8.0); 裂解液的配方組成為:體積比為1:1的A液和B液;其中， A液的配方為：0.4g/L的十六烷基三甲基溴化銨、200mM的三羥甲基氨基甲烷·鹽酸、 50mM的乙二胺四乙酸二鈉和0.4g/L的聚乙烯吡咯烷酮，平均分子量10000(pH8.0); B液的配方為:8M氯化鋰。
[0028] TE的配方組成為：10mM三羥甲基氨基甲烷·鹽酸和ImM乙二胺四乙酸二鈉。
[0029] 實(shí)施例2 采用的植物為梨葉片，提取步驟同實(shí)施例1，得到梨葉片基因組DNA。
[0030] 實(shí)施例3 (1) 取20mg新鮮的桃葉片置于1.5ml離心管中，再向離心管中加入300ul 65°C預(yù)熱的裂 解液，以及10 mg石英砂和維生素 C的混合物，用電動研磨儀將上述混合物研磨至勻漿狀，再 加入400 ul裂解液和10 ul 2-巰基乙醇，渦旋混勻，65°C保溫10分鐘，期間顛倒混勻1-2次； (2) 將步驟(1)得到的混合液冷卻至室溫后，加入700 ul氯仿，劇烈震蕩30秒，室溫放置 2分鐘;再于13000rpm，室溫下，離心5-10分鐘； (3) 取400 ul上清轉(zhuǎn)入另一個離心管中，加入100 ul的5M氯化鈉，顛倒混勾，加入lml無 水乙醇，顛倒混勻，室溫放置10分鐘;再于13000rpm，室溫下，離心5-10分鐘，徹底棄上清，保 留沉淀； (4 )在步驟(3 )的沉淀中加入400u 1 TE，用移液器吹打加速