一株用于防治番茄與葡萄根結(jié)線蟲(chóng)病害的淡紫擬青霉的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株用于防治番前與葡萄根結(jié)線蟲(chóng)病害的淡紫擬青霉 hVaci/ws)，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物線蟲(chóng)病是農(nóng)作物、蔬菜、果樹(shù)、林木、花丼及藥材種植的四大病源生物之一，其 危害僅次于真菌，超過(guò)細(xì)菌和病毒。植物寄生線蟲(chóng)每年造成世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的損失約1000億 美元，其中危害最大的一類(lèi)植物寄生線蟲(chóng)為根結(jié)線蟲(chóng)。
[0003] 植物寄生線蟲(chóng)的防治主要有化學(xué)殺線蟲(chóng)劑、栽培技術(shù)、培育抗性品種和生物農(nóng)藥。 由于根結(jié)線蟲(chóng)通常存活于土壤中和植物根內(nèi)，目前仍無(wú)特效的化學(xué)農(nóng)藥，只能在短期內(nèi)控 制線蟲(chóng)病害發(fā)生，因此化學(xué)農(nóng)藥難以控制其危害，且由于潛在的環(huán)境問(wèn)題，涉及人類(lèi)和動(dòng)物 健康，化學(xué)殺線蟲(chóng)劑的使用受到很大的限制。此外栽培技術(shù)(如輪作)、培育抗性品種等雖然 能夠起到一定的防治作用，但是實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中局限性較大。因此，作為安全、有效的防治 根結(jié)線蟲(chóng)病害的方法，生物防治技術(shù)及其制劑產(chǎn)品在植物線蟲(chóng)病害防治中的應(yīng)用就顯得尤 為重要。
[0004] 淡紫擬青霉屬于半知菌亞門(mén)，叢梗抱目，叢梗飽科，擬青霉屬，能廣泛寄生于線蟲(chóng) 卵，殺蟲(chóng)效果高效，具有安全、高效、持效期長(zhǎng)等特點(diǎn)，被認(rèn)為是最具有應(yīng)用前景的線蟲(chóng)生防 真菌。淡紫擬青霉除了具有殺線蟲(chóng)效果外，還可以寄生半翅目、同翅目、等翅目和鞘翅目及 鱗翅目等昆蟲(chóng)，對(duì)植物病原菌(如玉米小斑病、小麥赤霉病、黃瓜炭疽病菌、棉花枯萎病和水 稻惡苗病等)具有拮抗作用。淡紫擬青霉的次級(jí)代謝物也有一定的生理效能，如產(chǎn)生類(lèi)似吲 哚乙酸產(chǎn)物，促進(jìn)植物根系和植株生長(zhǎng)，對(duì)種子萌發(fā)和生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，還能產(chǎn)生多種酶 且具有一定的化學(xué)農(nóng)藥降解效應(yīng)。
[0005] 淡紫擬青霉對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)具有侵染力，但是由于生物個(gè)體特性的差異，造成不同來(lái) 源淡紫擬青霉對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)的防治效果有差異，因此需要不斷分離對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)具有更高致病 性的菌株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一株用于防治番茄與葡萄根結(jié)線蟲(chóng)病害的淡紫擬青霉，對(duì)番茄和葡 萄根結(jié)線蟲(chóng)病具有強(qiáng)致病性，可開(kāi)發(fā)為針對(duì)農(nóng)業(yè)根結(jié)線蟲(chóng)病的新型生物防治劑。
[0007] 本發(fā)明中一株用于防治番茄與葡萄根結(jié)線蟲(chóng)病害的淡紫擬青霉為淡紫擬青霉 YT08,其在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的 登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCCNo. 10026,保藏時(shí)間為2014年11月26日。
[0008] 本發(fā)明淡紫擬青霉YT08分離自山東省煙臺(tái)市海水養(yǎng)殖海帶表皮，該菌株在分離 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落初期為白色且菌絲致密，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，逐漸變?yōu)榈仙?，菌落與 培養(yǎng)基連接緊密，不易挑取。該菌株產(chǎn)分生孢子，孢子呈橢圓形，分生孢子梗呈掃帚狀。
[0009] 本發(fā)明淡紫擬青霉YT08對(duì)氯霉素不敏感，營(yíng)養(yǎng)要求低，在啤酒糟固體培養(yǎng)基上生 長(zhǎng)良好，且在20°C- 35°C均能正常培養(yǎng)。
[0010] 本發(fā)明淡紫擬青霉YT08對(duì)番茄和葡萄根結(jié)線蟲(chóng)病具有強(qiáng)防治效果，盆栽試驗(yàn)中 對(duì)番茄根結(jié)線蟲(chóng)的防治效果為89. 69%，對(duì)葡萄根結(jié)線蟲(chóng)的防治效果為93. 42%。
[0011] 本發(fā)明淡紫擬青霉YT08屬于擬青霉屬淡紫擬青霉種 iPaecilotnyceslilacinus)。
[0012] 生物材料信息： 分類(lèi)命名：淡紫擬青霉
[0013] 菌株編號(hào)：YT08。
[0014] 保藏機(jī)構(gòu)：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。
[0015] 保藏機(jī)構(gòu)簡(jiǎn)稱(chēng)：CGMCC。
[0016] 地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。
[0017] 保藏日期：2014年11月26日。
[0018] 保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)：CGMCCNo. 10026。
【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1為淡紫擬青霉YT08在分離培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征；圖2為淡紫擬青霉YT08的 顯微鏡形態(tài)觀察特征。
[0020]
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述，這些實(shí)施例用于理解而不是限制本 發(fā)明。
[0022] -株用于防治番茄與葡萄根結(jié)線蟲(chóng)病害的淡紫擬青霉，菌種命名為YT08,分類(lèi)命 名：淡紫擬青霉其保藏編號(hào)：CGMCCNo. 10026,保藏單位：中 國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3 號(hào)，保藏日期：2014年11月26日。
[0023] 實(shí)施例1:菌株YT08的分離篩選 淡紫擬青霉YT08由中國(guó)山東省煙臺(tái)市海水養(yǎng)殖的海帶表皮中分離得到。分離篩選按 照以下步驟進(jìn)行：將采集的海帶樣本按照1:100的比例加入無(wú)菌水稀釋?zhuān)?8°C的恒溫?fù)u 床中振搖30分鐘，在超凈工作臺(tái)上經(jīng)逐級(jí)稀釋后涂布篩選培養(yǎng)基平板上，28°C的恒溫?fù)u床 4一6天至長(zhǎng)出單菌落，挑取單菌落在分離培養(yǎng)基平板上進(jìn)行多次劃線分離純化，經(jīng)顯微鏡 鏡檢為純培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)接孟加拉紅固體斜面培養(yǎng)基，28°C的恒溫?fù)u床培養(yǎng)4一6天置于4°C下 保存，即為淡紫擬青霉YT08。
[0024] 所用篩選培養(yǎng)基組分如下：硫酸銨10g/L，磷酸氫二鉀2g/L，氯化鈉15g/L，七 水硫酸鎂1g/L，膠體殼聚糖100g/L，瓊脂20g/L，pH5.8，121°C滅菌20分鐘。
[0025] 所用的分離培養(yǎng)基組分如下：葡萄糖30g/L，硝酸鈉2g/L，磷酸氫二鉀1g/L，硫 酸鐵〇? 01g/L，氯化鉀0? 5g/L，七水硫酸鎂0? 5g/L，膠體殼聚糖6g/L，瓊脂20g/L，pH 6. 5,121 °C滅菌20分鐘。
[0026] 菌種保藏用的孟加拉紅培養(yǎng)基組分如下：蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，磷酸二 氫鉀1g/L，七水硫酸鎂0. 5g/L，瓊脂粉20g/L，孟加拉紅0. 0133g/L，氯霉素0. 1g/L，pH6. 5,121°C滅菌 20 分鐘。
[0027] 實(shí)施例2:菌株YT08的菌屬鑒定 1.菌株YT08的形態(tài)特征：將上述分離篩選的菌株YT08劃線接種于分離培養(yǎng)基上， 28°C的恒溫?fù)u床培養(yǎng)，定期觀察菌落生長(zhǎng)狀態(tài)。將菌株采用涂布法接種另一分離培養(yǎng)基中， 同時(shí)將滅菌后的蓋玻片（lcmXlcm)斜插入培養(yǎng)基中，置于28°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6天待 菌絲爬到蓋玻片上后，取出蓋玻片置于光學(xué)顯微鏡下觀察菌株YT08的菌絲和孢子形態(tài)。
[0028] 菌株YT08在培養(yǎng)初期菌落顏色為白色，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)后顏色逐漸加深，產(chǎn)生 孢子后菌落顏色顯示為淡紫色。圖1所示為菌株YT08在分離培養(yǎng)基上培養(yǎng)6天后的形態(tài) 特征，菌落呈現(xiàn)隆起狀圓形，，菌落與培養(yǎng)基連接緊密，不易挑取，菌絲致密且向外擴(kuò)散，顏 色為淡紫色，周?chē)燥@白色，不分泌可溶性色素。顯微鏡下觀察到的菌株YT08形態(tài)特征見(jiàn) 圖2,其分生孢子梗呈掃帚狀，孢子呈橢圓形，成串呈不分枝的鏈狀，基內(nèi)菌絲呈淺褐色。
[0029] 2.菌株YT08的18SrDNA序列分析 提取菌株YT08的總DNA，采用真菌18SrDNA的通用引物（NS1-5,-GTAGTCATATGCTTGT CTC-3 '，NS6-5 ' -GCATCACAGACCTGTTAITGCCTC-3 '）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電 泳，由PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果切割所需DNA目的條帶，利用凝膠回收試劑盒回收后送交公司測(cè) 序。
[0030] 測(cè)序所得菌株YT08的18SrDNA序列如序列表所示，經(jīng)過(guò)NCBIBlast比對(duì)分析，該 序列與GenBank中淡紫擬青霉的多個(gè)分離物（如JF824691. 1、 AB124670.UAY526475. 2.AB084157.UAB104884.UAB023945.UEF638694.UAB103380.U AF548079. 1等）的序列相似性高達(dá)100%。
[0031] 通過(guò)結(jié)合關(guān)于菌株YT08的形態(tài)特征及18SrDNA序列特征，可將菌株YT08鑒定為 '後繁擬著霉QPaecilomyceslilacinus)。
[0032] 實(shí)施例3:淡紫擬青霉YT08的發(fā)酵培養(yǎng) 1.菌種活化培養(yǎng) 每500ml三角燒瓶中加入100ml的菌種活化培養(yǎng)基，121°C蒸汽滅菌20分鐘。所用的 菌種活化培養(yǎng)基組成（g/L):甘油10,大豆蛋白胨15,MnS04 2,85%脫乙酰度的粉末殼聚糖 8，NaCl6，CaCl2l，MgS04 3，F(xiàn)eS04 0.5,初始pH7。
[0033] 從固體斜面菌種中挑出一小塊菌苔，直接接入液體的菌種活化培養(yǎng)基，在28°C和 200rpm下?lián)u床振搖培養(yǎng)48小時(shí)，至長(zhǎng)成淺白色粘稠菌絲體。
[0034] 2.固體發(fā)酵培養(yǎng) 固體發(fā)酵培養(yǎng)基：干啤酒糟3kg，蔗糖20g，大豆蛋白胨60g，85%脫乙酰度的粉末殼聚 糖10g，NaCl30g，MgS04 6g，MnS04 4g，用自來(lái)水定容至7升。配制方法：先用水將NaCl、 MgS04、MnS04、蔗糖和大豆蛋白胨溶解，攪拌均勻，再與其他物質(zhì)混勻，pH自然。將上述固體 發(fā)酵培養(yǎng)基裝入10L固體發(fā)酵罐中，118°C下蒸汽滅菌20分鐘。
[0035] 按照10% (體積百分比）接種量，將淡紫擬青霉YT08的種子培養(yǎng)產(chǎn)物倒入固體發(fā) 酵培養(yǎng)基中，啟動(dòng)機(jī)械攪拌使菌種與發(fā)酵培養(yǎng)基混勻。在28°C下靜態(tài)培養(yǎng)，每隔3小時(shí)通入 無(wú)菌空氣1次。培養(yǎng)3天后至培養(yǎng)基表層長(zhǎng)滿(mǎn)菌絲，再次啟動(dòng)機(jī)械攪拌將發(fā)酵罐中所有物 質(zhì)搗碎混勻，在28°C下靜態(tài)培養(yǎng)，每隔5小時(shí)通入無(wú)菌空氣1次，繼續(xù)培養(yǎng)4天后至培養(yǎng)基 上長(zhǎng)滿(mǎn)淡紫色孢子后終止發(fā)酵。
[0036] 發(fā)酵終止后啟動(dòng)機(jī)械攪拌裝置，將培養(yǎng)物打散混勻，從出料口取出，放入陰涼通風(fēng) 處晾干，即得淡紫擬青霉YT08的固體制劑。采用逐級(jí)稀釋涂布方法，在孟加拉紅培養(yǎng)基上 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)固體制劑中淡紫擬青霉YT08的活菌數(shù)為4. 7X109cfu/g。
[0037] 實(shí)施例4:淡紫擬青霉YT08對(duì)番茄根結(jié)線蟲(chóng)卵的寄生性 設(shè)處理組和對(duì)照組，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)(培養(yǎng)皿)。在無(wú)菌培養(yǎng)皿中加入2mL卵粒懸浮 液，其中處理組的每個(gè)培養(yǎng)皿中另加2mL淡紫擬青霉YT08孢子懸浮液，對(duì)照組的每個(gè)培養(yǎng) 皿中另加2mL無(wú)菌水。28°C下培養(yǎng)8天后，按照下式計(jì)算卵孵化率和卵寄生率：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株用于防治番茄與葡萄根結(jié)線蟲(chóng)病害的淡紫擬青霉，其特征在于該菌株為淡紫擬 青霉（YT08,是從山東省煙臺(tái)市海水養(yǎng)殖的海帶表皮中分離獲得 的，對(duì)番茄和葡萄根結(jié)根結(jié)線蟲(chóng)病具有強(qiáng)防治效果，已于2014年11月26日在中國(guó)微生物 菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心登記保藏，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 10026。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一株用于防治番茄與葡萄根結(jié)線蟲(chóng)病的淡紫擬青霉。本發(fā)明所提供的淡紫擬青霉是所述淡紫擬青霉YT08，其在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCC No.10026，保藏日期為2014年11月26日。本發(fā)明提供的淡紫擬青霉YT08 CGMCC No.10026對(duì)番茄和葡萄根結(jié)線蟲(chóng)具有強(qiáng)防治效果，可開(kāi)發(fā)為針對(duì)農(nóng)業(yè)根結(jié)線蟲(chóng)病的新型生物防治劑。CGMCC No.1002620141126
【IPC分類(lèi)】C12R1-79, A01P5-00, C12N1-14
【公開(kāi)號(hào)】CN104818216
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510026764
【發(fā)明人】程仕偉, 劉樹(shù)朋, 張萍
【申請(qǐng)人】魯東大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年8月5日
【申請(qǐng)日】2015年1月20日