一種淡紫擬青霉及其規(guī)模制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明屬于微生物用農(nóng)業(yè)用藥肥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種淡紫擬青霉及其規(guī)模制備方法。
【背景技術(shù)】
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[0002]根結(jié)線蟲作為分布廣泛、為害嚴(yán)重的一種植物寄生線蟲，對農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。根結(jié)線蟲可直接破壞寄主表皮細(xì)胞使作物造成機(jī)械損傷，也可通過口針刺傷寄主，分泌有毒物質(zhì)，形成瘤狀根結(jié)，影響作物生長。
[0003]淡紫擬青霉作為一種高效微生物藥肥，可有效防治根結(jié)線蟲為害，然而現(xiàn)有的微生物菌株，在實際應(yīng)用中，許多產(chǎn)品因含孢量有限而防效不及化學(xué)殺線蟲劑。因此，如何擴(kuò)大淡紫擬青霉產(chǎn)孢量，在短時間內(nèi)實現(xiàn)其規(guī)模生產(chǎn)的尤為重要。
[0004]現(xiàn)有技術(shù)中，例如公開號為CN 10332032的專利，采用固液兩相的方法進(jìn)行發(fā)酵，其含孢子量僅為109cfu/g，又如公開號CN 102925405采用液態(tài)發(fā)酵的方式進(jìn)行淡紫擬青霉菌株的規(guī)模生產(chǎn)，其活孢子量也僅為109cfu/g，發(fā)酵效率普遍較低。此外，現(xiàn)有的淡紫擬青霉的規(guī)模生產(chǎn)方法，生產(chǎn)周期長，例如公開號為:CN 103589649采用固態(tài)培養(yǎng)的方法，生產(chǎn)周期長，達(dá)32-37天，不能滿足淡紫擬青霉生產(chǎn)的實際需求。
[0005]綜上，現(xiàn)有淡紫擬青霉菌株產(chǎn)孢量低，缺少適合的規(guī)模發(fā)酵方法，不能滿足根結(jié)線蟲大規(guī)模防治的需求。因此，需要一種高產(chǎn)的淡紫擬青霉菌株，并結(jié)合其規(guī)模制備的方法，來實現(xiàn)淡紫擬青霉在農(nóng)業(yè)病害防治中的廣泛應(yīng)用，達(dá)到線蟲高效、規(guī)模防治的實際需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0006]本發(fā)明根據(jù)現(xiàn)有淡紫擬青霉在規(guī)模制備過程中出現(xiàn)的發(fā)酵效率低、制備周期長的缺點(diǎn)，篩選出一種高產(chǎn)的淡紫擬青霉菌株，拉丁名為:Paecilomyces lilacinus，已于2011年10月14日交由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏號為:CGMCC N0.5339。并根據(jù)其菌株的特點(diǎn)，開發(fā)出一種規(guī)模制備的方法，具有發(fā)酵效率高、制備周期短、制備方法簡單、制備成本低的優(yōu)勢，可實現(xiàn)淡紫擬青霉的廣泛應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0008]1、一種淡紫擬青霉，其特征在于:采用液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵相結(jié)合的方式進(jìn)行淡紫擬青霉的規(guī)模制備；其規(guī)模制備方法如下:
[0009](I)液態(tài)發(fā)酵:配制液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基100ml滅菌，接種淡紫擬青霉的菌塊，在25-30°C的搖床中震蕩，搖床轉(zhuǎn)速為160rpm-200rpm，震蕩培養(yǎng)3_5天，得到液體種子液A ;
[0010](2)固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)滅菌:將固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)混勻，采用滅菌方法進(jìn)行殺菌后，得到滅菌后的固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)B;
[0011](3)固態(tài)基質(zhì)噴霧接種:將A得到的種子液用無菌水進(jìn)行稀釋，種子液與無菌水的質(zhì)量比為:1:2-5: 1，將稀釋后的種子液倒入噴霧器中，將B在超凈工作臺中進(jìn)行接種，稀釋后的種子液與固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)的比例為:30-65ml:100g，得到物質(zhì)C ；
[0012](4)接種后基質(zhì)的培養(yǎng):將物質(zhì)C放置貨架上進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵的溫度條件為20-30°C，4-10天后，發(fā)酵結(jié)束，獲得發(fā)酵產(chǎn)物，將發(fā)酵產(chǎn)物放入烘箱干燥，烘箱溫度為25-35。。。
[0013]采用液態(tài)和固態(tài)相結(jié)合的發(fā)酵方法，其生產(chǎn)周期短，7-15天可以實現(xiàn)從種子液培養(yǎng)到淡紫擬青霉原藥的獲得。采用噴霧接種的方式來替代人工攪拌接種，生產(chǎn)速率可提高2-3倍，減少勞動力，降低生產(chǎn)成本。采用該制備方法進(jìn)行淡紫擬青霉的發(fā)酵，其發(fā)酵產(chǎn)物含孢子量高，可達(dá)1015_16cfu/g。采用上述制備方法制備的物質(zhì)可以直接通過震蕩獲得孢子粉，其獲得率可達(dá)15% (w/w)以上，制備后的物質(zhì)也可以直接作為原料做成淡紫擬青霉生物殺線蟲劑。
[0014]2、根據(jù)技術(shù)方案I所述的規(guī)模制備方法，其特征在于:所述液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米粉培養(yǎng)基，其配制方法為將玉米粉與水混合后熬煮8min-15min后加入糖分物質(zhì)，其中，每100ml水中的玉米粉含量為5-12g，糖分物質(zhì)含量為10_20g。
[0015]采用玉米粉熬煮液可將玉米粉營養(yǎng)物質(zhì)充分溶解，有助于其培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分充分融合，有助于淡紫擬青霉的液態(tài)培養(yǎng)，采用玉米粉培養(yǎng)基，淡紫擬青霉產(chǎn)孢量明顯高于PDB，可高出20%以上。
[0016]3、根據(jù)技術(shù)方案I所述的規(guī)模制備方法，其特征在于:所述固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)包括:主要基質(zhì)A、輔助基質(zhì)B、小米粉、蝦粉、硫酸銨。其中，小米粉作為營養(yǎng)物質(zhì)可提供充足的營養(yǎng)，硫酸銨可提供鹽分，蝦粉促進(jìn)淡紫擬青霉分泌幾丁質(zhì)酶，增強(qiáng)淡紫擬青霉寄生線蟲能力。
[0017]4、根據(jù)技術(shù)方案3所述的固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)，其特征在于:主要基質(zhì)A為麥麩或豆餅，或麥麩和豆餅的混合物；輔助基質(zhì)B為玉米粉或酵母粉、或玉米粉和酵母粉的混合物。主要基質(zhì)A用來提供碳源，麥麩和豆餅為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中價廉物美的碳源，而輔助基質(zhì)則提供氮源，同時，多種糧食作物提供全面充分的營養(yǎng)，以上物質(zhì)更有助于淡紫擬青霉的固態(tài)發(fā)酵。
[0018]5、根據(jù)技術(shù)方案4所述的固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)，其特征在于:各成分按質(zhì)量組分，主要基質(zhì)A為500-800份、輔助基質(zhì)B為300-450份、小米粉為50-200份、蝦粉為5_50份、硫酸銨為1-20份。固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)采用上述成分以及相應(yīng)比例，是根據(jù)淡紫擬青霉固態(tài)發(fā)酵過程中對各種成分的需求量進(jìn)行的合理配比，篩選出來的最優(yōu)配方，有利于淡紫擬青霉固態(tài)發(fā)酵的順利進(jìn)行。
[0019]6、根據(jù)技術(shù)方案I所述的規(guī)模制備方法，其特征在于:所述殺菌方法包括間歇蒸汽滅菌，具體步驟如下:
[0020]步驟(I):將固體發(fā)酵基質(zhì)通入100°C水蒸氣進(jìn)行滅菌，滅菌時間為30min以上，單次滅菌結(jié)束后，將固體發(fā)酵基質(zhì)放置18-24小時；
[0021]步驟(2):重復(fù)步驟(I)，重復(fù)次數(shù)為3-5次。
[0022]采用間歇蒸汽的方式進(jìn)行滅菌，可降低采用高壓蒸汽滅菌所存在的安全隱患，避免了高壓蒸汽滅菌容易造成固體基質(zhì)的板結(jié)，可減少人為攪拌步驟，從而降低固體基質(zhì)污染的概率。同時，滅菌方法也可以采用高壓蒸汽滅菌的方式，即:將混勻后的固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)在壓力103.4kPa下，在溫度115-130°C范圍內(nèi)進(jìn)行蒸汽滅菌，持續(xù)滅菌時間為20min_30mino
[0023]7、根據(jù)技術(shù)方案I所述的淡紫擬青霉，Paecilomyces lilacinus，其保藏號為CGMCC N0.5339ο該菌株為土壤有益菌，能有效防治土壤根結(jié)線蟲，在作物生長期還有良好的促進(jìn)生長、提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)的作用。
[0024]綜上所述，本發(fā)明提供了一種淡紫擬青霉，并根據(jù)其特征，通過選擇特定成分的培養(yǎng)基、液態(tài)固態(tài)相結(jié)合的發(fā)酵方式、采用噴霧式接種以及間歇蒸汽滅菌的方式，實現(xiàn)了淡紫擬青霉的規(guī)模制備，解決了現(xiàn)有技術(shù)淡紫擬青霉活孢子量少、人工接種效率低、固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品易板結(jié)、發(fā)酵效率低、發(fā)酵罐發(fā)酵成本高、制備周期長等一系列問題。本發(fā)明一種淡紫擬青霉及其規(guī)模制備方法，具有發(fā)酵原料易獲得、接種及發(fā)酵效率高、制備周期短、制備方法簡單、制備成本低的優(yōu)勢，可實現(xiàn)淡紫擬青霉的廣泛應(yīng)用。
【具體實施方式】
[0025]通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，實施例不應(yīng)該當(dāng)作對本發(fā)明的限制。
[0026]實施例一:
[0027]1、液態(tài)發(fā)酵:玉米粉5g和水1000ml，混合熬煮8分鐘，加入糖10g，制成液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，接種淡紫擬青霉Paecilomyces lilacinus保藏號為CGMCC N0.5339的菌塊，在250C的搖床中震蕩，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，震蕩培養(yǎng)3天，得到液體種子液A ；
[0028]2、固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)滅菌:將固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)按質(zhì)量比:主要基質(zhì)麥