促進(jìn)大鯢蛻皮的方法及提取大鯢基因組的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物工程術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種促進(jìn)大鯢蛻皮的方法及提取大鯢基因組的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大鯢(Andr ias dauidianus )，俗稱“娃娃魚”，也叫“大山椒魚”，屬兩棲綱(Amphibia)有尾目(Caudata)隱鮑鮑科(Cryptobranchidae)大鮑屬(Andrias)，是一種處于水生到陸生之間的過度物種，進(jìn)化上十分原始，研究認(rèn)為大鯢是與恐龍同時(shí)代的物種，為我國特有的珍稀野生動物，兼具極高的藥用價(jià)值和科研價(jià)值，主要分布在長江中上游、珠江中上游及漢水上游的深山峽谷溪流中。由于大鯢對水環(huán)境的依賴程度很大，擴(kuò)散能力較差，目前中國大鯢的分布范圍和資源己急劇下降，棲息環(huán)境呈現(xiàn)出嚴(yán)重的片斷化，再加上大鯢生存環(huán)境日益惡化，如人為捕殺、環(huán)境污染等，大鯢自然資源嚴(yán)重衰竭。
[0003]如何保護(hù)現(xiàn)存的野生種群，采取科學(xué)的繁殖配對措施以避免近交衰退和遺傳多樣性丟失，已成為當(dāng)前中國大鯢保護(hù)和養(yǎng)殖中面臨的關(guān)鍵問題。近些年來，雖然大鯢人工繁殖及規(guī)?；庇夹g(shù)取得突破性進(jìn)展，種群數(shù)量也有一定的恢復(fù)，但由于對大鯢遺傳背景缺乏了解，故不能從根本上解決它的瀕危問題。因此，開展大鯢保護(hù)遺傳學(xué)的研究，對大鯢的人工增殖和種質(zhì)資源管理有重要的意義。
[0004]目前為止，國內(nèi)外學(xué)者已進(jìn)行了大量大鯢遺傳學(xué)方面的研究。資料顯示，日本大鯢分析其基因結(jié)構(gòu)，采用的樣本是組織樣本:腳趾，尾部組織，皮膚組織和肝臟；中國大鯢線粒體基因組的提取多是通過采集大鯢的尾部肌肉、血液、肝臟或者是其受到一定刺激后分泌的粘液的方法。當(dāng)前采取的這些方法或多或少會對大鯢造成一定傷害，且大鯢受驚后一段時(shí)間內(nèi)會影響攝食，這是養(yǎng)殖戶不愿看到的。而且在保護(hù)野生大鯢的角度上來說也是不可取的。蛻皮是大鯢自然生長的產(chǎn)物，不需要刺激或者剪切大鯢身體任何部位。但是，大鯢在自然情況下，10到15天才蛻皮一次，而且在野外或者模擬自然環(huán)境養(yǎng)殖的條件下，也比較難以收集。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是:提供一種促進(jìn)大鯢蛻皮的方法及提取大鯢基因組的方法，它能快速、有效的獲取大鯢蛻皮，以作為提取大鯢基因組的材料，避免了對大鯢造成的損傷。
[0006]本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的:促進(jìn)大鯢蛻皮的方法，將大鯢置于離水環(huán)境下，溫度為18-23°C，濕度為40-80%，時(shí)間為3-5小時(shí);然后再將大鯢放置于水溫為18-23°C的水中，1_2小時(shí)后，即可獲得大鯢的新鮮蛻皮。
[0007]提取大鯢基因組的方法，收集大鯢的新鮮蛻皮作為提取大鯢基因組的材料。
[0008]由于采用了上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過發(fā)現(xiàn)了一套通過環(huán)境刺激大鯢使其快速產(chǎn)生蛻皮的方法，利用該方法能快速、有效的收集到大鯢蛻皮，為提取大鯢基因組提供材料，增加了提取大鯢基因組以作遺傳學(xué)分析的途徑，并且有效的避免了損傷大鯢，達(dá)到保護(hù)大鯢的目的，也符合動物保護(hù)的思想。本發(fā)明簡單易行，成本低廉，使用效果好。
【具體實(shí)施方式】
[0009]本發(fā)明的實(shí)施例1:促進(jìn)大鯢蛻皮的方法，將大鯢置于離水環(huán)境下，溫度為18-23°C，濕度為40-80%，時(shí)間為3-5;然后再將大鯢放置于水溫為18-23°C的水中，1-2時(shí)間后，SP可獲得大鯢的新鮮蛻皮。
[0010]本發(fā)明的實(shí)施例2:提取大鯢基因組的方法
I)將通過實(shí)施例1收集到的大鯢的新鮮蛻皮作為提取大鯢基因組的材料。采集的大鯢蛻皮無論是否新鮮，都可以提取到基因組。但是為了防止因大鯢基因組的降解影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，也為了后續(xù)實(shí)驗(yàn)?zāi)軠?zhǔn)確標(biāo)記，最好采集大鯢身上新鮮的蛻皮。
[0011]2)提取基因組:
①取Ig左右的蛻皮，剪切成小塊后放入1.5ml的離心管中，加入180μ1 Buffer GTL，將不同用品做好標(biāo)記。
[0012]②加入20μ1蛋白酶K，漩渦震蕩徹底混勻。56°C水浴，直至組織完全裂解，裂解過程中每隔一段時(shí)間顛倒或震蕩離心管使樣品分散。
[0013]③加入200μ1 Buffer GL，漩渦震蕩充分混勻，70°C水浴10分鐘。
[0014]④短暫離心后加入200μ1無水乙醇，漩渦震蕩充分混勻。
[0015]⑤短暫離心，將④所得溶液轉(zhuǎn)入收集管(Collect1nTube )的吸附柱(Sp inColumn DM)中，一次加不完可分多次加入。8000rpm離心Imin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
[0016]⑥向吸附柱中加入SOOyU^Buffer GWl (使用前加入無水乙醇)，8000rpm離心lmin，倒掉收吸附柱中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
[0017]⑦向吸附柱中加入SOOyU^Buffer GW2(使用前加入無水乙醇)，13000rpm離心lmin，倒掉收吸附柱中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
[0018]⑧13000rpm離心2min，倒掉收吸附柱中的廢液，將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘，以徹底晾干(去除殘余的乙醇)。
[0019]⑨將吸附柱置于基因組收集管中，向吸附柱的中間懸空加入50—200μ1BufferGE，室溫放置2—5分鐘，13000rpm離心I分鐘，收集DNA溶液，-20°C保存。
[0020]3)檢測獲得的基因組:采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，DM2000為Maker，點(diǎn)樣量為5μ1，電泳電壓110V，時(shí)間30~35min。
[0021 ] 4)PCR擴(kuò)增:根據(jù)公知技術(shù)設(shè)計(jì)，篩選出的引物，PCR反應(yīng)在PTC—200型PCR儀(TECHNE公司)上進(jìn)行，反應(yīng)體系為40μ1:上下游引物各2μ1;模板DNA 4μ1，ΜΙΧ 20μ1，加無菌去離子水至40μ1;反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性3 min;94°C變性45 S，56°C復(fù)性45 S，72°C延伸Imin，并進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 °C延伸10 min。
[0022]5)檢測目的片段:PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在DYY—ΙΠ32型平板電泳槽(北京六一儀器廠)上進(jìn)行。利用未加模板DNA的反應(yīng)液作為空白對照，以檢查是否有污染存在。點(diǎn)樣量為5μ1，電壓為100V，時(shí)間35?40 min。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種促進(jìn)大鯢蛻皮的方法，其特征在于:將大鯢置于離水環(huán)境下，溫度為18-23°c，濕度為40-80%，時(shí)間為3-5小時(shí);然后再將大鯢放置于水溫為18-23°C的水中，1-2小時(shí)后，即可獲得大鯢的新鮮蛻皮。2.一種基于如權(quán)利要求1所述的方法的提取大鯢基因組的方法，其特征在于:收集大鯢的新鮮蛻皮作為提取大鯢基因組的材料。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種促進(jìn)大鯢蛻皮的方法及提取大鯢基因組的方法。本發(fā)明通過發(fā)現(xiàn)了一套通過環(huán)境刺激大鯢使其快速產(chǎn)生蛻皮的方法，利用該方法能快速、有效的收集到大鯢蛻皮，為提取大鯢基因組提供材料，增加了提取大鯢基因組以作遺傳學(xué)分析的途徑，并且有效的避免了損傷大鯢，達(dá)到保護(hù)大鯢的目的，也符合動物保護(hù)的思想。本發(fā)明簡單易行，成本低廉，使用效果好。
【IPC分類】A01K67/02, C12N15/10
【公開號】CN105494257
【申請?zhí)枴緾N201511006587
【發(fā)明人】姚俊杰, 吳俁學(xué), 周紅霞, 熊偉, 秦國兵, 朱忠勝, 宋嬌
【申請人】貴州大學(xué)
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2015年12月29日