>[0029] 經(jīng)過上述操作，從土壤中篩選出一株對煙粉虱具有致病作用的真菌，編號P1TS01。
[0030] 實施例2菌株P(guān)1TS01的鑒定 實施例1篩選的菌株P(guān)1TS01在察氏培養(yǎng)基上，起初菌落規(guī)則圓形，隆起，菌絲白色，背 面淡黃色或近米黃色；延長培養(yǎng)，菌落仍呈圓形，形成淡粉色色孢子層；培養(yǎng)14天后，菌落 直徑 44~46mm。
[0031] 顯微結(jié)構(gòu)：菌絲細長，無色透明，具分隔，寬度1.58~3. 61μπι;分生孢子梗上著 生2~5個瓶梗，瓶梗橢圓形或梭形膨大，向上逐漸細管狀，長6. 07~7. 44μm，寬2. 77~3. 66 ym;其上產(chǎn)大量分生孢子，分生孢子串生、無色透明，單胞子呈橢圓形至卵圓形，長 2·51~3·66μπι，寬 1·77~2·66μπι。
[0032] 分子系統(tǒng)發(fā)育：采用通用引物ITS1、ITS4擴增P1TS01菌株的rDNA-ITS基因序 列（如SEQIDNO:1所示)，測序后與NCBI數(shù)據(jù)庫中已知序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表 明，P1TS01菌株與淡紫擬青霉處在同一分支上，同源性為99%。
[0033] 通過上述生物學性狀及生理生化和分子鑒定可知，P1TS01菌株分類地位屬于 真菌界（半知菌亞門絲抱綱絲抱目 (iaJes)、叢梗抱科（iftwiiaceae)、擬青霉屬（〇
[0034] 該菌株于2015年3月26日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏編號為 CCTCCNO.M2015168,保藏地址為中國武漢武漢大學。
[0035] 實施例3 分生孢子懸浮液配制：從斜面菌種上挑取分生孢子，接入已經(jīng)滅菌的0.05 %的吐 溫-80溶液中，用血球計數(shù)板測量孢子濃度，并調(diào)整到107個分生孢子/mL。備用。
[0036] 種子培養(yǎng)：將2mL孢子懸浮液接種于98mL種子培養(yǎng)基中，在180r/m和26°C條 件下?lián)u瓶培養(yǎng)2-3天即成種子液。種子培養(yǎng)基為0. 5%蛋白胨的Czapek-Dox培養(yǎng)基，其成 分為：蛋白陳 5g，NaN03 3g，K2HP04 1g，MgS04 7H20 0.5g，KCl0.5g，F(xiàn)eS04 7H20 0.01 g，茂糖 30g，瓊脂 15-20g，水 1000mL。
[0037]固體發(fā)酵：先將大米蒸熟，裝入保鮮袋中，待其冷卻至常溫后，接種上述種子液，接 種比例為5-15% (V/W)，在25-28 °C條件下培養(yǎng)2周左右，待米粒表面長滿分生孢子是過 篩分離分生孢子，封口包裝，保溫保藏備用。
[0038] 幾種蟲生真菌對煙粉虱的致病力比較 供試菌株培養(yǎng)與孢子懸浮液配制：以P1TS01及MaTSOl等5個菌株供試(表1 )。在PDA 培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)3周后，取分生孢子，用0. 05%吐溫80溶液配制成1.OX10s個孢子/mL的懸浮液，采用浸漬法處理，將孢子接種于盆栽扶桑苗上的2齡B型煙粉虱若蟲上，以清水 處理作為對照，重復3次，每隔48小時檢查煙粉虱的死蟲數(shù)，最后計算13天后煙粉虱的累 積死亡率。
[0039] 供試蟲源的飼養(yǎng)：選取長勢良好且健康的扶桑苗，摘除老葉部分，留下20片左右 的新葉，將葉片用清水清洗干凈，放入養(yǎng)蟲籠中。待葉片風干后，將經(jīng)多代人工飼養(yǎng)純化的B 型煙粉虱成蟲釋放到養(yǎng)蟲籠中，以每株釋放50對煙粉虱成蟲計算釋放蟲量。在光照14:10 (L:D)、溫度25 ± 1 °C、相對濕度70 ± 10%條件下，讓煙粉虱在籠中產(chǎn)卵1天，然后驅(qū)走全部成 蟲。繼續(xù)培養(yǎng)，并觀察煙粉虱卵孵化情況，待發(fā)育到2齡若蟲期時(約7d)進行實驗。
[0040] 累積死亡率（％) =調(diào)查時累積死亡蟲數(shù)/處理前蟲數(shù)X100% 校正死亡率（％)=(處理死亡率-對照死亡率）/( 1-對照死亡率）X100% 不同菌株對煙粉虱的累計校正死亡率如表1。結(jié)果顯示P1TS01菌株效果最好，在處理 后10天，煙粉虱死亡率達到92. 78%。
[0041] 表1供試菌株對煙粉虱2齡若蟲的致病力（X10s孢子/mL)
實施例4 :P1TS01菌株對煙粉虱的毒力測定 在室內(nèi)條件下，采用浸漬法將離體的帶有2齡B型煙粉虱若蟲的扶桑葉片(每葉不少 于 50 頭若蟲）分別在 9. 0X107 個 /mL、3. 0X107 個 /mL、1. 0X107個 /mL、3. 3X10 6 個 /mL、 1. 1X106個分生孢子/mL濃度梯度的菌株分生孢子懸浮液中浸漬葉片10s，自然晾干后放 入干凈培養(yǎng)皿(底部墊濕濾紙及薄層脫脂棉，葉柄基部纏繞含營養(yǎng)液的濕棉球）中，然后將 培養(yǎng)皿放入光照14 :10(L:D)，溫度25±1°C下培養(yǎng)，實驗重復3次。
[0042] 每隔2天觀察記錄若蟲死亡情況，計算死亡率與半致死濃度（LC5。）及半致死時間 ατ50) 累積校正死亡率如表2,進而計算出半致死濃度LC5。(95%置信區(qū)間）為 1.66(0.98-2.47)X106spores/mL(處理第6天)，半致死時間LT5Q(95%置信區(qū)間）為 4. 35(4. 12-4. 59)天。
[0043] 表2P1TS01菌株對2齡B型煙粉虱若蟲的累積校正病死率（％)
【主權(quán)項】
1. 一株淡紫擬青霉（JiJaciiws)菌株P(guān)1TS01，其特征在于，所述菌 株于2015年3月31日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏編號為CCTCCNo. M2015168。2. 權(quán)利要求1所述淡紫擬青霉（菌株P(guān)1TS01在防治煙粉虱 中的應用。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于，所述防治煙粉虱是收獲淡紫擬青霉的分 生孢子，用0. 05%吐溫-80溶液配制成濃度為107分生孢子/mL的懸浮液，于煙粉虱若蟲發(fā) 生高峰期采用葉面噴霧法將懸浮液施用于田間。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一株淡紫擬青霉PlTS01及其在防治煙粉虱中的應用。所述菌株從甘肅省永登縣中川鎮(zhèn)的土壤中分離純化獲得，于2015年3月31日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），保藏編號為CCTCC？No.？M2015168。該菌株對煙粉虱具有很強的殺蟲活性，在處理后第6天，對B型煙粉虱2齡若蟲的半致死濃度LC50為1.66×106孢子/mL，半致死時間LT50為4.35？d（在1.0×107孢子/mL劑量下）。該菌株展現(xiàn)了作為環(huán)境友好的微生物農(nóng)藥用于防治農(nóng)業(yè)重要害蟲-煙粉虱的良好前景。CCTCC No. M201516820150326
【IPC分類】A01P7/04, C12R1/79, C12N1/14, A01N63/04
【公開號】CN105274008
【申請?zhí)枴緾N201510444821
【發(fā)明人】胡瓊波, 張博文, 翁群芳, 姜艷芳
【申請人】華南農(nóng)業(yè)大學
【公開日】2016年1月27日
【申請日】2015年7月27日